Magnetiske pincet til måling af Twist og Moment

Summary

Magnetiske pincet, en kraftfuld enkelt molekyle manipulation teknik, kan tilpasses til de direkte målinger af twist (ved hjælp af en konfiguration kaldes frit kredser magnetiske pincet) og drejningsmoment (ved hjælp af en konfiguration betegnes magnetisk moment pincet) i biologiske makromolekyler. Retningslinjer for udførelse af sådanne målinger er givet, herunder ansøgninger til studiet af DNA og tilhørende nucleo-protein filamenter.

Abstract

Enkelt-molekyle teknikker gør det muligt at undersøge opførslen af ​​enkelte biologiske molekyler i opløsning i realtid. Disse teknikker omfatter såkaldte force spektroskopi tilgange såsom atomic force mikroskopi, optiske pincetter, flyde stretching og magnetiske pincet. Blandt disse metoder, har magnetiske pincet udmærket sig ved deres evne til at anvende moment og samtidig opretholde en konstant stretching kraft. Her illustreres det, hvordan en sådan "konventionelle" magnetiske pincet eksperimentelle konfiguration kan gennem en enkel ændring af sit felt konfiguration til at minimere størrelsen af ​​den tværgående område, som er indrettet til at måle graden af ​​drejning i et biologisk molekyle. Betegnes den resulterende konfiguration af de frit-kredsløb magnetiske pincet. Derudover er det vist, hvordan yderligere modifikation af feltet konfiguration kan give et tværgående felt med en størrelsesorden mellemprodukt, der ligger mellem & #8220; konventionelle "magnetiske pincet og frit kredsløb magnetiske pincet, hvilket gør det muligt direkte at måle moment lagret i et biologisk molekyle. Betegnes denne konfiguration de magnetiske pincet moment. Den ledsagende video forklarer i detaljer, hvordan omlægning af konventionelle magnetiske pincet til frit kredser magnetiske pincetter og magnetisk moment pincet kan opnås, og demonstrerer brugen af ​​disse teknikker. Disse tilpasninger bevare alle de stærke sider af konventionelle magnetiske pincet mens høj grad at udvide den alsidighed af denne magtfulde instrument.

Introduction

I de senere år har enkelt-molekyle teknikker bevist deres brede anvendelighed i studiet af bearbejdende motordrevne proteiner og andre enzymer, hvilket gav indsigt i deres kinetik og den underliggende mechanochemistry. I forbindelse med force spektroskopi, er vigtige bidrag blevet foretaget af atomic force mikroskopi flow strække, og optiske og magnetiske pincet. Optiske og magnetiske pincet (MT) har bl.a. formået at kombinere stor fleksibilitet i form af molekylær manipulation med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Her fokuserer vi på MT, som kan anvende både strækker kræfter og momenter til biologiske molekyler tøjret mellem en overflade og superparamagnetiske perler ^1-3.

Magnetiske pincet (MT, figur 1a) er en meget alsidig enkelt molekyle teknik, der har været anvendt til at overvåge både de mekaniske egenskaber af nukleinsyrer samt deres interaktioner med proteiner. MT har mange kræfters, herunder den overordnede enkelhed og robusthed forsøgsvis iværksættelse, facile anvendelse af drejningsmoment, naturlig drift og ligetil kalibrering i konstant kraft mode ^4, udvidelse til parallelle målinger ^{5, 6,} og fravær af prøve opvarmning og solskader. Sammenlignet med andre enkelt molekyle tilgange, MT giver en måde at udføre force afhængighed målinger ved kræfter så lavt som ≈ 10 fN og har evnen til at ligefrem styre graden af ​​supercoiling. Mens MTS overvejende er blevet anvendt som et eksperimentelt redskab til at undersøge biologiske processer, der involverer nukleinsyrer ^{7, 8,} har de også fundet anvendelse i undersøgelser af de mekaniske egenskaber af proteiner ^9-13 eller celler ^{10, 14-17.} Talrige nyttige referencer er til rådighed, der beskriver, hvordan man opbygger og køre en MT ^{4, 18-20.}

Howevis, behøver konventionelle MT ikke spore roterende bevægelse direkte, og mens de anvender moment, de ikke måle moment direkte. Desuden kan de begrænse fri rotation af nukleinsyren tøjr. Her præsenterer vi to udvidelser af magnet pincet. Den første, der betegnes frit kredsløb magnetiske pincetter (FOMT, Figur 1b) ^21, tillader målinger af ligevægts vinkel udsving og ændringer i twist af tøjrede nukleinsyremolekyler, uden at begrænse den roterende bevægelse omkring tether aksen. Den anden, betegnet magnetiske moment pincet (MTT, figur 1c), som har evnen til at anvende og direkte måle både kræfter og momenter til enkelte biomolekyler ^22-27.

I det følgende protokol, formoder vi, at læseren har på hans / hendes disposition en "traditionel" MT instrument. Vi henviser læseren til diskussionen om referencer om hvordan at opbygge og drive en MT sat op, samt considerationer, der skal tages i betragtning ved udvælgelsen af ​​magnetiske perler, magneter, og sporing af rutiner. Hertil kommer, punkt 1 og 2 i protokollen tekst beskriver, hvordan vi typisk forberede og inkuberes en DNA-prøve til brug i MT samt de foreløbige målinger, der kan udføres på en enkelt DNA i konventionel MT. Punkt 3 og 4 i protokollen Text illustrere, hvordan en MT instrument let kan tilpasses og anvendes til FOMT og MTT målinger.

Protocol

1.. Forberedelse og Inkubation af en DNA-prøve

1. Forbered DNA-konstruktioner, der er ligeret til duplex ender (typisk beskæftiger ≈ 600 bp DNA PCR-fragmenter), der er funktionaliseret med flere biotin og digoxigenin grupper, henholdsvis ^18. For at starte, en DNA tøjr længde> 1 um, fx en 7,9 kbp, der svarer til en strakt længde på ~ 2,7 um som ansat her, anbefales til brugervenlighed; især ved hjælp af en DNA-længde, der er lig med eller kortere end perlen radius er problematisk på grund af fastgørelsen geometri i MTT og FOMT. Jf. diskussionen om en beskrivelse af, hvordan DNA længde påvirker tidsmæssig respons i kantede domæne.
2. Saml flowceller for enkelt-molekyle eksperimenter. For flow celler bruge to glas mikroskop dækglas adskilt af et dobbelt lag Parafilm spacer. Den øverste mikroskop dækglas bør have to huller for væsken ind-og udløb til cellen. Det er praktisk atbruge en sandblæser til at bore hullerne. Den nederste dækglas overtrukket med nitrocellulose (0,1% vægt / vol, i amylacetat). Placer parafilmen afstandsstykker på nitrocellulose-belagte side af de nederste dias og lukke toppen med rene top dias.
3. Seal flow celler. Ved hjælp af fysiske pincet placere samlet flow celle på en varmeplade indstillet til 80-100 ° C i ~ 1 min. Vær opmærksom på at flow celle er godt forseglet, at Parafilm ikke lukke hullerne, der forbinder til ind-og udløb, og at objektglas er godt afstemt.
   Bemærk: For at sikre en god tætning, anbefales det at slagtilfælde ud bobler i Parafilm hjælp af en stor vatpind. Flowcellen kan derefter monteres på den magnetiske pincet instrument.
4. Forbered buffere. Forbered TE tethering-buffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 200 mM NaCI). Alternativt kan man anvende PBS-buffer (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM phosphatbuffer, pH 7,4) suppleret wed 100 ug / ml BSA, 0,1% Tween og 5 mM natriumazid (PBS +) tethering buffer. Flush 2-3 cellevolumener TE tethering puffer i flowcellen.
5. Inkuber 0,5 eller 1,5 um radius umagnetiske latexkugler i flowcellen for ~ 30 min. Disse perler vil fungere som reference-perler i løbet af magnetiske pincet målinger, der tillader en at minimere effekten af afdrift mellem målet og prøveholderen (dvs. flow celle). Skyl separate ikke-magnetiske perler ved at skylle med 2-3 cellevolumener TE tethering buffer.
6. Funktionalisere bundfladen af ​​flowcellen ved inkubering med 100 ug / ml anti-digoxigenin i PBS i mindst 1 time (fortrinsvis længere, inkubation kan udføres om natten) at tilvejebringe DNA-fastgørelse. Skyl med 2-3 cellevolumener TE tethering buffer. Endelig inkuberes flowcellen med 2 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) i TE tethering buffer i 30 min for overfladepassivering.
7. Tag en portion af2 ml streptavidin-coatede superparamagnetiske MyOne perler (se Diskussion og Table of Materials) og fortyndes med 10 ml TE tethering buffer. Vaskes to gange med 10 ml TE tethering puffer under anvendelse af en magnetisk partikelkoncentrator og resuspender i 10 ml TE tethering puffer. Fastgør ~ 1 ml af DNA-molekylerne (ca. 1 ng) til disse perler ved inkubering i TE tethering buffer i 30 minutter.
8. Opløsningen af ​​det DNA-bundne superparamagnetiske perler tifold fortyndes ved tilsætning af 90 ml TE tethering buffer. Endelig injicere opløsningen i flow-cellen og inkuberes i ~ 1 time for at tillade DNA tilknytning til anti-digoxigenin overflade. Vask flowcellen grundigt med TE tethering buffer. Efter inkubation af DNA-tether konstruktioner, skyl grundigt med eksperimentel buffer (dette kan være TE tethering buffer) til at fjerne alle ikke-tilsluttede perler.
9. For målinger, der ansætter en kantet sporing protokol, der kræver fiducial markør perler knyttet til de magnetiske perler

2. Målinger på en enkelt DNA-molekyle i Konventionelle Magnetic pincet

1. Anvendelse af en konventionel MT (se Diskussion) med egnede felt konfiguration (figur 1a), og både translations-og rotations kontrol af magneten position, søge efter drejeligt hæmmet DNA-molekyler i flowcellen. Ved at trække kræfter ≥ 1 PN (konsultere referencer ^{4, 19, 20, 28, 29} om force kalibrering i magnetiske pincet), nemt kan skelnes tøjrede perler fra perler fast til overfladen af bunden dias ved deres forskellige højder i fokus . Hvorvidt et DNA-molekyle er rotationsmæssigt begrænset kan vurderes ved at indføre 20-30 turns af magneterne på en kraft på ≈ 0,25 PN: her, bør tether længde falde med 0,4-0,5 um.
   Bemærk: Hvis du vil køre magnetiske pincetter eksperimenter, er billedbehandling bruges til at bestemme x, y og z position af DNA-tøjret perler. Brugerdefineret Labview software til dette formål er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning.
   1. Kontroller, at perlen er fastgjort med en enkelt DNA tøjr. Dette kan gøres ved at sammenligne opførsel under positive og negative drejninger på kræfter> 1 PN (figur 2a). I denne kraft regime vil tilstedeværelsen af ​​flere DNA tøjrene give anledning til en omtrent symmetrisk fald i forlængelse ved at indføre positive og negative omdrejninger, hvorimod enkelt DNA bindsler vil give anledning til en asymmetrisk reaktion.
2. Søg efter egnede faste perler sidder fast i bunden overflade i nærheden af ​​at binde af interesse, der kan tjene som reference-perler.
3. Kalibrer længde than-DNA, l. Positionen af flowcelle overflade kan bestemmes ved at bringe den bundne perle i kontakt med overfladen (fx ved at dreje magneten ved ~ 60 omdrejninger ved en kraft under 0,2 PN). Målinger af den bundne perle lodrette position i forhold til denne overflade rapportere derefter absolutte værdi af l.
   Bemærk: For at minimere de efterfølgende virkninger af drift, anbefales det at udføre målinger af l forhold til placeringen af en henvisning perle fastgjort til overfladen.
4. Optag en rotation kurve (dvs. en måling af forlængelse af DNA som en funktion af antallet af vindinger) ved en strækning kraft ≈ 0,25 PN (figur 2a).
   1. Bestem antallet af omgange, hvor forlængelsen er maksimal, idet dette svarer til den tilstand, hvor DNA-molekylet er vridningsmæssigt afslappet. For at gøre dette, er det nyttigt at passe rotation kurve lokalt med en parabolsk eller en Gaussisk funktion til at bestemme centret posipå. Definer dette punkt som "nul omdrejninger".
      Bemærk: En specialfremstillet skriftlig rutine til dette formål er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning.
5. For en række ~ 20 magnet positioner, bestemme den gennemsnitlige forlængelse af vridningsmæssigt-afslappede molekyle (dvs. på "nul omdrejninger", se trin 2.4.1) fra z-spor.
6. For hvert målepunkt i trin 2.5, præcist at afgøre det strækker kraft fra udsvingene i x-eller y-position ^{20, 28, 29,} eller, forudsat at magnetiseringen af perlen er velkendt, ved hjælp af kendskab til det lokale område gradient ^4.. Plotte strækker kraft versus de gennemsnitlige udvidelse resulterer i en kraft-udvidelse kurve (figur 2b).
   1. Monter de resulterende kraft-forlængelse data til ormelignende kæde ligning ved hjælp af den polynomielle tilnærmelse af Bouchiat et al ^30.
   Hvis forberede efterfølgende FOMT målinger langsomt dreje magneterne, mens du optager den magnetiske perle udflugter i (x, y).
   Bemærk: Den mindre radius af den resulterende ringformede på konventionel MT konfiguration tættere DNA-molekylet er bundet tættere til "syd pol" af magnetisk perle. Når man skifter til FOMT konfiguration, vil et sådant DNA-molekyle bindes tæt til "ækvator" af magnetisk perle, som giver pålidelig sporing af rotationsvinkel (x, y)-position (se Diskussion).

3.. Målinger af DNA Twist Brug den frit kredser Magnetiske pincet

1. Erstatte manuelt firkantede magneter de konventionelle magnetiske pincet af en cylindrisk magnet, der anvendes til FOMT (figur 1b). Denne operation skal udføres på en sådan måde, at den valgte DNA tøjret forbliver inden for synsfeltet. Dette kan ske på mindre end 1 min ved blot at skrue fuldstændig magnet hoved, der holder magneterne for konventionelle pincet konfiguration og erstatte det med en magnet hoved, der besidder en cylindrisk magnet for FOMT.

De opleve (x, y) af en magnetisk perle bindes af en enkelt dsDNA tøjr stærkt afhængig positionen af tøjret i forhold til aksen af den cylindriske magnet (figur 1b, figur 3a). Optag (x, y) opleve for at bestemme den tilsvarende placering i karakteristiske fluktuationsmønster (figur 3a, Diskussion).

Udfør grov justering af magnet i FOMT. Dette kan opnås ved at bevæge den cylindriske magnet over flow-celle ved anvendelse af (x, y) oversættelse faser. Hvis (x, y) opleve følge en bue, er den cylindriske magnet ikke korrekt justeret og skal flyttesi den ønskede retning (figur 3b).

1. Grov justering kan udføres inden for 15 min for tilfælde af MyOne perler med 7,9 kbp bindsler, og er fuldført, når måling af (x, y) udflugter resultater i observation af cirkulær bevægelse (figur 3b, i midten).
   Bemærk: Grov justering er typisk tilstrækkeligt til at observere ændringer i twist foranlediget af protein binding til enkelte DNA tøjret i FOMT konfiguration ^{21, 31} (Repræsentative resultater, figur 5), på trods af det medfølgende todimensionale histogram kan ikke have sine tællinger absolut ensartet fordelt langs den cirkulære ringformede (figur 3c).

Hvis det er nødvendigt til yderligere forsøg, udføre fint tilpasning på FOMT. Dette kan opnås ved hjælp af høj opløsning mikrometer skruer eller en høj opløsning automatiseret stadium enten flytte magneten eller flowcellen til centare den cylindriske magnet på perlen inden for ~ 10 um. I finjustering fase magneten placeres omhyggeligt, således at udsving på cirklen ringformede er næsten ensartet, svarende til en situation, hvor den energi barriere til fuld rotation på grund af magneten er k _B T (Figur 4).
Bemærk: Et Matlab script til at plotte svingninger i et histogram eller thermogram som i figur 4 er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning.
Bemærk: Fin justering kan opnås inden 45 min for tilfælde af MyOne perler med 7,9 kbp bindsler, og i reducerede tidsrammer for mindre perler og kortere bindsler er ansat (se Diskussion).
Bemærk: Fin justering er typisk forpligtet til at udføre målinger af vridningsstivheden af nøgne eller protein-belagt DNA (Repræsentative resultater, figur 4).

Hvis det er nødvendigt for analyse, kalibrere kraft i FOMT. Dette kan udføres ina måde analog med MT, enten ved hjælp af perle radiale udsving <r ^2> (hvor de vinklede parentes den gennemsnitlige tid) som vist i den ledsagende video og detaljeret i Lipfert m.fl. ²¹ eller, forudsat at magnetiseringen af perlen er vel -kendt, hvorved kendskab til det lokale område gradient ^21.

4.. Målinger af DNA spændingsmoment i det magnetiske Moment Pincet

1. Manuelt erstatte den cylindriske magnet, der anvendes til FOMT af en cylindrisk magnet plus en side (permanent) magnet for MTT (figur 1c). Denne operation skal udføres på en sådan måde, at den valgte DNA tøjret forbliver inden for synsfeltet.
   1. Den mest enkle måde at opnå dette er at manuelt at tilføje den side magnet på dens rette placering, hvilket kan opnås inden for 1 min. Ingen yderligere justering er nødvendig.
      Bemærk: Et alternativ til en side magnet er brugenaf elektromagneter ^32.
2. Hvis det kræves til analyse, kalibrere kraft på en måde analog med MT, enten ved hjælp af perlens x eller y-udsving eller forudsat magnetiseringen af perlen er velkendt, ved hjælp af kendskab til det lokale feltgradient ^21.
3. Spor kantede svingninger som en funktion af tid θ (t) ved hjælp af enten fiducielle baseret sporing protokol ²³ eller, som vist i den ledsagende video, den kantede sporing protokol baseret på overvågning af (x, y)-position (se Diskussion). I førstnævnte tilfælde optage billeder i fuld af vulsten som en funktion af tid for efterfølgende billedbehandling. I sidstnævnte tilfælde er det tilstrækkeligt at optage perle s (x, y), udsving på dette trin.
   Bemærk: Et Matlab script til at bestemme θ (t) fra fuld billeder af perlen som en funktion af tid i fiducielle baseret sporing protokol er envailable fra forfatterne efter anmodning.
   1. Som beskrevet i Diskussion, for det kantede sporing protokol baseret på overvågning af (x, y)-position er det også tilrådeligt at indspille en tid spor, hvor magneterne er langsomt (typisk ved 0,1 Hz) drejes af flere omgange. Dette tillader en at præcist at konvertere kartesiske koordinater (x, y) til polære koordinater (r, θ) ved hjælp af ligninger 3-5 af diskussionen.
      Bemærk: En MATLAB script for kantet sporing script baseret på overvågning af (x, y)-position er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning.
      Bemærk: Målingen tid er mest afhængig af den ønskede moment opløsning. En detaljeret argument er givet i Lipfert et al ^24. For MyOne perler og 8 kbp DNA bindsler, måling for 30-100 sekunder bør være tilstrækkelig til at give et moment opløsning i intervallet ~ 1 pN · nm.
4. Bestem stivhed torsionsstivhed fælde fra the varians af de kantede udsving _(σ θ ^2, i radianer) ved hjælp af:
   k _θ = k _B T / σ _θ ² (1)
   Bemærk: Typiske roterende fælde stivheder opnået i MTT er i intervallet 10-1,000 PN · nm / rad, lavere end for konventionelle magnetiske pincet.
5. Desuden registrerer z-positionen af perle og anvende dette til at finde tøjret længde l (se også trin 2,4-2,7).
6. Roter N vender og igen optage θ (t) og l (t).
   Bemærk: Det reducerede roterende fælde stivhed af MTT forhold til MT gør det velegnet til målinger af enkelt molekyle drejningsmoment, men antyder, at det maksimale drejningsmoment, der kan udøves reduceres. Dette indebærer, at MTT ikke kan være i stand til at opveje høje drag momenter forårsaget af hurtig rotation. Man skal derfor tages ikke at overskride den maksimale hastighed; typically rotere ved hastigheder tæt på 0,1 Hz.
7. Bestem moment akkumuleret i nukleinsyre tøjret efter N vender hjælp:
   Γ = - k _θ <θ _N - θ _0> (2)
   Hvor <...> angiver den gennemsnitlige og θ ₀ og θ _N vinklen ved nul omdrejninger (svarende til en vridningsmæssigt afslappet tøjr, jfr. Trin 2.3 og N vender hhv.
8. Gentag trin 4.5 og 4.6, som er nødvendige for fuldt ud at bestemme et molekyle drejningsmoment reaktion i en enkelt måling run (Repræsentative resultater, figur 6).

Representative Results

Repræsentative resultater fra MT (fig. 1a) er vist i fig. 2. Figur 2a viser rotation udvidelser af kurver for et 7,9 kb DNA-taget på F = 0,25, 0,5, og 2,0 PN. Svaret fra en enkelt DNA til rotation bør symmetrisk på de laveste kræfter (0,25 PN), med forlængelsen af ​​DNA faldende som følge af dannelsen af ​​positive eller negative plectonemic supercoils. Kvalitativ viden om dette svar er nyttigt, når der oprindeligt søger efter drejningsstift hæmmet DNA tøjr (trin 2.1). Bemærk, at yderligere undersøgelse af tøjret er forpligtet til at kontrollere, at den består af en enkelt DNA-molekyle: her, asymmetriske reaktion på en enkelt DNA til rotation på kræfter, der overstiger 0,5 PN hjælper med at skelne det fra flere DNA (trin 2.1.1). Når dette er blevet bekræftet, man vender tilbage til den roterende reaktion på 0,25 PN for at bestemme det nøjagtige antal af magnet vender hvor enkelt DNA is vridningsmæssigt afslappet, hvor man tager en kraft-udvidelse kurve, der skal ligne Figur 2 b. Til netop denne måling, et anfald af data til ormelignende chain-model (fuldt optrukket linie) gav en monteret kontur længde L _C = 2,71 m og bøjning vedholdenhed længde L _P = 45 nm. For dsDNA bør monteret værdier persistens længde ligge i området 40-55 nm, afhængigt af pufferbetingelser ³³ og monteret kontur længde bør være tæt (typisk inden for 10%) til den forventede værdi for DNA konstruktion, anvendes i målingerne, ved hjælp af forholdet L _DNA = 0,34 nm / bp · antal basepar.

Figur 3 viser de procedurer og resultater af tilpasningen i FOMT (figur 1b). De første (x, y) udflugter optaget i trin 3.2 kan sammenlignes med den generelle opfattelse af svingninger som en funktion of tværgående magnet stillingen vist i fig 3a, der viser en "hvirvel"-mønster, der kan anvendes til at styre efterfølgende relative forskydning mellem magnet og DNA-bundne perle afholdt i FOMT. Når efterfølgende grove justeringen udført, perlen er (x, y)-udsving spore en cirkulær bane, som det også fremgår af det sorte spor i figur 3b. På dette tidspunkt er drejningsmomentet fra magneterne omkring z-aksen reduceret til det punkt, at termiske fluktuationer tilstrækkeligt at rotere vulst omkring dens fastgørelsespunkt. Radius R _cirkel af den resulterende cirkulære ringformede (monteret cirkel er vist i rødt) repræsenterer den radiale afstand mellem DNA fastgørelsespunktet og perlens centrum (figur 1b). Som vist i figur 3c,, et histogram af dataene i figur 3b viser imidlertid, at grove tilpasning ikke garanterer en ensartet dækningaf alle mulige positioner langs den cirkulære annulus. Selvom termiske fluktuationer er tilstrækkelige til at udforske alle rotationer vinkel på cirklen, er der stadig en lille energi barriere (i størrelsesordenen den termiske energi k _B T) til fri rotation.

Når finere tilpasning udføres i FOMT (trin 3.4), kan instrumentet anvendes til at bestemme torsions modul DNA (figur 4). Først finjustering af prøven anvendes til at opnå cirkulær bevægelse (figur 4a), hvis todimensionale histogram viser nu ensartet dækning (figur 4b). Den tilsvarende tidssporet q (t), i kantede svingninger (fremstillet ved omdannelse af (x, y)-positionerne, se nedenfor) viser ingen periodicitet svarende til 360 ˚ (4c) og afslører store opleve svarende til flere hele omdrejninger (fig. 4d). Den implicitte energi landskaber harmonisk over et område på> 1.000 ˚ (fig. 4e). Standardafvigelsen for udsvingene er σ _θ = 223 °, svarende til en kantet fælde stivhed k _θ = k _B T / σ _θ ² = 0,27 PN · nm / rad, som igen giver et estimat for den effektive torsionsstivhed vedholdenhed længde DNA svarende til C = L _C / _σ θ ² ~ 76 nm (L _C = 1,150 nm for 3,4 kbp DNA, der anvendes i denne måling) på målte kraft.

Et eksempel på, hvordan FOMT kan anvendes til at måle ændringen i twist induceret i den fikserede DNA-molekyle ved binding af proteiner ^{31, 34} er vist i fig. 5. Her har vi overvåget bindingen af RAD51 protein at fordobleDNA; RAD51 er kendt for både at forlænge og slappe af DNA som det danner en nukleoprotein filament ^31. Efter skylning RAD51 i strømmen-cellen, observere vi, at perlen gennemgår en spiral bane i FOMT (figur 5a). Ved at konvertere spor af (x, y) bevægelse, som en funktion af tid til q (t) som beskrevet ovenfor kan vi co-plot, at RAD51 har på DNA tøjr længde og graden af afvikling (figur 5b, c) .

En alternativ fremgangsmåde til måling af de vridningsmæssige egenskaber af DNA er MTT (figur 1c, figur 6). Den skematiske i figur 6a illustrerer princippet for målingen: efter overwinding (eller underwinding) DNA tøjret ved N vender DNA udøver en genoprettelse moment på perlen, der fører til et skift i ligevægt vinkelposition fra θ ₀ til θ _N. I MTT den tværgående komponent af magnetfeltet er reduceret i forhold til MT, hvilket letter måling af kantede forskydninger, mens der stadig tillades perle rotation (figur 1). Størrelsen af vinkelforskydning målt efter påføring N = 45 bliver til et 7,9 kbp DNA er vist i figur 6b. Den komplette sekvens af MTT måling protokollen og den resulterende resultatet af et drejningsmoment mod drejning kurve for DNA er vist i figur 6c-f. Her bliver målinger af standardafvigelsen (figur 6c) og den gennemsnitlige (figur 6d), i vinkelkoordinatsystemet vist som en funktion af over-og underwinding med standardafvigelsen er omvendt proportional med den kantede fælde stivhed (ligning 1). Tilsammen disse mængder tillader en at konstruere et drejningsmoment versus rotation kurve for DNA (Figur 6f), som skal vise en lineær respons region centreret omkring 0 forvandler ennd to plateauer, hvor mætter drejningsmoment, ved positive og negative rotationer, hhv. En sådan drejningsmoment versus rotation kurve supplerer oplysningerne i en udvidelse versus rotation kurve (figur 6e), hvorved kvantificering af overgange, der ledsager foldning og denaturering af DNA.

Figur 1.. Skema af konventionelle magnetiske pincet (MT), frit kredser magnetiske pincet (FOMT), magnetisk moment pincet (MTT), og to strategier til at spore rotation vinkel. (A) I alle tre implementeringer af magnetiske pincet, er magnetiske perler bundet til en flow-celle overflade ved funktionaliserede makromolekyler, fx de dobbeltstrengede DNA-molekyler er vist skematisk. Reference-perler er knyttet til strømmen celleoverfladen og sporet til drift korrektion. Alle tre MT set-ups anvende magneter til at anvende en opadgående strækning kraft på magnetiske perler, og derfor DNA tøjr. I konventionel MT, et par magneter udøver et magnetfelt, som er orienteret på tværs i forhold til tether akse tæt begrænse rotation af vulsten omkring DNA-tether akse. I FOMT en cylinderformet magnet tilvejebringer et magnetfelt, orienteret langs linen retning. Når tøjret er rettet ind på midten af ​​cylinderformet magnet, er de resterende tværgående områder minimeret, der tillader fri rotation omkring tether akse MTT er en side magnet tilsat til cylinderformet magnet anvendes FOMT for at give en lille tværgående felt (reduceret i størrelse i forhold til MT). Denne lille tværgående felt muliggør anvendelsen af drejningsmoment samt dens måling. (B) To strategier til at måle drejningsvinklen af en magnetisk perle om DNA-tether-aksen er vist. 1): en markør perle (green) er fastgjort til magnetiske perler (brun) giver et asymmetrisk billede, der gør det muligt vinkel sporing af forestille analyse. To CCD billeder af en 1,4-um-radius magnetisk perle med en 0,5-um-radius fiducial markør vises, i fokus, og out-of-fokus. 2): når DNA'et er bundet til magnetiske perler ved en stilling væk fra vulsten sydpol, midt i perlen svinger langs en bue, hvis centrum definerer en vinkelposition. Enten strategien kan bruges til at spore rotation vinkel og overvåge forskydninger i vinkel position som tøjret vridningsmæssigt er anstrengt (spor til højre), således at målinger af enkelt molekyle drejningsmoment.

Figur 2.. DNA kalibreringsmålinger i den konventionelle MT. (A) Rotation-udvidelse kurver for en 7,9 kb DNA taget ved F = 00,25, 0,5, og 2,0 PN. Asymmetriske reaktion under rotation til positive og negative omdrejninger af enkelt dobbeltstrengede DNA bindsler kan anvendes som en praktisk test af tøjret fastgørelse. (B) Force-udvidelse-kurve for et 7,9 kb DNA sammen med en tilpasning til ormen, ligesom kæde model (fuldt optrukket linie), hvilket giver en monteret kontur længde L _C = 2,71 m og bøjning vedholdenhed længde L _P = 45 nm. Alle målinger blev udført i PBS-buffer.

Figur 3.. Justering i FOMT. (A) (x, y) svingninger af DNA-bundne perle afholdt i FOMT som en funktion af magnet position. Positionen af den cylindriske magnet blev scannet ved en konstant højde på 3 mm på tværs af strømmen celleoverfladen i trin på 250 um x og (x, y)-fluktuationsmønster med magnet position ligner en cyklon eller vortex er tydelige. Denne "vortex" mønster kan anvendes til at styre forskydningen af ​​magneten (eller alternativt tøjret samtidig holde magneten fast) i x og y (indikeret ved de store pile) for at opnå tilpasning. Når grov opretning er fuldført, perlens (x, y)-udsving spore en cirkulær bane (blå spor i midten af plottet). Dette spor blev indspillet i et særskilt forsøg efter justere magneter i mindre skridt omkring centrum og er vist for illustration i dette plot. (B), (x, y)-udsving i et DNA-tøjret perle afholdt i than FOMT efter vellykket groft tilpasning af magneten (sort trace). Udsvingene ligge på en cirkulær annulus og termiske fluktuationer er tilstrækkelige til at udforske alle rotationer vinkler på cirklen. En monteret cirkel vises i rødt. (C) Et histogram, der svarer til dataene i (b), viser, at grove tilpasning ikke garanterer en ensartet dækning af alle mulige positioner langs den cirkulære annulus. Selvom termiske fluktuationer er tilstrækkelige til at udforske alle rotationer vinkel på cirklen, er der stadig en energi barriere (på i størrelsesordenen den termiske energi k _B T) til fri rotation.

Fig. 4. Måling af DNA vridningsstivhed hjælp FOMT. (X, y)-bane (a) og histogram (b) et DNA-Tethperle s udsving lagdelte efter fin justering af den relative magnet-tøjr position i FOMT. Under disse omstændigheder histogrammet afslører væsentlige ensartet dækning af positionerne på cirklen. (C) Roterende udsving i perlen bestemmes ud fra (x, y)-position. (D) Histogram af rotations udsving. Den røde linje er en Gauss pasform med _σ θ = 223 °. (E) Energimæssigt antydes af den roterende udsving tæthed fra (c) og (d). Forskellen mellem den energi landskab antydes af rotations udsving og en harmonisk tilnærmelse (med k _θ = k _B T / σ _θ ² = 0,27 pN-nm/rad) er meget mindre end den termiske energi k _B T over flere omgange. Data er forskudt for klarhed, således at θ ₀ = 0. Bredden afsvingningerne kan anvendes til at bestemme vridningsstivhed af DNA, jf. hovedteksten. Målingen blev udført i PBS-puffer ved en strækning kraft ~ 1 PN. Data er tilpasset fra Lipfert et al ^21.

Fig. 5. Den binding af RAD51 protein til DNA målt ved anvendelse FOMT. (A) Forsamlingen af RAD51 protein på en tøjret 7,9 kbp dsDNA overvåges på 3,5 PN. (X, y, z)-bane udføres af magnetiske perler (diameter 1,0 mm) i løbet af de første 200 sekunder af aggregatet er vist med tiden farvekodet fra blå til rød. (B) udvidelse af dsDNA udledes fra z-komponenten af perlen forløb i (a) som en funktion af tiden. (c) rotationsvinkel omkring dsDNA tether akse udledesfra x, y-komponenter af perlen forløb i (a) som en funktion af tiden.

Figur 6. Torque målinger på et enkelt DNA tøjr i MTT. (A) Skematisk viser Måleprincippet drejningsmoment. Efter over-(eller under-) vikling DNA tøjr af N vender DNA udøver en genoprettende drejningsmoment på perlen, der fører til et skift i ligevægt vinkelposition fra θ ₀ til θ _N. (B) Eksempel på angle sporingssteder at måle moment:. kantede udsving i en perle tøjret til en vridningsmæssigt afslappet 7,9 kbp DNA-molekylet før (blå) og efter at indføre 40 omgange (mørk rød) (cf) Moment måling på en 7,9 kbp DNA-molekyle i PBS-buffer holdes på et stopkastning kraft ~ 3 pN vha. referenceenergi markør perle baseret kantet sporing protokol. Kantede udsving som vist i (b), blev registreret som en funktion af antallet af anvendte omdrejninger. (C) standardafvigelsen for kantede udsving som funktion af anvendte sving. Bredden af udsvingene er omtrent konstant, hvilket indikerer konstant kantet fælde stivhed. (D) Skiftet i den gennemsnitlige rotation vinkel som funktion af anvendte sving. Systematiske forskydninger af den gennemsnitlige vinkel på over-og underwinding er tydelige. (E) samtidigt overvåges DNA tether udvidelse som en funktion af anvendt sving. (F) drejningsmoment, der udøves af DNA tøjr bestemt ud fra den gennemsnitlige vinkel vist i (d) , jf. hovedteksten. Over-og underwinding omkring nul vender giver anledning til en lineær drejningsmoment vs vender reaktion af DNA-tether (monteret grå skråninger ion (d) og (f)), der kan anvendes til at bestemme den effektive torsionsstivhed persistens længde (~ 77 nm for dette datasæt). Yderligere overwinding fører til foldning og dannelse af plectonemic supercoils (skematisk vist i mellemværker), hvilket svarer til et moment plateau (sort linie på positive drejninger i (f) på ~ 26 PN · nm) og et lineært fald i tøjret forlænger med nummer omgange (sorte hældning i (e)). Unwinding ud over den lineære regime forårsager DNA til lokalt at smelte (vist i mellemværker til venstre), præget af en moment plateau svarende til den smeltende drejningsmoment (sort linie på negative drejninger i (f) på ~ -11 pN · nm).

Discussion

Når du kører eksperimenter ved hjælp MTT eller FOMT, skal gøres med hensyn til perler, magneter, tracking protokoller, osv. De bedste valg, der skal foretages, vil afhænge af forsøget af interesse en række valg. Nedenfor beskriver vi de afvejninger, der ledsager forskellige valg, der skulle lette valg for et bestemt eksperiment. Dernæst beskriver vi flere kritiske trin, der ledsager tilpasningen og driften af ​​MTT og FOMT eksperimenter. Endelig diskuterer vi betydningen af ​​MTT og FOMT med hensyn til de eksisterende metoder samt fremtidige ansøgninger.

Overvejelser Forud for starten af MTT og FOMT Eksperimenter

Ethvert eksperiment kræver en til at vælge en form for magnetisk perle til brug. Man kan vælge mellem flere kommercielt tilgængelige streptavidin-coatede superparamagnetiske perler, f.eks, 0,25 mM radius perler, 0,5 mM radius perler, eller 1,4 mM radius perler (see Materials tabel). Større perler vil have en øget magnetisk moment i forhold til mindre perler (groft skalering som volumen), og dermed deres anvendelse vil lette anvendelsen af højere kræfter (for typiske kræfter opnået i vores instrumenter, se tabel 1). Når kantet tracking bruge markør perler ønskes, vi typisk arbejder med radius 1,4 m og bruge 0,5 mM radius umagnetisk biotinylerede perler som markør perler (se punkt 1.9 for den tilsvarende vedhæftede protokol). Brugen af mindre perler anbefales især til FOMT, som den karakteristiske tidshorisont for perle rotation τ _C er lig med forholdet mellem systemets træk over sin fjederkonstanten γ / k _θ; vigtigere, roterende vindmodstand relevant for kantede måletid skala skalaer som ~ R _perle ^3, dvs med tredje potens af radius (se tabel 2 forden karakteristiske tidsskalaer flere perle-DNA kombinationer i FOMT og MTT målinger). Ledsagende nedsættelser af den maksimale kraft, der kan anvendes, kan løses ved hjælp af en spejlvendt stak af cylindriske magneter ^27. Ikke desto mindre, i FOMT målinger kan det nogle gange være nødvendigt at gå på kompromis mellem det bedst opnåelige tidsmæssige opløsning og den maksimale anvendte kraft.

Derudover et eksperiment kræver udvælgelsen af ​​en magnet konfiguration. I den konventionelle magnetiske pincet konfiguration (figur 1a), bruger vi typisk et par af 5x5x5 mm kubiske magneter i lodret retning med en 0,5 eller 1 mm mellem magneterne ^4. Når magneterne er anbragt langs x (y-aksen), giver dette et magnetfelt, der er primært rettet langs x (y-aksen). For FOMT eksperimenter, er en cylinderformet magnet udvalgt hvis centrum magnetfeltet er primært rettetlangs z-aksen (figur 1b). I praksis anvender vi en stak af tre sådanne cylindrisk formede magneter, hver med en diameter på 6 mm, og et centralt hul 2 mm i diameter, til en samlet tykkelse på 6 mm. Når der ønskes højere trækkræfter, er en "vendt stakken" magnet konfiguration, i hvilken den nederste magnet er stablet med modsat magnetisering foretrækkes. For at opnå MTT konfiguration (figur 1c), vi tilføjer en yderligere magnet på siden af den primære magnet stakken af FOMT konfiguration, typisk en massiv cylinder med diameter på 4 mm og en højde på 7 mm. At se, hvordan den maksimale kræfter opnået i vores instrumenter afhænger af den magnet konfiguration, se tabel 1.

Tilpasningen af MTT og FOMT Eksperimenter

Da magnetiske perler har en (ca.) jævnt funktionaliserede overflade (typisk streptavidin), og siden fastgørelse af både den funktionaliserede nucleic syre bindsler og markør perler (i tilfælde af markør perle-baserede kantet sporing er ansat) sker via simpel inkubation i opløsning, man ikke styre, hvor linen og / eller markør perle tillægger magnetisk perle. De magnetiske perler har en foretrukken magnetisering akse, der har tendens til at bringe langs retningen af ​​det eksterne felt. Hvis vi betegne de punkter, hvor den foretrukne magnetisering skærer perlen overflade som nord og syd poler, så perler, hvor DNA-tether er knyttet tæt på ækvator vil spore en cirkulær annulus med en radius tæt på eller lidt større end perle radius i FOMT; I modsætning hertil vil perler, der er knyttet tæt på den sydlige pol svinge på en cirkulær annulus med meget lille radius i FOMT, der kan udelukke montering af cirklen ved hjælp af ligninger 3-5. Vi bemærker, at ved simpel sfærisk geometri, sandsynligheden for at knytte nær ækvator er meget større end en vedhæftet fil, præcis ved polerne; derfor, de fleste beads vil bindes således, at (x, y)-baserede kantet sporing kan udføres med succes.

Et lignende argument holder til fastgørelse af markør-perler til fiducielle markør baseret kantet sporing. Markøren perle bruges til at skabe en asymmetri i billedet af den magnetiske perle, der muliggør vinkel tracking. Hvis markøren perlen er fastgjort nøjagtigt på nord eller sydpolen af perlen (dvs. direkte på toppen eller i bunden), det resulterende billede er stadig rotationssymmetriske og kantede sporing protokol mislykkes. Men ved samme sfæriske geometri argument, chancen for en markør perle at vedhæfte direkte på en af ​​polerne er relativt lille; finder vi, at i praksis de fleste markør perler giver en tilstrækkelig asymmetri at aktivere kantet sporing. Endelig bemærker vi, at den retning felt i de konventionelle magnetiske pincet er i (x, y)-planen; derfor vil de foretrukne magnetiseringskurver akse perlen tilpasse i the (x, y)-planen og nord og syd poler, som defineret ovenfor, der kommer til at være på siderne af perlen usandsynligt situationen i FOMT eller MTT, hvor polerne er i top og bund.

I FOMT eksperimenter, et afgørende skridt er tilpasningen af ​​den cylindriske magnet, således at den radiale magnetfelt er ubetydelig i nærhed til perlen. Denne tilpasning udføres for en enkelt perle ad gangen. At bedømme, hvorvidt perle bevægelse i FOMT er jævnt fordelt over et cirkulært annulus, skal målingen tid overstige 20 · τ _C. Da τ _C lig ~ 45 sek 8 kbp DNA og et 0,5 mm radius perle, måling tid er ~ 900 sek i de sidste faser af tilpasning. Til sammenligning, anvendelse af 1,9 kbp-DNA og 0,25 mm radius perler reducerer τ _C tyve-fold til ~ 2 sek (se også tabel 2).

Kritiske trin og overvejelser til Tracking Under FOMT og MTT Eksperimenter

At spore perle in-plane udsving, dvs sin (x, y)-position, vi ansætter en krydskorrelationsfunktion analyse af intensitetsprofiler vises af en perle ved efterfølgende tidsintervaller ^{35, 36.} Dette kan udføres ved sub-pixel opløsning med en nøjagtighed på nogle få nanometer ^20. At spore perlens bevægelse i z, bruger vi typisk en metode først designet af Gosse og Croquette, hvor målet er brændplanet (OFP) nøjagtigt forskydes i lodret retning, mens billeddannelse af diffraktion ringe af vulsten fastgjort til nukleinsyre ²⁰ . På denne måde, er en kalibrering profil frembragt korrelere diffraktionsmønstret af perlen til afstanden mellem perlen og OFP ^19.. Når denne kalbreringsprofil interpoleres, kan de lodrette forskydninger af perlen også målt med en nøjagtighed på op til et par nm ^20.Vi henviser læseren til yderligere referencer, der beskriver mere raffinerede sporingsalgoritmerne ^{37, 38} samt deres ansøgning til parallel sporing af flere perler ^{5, 6, 37.}

Når du bruger kantet sporing, der bygger på omdannelsen af (x, y)-positionerne i kantede koordinater, vi anbefaler at gå frem som følger. Fra en tid, spor, hvor perlen spor ud af en cirkulær annulus bruge (x _i, y _i) positioner (hvor indekset i betegner efterfølgende målepunkter) for at passe cirklens centrum (x _0, y ₀₎ og radius R _cirkel (figur 2a) ved at minimere:

(3)

hvor summen løber over alle datapunkter. Efter Fitting x _0, y _0, og R _cirkel, fastlægge de polære koordinater (r _i, θ _i), i hvert datapunkt i den tid spor ved hjælp af:

(4)

(5)

Bemærk, at man skal sørge for at "pakke" vinklen θ, dvs at tilføje fase spring af ± π eventuelt. Brugerdefineret skrevet kode for montering og konvertering fra (x, y) til (r, θ) koordinater er tilgængelig fra forfatterne efter anmodning. I FOMT kan en tid spor, hvor perlen spor ud af en cirkulær annulus opnås ved at opnå grov justering (jf. trin 3.3) og registrering af termiske fluktuationer af perlen. I MTT termiske svingningertioner er utilstrækkelige til at spore den cirkulære annulus; i stedet bruge en tid spor, hvor magneterne er langsomt (typisk ved 0,1 Hz) drejes af flere omgange for at passe til cirkel ved hjælp af ligninger 3-5.

Vi bemærker, at for MTT, er det vigtigt at vælge den rette kantede sporing fremgangsmåde, dvs via en kantet sporing markør (Figur 1c, figur 1d, figur 3a) eller via omdannelse af (x, y)-positionerne i kantede koordinater ( Figur 1d, figur 2b). Mens typisk nøjagtighed vinkelpositionen sporing fra (x, y)-position og anvendelse af markørvacciner perler er sammenlignelige, er det vigtigt at indse, at krydstale opstår mellem en perle er udsving i (x, y) og i vinkel, som beskrevet i Janssen et al ^32: således, kantet sporing fra (x, y)-positionerne er kun gyldige, forudsat at de Brownske udsving i (x, Y) kun bidrager ubetydeligt til usikkerheden i den kantede koordinere og dets rette brug af (x, kan y)-sporing kræver tuning af roterende fælde stivhed via justering af positionen af siden magnet. Typisk anvendelse af højere fælde stivhed kræver brug af kantede tracking bruge markør perler. Anvendelsen af ​​markørgener perler kræver et yderligere trin vedhæftet fil, hvilket kan reducere antallet af brugbare tøjr (se vedhæftede protokol i trin 1.9). Ved brug af markør perle-baseret sporing, er det vigtigt at vælge magnetiske perler, der har en markør perle er fastgjort nær ækvator for de bedste resultater.

Betydningen af den FOMT og MTT Approaches Sammenlignet med eksisterende metoder og applikationer

I det ovenstående har vi vist, hvordan man kan, startende fra konventionel MT, nemt ændre magnet konfigurationer til at konvertere instrumentet til MTT eller FOMT. Denne enkle mNDRING, som kan være ledsaget af indførelsen af ​​kantede sporing når der ønskes brug af en kantet sporing markør, er en øjeblikkelig stærkt punkt i begge konfigurationer, da det tillader brugeren at anvende moment, måle moment, eller måle twist, afhængigt af eksperimentere ved hånden. Som nævnt i indledningen, både FOMT og MTT gavn af mange af de eksisterende styrker af MT, navnlig deres enkelhed, med MTT i særdeleshed også nyder godt af den evne parallelle målinger ^{5, 6} (disse er ikke så nemt at opnå i FOMT givet kravet om tilpasning af tøjret i forhold til midten af ​​den cylindriske magnet). Især gør MTT og FOMT ikke kræver, i modsætning til andre teknikker, komplekse optiske design ⁴¹ specielt nano-fabrikerede partikler ^{22, 39, 40,} eller indførelse af yderligere perler inden for den tøjret (DNA) molekyle ^42.. Sådanne other teknikker kan ikke desto mindre give andre fordele såsom højere tidsmæssig opløsning ^{27, 43, 44.} Både FOMT og MTT skulle finde fremtidige ansøgninger i studiet af genomet behandling, da adfærd molekylære motorer på DNA er både påvirket af og har konsekvenser for den lokale twist og drejningsmoment. Yderligere programmer kan findes i de nye inden for DNA-nanoteknologi ²⁷ eller i den bredere roterende motorer er aktive i biologisk behandling ^{7, 45.}

	M270 (R perle = 1,4 um)	MyOne (R perle = 0,5 um)	Ademtech (R perle = 0,25 um)
Konventionel MT (par kubik 5 x 5 x 5 mm 3 magneter, 1 mm hul, lodret justering)	70 PN	8 PN	1.6 PN
FOMT eller MTT * (stak af tre cylindriske magneter, diameter 6 mm, 2 mm hul diameter)	9 PN	1 pn	0,2 PN
FOMT eller MTT * (stak af tre cylindriske magneter, diameter 6 mm, 1 mm hul diameter)	18 PN	2 PN	0,4 PN
FOMT eller MTT * (stak af tre cylindriske magneter med sidste vendt, 1 mm hul diameter)	~ 50 PN	9 PN	1.8 PN

* Tilstedeværelsen af ​​den lille side magnet i MTT har en ubetydelig indvirkning på den strækning kraft

Tabel 1. Maksimale kræfter typisk opnået for forskellige magnet konfigurationer og perle typer.

	R perle = 1,4 um	R perle = 0,5 um	R perle =0,25 um
Friktionskoefficient *	120 PN · nm · sek	5.5 PN · nm · sek	0.7 PN · nm · sek
Karakteristisk tidsskala: FOMT, 10 kbp DNA **	1200 sek	55 sec	7 sek
Karakteristisk tidsskala: FOMT, 1 kbp DNA	120 sek	5,5 sek	0,7 sek
Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 100 PN · nm / rad	1,2 sek	0,06 sek	0,007 sek
Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 1000 PN · nm / rad	0,12 sek	0,006 sek = 6 msek	0,0007 s = 0,7 msek

^* Friktionskoefficient til rotation omkring en akse gennem "ækvator" (dvs. situationen vist i figur 1b), Givet ved 14 · p · h · R _vulst ^3, hvor h er viskositeten af bufferen.
^** I FOMT er den roterende fælde stivhed givet ved vridningsstivhed af DNA, k _{q, DNA} = C · k _B T / L _C, hvor C er den effektive torsionsstivhed vedholdenhed længde, antages at være 80 nm her ( som er karakteristisk for en mellemliggende kraft regime, F ~ 1 PN) og L _C er konturen længde af DNA, 0,34 nm pr basepar.

Tabel 2.. Friktion koefficienter og karakteristisk tidsplaner for FOMT og MTT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sandblaster	Great Lake Orthodontics	190-070 Microetcher II
Nitrocellulose	Life Technologies	LC2001
Magnetic particle concentrator	Life Technologies	12002D
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius)	Polysciences	17010
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius)	Sanbio	PV05N/2179
Antidigoxigenin	Roche	11 214 667 001
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius)	Ademtech	3150
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”)	Life Technologies	650.01
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”)	Life Technologies	653.05
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius)	Life Technologies	F-8768
Cubic magnets for conventional tweezers	Supermagnete	W-05-N50-G
Cylindrical magnet for MTT and FOMT	Supermagnete	R-06-02-02G
Side magnet for MTT	Supermagnete	S-04-07-N
Linear stage	Physik Instrumente	M-126.PD
Rotary stage	Physik Instrumente	C-150
High-resolution automated sample stage	Physik Instrumente	P-733.2D
Software for coding analysis routines	The Mathworks	MATLAB	custom-written routines are available from the authors