Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Magnetiske pinsett for måling av Twist og dreiemoment

Published: May 19, 2014 doi: 10.3791/51503
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

Summary

Magnetiske pinsett, en kraftig single-molekyl manipulasjon teknikken, kan tilpasses for de direkte målinger av twist (ved hjelp av en konfigurasjon kalles fritt-bane rundt magnetiske pinsett) og dreiemoment (ved hjelp av en konfigurasjon kalles magnetisk moment pinsett) i biologiske makromolekyler. Retningslinjer for å utføre slike målinger er gitt, inklusive anvendelser for analyse av DNA og tilhørende nucleo-proteinfilamenter.

Abstract

Single-molekyl teknikker gjør det mulig å undersøke oppførselen av individuelle biologiske molekyler i løsningen i sann tid. Disse teknikkene omfatter såkalte kraft spektroskopi tilnærminger som atomic force mikroskopi, optiske pinsetter, flyte stretching, og magnetiske pinsett. Blant disse metodene, har magnetiske pinsett utmerker seg ved sin evne til å påføre dreiemoment og samtidig opprettholde en konstant strekkraft. Her er det vist hvordan en slik "vanlig" magnetiske pinsett eksperimentelle konfigurasjonen kan, via en enkel endring av dens feltkonfigurasjon for å minimere størrelsen av den tverrgående felt, være innrettet til å måle graden av vridning i et biologisk molekyl. Den resulterende konfigurasjonen kalles de fritt-bane rundt magnetiske pinsett. I tillegg er det vist hvordan ytterligere modifikasjon av feltet konfigurasjon kan gi en tverrgående felt med en størrelse mellom den i av-#8220; konvensjonelle "magnetiske pinsetter og de fritt-bane rundt magnetiske pinsett, som gjør det mulig å direkte måle dreiemomentet som er lagret i et biologisk molekyl. Denne konfigurasjonen kalles den magnetiske moment pinsett. Den tilhørende video beskriver i detalj hvordan omdannelsen av konvensjonelle magnetiske pinsett til fritt-bane rundt magnetiske pinsetter og magnetisk moment pinsett kan gjennomføres, og viser bruken av disse teknikkene. Disse tilpasningene vedlikeholde alle de sterke sidene ved konvensjonelle magnetiske pinsett mens sterkt voksende allsidigheten til denne kraftige instrument.

Introduction

I de senere årene, har single-molekyl teknikker bevist sin brede anvendelighet i studiet av processive motor proteiner og andre enzymer, gir innsikt i deres kinetikk og den underliggende mechanochemistry. I sammenheng med kraft spektroskopi, har viktige bidrag blitt gjort av atomic force mikros flyt stretching, og optiske og magnetiske pinsett. Optiske og magnetiske pinsett (MT) har spesielt lyktes i å kombinere stor fleksibilitet i forhold til molekylær manipulasjon med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Her fokuserer vi på MT, som kan gjelde både strekker krefter og momenter til biologiske molekyler tjoret mellom en flate og superparamagnetiske perler 1-3.

Magnetiske pinsett (MT, figur 1a) er et meget allsidig én-molekyl teknikk som har blitt brukt for å overvåke både de mekaniske egenskaper av nukleinsyrer, så vel som deres interaksjon med proteiner. MT har mange styrkes, inkludert generelle enkelhet og robusthet av den eksperimentelle implementering, lettvinte bruk av dreiemoment, naturlig drift og grei kalibrering i konstant kraft modus 4, utvidelse til parallelle målinger 5, 6, og fravær av prøven oppvarming og photodamage. Sammenlignet med andre single-molekyl tilnærminger, MT gi en måte å utføre makt-avhengighets målinger på kreftene så lavt som ≈ 10 fN og har evnen til å oversiktlig kontrollere graden av supercoiling. Mens MTS har hovedsakelig blitt brukt som et eksperimentelt verktøy for å undersøke biologiske prosesser som omfatter nukleinsyrer 7, 8, har de også funnet anvendelse i studier av de mekaniske egenskapene til proteinene 9-13 eller celler 10, 14-17. Mange nyttige referanser er tilgjengelig som beskriver hvordan bygge og drive en MT 4, 18-20.

Howeveh, trenger konvensjonell MT ikke spore roterende bevegelse direkte, og, mens de gjelder dreiemoment, har de ikke måle dreiemoment direkte. I tillegg begrenser de den frie rotasjon av nukleinsyre tether. Her presenterer vi to utvidelser av magnet pinsett. Den første, kalt fritt-bane rundt magnetiske pinsett (FOMT, Figur 1b) 21, gjør at målinger av likevektsvinkel svingninger og endringer i twist av tethered nukleinsyremolekyler, uten å begrense den roterende bevegelse rundt tjore aksen. Den andre, kalt magnetiske moment pinsett (MTT, figur 1c), som har evnen til å søke og direkte måle både krefter og momenter til enkelt biomolekyler 22-27.

I den følgende protokoll, antar vi at leseren har på hans / hennes disposisjon en "konvensjonelle" MT instrument. Vi henviser leseren til diskusjon etter referanser på hvordan å bygge og drive en MT satt opp, samt betyderasjoner som må tas hensyn til ved valg av magnetiske kuler, magneter, og sporing av rutiner. I tillegg, avsnitt 1 og 2 i protokollen tekst beskriver hvordan vi vanligvis forberede og inkuber en DNA-prøve til bruk i MT, så vel som de foreløpige målinger som kan utføres på en enkelt DNA på konvensjonell MT. § § 3 og 4 i protokollen Tekst illustrere hvordan en MT instrument kan lett tilpasses og brukes for FOMT og MTT målinger.

Protocol

En. Utarbeidelse og Inkubasjon av en DNA-prøve

  1. Forbered DNA-konstruksjoner som bindes sammen til duplex ender (bruker vanligvis ≈ 600 bp DNA PCR fragmenter) som er funksjon med flere biotin og Digoxigenin grupper, henholdsvis 18. For å starte, en DNA tjore lengde> 1 mikrometer, for eksempel en 7,9 kbp tilsvarer en strukket lengde på ~ 2,7 mikrometer som er ansatt her, anbefales for brukervennlighet; Særlig ved bruk av en DNA-lengde som er lik eller kortere enn vulsten radius er problematisk på grunn av geometrien utstyret i MTT og FOMT. Se diskusjon for en beskrivelse av hvordan DNA lengden påvirker time respons i vinkel domenet.
  2. Monter flyt celler for single-molekyl eksperimenter. For flyt celler, bruke to glass mikroskop Dekk atskilt med en tolags Parafilm spacer. Den øverste mikroskop dekk skal ha to hull for fluidinntak og-uttak til celle. Det er praktisk åbruke en sandblaster å bore hullene. Den nederste dekkglass er belagt med nitrocellulose (0,1% vekt / volum i amyl-acetat). Plasser Parafilm avstandsstykker på nitrocellulose-belagt side av bunn lysbilder og lukker toppen med rene topp lysbilder.
  3. Tett flyt celler. Ved hjelp av fysiske pinsett, plasserer den sammensatte flyt celle i et varmeplaten satt til 80-100 ° C for ~ 1 min. Vær oppmerksom på at strømningscellen er godt isolert, at Parafilm ikke lukker hullene som kobler seg til inn-og utløp, og at glassplater er godt justert.
    Merk: For å sikre en god tetning, anbefales det å stryke ut bobler i Parafilm ved hjelp av en stor bomullsdott. Strømningscellen kan deretter monteres på det magnetiske pinsett instrument.
  4. Forbered buffere. Forbered TE-deling buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), og 200 mM NaCl). Alternativt kan man bruke PBS-buffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM fosfatbuffer, pH 7,4) supplert wed 100 pg / ml BSA, 0,1% Tween, og 5 mM natriumazid (PBS +) i tilknytning buffer. Skyll 2-3 celle volumer TE tethering buffer i strømningscellen.
  5. Inkuber 0,5 eller 1,5 mikrometer radius umagnetiske latekskuler i strømningscellen for ~ 30 min. Disse perlene vil fungere som referanse perler i løpet av magnetiske pinsett målinger som tillater en å minimere effekten av drift mellom objektiv og prøveholderen (dvs. strømningscellen). Skylle ut fristilt ikke-magnetiske kuler ved å skylle med 2-3 celle volumer av TE tethering buffer.
  6. Functionalize bunnflaten av strømningscellen ved inkubasjon med 100 ug / ml anti-Digoxigenin i PBS i minst 1 time (fortrinnsvis lenger, inkubering kan utføres natten over), for å gi for DNA-vedlegg. Skyll med 2-3 celle volumer av TE tethering buffer. Endelig inkuber strømningscelle med 2 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) i TE-deling buffer i 30 min for overflatepassivering.
  7. Ta en porsjon av2 ml streptavidin-belagt superparamagnetiske MyOne perler (se Diskusjon og Table of Materials) og fortynnes med 10 ml TE tethering buffer. Vask to ganger med 10 ml TE tethering buffer ved hjelp av en magnetisk partikkel konsentrator, og resuspender i 10 ml TE tethering buffer. Fest ~ 1 ml av DNA-molekyler (omtrent 1 ng) til disse perler ved inkubasjon i TE-deling buffer i 30 min.
  8. Fortynn løsningen av DNA-bundet superparamagnetiske kuler ti ganger ved å tilsette 90 ml TE buffer-deling. Endelig injisere oppløsningen i strømningscellen, og inkuber i ~ 1 time for å tillate DNA-vedlegg til anti-Digoxigenin-belagte overflate. Vask strømningscellen grundig med TE tethering buffer. Etter inkubering av DNA-tether konstruksjoner, skylle i stor utstrekning med forsøksbuffer (dette kan være TE-deling buffer) for å fjerne alle ikke-tilkoblede perler.
  9. For målinger som ansetter en vinkel sporing protokoll som krever fiducial markør perler festet til magnetiske kuler

2. Målinger på en enkelt DNA molekyl i Konvensjonelle Magnetic pinsett

  1. Ved hjelp av en konvensjonell MT (se Diskusjon) med passende feltkonfigurasjon (figur 1a), og både translatorisk og rotasjonskontroll av magneten stilling, søke etter rotasjonsmessig begrenset DNA-molekyler i strømningscellen. Ved å trekke krefter ≥ 1 pN (se referansene 4, 19, 20, 28, 29 med hensyn kraft kalibrering i magnetiske pinsett), kan binding av perler lett skilles fra perlene fast til overflaten av den nedre glide ved deres forskjellige høyder i fokuserings . Hvorvidt et DNA-molekyl er rotasjonsmessig begrenset kan vurderes ved å innføre 20-30 omdreinings av magnetene på en kraft på ≈ 0,25 PN: her bør tjore lengden reduseres med 0,4-0,5 mikrometer.
    Merk: For å kjøre magnetiske pinsett eksperimenter, blir bildebehandlingen anvendes for å bestemme x-, y-og z-posisjonen av DNA-bundet perler. Custom LabVIEW programvare for dette formål er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel.
    1. Kontroller at vulsten blir festet ved hjelp av et enkelt DNA tether. Dette kan gjøres ved å sammenligne adferden ved positive og negative svinger i kreftene> 1 pN (figur 2a). I denne kraft regime, vil tilstedeværelsen av flere DNA-stagene gi opphav til en tilnærmet symmetrisk reduksjon i forlengelsen ved innføring av positive og negative svinger, mens én DNA stagene vil gi opphav til en asymmetrisk respons.
  2. Søk etter passende faste perler fast til bunnflaten i nærheten av fortøyningen av interesse som kan tjene som referanse perler.
  3. Kalibrer lengden av tHan DNA, l. Posisjonen til Flowcell overflaten kan bestemmes ved å bringe bundet vulsten er i kontakt med overflaten (for eksempel ved å dreie magneten ved ~ 60 omdreininger ved en kraft under 0,2 pN). Målinger av den forankrede vulsten sin vertikale stilling med hensyn til denne overflaten, og rapportere om absoluttverdien av l.
    Merk: For å minimalisere videre virkning av drift, er det anbefalt å utføre målinger av l i forhold til posisjonen for en referanse limstreng som er festet til overflaten.
  4. Ta opp en rotasjonskurven (dvs. en måling av DNA-forlengelsen som funksjon av det antall omdreininger) ved en strekkraft av ≈ 0,25 pN (figur 2a).
    1. Bestem antall omdreininger på som utvidelsen er maksimal, da dette tilsvarer staten hvor DNA-molekylet er vridnings avslappet. For å gjøre dette, er det nyttig å passe rotasjonskurve lokalt med en parabolsk eller en Gaussian funksjonen til å bestemme sentrum posipå. Definer dette punktet som "null omdreininger".
      Merk: En spesial skriftlig rutine for dette formålet er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel.
  5. For en serie av ~ 20 magnet stillinger, bestemme den gjennomsnittlige forlengelse av vridnings-avslappet molekyl (dvs. "null omdreininger", se trinn 2.4.1) fra z-spor.
  6. For hvert målepunkt i trinn 2.5, nøyaktig å bestemme strekkraften fra svingningene i x-eller y-stilling 20, 28, 29, eller, forutsatt at magnetiseringen av vulsten er kjent, ved hjelp av kjennskap til den lokale feltgradient 4.. Plotting av den strekkraft i forhold til den gjennomsnittlige forlengelse resulterer i en forlengelseskraft-kurven (figur 2b).
    1. Monter de resulterende skjøte kraft-data til orm-lignende kjede ligning ved hjelp av polynomet tilnærming av Bouchiat et al 30.
    Hvis forbereder for senere FOMT målinger, sakte rotere magnetene ved opptak av en magnetisk perle ekskursjoner i (x, y).
    Merk: Jo mindre radius av den resulterende ringformede rom i den konvensjonelle MT konfigurasjon, nærmere DNA-molekyl er bundet nærmere "sydpol" av magnetiske kuler. Når man går over til den FOMT konfigurasjon, vil et slikt DNA-molekyl blir bundet tett til "ekvator" av magnetiske kuler, noe som gjør det mulig pålitelig sporing av dreievinkelen fra (x, y)-stilling (se diskusjon).

Tre. Målinger av DNA Twist Bruke Fritt-bane rundt Magnetic pinsett

  1. Manuelt erstatte de firkantede magneter av den konvensjonelle magnetiske pinsett av en sylindrisk magnet som brukes for FOMT (Figur 1b). Denne operasjon bør utføres på en slik måte at den valgte DNA tether forblir innenfor synsfeltet. Dette kan oppnås på mindre enn 1 min ved ganske enkelt å skru ut den komplette magnet hode som holder magnetene for den konvensjonelle konfigurasjon pinsett og erstatte den med et magnethode som har en sylindrisk magnet for FOMT.
  • Den utflukter i (x, y) av en på magnetiske kuler bundet av en enkelt dsDNA tether avhenger sterkt av stillingen av fortøyningen i forhold til aksen av den sylindriske magnet (figur 1b, figur 3a). Registrer de (x, y) utflukter for å fastslå den tilsvarende plassering i den karakteristiske svingning mønster (Figur 3a, Diskusjon).
  • Utføre grov justering av magneten i FOMT. Dette kan oppnås ved å bevege den sylindriske magnet over strømningscelle ved hjelp av (x, y) oversettings stadier. Hvis de (x, y) utflukter følger en bue, er den sylindriske magnet ikke riktig justert og må flyttesi den riktige retning (figur 3b).
    1. Grov innretting kan oppnås i løpet av 15 min for tilfelle av MyOne perler med 7,9 kbp stagene, og er fullført når målingen av de (x, y) utflukter resulterer i observasjon av sirkelbevegelse (figur 3b, i midten).
      Merk: Grov innretting er typisk tilstrekkelig til å observere endringene i twist foranlediget av proteinbinding til enkelt DNA'er tjoret i FOMT konfigurasjonen 21, 31 (Representative resultater, figur 5), til tross for den tilhørende to-dimensjonale histogram kan ikke ha sine teller absolutt jevnt fordelt langs sirkelringrommet (figur 3c).
  • Ved behov for ytterligere forsøk, utføre fine justering i FOMT. Dette kan oppnås ved hjelp av høyoppløselige mikrometer skruer eller en høyoppløselig automatisert scenen for å enten flytte magnet eller strømningscellen til øreeh den sylindriske magneten på vulsten til innenfor ~ 10 mikrometer. I den fine justeringstrinn, blir magneten omhyggelig posisjonert slik at svingningene i kretsen ringrommet er nesten ensartet, hvilket tilsvarer en situasjon hvor energibarrieren for å full rotasjon på grunn av at magneten er k B T (Figur 4).
    Merk: En MATLAB skript for plotting svingningene i et histogram eller termo som i figur 4 er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel.
    Merk: Fine tilpasning kan utføres innen 45 min for tilfelle av MyOne perler med 7,9 KBP platformer, og i redusert tidsrammer for mindre perler og kortere stagene er ansatt (se diskusjon).
    Merk: Fine justering er vanligvis nødvendig for å utføre målinger av vridningsstivhet av nakne eller protein-belagt DNA (Representative Resultater, figur 4).
  • Ved behov for analyse, kalibrere kraft i FOMT. Dette kan gjennomføres ina analog måte med MT, enten ved hjelp av vulsten største radiale svingninger <r 2> (hvor de vinklede brak betegne tiden gjennomsnitt) som vist i den medfølgende video og detaljert i Lipfert et al 21, eller, forutsatt at magnetiseringen av vulsten er godt kjent, ved hjelp av kjennskap til den lokale feltgradient 21..

    • 4. Målinger av DNA Torque Bruke Magnetic Torque Pinsett

    1. Manuelt å erstatte den sylindriske magnet som anvendes for FOMT av en sylindrisk magnet pluss en side (permanent) magnet for MTT (figur 1c). Denne operasjon bør utføres på en slik måte at den valgte DNA tether forblir innenfor synsfeltet.
      1. Den enkleste måten å oppnå dette på er å legge side magnet på sin riktige sted, noe som kan oppnås i løpet av 1 min manuelt. Ingen videre omstilling er nødvendig.
        Merk: Et alternativ til en side magnet er brukenav elektromagneter 32.
    2. Hvis det er nødvendig for analysen, kalibrere kraft på en måte som er analog med MT, enten ved hjelp av vulsten er x eller y-svingninger eller, forutsatt at magnetiseringen av vulsten er kjent, ved hjelp av kjennskap til den lokale feltgradient 21..
    3. Spor vinkelvariasjoner som en funksjon av tiden θ (t) ved hjelp av enten fast avlesnings-basert sporings protokoll 23 eller, som vist i den medfølgende video, vinkelsporingsprotokoll basert på overvåking av (x, y)-stilling (se diskusjon). I det første tilfelle, opp helbilder av vulsten som en funksjon av tid for etterfølgende bildebehandling. I det sistnevnte tilfelle er det tilstrekkelig å ta opp vulsten er (x, y) svingninger ved dette trinnet.
      Merk: En MATLAB script for bestemmelse θ (t) fra helbilder av vulsten som en funksjon av tid i avlesnings-basert sporings protokoll er etTilg fra forfatterne på forespørsel.
      1. Som beskrevet i diskusjonen, for den kantete sporing protokoll basert på oppfølging av (x, y)-posisjon er det også lurt å ta en tid spor der magnetene er sakte (typisk på 0,1 Hz) roteres ved flere svinger. Dette vil tillate en å nøyaktig konvertere kartesiske koordinater (x, y) inn i polarkoordinater (r, θ) ved hjelp av ligninger 3-5 av diskusjonen.
        Merk: En MATLAB skript for kantete sporingsskriptet basert på overvåking av (x, y)-posisjon er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel.
        Merk: Målingen tid avhenger for det meste på moment oppløsning ønsket. En detaljert argument er gitt i Lipfert et al 24. For MyOne perler og 8 KBP DNA stagene, måling for 30-100 sek bør være tilstrekkelig til å gi et dreiemoment oppløsning i størrelsesorden ~ 1 PN · nm.
    4. Bestem stivhet av den vridnings felle fra the variansen av de kantede svingninger (σ θ 2, i radianer) bruker:
      k θ = k B T / σ θ 2 (1)
      Merk: Typiske rotasjons felle stiffnesses oppnådd i MTT er i størrelsesorden 10-1,000 PN · nm / rad, lavere enn for konvensjonelle magnetiske pinsett.
    5. I tillegg registrerer z-posisjonen av vulsten og bruke dette til å bestemme tjoringen lengde l (se også trinn 2.4 til 2.7).
    6. Roter N snur og igjen ta opp θ (t) og l (t).
      Merk: Den reduserte rotasjons felle stivhet av MTT forhold til MT gjør den egnet for målinger av enkelt molekyl dreiemoment, men innebærer at det maksimale dreiemoment som kan utøves reduseres. Dette innebærer at MTT ikke kan være i stand til å motvirke høye dra momenter forårsaket av rask rotasjon. Det må derfor tas for ikke å overskride den maksimale hastigheten; typically rotere ved hastigheter nær 0,1 Hz.
    7. Bestem dreiemoment akkumulert i nukleinsyre tjore etter N slår til med:
      Γ = - k θ <θ N - θ 0> (2)
      Hvor <...> betegner den gjennomsnittlige og θ 0 og θ N er vinkelen ved null omdreininger (svarende til en vridnings avslappet tether, jfr. Steg 2.3 og N viser, henholdsvis.
    8. Gjenta trinn 4,5 og 4,6 som nødvendig for å fullt ut bestemme et molekyl dreiemoment respons på en enkelt måling run (Representant Resultater, figur 6).

    Representative Results

    Representative resultater fra MT (fig. 1a) er vist i figur 2.. Figur 2a viser skjøte-rotasjon kurver for et 7,9 kb DNA-tatt ved K = 0,25, 0,5, og 2,0 pN. Responsen av en enkelt DNA til rotasjon skal symmetrisk til de laveste krefter (0,25 pn), med forlengelse av DNA-ned som følge av dannelsen av positive eller negative plectonemic supercoils. Kvalitativ kunnskap om dette svaret er nyttig når utgangspunktet søker etter en rotasjons begrenset DNA tjore (trinn 2.1). Legg merke til at ytterligere inspeksjon av fortøyningen er nødvendig for å verifisere at det består av et enkelt DNA-molekyl: her, asymmetrisk respons på en enkelt DNA til rotasjon ved krefter som overstiger 0,5 pN bidrar til å skille det fra flere DNA-molekyler (trinn 2.1.1). Når dette har blitt bekreftet, en vender tilbake til den rotasjons respons på 0,25 pN for å bestemme det nøyaktige antall magnet svinger ved hvilken enkelt DNA ir vridnings avslappet, der man tar en forlengelseskraft-kurven som skal ligne Fig. 2 b. For denne målingen, et anfall av data til orm-lignende kjedemodell (heltrukket linje) ga en montert kontur lengde L C = 2,71 mikrometer og bøying utholdenhet lengde L P = 45 nm. For dsDNA bør montert verdier av utholdenhet lengde ligge i området 40-55 nm, avhengig av bufferbetingelser 33, og montert kontur lengde bør være nær (vanligvis innen 10%) til verdien forventet for DNA-konstruksjon som er brukt i målingene, ved hjelp av forholdet L DNA = 0,34 nm / bp · antall basepar.

    Figur 3 viser fremgangsmåten og resultatene av innretting i FOMT (Figur 1b). De innledende (x, y) utflukter registrert i trinn 3.2 kan sammenlignes med den generelle syn på svingninger som funksjon of den tverrgående magnet stilling som er vist i figur 3a, som viser en "vortex"-mønster som kan anvendes for å lede følgende relativ forskyvning mellom magneten og DNA-tjoret vulsten holdes i FOMT. Ved etterfølgende grov innretting er fullført, vulsten er (x, y)-svingninger spore ut en sirkulær bane, som også er vist i den svarte spor i figur 3b. På dette punktet, er dreiemomentet fra magnetene om z-aksen reduseres til det punkt at termiske svingninger være tilstrekkelig til å rotere vulsten rundt sitt festepunkt. Radien R krets av den resulterende sirkulære ringrommet (montert sirkel er vist i rødt) representerer den radiale avstand mellom den DNA festepunkt og vulsten sentrum (Figur 1b). Som vist på figur 3c, er imidlertid et histogram av dataene i Figur 3b viser at grov innretting ikke garanterer jevn dekningav alle mulige posisjoner langs den sirkulære ringrommet. Selv om det termiske svingninger er tilstrekkelig til å utforske alle rotasjoner vinkel på sirkelen, gjenstår en liten energibarriere (i størrelsesorden av den termiske energien k B T) til fri rotasjon.

    Når finere justering er utført i FOMT (trinn 3.4), kan apparatet benyttes for å bestemme vridnings modulus of DNA (figur 4). Først blir fin justering av prøven brukes for å oppnå sirkulær bevegelse (Fig. 4a), hvis to-dimensjonal histogram skal nå vise et jevnt belegg (figur 4b). Den tilsvarende tid spor q (t) av vinkel-svingninger (oppnådd fra omdannelse av (x, y)-posisjoner, se nedenfor) viser ingen periodisitet som tilsvarer 360 ˚ (fig. 4c), og avslører store turer svarende til flere fullstendige omdreininger (figur 4d). Den implisitte energi landskapeter harmonisk over et område av> 1,000 ˚ (fig. 4e). Standardavviket til svingningene er σ θ = 223 °, som tilsvarer en vinkel felle stivhet k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 PN · nm / rad, noe som i sin tur gir et estimat av den effektive vridnings utholdenhet lengde DNA lik C = L C / σ θ 2 ~ 76 nm (L C = 1150 nm for den 3,4 kbp DNA som brukes i denne måling) ved den målte kraft.

    Et eksempel på hvordan FOMT kan brukes til å måle endringen i vridning indusert inn i det forankrede DNA-molekylet gjennom binding av proteiner 31, 34 er vist i figur 5.. Her har vi overvåket bindingen av RAD51 protein for å dobleDNA; RAD51 er kjent for å både forlenge og slappe av DNA som den danner en nucleoprotein filament 31. Ved spyling RAD51 inn i strømningscellen, ser vi at vulsten undergår en spiralbane i FOMT (figur 5a). Ved å konvertere spor av (x, y) bevegelse som en funksjon av tid til q (t) som beskrevet ovenfor, kan vi co-plot av effekten som RAD51 har på DNA tether lengde og dens grad av avkobling (figur 5b, c) .

    En alternativ tilnærming for å måle torsjons-egenskapene til DNA er MTT (figur 1c, Fig. 6). Den skjematisk på figur 6a viser prinsippet for måling: Når overwinding (eller underwinding) DNA tjoringen av N svinger, DNA utøver en gjenopprettende moment på vulsten som fører til en forskyvning i likevekten vinkelposisjon θ 0 til θ N. I MTT den tverrgående komponenten av magnetfeltet blir redusert i forhold til tråden, noe som letter måling av slike vinkel-forskyvninger men allikevel tillate kuler rotasjon (figur 1). Størrelsen av den vinkel-forskyvning målt etter påføring av N = 45 blir til et 7.9 kbp DNA er vist i figur 6b. Den komplette sekvens av det MTT målingsprotokoll og den resulterende utfall av en dreiemomentkurve versus rotasjon for DNA er vist i figur 6c-f. Her blir målinger av standardavviket (figur 6c), og gjennomsnittlig (fig. 6d) av vinkel koordinaten er vist som en funksjon av over-og underwinding, med standardavviket blir omvendt proporsjonal med vinkel felle stivhet (Ligning 1). Samlet utgjør disse mengdene tillater en å konstruere et dreiemoment versus rotasjonskurve for DNA (figur 6f), som skal vise en lineær respons regionen sentrert om 0 slår ennd to platåer ved hvilken moment mettet, til positive og negative rotasjoner, henholdsvis. En slik dreiemoment versus rotasjonskurve utfyller informasjonen i en forlengelse versus rotasjonskurve (Figur 6e), og dermed kvantifisere overgangene som følger med knekking og denaturering av DNA.

    Figur 1
    Figur 1. Skjematisk av konvensjonelle magnetiske pinsett (MT), fritt-bane rundt magnetiske pinsett (FOMT), magnetisk moment pinsett (MTT), og to strategier for sporing rotasjonsvinkel. (A) I alle de tre implementeringer av magnetiske pinsett, er magnetiske kuler bundet til en strømningscelleoverflate ved funksjonmakromolekyler, for eksempel, den dobbelt-strengede DNA-molekyler som er vist skjematisk. Referanse perler er festet til strømningscelleoverflaten og sporet for lentet korreksjon. Alle tre MT oppsett anvende magneter for å anvende en oppadgående strekkraft på magnetiske kuler, og derfor DNA tether. I konvensjonelle MT, et par magneter utøver et magnetisk felt som er orientert i tverretningen i forhold til festes akse, tett begrenser rotasjonen av vulsten rundt DNA-tether akse. I FOMT, gir en sylindrisk formet magnet et magnetisk felt som orientert langs tether retning. Når fortøyningen er innrettet til sentrum av den sylinderformede magnet, blir eventuelle gjenværende tverrgående felt reduseres til et minimum, slik at fri rotasjon om festes aksen I MTT er et side magnet tilsatt til den sylinderformede magnet anvendes i FOMT for å tilveiebringe en liten tverrgående felt (redusert i omfang i forhold til MT). Denne lille tverrgående felt muliggjør anvendelsen av dreiemoment samt dens måling. (B) To strategier for å måle rotasjonsvinkelen for en magnetisk vulsten om DNA-festes aksen er vist. 1): en markør perle (green) som er festet til det magnetiske kuler (brun) gir en asymmetrisk bilde som muliggjør vinkelsporing ved å forestille seg analyse. To CCD bilder av en 1,4-mikrometer-radius magnetiske kuler med en 0,5-mikrometer-radius fiducial markør vises, i fokus og ut-av-fokus. 2): når DNA er bundet til magnetiske kuler ved en posisjon bort fra vulsten sydpol, midt i limstrengen svinger langs en bue hvis sentrum definerer en vinkelstilling. Enten strategi kan anvendes for å spore rotasjonsvinkel, og for å overvåke endringer i vinkelstilling som tjoringen er vridnings anstrengt spor (til høyre), og muliggjør måling av enkelt molekyl dreiemoment.

    Fig. 2
    Målinger Figur 2. DNA kalibrerings i den konvensjonelle MT. (A) skjøte Rotasjon-kurver for en 7,9 kb DNA tatt på F = 00,25, 0,5, og 2,0 PN. Den asymmetrisk respons under rotasjon til positive og negative omdreininger av enkelt dobbelt-strengede DNA-stagene kan brukes som en enkel test av fortøyningen utstyret. (B) forlengelse kraft-kurve for en 7,9 kb DNA, sammen med en passe til ormen som kjede-modellen (heltrukket linje), hvilket ga en montert kontur lengde L C = 2,71 um og bøye utholdenhet lengde L P = 45 nm. Alle målinger ble utført i PBS-buffer.

    Figur 3
    Figur 3. Justering i FOMT. (A) (x, y) svingninger av DNA-bundet vulsten holdes i FOMT som en funksjon av magnet stilling. Posisjonen av den sylindriske magneten ble skannet ved en konstant høyde på 3 mm på tvers av strømningscelleoverflaten i trinn på 250 mikrometer i x-og (x, y)-svingning mønster med magnet stilling som likner en syklon eller vortex er tydelige. Denne "vortex"-mønsteret kan benyttes til å styre forskyvningen av magneten (eller alternativt tjoringen samtidig som magneten fast) i x-og y (indikert med store piler) for å oppnå innretting. Når grov innretting er fullført, vulsten er (x, y)-svingninger spore ut en sirkulær bane (blå spor i senter av plottet). Dette spor ble spilt inn i et eget eksperiment etter samkjøre magnetene i mindre trinn om senteret og er vist for illustrasjon i denne tomten. (B) (x, y)-svingninger av en DNA-tethered perle holdt i than FOMT etter vellykket grov justering av magneten (svart spor). Svingningene ligge på en sirkulær ringrom og termiske svingninger er tilstrekkelig til å utforske alle rotasjoner vinkler på sirkelen. En montert sirkel vises i rødt. (C) Et histogram som tilsvarer dataene i (b), som viser at grov justering ikke garanterer jevn dekning av alle mulige posisjoner langs den sirkulære ringrommet. Selv om det termiske svingninger er tilstrekkelig til å utforske alle rotasjoner vinkel på sirkelen, gjenstår det en energibarriere (på i størrelsesorden av den termiske energien k B T) til fri rotasjon.

    Figur 4
    Figur 4 Måling av DNA vridningsstivheten ved hjelp FOMT.. (X, y)-bane (a) og histogram (b) av en DNA-Tethered perle svingninger etter fine justering av den relative magnet-tjore posisjon i FOMT. Under disse omstendigheter viser histogrammet i det vesentlige jevn dekning av stillingene på sirkelen. (C) Rotasjons-svingninger av vulsten bestemmes fra (x, y)-stillingene. (D) histogram av de rotasjons-svingninger. Den røde linjen er et Gaussian passform med σ θ = 223 °. (E) Energien landskapet implisert av rotasjons svingninger tetthet fra (c) og (d). Forskjellen mellom energi landskapet implisert av rotasjonsbevegelser og en harmonisk tilnærming (med k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 pN-nm/rad) er mye mindre enn den termiske energien k B T over flere svinger. Data forskyvning for klarhet slik at θ 0 = 0. Breddensvingningene kan brukes til å bestemme vridningsstivhet av DNA, se løpende teksten. Målingen ble foretatt i PBS-buffer ved en strekkraft av ~ 1 pN. Data er tilpasset fra Lipfert et al 21.

    Figur 5
    Figur 5. Bindingen av RAD51 protein til DNA målt ved hjelp FOMT. (A) Montering av RAD51 protein på en tethered 7,9 kbp dsDNA overvåkes på 3,5 PN. Den (x, y, z)-bane utført av magnetiske kuler (diameter 1,0 mm) i løpet av de første 200 sekunder etter at sammenstillingen er vist med tidsfargekodet fra blått til rødt. (B) forlengelse av dsDNA utledes av z-komponenten av vulsten bane i (a) som en funksjon av tiden. (c) rotasjonsvinkel om dsDNA festesaksen utledesfra x, y-komponentene av vulsten bane i (a) som en funksjon av tiden.

    Figur 6
    Figur 6. Momentmålinger på en enkelt DNA tether i MTT. (A) skjematisk viser prinsippet for måling av dreiemomentet. Etter over-(eller under-) svingete DNA tjore av N snur, utøver DNA et gjenopprette dreiemoment på perle som fører til et skifte i likevekt kantete posisjon fra θ 0 til θ N. (B) Eksempel på vinkel spor som brukes å måle dreiemoment:. kantete svingninger av en perle tjoret til en vridnings avslappet 7,9 kbp DNA molekyl før (blå) og etter innføring av 40 omdreininger (mørk rød) (jf.) Torque måling på en 7,9 kbp DNA-molekylet i PBS buffer holdt på en stbrekninger kraft ~ 3 PN bruker fiducial markør perle basert kantete sporing protokollen. Vinkel svingninger som vist i (b) ble registrert som en funksjon av antall utførte omdreininger. (C) Standardavviket i vinkelvariasjoner som en funksjon av anvendt omdreininger. Bredden av svingningene er tilnærmet konstant, noe som indikerer konstant vinkel felle stivhet. (D) forskyvning i den midlere rotasjonsvinkelen som en funksjon av anvendt omdreininger. Systema skift av den midlere vinkel på over-og underwinding er åpenbar. (E) overvåkes samtidig DNA tether forlengelse som funksjon av anvendt omdreininger. (F) Et dreiemoment som utøves av DNA tether bestemt fra den midlere vinkelen vist i (d) , se hovedteksten. Over-og underwinding rundt null omdreininger gir opphav til en lineær dreiemoment g. svinger respons på DNA-tjoringen (montert grå bakker ion (d) og (f)) som kan brukes til å bestemme den effektive torsjons utholdenhet lengde (~ 77 nm for dette datasettet). Videre overwinding fører til knekking og dannelse av plectonemic supercoils (skjematisk vist i innfellinger), tilsvarende en moment platå (svart linje på positive vendinger i (f) på ~ 26 PN · nm) og en lineær reduksjon av fortøyningen forlengelse med tall omdreininger (svart bakke i (e)). Avkobling utover den lineære regimet fører til at DNA til lokalt smelte (vist i innfellinger til venstre), preget av en moment platå lik smelte dreiemoment (svart linje på negative vendinger i (f) på ~ -11 pN · nm).

    Discussion

    Når du kjører eksperimenter ved hjelp av MTT eller FOMT, en rekke valg må gjøres om perler, magneter, sporing protokoller, etc. De beste valg som skal gjøres vil avhenge av eksperimentet av interesse. Nedenfor beskriver vi de avveiningene som følger ulike valg, som skal legge til rette valget for et bestemt eksperiment. Deretter beskriver vi flere viktige skritt som følger med justering og drift av MTT og FOMT eksperimenter. Til slutt diskuterer vi betydningen av MTT og FOMT med hensyn til eksisterende metoder samt fremtidige søknader.

    Hensyn Før starten av MTT og FOMT Experiments

    Alle forsøk krever en for å velge en type magnetiske kuler for bruk. Man kan velge mellom flere kommersielt tilgjengelige streptavidin-belagt superparamagnetiske perler, for eksempel, 0,25 mikrometer radius perler, 0,5 mikrometer radius perler, eller 1,4 mikrometer radius perler (see Materials tabell). Større perler vil ha en økt magnetisk moment i forhold til mindre perler (omtrent skalering som volumet) og derfor deres bruk vil lette anvendelsen av høyere krefter (for typiske styrker oppnådd i våre instrumenter, se tabell 1). Når vinkel sporing ved hjelp av markør perler er ønsket, vi vanligvis jobber med 1,4 mikrometer radius og bruke 0,5 mikrometer radius ikke-magnetiske biotinylerte perler som markør perler (se punkt 1.9 for tilsvarende vedlegg protokollen). Bruken av mindre kuler er spesielt anbefalt for FOMT, som den karakteristiske tidsskala for vulsten rotasjon τ C er lik forholdet mellom systemets drag i løpet av sin fjærkonstant γ / k θ; viktigere, rotasjons luftmotstandskoeffisient relevant for vinkelmålingstidsskala skalaer som ~ R vulsten 3, dvs. med tredje potens av radien (se tabell 2 forden karakteristiske tidsskalaer for flere perle-DNA kombinasjoner i FOMT og MTT målinger). Medfølgende reduksjoner i maksimal kraft som kan brukes kan løses ved hjelp av en snudd bunken med sylindriske magnetene 27. Likevel, i FOMT målinger kan det noen ganger være nødvendig å inngå kompromiss mellom den beste oppnåelige tidsmessig oppløsning og den maksimale anvendt kraft.

    I tillegg er et eksperiment som krever valg av en magnet-konfigurasjon. I den konvensjonelle magnetiske pinsett konfigurasjon (Figur 1a), vi bruker vanligvis et par 5x5x5 mm kubiske magneter i vertikal retning med en 0,5 eller 1 mm gap mellom magnetene fire. Når magnetene er fordelt langs x-aksen (y), gir dette et magnetisk felt som er hovedsakelig rettet langs x-aksen (y). For FOMT eksperimenter, er et sylindrisk formet magnet velges ved hvis sentrum det magnetiske feltet er primært rettetlangs z-aksen (figur 1b). I praksis benyttes en stabel av tre slike sylinderformede magneter, hver med en diameter på 6 mm og en 2 mm diameter sentralt hull, for en total tykkelse på 6 mm. Når høyere trekkrefter er ønsket, blir en "tuppet stack" magnet-konfigurasjon hvori den nederste magnet er stablet med motsatt magnetiseringen foretrukket. For å oppnå den MTT-konfigurasjon (figur 1c), legger vi en ytterligere magnet på siden av hovedmagnet stabel av FOMT konfigurasjon, vanligvis en solid sylinder med 4 mm diameter og en høyde på 7 mm. For å se hvordan de maksimale krefter som oppnås i våre instrumenter avhenger av magnetkonfigurasjon, se tabell 1.

    Justering av MTT og FOMT Experiments

    Siden magnetiske kuler har en (ca.) jevnt funksjonalisert overflate (typisk streptavidin) og siden å feste både den funksjon nucleic syre stagene og Marker perler (i tilfelle markør perle-basert vinkel sporing er ansatt) skjer via enkle inkubasjon i løsningen, gjør man ikke kontrollere hvor snor og / eller markør perle feste til den magnetiske kuler. De magnetiske perler har en foretrukket magnetisering akse som har en tendens til å justere langs retningen av det ytre felt. Hvis vi betegner de punkter hvor den foretrukne magnetisering akse skjærer vulsten overflate som nord-og sydpolen, og perlene hvor DNA-tether er festet i nærheten av ekvator vil spore ut en sirkulær ringrommet med en radius nær eller er litt større enn perle radius i FOMT; i kontrast, vil perler som er festet nær sydpolen svinge på en sirkulær ringrommet med svært liten radius i FOMT, noe som kan være til hinder for montering av sirkelen ved hjelp av ligninger 3-5. Vi merker oss at ved enkel sfærisk geometri, er sannsynligheten for å feste nær ekvator mye større enn et vedlegg nøyaktig ved polene; Derfor er de fleste beads vil være bundet slik at de (x, y)-baserte vinkelsporing kan utføres med hell.

    Et lignende argument holder til å feste markøren perler for fiducial markør basert vinkel sporing. Markøren vulsten blir brukt til å lage en asymmetri i bildet av det magnetiske kuler som muliggjør vinkelsporing. Hvis markøren vulsten blir festet nøyaktig på nord-eller sydpolen på vulsten (dvs. direkte på toppen eller på bunnen), er det resulterende bildet fremdeles rotasjonssymmetrisk og vinkelsporings protokollen svikter. Imidlertid, ved det samme sfæriske geometri argument, er sjansen for en markør perle for å feste direkte til en av polene forholdsvis liten; finner vi at i praksis de fleste markør perler gi en tilstrekkelig asymmetri å aktivere kantete sporing. Til slutt ser vi at i de konvensjonelle magnetiske pinsett feltet retningen er i (x, y)-planet; derfor vil de foretrukne magnetiseringsnivåene aksen av perlen justere i the (x, y)-planet og de ​​nord-og sydpolen, som definert ovenfor, kommer til å være på sidene av perle, usannsynlig situasjonen i FOMT eller MTT, hvor polene er på toppen og bunnen.

    I FOMT eksperimenter, er et kritisk trinn i innretting av den sylindriske magnet, slik at den radiale magnetiske feltet er ubetydelig i nærhet til vulsten. Denne innretting er utført for en enkelt perle på en gang. For å bedømme om perle bevegelse i FOMT er jevnt fordelt over en sirkulær ringrommet, bør målingen tidspunkt overstige 20 · τ C. Som τ C tilsvarer ~ 45 sek for 8 kbp DNA og en 0,5 mm radius perle, er måling tid ~ 900 sek i sluttfasen av justering. For sammenligning, bruk av 1.9 kbp DNA og 0,25 mm radius perler reduserer τ C tyve ganger til ~ 2 sek (se også tabell 2).

    Kritiske trinn og Hensyn for sporing Under FOMT og MTT Experiments

    For å spore perle største svingninger i-planet, det vil si sin (x, y)-stilling, anvender vi en kryss-korrelasjonsanalyse av de belastningsprofiler som vises av en vulst ved etterfølgende tidsintervaller 35, 36.. Dette kan bli utført ved sub-bildepunkter med en nøyaktighet på noen få nanometer 20. For å spore vulsten bevegelse i z, vi bruker vanligvis en metode først utformet ved Gosse og Croquette, der målet er fokalplanet (OFP) er nøyaktig forskjøvet i vertikal retning mens avbildning av diffraksjons-ringer av vulsten festet til nukleinsyren 20 . På denne måte blir en kalibreringsprofil generert korrelering diffraksjonsmønsteret av perlen til avstanden mellom vulsten og OFP 19.. Når denne kalibreringsprofilen er interpolert, kan de vertikale forskyvninger av vulsten også bli målt med en nøyaktighet på opp til noen få nm 20.Vi henviser leseren til ytterligere referanser som beskriver mer raffinert sporing algoritmer 37, 38 samt deres søknad til parallell sporing av flere perler 5, 6, 37.

    Ved bruk av vinkel sporing som er avhengig av konvertering av (x, y)-posisjoner i kantete koordinater, anbefaler vi å fortsette som følger. Fra en tids spor hvori vulsten sporer ut en sirkulær ringrommet, bruker (x i, y i) posisjoner (hvor indeksen i betegner påfølgende målepunkter) for å passe til sirkelsenteret (0 x, y 0), og en radius R sirkel (figur 2a) ved å minimere:

    (3)

    der summen løper over alle datapunkter. Etter fitting x 0, y 0, og R sirkel, bestemme polarkoordinater (r i, θ i) av hvert datapunkt i tids spor med;

    (4)

    (5)

    Legg merke til at man bør passe på å "pakke" vinkelen θ, dvs. å legge fase hopper av ± π der det er hensiktsmessig. Custom-skrevet kode for montering og konvertering fra (x, y) til (r, θ) koordinerer er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. I FOMT, kan en tids spor hvori vulsten sporer ut en sirkulær ringrommet kan oppnås ved å oppnå grov innretting (kfr. trinn 3.3) og registrering av termiske svingninger av vulsten. I MTT, termisk svingerasjon er utilstrekkelige for å spore opp den sirkulære ringrommet; Bruk i stedet en tid spor der magnetene er sakte (typisk på 0,1 Hz) roteres ved flere omganger for å passe sirkelen ved hjelp av ligninger 3-5.

    Vi merker oss at for MTT, er det viktig å velge den riktige vinkel relativ tilnærming, det vil si via en vinkelsporingsmerke (figur 1c, Fig. 1d, figur 3a) eller via omdannelse av (x, y)-stillingene i vinkelkoordinater ( Figur 1d, figur 2b). Mens vanligvis den nøyaktighet på vinkelsporings fra (x, y)-stillingen og bruken av markør perler er sammenlignbare, er det viktig å innse at krysstale oppstår mellom en kule største svingninger i (x, y) og i vinkel, som beskrevet i Janssen et al 32: altså, er kantete sporing fra (x, y)-posisjoner bare gyldige hvis de Brownske svingninger i (x, Y) bidrar bare ubetydelig til usikkerheten i vinkel koordinaten, og den riktige bruken av (x, kan y)-sporing kreve justering av rotasjons-felle stivhet via justering av stillingen til side magnet. Vanligvis krever bruk av høyere felle stivhet ved bruk av vinkelsporing ved bruk av markør-perler. Bruken av markør perler krever et ytterligere festetrinn, noe som kan redusere antallet av brukbare stagene (se vedlegget protokollen i trinn 1.9). Ved bruk av markør perle-basert sporing, er det viktig å velge magnetiske kuler som har en markør vulsten er festet i nærheten av ekvator for best resultat.

    Betydningen av den FOMT og MTT tilnærminger i forhold til eksisterende metoder og programmer

    I det ovennevnte, har vi vist hvordan man kan, fra konvensjonelle MT, lett endre magnetkonfigurasjoner for å konvertere apparatet i MTT eller FOMT. Dette grei modification, som kan være ledsaget av innføringen av vinkelsporing ved bruk av en vinkelsporingsmerke er ønsket, er en umiddelbar sterk punktet for begge konfigurasjoner, som det tillater brukeren å påføre dreiemoment, å måle dreiemoment, eller måle vridning avhengig eksperimentere for hånden. Som nevnt i innledningen, både FOMT og MTT dra nytte av mange av de eksisterende styrkene i MT, spesielt sin enkelhet, med MTT spesielt også drar nytte av evnen til parallelle målinger 5, 6 (disse ikke er like enkelt å oppnå i FOMT gitt kravet om innretting av fortøyningen i forhold til midten av den sylindriske magneten). Spesielt, har MTT og FOMT ikke krever, i motsetning til andre teknikker, spesielt nanopartikler fremstilt 22, 39, 40, komplekst optisk design 41, eller innføring av ytterligere perler innenfor tjoret (DNA)-molekyl 42.. Slike other teknikker kan likevel gi andre fordeler som for eksempel høyere tidsoppløsning 27, 43, 44. Både FOMT og MTT bør finne fremtidige søknader i studiet av genomet behandling, som oppførselen til molekylære motorer på DNA er både påvirket av og har konsekvenser for lokal vri og dreiemoment. Andre programmer kan bli funnet i det nye feltet av DNA nanoteknologi 27 eller i den bredere felt av roterende motorer aktive i biologisk behandling 7, 45.

    M270 (R perle = 1,4 mikrometer) MyOne (R perle = 0,5 mikrometer) Ademtech (R perle = 0,25 mikrometer)
    Konvensjonell MT (par kubikk 5 x 5 x 5 mm 3 magneter, 1 mm gap, vertical alignment) 70 PN 8 PN 1,6 PN
    FOMT eller MTT * (stabel av tre sylindriske magneter, mm diameter 6, 2 mm diameter gap) 9 PN 1 PN 0,2 PN
    FOMT eller MTT * (stabel av tre sylindriske magneter, mm diameter 6, 1 mm diameter gap) 18 PN 2 PN 0,4 PN
    FOMT eller MTT * (stabel av tre sylindriske magneter med siste snudd, 1 mm diameter gap) ~ 50 PN 9 PN 1,8 PN

    * Tilstedeværelsen av den lille side magneten i MTT har en ubetydelig virkning på strekkstyrke

    Tabell 1. Maksimale kreftene vanligvis oppnås for ulike magnet konfigurasjoner og perle typer.

    R perle = 1,4 mikrometer R perle = 0,5 mikrometer R perle =0,25 um
    Friksjonskoeffisient * 120 PN · nm · sek 5,5 PN · nm · sek 0,7 PN · nm · sek
    Karakteristisk tidsskala: FOMT, 10 kbp DNA ** 1200 sek 55 sek 7 sek
    Karakteristisk tidsskala: FOMT, en kbp DNA 120 sek 5,5 sek 0,7 sek
    Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 100 PN · nm / rad 1,2 sek 0,06 sek 0.007 sek
    Karakteristisk tidsskala: MTT, k q = 1000 PN · nm / rad 0,12 sek 0,006 sek = 6 ms 0,0007 s = 0,7 msek

    * Friksjonskoeffisient for rotasjon om en akse gjennom "ekvator" (dvs. den situasjon er vist i figur 1b), Gitt ved 14 · p · h · R perle 3, der h er viskositeten til buffer.
    ** I FOMT, er rotasjons-felle stivhet gitt av vridningsstivheten av DNA, k q, DNA = C · k B t / l C, hvor C er den effektive torsjons utholdenhet lengde, antas å være 80 nm her ( som er karakteristisk for et mellomliggende kraft-regimet, F ~ 1 pN) og l C er konturen lengden av DNA, 0.34 nm per basepar.

    Tabell 2. Friksjonskoeffisienter og karakteristisk tidsskalaer for FOMT og MTT.

    Disclosures

    Et patent knyttet til dette arbeidet har blitt arkivert under henvisning PCT/NL2011/050446.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av TU Delft, Nederland Organisation for Scientific Research (NWO), Stiftelsen for Fundamental Research on Matter, og av European Science Foundation.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sandblaster Great Lake Orthodontics 190-070 Microetcher II
    Nitrocellulose Life Technologies LC2001
    Magnetic particle concentrator Life Technologies 12002D
    Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) Polysciences 17010
    Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) Sanbio PV05N/2179
    Antidigoxigenin Roche 11 214 667 001
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) Ademtech 3150
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) Life Technologies 650.01
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) Life Technologies 653.05
    Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) Life Technologies F-8768
    Cubic magnets for conventional tweezers Supermagnete W-05-N50-G
    Cylindrical magnet for MTT and FOMT Supermagnete R-06-02-02G
    Side magnet for MTT Supermagnete S-04-07-N
    Linear stage Physik Instrumente M-126.PD
    Rotary stage Physik Instrumente C-150
    High-resolution automated sample stage Physik Instrumente P-733.2D
    Software for coding analysis routines The Mathworks MATLAB custom-written routines are available from the authors

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271, 1835-1837 (1996).
    2. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421, 423-427 (2003).
    3. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods. 5, 491-505 (2008).
    4. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).
    5. Ribeck, N., Saleh, O. A. Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers. The Review of scientific instruments. 79, (2008).
    6. De Vlaminck, I., et al. Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering. Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).
    7. Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective. Cell. 142, 519-530 (2010).
    8. Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).
    9. Ajjan, R., et al. Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity. Blood. 111, 643-650 (2008).
    10. Mierke, C. T., et al. Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain. Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).
    11. Shang, H., Lee, G. U. Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction. Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).
    12. Shang, H. K. P., et al. The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries. J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).
    13. Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. Implementation of force differentiation in the immunoassay. Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).
    14. Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).
    15. Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).
    16. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).
    17. Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers. Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).
    18. Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases. Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).
    19. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorder, P., van Oijen, A. , Springer. (2009).
    20. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).
    21. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications. 2, 439 (2011).
    22. Celedon, A., et al. Magnetic tweezers measurement of single molecule torque. Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).
    23. Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics. The Review of scientific instruments. 82, (2011).
    24. Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments. Nature. 7, 977-980 (2010).
    25. Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers. Physical review letters. , 102 (2009).
    26. Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. Soft magnetic tweezers: A proof of principle. Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).
    27. Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami. Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).
    28. Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data. Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).
    29. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. The Review of scientific instruments. 83, (2012).
    30. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).
    31. Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament. Nucleic acids research. 41, (2013).
    32. Janssen, X. J., et al. Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque. Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).
    33. Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).
    34. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nat Commun. 2, 439 (2011).
    35. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).
    36. Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331, 450-453 (1988).
    37. Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification. Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).
    38. Kim, K., Saleh, O. A. A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements. Nucleic acids research. 37, 136 (2009).
    39. Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods. 4, 223-225 (2007).
    40. Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. Electron beam fabrication of birefringent microcylinders. ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).
    41. La Porta, A., Wang, M. D. Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles. Physical review letters. 92, (2004).
    42. Gore, J., et al. DNA overwinds when stretched. Nature. 442, 836-839 (2006).
    43. Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. Recent developments in single-molecule DNA mechanics. Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).
    44. Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).
    45. Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. Torque measurement at the single-molecule level. Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).

    Tags

    Bioteknologi magnetiske pinsett magnetiske moment pinsett fritt-bane rundt magnetiske pinsett vri dreiemoment DNA single-molekyl teknikker
    Magnetiske pinsett for måling av Twist og dreiemoment
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O.,… More

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter