Magnetiska pincett för Mätning av Twist och vridmoment

Summary

Magnetiska pincett, en kraftfull enda molekyl manipulation teknik, kan anpassas för direkta mätningar av twist (med en konfiguration som kallas fri-orbiting magnetiska pincett) och vridmoment (med en konfiguration kallas magnetiskt moment pincett) i biologiska makromolekyler. Riktlinjer för utförande av sådana mätningar ges, inklusive ansökningar till studier av DNA och tillhörande nucleo-protein trådar.

Abstract

Enda molekyl tekniker gör det möjligt att undersöka hur enskilda biologiska molekyler i lösning i realtid. Dessa tekniker inkluderar sk force spektroskopi metoder såsom atomkraftsmikroskopi, optisk pincett, flöde stretching och magnetiska pincett. Bland dessa metoder, har magnetiska pincett utmärkt sig genom sin förmåga att tillämpa vridmoment samtidigt som en konstant stretching kraft. Här är det illustrerat hur en sådan "konventionella" magnetiska pincett experimentella konfigurationen kan genom en enkel modifiering av dess fältkonfigurationen för att minimera storleken på den transversella fält, vara anpassad för att mäta graden av vridning i en biologisk molekyl. Den resulterande konfigurationen kallas de fritt-kretsar runt magnetiska pincett. Dessutom är det visat hur ytterligare modifiering av fältkonfigurationen kan ge en tvärgående fält med en storlek mellan den för den & #8220; konventionella "magnetiska pincett och de fritt-orbiting magnetiska pincett, vilket gör det möjligt att direkt mäta det vridmoment som finns lagrad i en biologisk molekyl. Denna konfiguration kallas de magnetiska moment pincett. Den medföljande video förklarar i detalj hur omvandlingen av konventionella magnetiska pincett i fritt-kretsande magnetiska pincett och magnetiska moment pincett kan åstadkommas, och visar användningen av dessa tekniker. Dessa anpassningar behålla alla styrkor av konventionella magnetiska pincett samtidigt kraftigt utöka mångsidigheten hos denna kraftfulla instrument.

Introduction

Under senare år har enda molekyl tekniker bevisat deras breda tillämplighet i studien av processive motorproteiner och andra enzymer, vilket ger inblick i deras kinetik och den underliggande mechanochemistry. I samband med kraft spektroskopi, har viktiga insatser gjorts av atomkraftsmikroskopi flöde stretching, och optiska och magnetiska pincett. Optiska och magnetiska pincett (MT) har bland annat lyckats kombinera stor flexibilitet i fråga om molekylär manipulation med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Här fokuserar vi på MT, som kan gälla både stretching krafter och moment till biologiska molekyler bundna mellan en yta och superparamagnetiska kulor ^1-3.

Magnetiska pincett (MT, figur 1a) är en mycket mångsidig enda molekyl teknik som har använts för att övervaka både de mekaniska egenskaperna hos nukleinsyror och deras interaktioner med proteiner. MT har många styrkas, inklusive total enkelhet och robusthet i den experimentella genomförande, facile tillämpning av vridmoment, naturlig drift och enkel kalibrering i konstant kraft läge ^4, förlängning till parallella mätningar ^{5, 6,} och frånvaro av prov värme och fotoskador. Jämfört med andra enda molekyl närmar sig, MT ger ett sätt att utföra tvångsberoende mätningar vid krafter så låga som ≈ 10 FN och har förmågan att rakt kontrollera graden av supercoiling. Medan MTs har övervägande använts som ett experimentellt verktyg för att undersöka biologiska processer som involverar nukleinsyror ^{7, 8,} har de också funnit användning i studier av de mekaniska egenskaperna hos proteiner ^9-13 eller celler ^{10, 14-17.} Många användbara referenser finns som beskriver hur man bygger och driver en MT ^{4, 18-20.}

However, gör konventionell MT inte spåra roterande rörelsen direkt, och, medan de gäller vridmoment, de inte mäter vridmoment direkt. Dessutom är de begränsa den fria rotationen av nukleinsyran tjuder. Här presenterar vi två förlängningar av magnet pincett. De första, benämnda fritt-orbiting magnetiska pincett (FOMT, figur 1b) ^21, tillåter mätningar av jämviktsvinkelvariationer och förändringar i snodd av tjudrade nukleinsyramolekyler, utan begränsande rotationsrörelse runt tjuder axeln. Den andra, benämnd magnetiska moment pincett (MTT, figur 1c), som har förmågan att tillämpa och direkt mäta både krafter och moment till enskilda biomolekyler ^22-27.

I följande protokoll, vi förutsätter att läsaren har på hans / hennes disposition en "konventionell" MT instrument. Vi hänvisar läsaren till den diskussion om referenser om hur man bygger och driver en MT inrättas, liksom consideransoner som måste tas i beaktande vid val av magnetiska pärlor, magneter och spårningsrutiner. Dessutom, avsnitt 1 och 2 i protokollet text beskriver hur vi vanligtvis förbereder och inkubera ett DNA-prov för användning i MT samt de preliminära mätningar som kan utföras på en enda DNA i den konventionella MT. § § 3 och 4 i protokollet Text illustrera hur ett MT instrument kan lätt anpassas och användas för FOMT och MTT mätningar.

Protocol

1. Upprättande och Inkubation av ett DNA-prov

1. Förbered DNA-konstruktioner som är ligerade till duplex ändar (vanligtvis anställa ≈ 600 bp DNA PCR-fragment) som funktionaliserats med flera biotin och digoxigenin grupper, respektive ^18. För att starta, ett DNA tjuder längd> 1 um, t.ex. en 7,9 kb motsvarande en utsträckta längd ~ 2,7 um som används här, rekommenderas för enkel användning; i synnerhet, med användning av en DNA-längd som är lika med eller kortare än pärlans radie är problematisk på grund av fastsättningen geometrin i MTT och FOMT. Se diskussionen för en beskrivning av hur DNA-längd påverkar tidsmässiga svar i vinkeldomänen.
2. Montera flödesceller för enda molekyl experiment. För flödescellerna, använd två glas mikroskop täckglas åtskilda av en dubbla lager Parafilm spacer. Den översta mikroskop täckglas bör ha två hål för vätske in-och utlopp till cellen. Det är praktiskt attAnvänd en sandbläster för att borra hålen. Den undre täckglas är belagd med nitrocellulosa (0,1% vikt / volym i amylacetat). Placera Parafilm distanser på nitrocellulosa belagda sidan av botten diabilder och stäng den övre med rena topp diabilder.
3. Täta flödesceller. Med hjälp av fysiska pincett, placera den monterade flödescell på en värmeplatta satt till 80-100 ° C i ~ 1 min. Var uppmärksam att flödescellen är väl förseglad, att Parafilm inte stänga hålen som ansluter till in-och utlopp, och att glasskivor är väl i linje.
   OBS: För att få det tätt, rekommenderas till stroke ut bubblor i Parafilm med hjälp av en stor bomullspinne. Cellflödet kan sedan monteras på den magnetiska pincett instrumentet.
4. Förbered buffertar. Förbered TE tethering-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), och 200 mM NaCl). Alternativt kan man använda PBS-buffert (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM fosfatbuffert, pH 7,4) kompletterat with 100 | ig / ml BSA, 0,1% Tween och 5 mM natriumazid (PBS +) såsom tethering buffert. Flush 2-3 cellvolymer TE tethering buffert in i flödescellen.
5. Inkubera 0,5 eller 1,5 ^ m radie omagnetiska latexpärlor i flödescellen under ~ 30 min. Dessa pärlor kommer att fungera som referens pärlor under magnetiska pincett mätningar som tillåter en att minimera effekten av drift mellan målet och provhållaren (dvs. flödescellen). Spola obundna icke-magnetiska kulor genom att skölja med 2-3 cellvolymer TE tjudra buffert.
6. Funktionalisera bottenytan hos flödescellen genom inkubering med 100 ^ g / ml anti-digoxigenin i PBS under minst en timme (företrädesvis längre; inkubering kan utföras över natten), för att möjliggöra DNA-fastsättning. Skölj med 2-3 cellvolymer TE tjudra buffert. Slutligen inkubera i flödescellen med 2 mg / ml bovint serumalbumin (BSA) i TE-sammanlänkning-buffert under 30 min för ytpassivering.
7. Tag en alikvot av2 ml streptavidinbelagda superpara MyOne pärlor (se diskussion och tabell of Materials) och späd med 10 ml TE-sammanlänkning buffert. Tvätta två gånger med 10 ml TE-sammanlänkning buffert med användning av en magnetisk partikelkoncentrator, och återsuspendera i 10 ml TE-sammanlänkning buffert. Fäst ~ 1 ml av DNA-molekyler (ungefär 1 ng) till dessa kulor genom inkubation i TE-sammanlänkning-buffert under 30 min.
8. Späd lösningen av den DNA-bundna superparamagnetiska pärlor tio-faldigt genom tillsats av 90 ml TE-sammanlänkning buffert. Slutligen injicera lösningen in i flödescellen och inkubera i ~ 1 h för att möjliggöra DNA-bindning till anti-digoxigenin-belagd yta. Tvätta flödescellen noggrant med TE tethering buffert. Efter inkubation av DNA-tjuder konstruktioner, spola mycket med experimentell buffert (detta kan vara TE-tethering buffert) för att ta bort alla icke-anslutna pärlor.
9. För mätningar som använder en vinkelspårningsprotokoll som kräver referensmarkören pärlor knutna till magnetiska kulor

2. Mätningar på en enda DNA-molekyl i de konventionella magnetiska pincett

1. Med användning av en konventionell MT (se Diskussion) med lämplig konfiguration fält (figur 1a) och både translations-och rotationsstyrning av magnetpositionen, söka efter rotations Constrained DNA-molekyler i flödescellen. Vid dragkrafter ≥ 1 pN (konsul referenser ^{4, 19, 20, 28, 29} gällande kraft kalibrering i magnetiska pincett), kan bundna pärlor lätt skiljas från kulor fastnat på ytan av botten glida genom sina olika höjder i fokus . Kan bedömas genom att införa 20-30 varv om en DNA-molekyl är rotations begränsass av magneterna vid en kraft ≈ 0,25 PN: här, bör begränsningslängden minska med 0,4-0,5 um.
   OBS: För att köra magnetiska pincett experiment, är bildbehandling används för att bestämma x, y och z ställning av DNA-bundna pärlor. Anpassad Labview programvara för detta ändamål är tillgänglig från författarna på begäran.
   1. Verifiera att vulsten är fäst med en enda DNA-tjuder. Detta kan göras genom att jämföra uppträdandet vid positiva och negativa svängar vid krafter> 1 pN (Figur 2a). I denna kraftordning, kommer närvaron av multipla DNA tjuder ger upphov till en ungefär symmetrisk minskning av förlängningen vid införande av positiva och negativa svängar, medan enstaka DNA tjuder kommer att ge upphov till en asymmetrisk reaktion.
2. Sök efter lämpliga fasta kulor fastnat på bottenytan i närheten av tjuder av intresse som kan tjäna som referens pärlor.
3. Kalibrera längd tHan DNA, l.. Placeringen av flödescellen ytan kan bestämmas genom att den bundna pärla i kontakt med ytan (t ex genom att rotera magneten genom ~ 60 varv på en kraft under 0,2 PN). Mätningar av den bundna pärlans vertikal position med avseende på denna yta rapporterar sedan på absolutvärdet av L.
   OBS: För att minimera efterföljande effekter av drift, är det tillrådligt att utföra mätningar av l förhållande till läget för ett referens pärla fäst på ytan.
4. Spela in ett rotationskurva (dvs. ett mått på DNA-förlängning som en funktion av antalet varv) vid en sträckningskraft av ≈ 0,25 pN (Figur 2a).
   1. Bestäm antalet varv där förlängningen är maximal, eftersom det motsvarar den stat där DNA-molekylen är vrid avslappnad. För att göra detta, är det bra att passa rotationskurvan lokalt med en parabolisk eller en Gauss-funktion för att bestämma mitt positividare. Definiera denna punkt som "noll varv".
      Anm: En anpassad skriven rutin för detta ändamål är tillgänglig från författarna på begäran.
5. För en serie ~ 20 magnetpositioner, fastställa den genomsnittliga förlängningen av vrid-avslappnad molekyl (dvs. vid "noll varv", se steg 2.4.1) från z-spår.
6. För varje mätpunkt i steg 2,5, exakt bestämma den sträckande kraften från fluktuationerna i x-eller y-position ^{20, 28, 29,} eller, under förutsättning att magnetiseringen av vulsten är välkänd, genom att använda kunskap om den lokala fältgradienten ^4. Plottning sträckkraften kontra genomsnittliga förlängning resulterar i en kraft-förlängningskurvan (figur 2b).
   1. Montera de resulterande kraft-förlängningsdata till maskliknande kedja ekvationen med hjälp av polynom approximation av Bouchiat et al ^30.
   Om förberedelserna för efterföljande FOMT mätningar, rotera långsamt magneterna medan du spelar in den magnetiska pärla s utflykter i (x, y).
   Anmärkning: Ju mindre radien av den resulterande ringen i den konventionella MT konfiguration, att ju mer den DNA-molekyl som är tjudrad närmare den "sydpol" av magnetiska pärlor. När en omkopplare till FOMT konfiguration, kommer en sådan DNA-molekyl tjudras tätt till "ekvator" av magnetiska pärlor, som möjliggör pålitlig spårning av rotationsvinkeln från (x, y)-positionen (se Diskussion).

3. Mätning av DNA Twist Använda Fritt-kretsar kring magnetiska pincett

1. Manuellt ersätta de fyrkantiga magneter av de konventionella magnetiska pincett av en cylindrisk magnet som används för FOMT (figur 1b). Denna operation bör utföras på ett sådant sätt att den valda DNA-tjuder förblir inom synfältet. Detta kan göras på mindre än 1 min genom att helt enkelt skruva av hela magnethuvudet som håller magneterna för den konventionella pincett konfiguration och ersätta den med en magnethuvud som har en cylindrisk magnet för FOMT.

De utflykter i (x, y) med en magnetisk pärla bundna av en enda dsDNA tjuder är starkt beroende av läget av tjuder med avseende på axeln hos den cylindriska magneten (figur 1b, figur 3a). Anteckna de (x, y) utflykter i syfte att bestämma den motsvarande plats inom den karakteristiska fluktuationer mönster (figur 3a, Diskussion).

Utför grov inriktning av magneten i FOMT. Detta kan uppnås genom att förflytta den cylindriska magneten ovanför den flödescell med användning av (x, y) stadier översättning. Om (x, y) utflykter följer en båge, är den cylindriska magneten inte korrekt inställd och behöver flyttasi lämplig riktning (figur 3b).

1. Grov justering kan utföras inom 15 minuter i fallet med MyOne pärlor med 7,9 kbp tjuder, och är fullständig när mätning av (x, y) utflykter resultat i observationen av cirkelrörelse (figur 3b, mitten).
   OBS: Grovt anpassningen är normalt tillräcklig för att observera förändringar i twist som orsakas av proteinbindning till enstaka DNA tjudrade i FOMT konfiguration ^{21, 31} (Representativa resultat, figur 5), trots den medföljande tvådimensionella histogram kan inte ha sina räkningar absolut jämnt fördelade längs den runda ringen (Figur 3c).

Om det behövs för ytterligare experiment, utföra fin anpassning i FOMT. Detta kan uppnås med hjälp av högupplösta mikrometerskruvar eller en högupplöst automatiserad skede att antingen flytta magneten eller flödescellen till centER de cylindriska magneten på vulsten till inom ~ 10 pm. I den fina inriktningsstadiet, är magneten noggrant placeras så att svängningarna på cirkeln ringen är nästan jämn, vilket motsvarar en situation där energi hinder för full rotation på grund av magneten är k _B T (Figur 4).
Anm: En MATLAB-skript för att rita svängningarna i ett histogram eller termogram som i figur 4 är tillgänglig från författarna på begäran.
OBS: Fin justering kan utföras inom 45 minuter för fallet med MyOne pärlor med 7,9 kbp tjuder, och i minskade tidsramar för mindre pärlor och kortare tjuder används (se diskussion).
OBS: Fin justering vanligen krävs för att utföra mätningar av vridstyvhet av nakna eller proteinbelagda DNA (Representativa resultat, Figur 4).

Om det behövs för analys, kalibrera kraft i FOMT. Detta kan ske ina sätt analogt med MT, antingen med den pärla s radiella svängningar <r ^2> (där de vinklade parentes anger tiden genomsnitt) som visas i medföljande video och detaljerad i Lipfert et al ^21, eller, som magnetiseringen av pärlan är väl -känd, genom att använda kunskap om den lokala fältgradienten ^21.

4. Mätning av DNA Moment använda magneten Moment pincett

1. Manuellt ersätta cylindrisk magnet som används för FOMT av en cylindrisk magnet plus en sida (permanent) magnet för MTT (fig 1c). Denna operation bör utföras på ett sådant sätt att den valda DNA-tjuder förblir inom synfältet.
   1. Det enklaste sättet att uppnå detta är att manuellt lägga till sido magneten på sin rätta plats, som kan åstadkommas inom 1 min. Ingen ytterligare omjustering är nödvändig.
      Notera: Ett alternativ till en sido magnet är användningenav elektromagneter ^32.
2. Om det behövs för analys, kalibrera kraft på ett sätt analogt med MT, antingen med den pärla x-eller y-fluktuationer eller, om magnetiseringen av pärlan är välkänd, med hjälp av kunskap om den lokala fältgradienten ^21.
3. Oss vinkelvariationer som en funktion av tiden θ (t) genom att använda antingen de referensbaserade spårningsprotokoll ²³ eller, såsom visas i det tillhörande video, vinkelspårningsprotokoll baserat på övervakning av (x, y)-positionen (se Diskussion). I det förra fallet, registrera helbilder av pärlan som en funktion av tid för efterföljande bildbehandling. I det senare fallet är det tillräckligt att registrera pärla s (x, y) fluktuationer i detta steg.
   Anm: En MATLAB-skript för att bestämma θ (t) från full bilder av pärlan som en funktion av tiden i de referensbaserade tracking-protokollet är enTillgängligt från författarna på begäran.
   1. Som beskrivs i Diskussion, för vinkelspårningsprotokollet bygger på att (x, y)-läge är det också klokt att spela in en tidskurva där magneterna är långsamt (vanligen vid 0,1 Hz) roteras flera varv. Detta kommer att tillåta en att exakt konvertera kartesiska koordinater (x, y) till polära koordinater (r, θ) med hjälp av ekvationer 3-5 av diskussionen.
      Anm: En MATLAB-skript för vinkel spårningsskriptet bygger på att (x, y)-position är tillgänglig från författarna på begäran.
      OBS: Mättiden beror mest på önskad upplösning momentet. En detaljerad parameter anges i Lipfert et al ^24. För MyOne pärlor och 8 kbp DNA tjuder, mät för 30-100 sek bör vara tillräcklig för att ge ett vridmoment upplösning i intervallet ~ 1 PN · nm.
4. Bestäm styvhet vrid fällan från the variansen av vinkelförändringar _(σ θ ^2, i radianer) med hjälp av:
   k _θ = k _B T / σ _θ ² (1)
   Obs: Typiska rotations fälla styv uppnåtts i MTT är i intervallet 10-1000 PN · nm / rad, lägre än för konventionella magnetiska pincett.
5. Dessutom registrerar den z-positionen hos vulsten och använda detta för att bestämma den tjuder längd l (se också steg från 2,4 till 2,7).
6. Rotera N varv och återigen spela in θ (t) och L (t).
   Anmärkning: Den reducerade rotations fälla styvhet MTT jämfört med MT gör den lämplig för mätningar av enstaka molekyl vridmoment, men innebär att det maximala vridmomentet som kan utövas minskas. Detta innebär att MTT inte kanske kan uppväga höga dragmoment som orsakas av snabb rotation. Man måste därför med att inte överskrida den maximala hastigheten; typically rotera med hastigheter nära 0,1 Hz.
7. Bestäm vridmoment ackumuleras i nukleinsyran tjuder efter N varv med användning av:
   Γ = - k _θ <θ _N - θ _0> (2)
   Var <...> betecknar genomsnittet och θ ₀ θ och _N är den vinkel vid noll varv (motsvarande en vrid avslappnad tjuder, jfr. Steg 2,3 och N varv, respektive.
8. Upprepa steg 4,5 och 4,6 som krävs för att till fullo fastställa en molekyl vridmoment svar i en enda mätning körning (Representativa resultat, figur 6).

Representative Results

Representativa resultat från MT (figur 1a) visas i figur 2. Figur 2a visar vridning-förlängningskurvor för ett 7,9 kb DNA-tas på F = 0,25, 0,5, och 2,0 pN. Svaret från en enda DNA på rotation bör symmetriskt vid de lägsta styrkorna (0,25 PN), med tillägget av DNA minskar som ett resultat av bildandet av positiva eller negativa plectonemic supercoils. Kvalitativ kunskap om detta svar är användbart när först efter en rotations begränsad DNA tjuder (steg 2,1). Observera att ytterligare inspektion av tjuder är skyldig att kontrollera att den består av en enda DNA-molekyl: här, den asymmetriska svar på en enda DNA till rotation på krafter överstigande 0,5 pN hjälper till att skilja den från flera DNA (steg 2.1.1). När detta har verifierats, återgår man till rotations svaret på 0.25 pN för att fastställa det exakta antalet magnet varv där enda DNA is vrid avslappnad, där man tar ett kraft-förlängningskurvan, som bör likna figur 2b. För denna mätning, ett anfall av data till maskliknande kedja modell (heldragen linje) gav en monterad konturlängd L _C = 2,71 um och bock uthållighet längd L _P = 45 nm. För dsDNA bör de monterade värdena för persistens längd ligga i området 40 till 55 nm, beroende på de buffertbetingelser ³³ och den monterade kontur längd bör vara nära (vanligen inom 10%) till det värde som förväntas för den DNA-konstruktion som används i mätningarna, med hjälp av förhållandet _L-DNA = 0,34 nm / bp · antal baspar.

Figur 3 visar de förfaranden och resultat av anpassningen i FOMT (figur 1b). De initiala (x, y) utflykter spelats i steg 3.2 kan jämföras med den samlade bild av variationer som funktion of den tvärgående magnetpositionen som visas i figur 3a, som visar en "virvel"-mönster som kan användas för att styra efterföljande relativ förskjutning mellan magneten och DNA-tjudrad vulst hålls i FOMT. Vid efterföljande grov anpassningen är klar, pärlan s (x, y)-fluktuationer spåra ut en cirkulär bana, vilket också framgår av den svarta kurvan i figur 3b. Vid denna punkt, är vridmomentet från magneterna omkring z-axeln minskas till den punkt att termiska fluktuationer tillräckligt för att rotera kulan kring sin fästpunkt. Radien R _cirkel av den resulterande cirkulära ringen (monterad cirkel visas i rött) representerar det radiella avståndet mellan DNA-fästpunkt och pärlan centrum (Figur 1b). Såsom visas i figur 3c, men visar ett histogram av data i figur 3b att grovinriktning inte garanterar jämn täckningav alla möjliga lägen längs den cirkulära ringen. Även om termiska fluktuationer är tillräckliga för att utforska alla rotationer vinkel på cirkeln, finns det fortfarande en liten energibarriär (i storleksordningen den värmeenergi k _B T) för fri rotation.

När finare anpassning utföres i FOMT (steg 3,4), kan instrumentet användas för att bestämma vridmodul av DNA (Figur 4). För det första är fina anpassning av provet som används för att erhålla cirkulär rörelse (figur 4a) vars tvådimensionellt histogram bör nu visa jämn täckning (figur 4b). Motsvarande tidskurva q (t) för vinkelsvängningar (erhållen från omvandling av (x, y)-lägen, se nedan) inte uppvisar någon periodicitet som svarar mot 360 ˚ (fig. 4c) och avslöjar stora utslag motsvarar flera hela varv (Figur 4d). Den implicita energilandskapetär harmonisk över ett intervall av> 1000 ˚ (figur 4e). Standardavvikelsen för fluktuationerna är σ _θ = 223 °, vilket motsvarar en vinkel fälla styvhet k _θ = k _B T / σ _θ ² = 0.27 PN · nm / rad, vilket i sin tur ger en uppskattning av den effektiva vrid uthållighet längd DNA lika med C = L _C / _σ θ ² ~ 76 nm (L _C = 1,150 nm för 3,4 kb DNA som används i denna mätning) vid den uppmätta kraften.

Ett exempel på hur FOMT kan användas för att mäta förändringen i vridning induceras i den bundna DNA-molekyl genom bindningen av proteiner ^{31, 34} visas i figur 5. Här har vi övervakas bindningen av RAD51-proteinet att fördubblaDNA; RAD51 är känd för att både förlänga och varva ner DNA som den bildar ett nukleoprotein filament ^31. Vid spolning RAD51 in i flödescellen, observerar vi att pärlan undergår en spiralbana i FOMT (figur 5a). Genom att omvandla spår av (x, y) rörelse som en funktion av tid för att Q (t) såsom beskrivits ovan, kan vi co-plot effekten att RAD51 har på DNA tjuder längd och dess grad av avlindning (figur 5b, c) .

Ett alternativt tillvägagångssätt för att mäta vridningsegenskaperna hos DNA är MTT (fig 1c, figur 6). Schemat i figur 6a visar principen för mätning: efter överlindning (eller underwinding) DNA tjuder med N varv, DNA utövar ett återställande moment på pärlan som leder till en förändring av jämviktsvinkelläge från θ ₀ till θ _N. I MTT tvärkomponenten i magnetfältet reduceras jämfört med MT, vilket underlättar mätning av sådana vinkel skift medan de låter pärla rotation (Figur 1). Storleken på vinkelskiftningen mäts efter applicering N = 45 vänder sig till en 7,9 kbp DNA visas i figur 6b. Den fullständiga sekvensen för MTT mätprotokoll och det erhållna resultatet av ett vridmoment versus rotationskurvan för DNA som visas i figur 6c-f. Här används mätningar av standardavvikelsen (fig. 6c) och medelvärdet (fig 6d) av vinkelkoordinat visas som en funktion av över-och underwinding, med standardavvikelsen är omvänt proportionell mot vinkel fällan stelhet (ekvation 1). Sammantaget dessa kvantiteter tillåter en att konstruera ett vridmoment kontra rotationskurva för DNA (Figur 6f), som ska visa ett linjärt svar region centrerad omkring 0 förvandlar ennd två platåer där moment mättade fettsyror, vid positiva och negativa rotationer, respektive. Ett sådant vridmoment kontra rotationskurva kompletterar informationen i en förlängning versus rotationskurva (figur 6e) och därigenom kvantifiera de övergångar som följer med buckling och denaturering av DNA.

Figur 1. Schema för konventionella magnetiska pincett (MT), fritt-orbiting magnetiska pincett (FOMT), magnetiska moment pincett (MTT) och två strategier för att spåra rotationsvinkel. (A) I samtliga tre tillämpningar av magnetiska pincett, är magnetiska pärlor bundna till en flödescellytan genom funktionaliserade makromolekyler, t ex de dubbelsträngade DNA-molekyler som visas schematiskt. Referens pärlorna är fästa till flödescellytan och spåras för DRIft korrigering. Alla tre MT uppställningar använda magneter för att tillämpa en uppåtsträckkraft på magnetiska pärlor och därför DNA tjuder. Vid konventionell MT, ett par magneter utövar ett magnetfält som är orienterat i tvärriktningen i förhållande till förankringsaxeln tätt begränsa rotation av vulsten runt DNA-tjuder axel. I FOMT tillhandahåller en cylindriskt formad magnet ett magnetfält som orienterad längs tjudret riktning. När tjuder är vinklad mot centrum av den cylindriskt formad magnet, återstår några tvärgående fält minimeras, vilket tillåter fri rotation kring förankringsaxeln I MTT är en sido magnet tillsatt i cylindriskt formad magnet som används i FOMT i syfte att tillhandahålla en liten tvärgående fält (reducerad i storlek jämfört med MT). Denna lilla tvärgående fält möjliggör tillämpningen av vridmomentet och dess mått. (B) Två strategier för att mäta rotationsvinkeln av en magnetisk pärla om DNA-tjuder axeln visas. 1): en markör pärla (green) fäst vid magnetiska pärlor (brun) ger en asymmetrisk bild som gör att vinkeln spårning av föreställa analys. Två CCD-bilder av en 1,4-ìm-radie magnetisk pärla med en 0,5-ìm-radie referensmarkören visas, i fokus och out-of-fokus. 2): när DNA är bunden till magnetiska pärlor vid ett läge bort från vulsten sydpol fluktuerar centrala vulsten längs en båge vars centrum definierar en vinkelposition. Antingen strategi kan användas för att spåra rotationsvinkeln och övervaka förändringar i vinkeln position som tjuder är vrid ansträngd (spår till höger), vilket möjliggör mätningar av enda molekyl vridmoment.

Figur 2. DNA kalibreringsmätningar i den konventionella MT. (A) Rotation-förlängningskurvor för en 7,9 kb DNA tas på F = 00,25, 0,5, och 2,0 pN. Den asymmetriska svar under rotation för att positiva och negativa varv av enkeldubbelsträngade DNA-tjuder kan användas som ett praktiskt test av tjudret fastsättning. (B) Kraft-förlängningskurva för ett 7,9 kb DNA, tillsammans med en passning till masken- liknande kedja modell (heldragen linje), vilket ger en monterad konturlängd L _C = 2,71 um och bock uthållighet längd L _P = 45 nm. Alla mätningar genomfördes i PBS-buffert.

Figur 3. Justering i FOMT. (A) (x, y) variationer av DNA-bundna vulst hålls i FOMT som en funktion av magnetposition. Positionen för den cylindriska magneten skannades vid en konstant höjd av 3 mm tvärsöver flödescellytan i steg om 250 ^ m i x-och (x, y)-fluktuation mönster med magnetpositionen som liknar en cyklon eller virvel är uppenbara. Denna "virvel"-mönster kan användas för att styra förskjutningen av magneten (eller alternativt tjudret samtidigt hålla magneten fast) i x och y (indikeras av de stora pilarna) för att uppnå anpassningen. När grov anpassningen är klar, pärlan s (x, y)-fluktuationer spåra ut en cirkulär bana (blå spår i mitten av tomten). Detta spår spelades in i ett separat experiment efter att rikta magneterna i mindre steg om centrum och visas för illustration i denna komplott. (B) (x, y)-fluktuationer i ett DNA-bundna pärla hölls i than FOMT efter framgångsrik grov-anpassning av magneten (svarta spår). Svängningarna ligga på en rund ring och termiska fluktuationer är tillräckliga för att utforska alla rotationer vinklar på cirkeln. En monterad cirkel visas i rött. (C) Ett histogram som motsvarar uppgifterna i (b), som visar att grov anpassning inte garanterar jämn täckning av alla möjliga positioner längs den cirkulära ringen. Även om termiska fluktuationer är tillräckliga för att utforska alla rotationer vinkel på cirkeln, finns det fortfarande en energibarriär (på i storleksordningen den värmeenergi k _B T) för fri rotation.

Enligt fig. 4. Mätning av DNA torsionsstyvhet använder FOMT. (X, y)-bana (A) och histogram (b) en DNA-Tethställda pärla svängningar efter fina inriktning av den relativa magnet-Tether position i FOMT. Under dessa förhållanden visar histogrammet väsentligen likformig täckning av de positioner på cirkeln. (C) Rotations fluktuationer av vulsten bestämdes från (x, y)-lägen. (D) Histogram av rotationssvängningar. Den röda linjen är en Gaussisk passform med _σ θ = 223 °. (E) Energilandskapet antyds av rotations fluktuation tätheten från (c) och (d). Skillnaden mellan energilandskapet följer av rotationssvängningar och en harmonisk approximation (med k _θ = k _B T / σ _θ ² = 0,27 pN-nm/rad) är mycket mindre än den värmeenergi k _B T under flera varv. Data är förskjutna för tydlighets skull, så att θ ₀ = 0. Bredden påsvängningarna kan användas för att bestämma vridstyvhet av DNA, se huvudtexten. Mätningen genomfördes i PBS-buffert vid en sträckningskraft på ~ en PN. Data är anpassade från Lipfert et al ^21.

Figur 5. Bindningen av RAD51-proteinet till DNA mäts med användning FOMT. (A) Montering av RAD51 protein på en tjudrad 7,9 kbp dsDNA övervakas på 3,5 PN. Den (x, y, z)-bana utförs av magnetisk pärla (diameter 1,0 mm) under den första 200 sek av enheten visas, med tidsfärgkodade från blått till rött. (B) Förlängningen av dsDNA härledas från z-komponenten av vulsten trajectory i (a) som en funktion av tiden. (c) rotationsvinkel om dsDNA förankringsaxeln deduceradefrån x-, y-komponenterna hos vulsten trajectory i (a) som en funktion av tiden.

Figur 6. Vridmomentmätningar på en enda DNA-tjuder i MTT. (A) Schematisk bild som visar principen för mätning av vridmoment. Efter över-(eller under-) lindning av DNA tjuder med N varv, utövar DNA ett återställande vridmoment på pärlan som leder till en förskjutning i jämviktsvinkelläge från θ ₀ till θ _N. (B) Exempel på vinkel linjer som används för för att mäta vridmoment:. vinkelvariationer en pärla bundna till en vrid avslappnad 7,9 kbp DNA-molekylen före (blå) och efter införandet av 40 varv (mörk röd) (cf) Momentmätning på ett 7,9 kb DNA-molekyl i PBS-buffert som hölls vid en stkväljningar kraft ~ 3 pN använda referensmarkören pärla baserad vinkelspårningsprotokollet. Vinkel svängningar som visas i (b) registrerades som en funktion av antalet tillämpade varv. (C) Standardavvikelsen för vinkelförändringar som en funktion av tillämpade svängar. Bredden på fluktuationerna är ungefär konstant, vilket indikerar konstant vinkel fälla styvhet. (D) Förskjutningen i medelrotationsvinkeln som funktion av tillämpade svängar. Systematiska skiftningar av medelvinkeln vid över och underwinding är uppenbara. (E) samtidigt övervakas DNA tjuder förlängningen som en funktion av tillämpad svängar. (F) Det vridmoment som utövas av det DNA tjuder bestämdes från medelvinkeln visas i (d) , se huvudtexten. Over-och underwinding kring noll varv ger upphov till ett linjärt vridmoment vs vänder svar på DNA-tjuder (monterade gråa sluttningar jon (d) och (f)) som kan användas för att bestämma den effektiva vrid uthållighet längd (~ 77 nm för denna datamängd). Vidare överlind leder till knäckning och bildning av plectonemic supercoils (schematiskt visas i inläggningar), vilket motsvarar en moment platå (svart linje vid positiva svängar i (f) på ~ 26 PN · nm) och en linjär minskning av tjuder förlängning med nummer varv (svart lutning i (e)). Unwinding bortom den linjära regimen gör att DNA att lokalt smälta (visas i inläggningar till vänster), markerad med en moment platå lika med smältmoment (svart linje vid negativa svängar i (f) vid ~ -11 PN · nm).

Discussion

När du kör experiment med hjälp av MTT eller FOMT, ett antal val måste göras om pärlor, magneter, spårning protokoll etc. De bästa val som ska göras kommer att bero på försöket av intresse. Nedan beskriver vi de avvägningar som följer med olika val, vilket bör underlätta valet för ett visst experiment. Därefter beskriver vi flera viktiga steg som följer inriktningen och driften av MTT och FOMT experiment. Slutligen diskuterar vi betydelsen av MTT och FOMT med avseende på befintliga metoder och framtida tillämpningar.

Överväganden före starten av MTT och FOMT Experiment

Varje experiment kräver en att välja en typ av magnetisk pärla för användning. Man kan välja mellan flera kommersiellt tillgängliga streptavidintäckta superparamagnetiska kulor, till exempel, 0,25 um radie pärlor, 0,5 ìm radie pärlor, eller 1,4 ìm radie pärlor (see tabellen Materials). Större pärlor kommer att ha en ökad magnetiskt moment jämfört med mindre pärlor (grovt skalnings eftersom volymen) och därmed deras användning kommer att underlätta tillämpningen av högre krafter (för typiska krafter som uppnås i våra instrument, se tabell 1). När vinkel spårning med hjälp av markör pärlor önskas, vi arbetar vanligtvis med 1,4 ìm radie och använda 0.5 um radie omagnetiska biotinylerade pärlor som markör pärlor (se punkt 1.9 för motsvarande fäst-protokollet). Användningen av mindre pärlor rekommenderas speciellt för FOMT, som det karakteristiska tidsplanen för pärla rotation τ _C är lika med kvoten mellan systemets dra över sin fjäderkonstanten γ / k _θ; viktigare, rotationsluftmotståndskoefficient är relevant för de vinkel mättid skala skalor som ~ R _vulst ^3, dvs med den tredje potensen av radien (se tabell 2 förden karakteristiska tidsskalor för flera pärla-DNA-kombinationer i FOMT och MTT mätningar). Kompletterande minskningar av den största kraft som kan tillämpas kan åtgärdas med hjälp av en spegelvänd bunt med cylindriska magneter ^27. Icke desto mindre i FOMT mätningar det ibland kan vara nödvändigt att kompromissa mellan det bästa möjliga tidsmässiga upplösningen och den maximala anbringade kraften.

Dessutom kräver ett experiment valet av en magnet-konfiguration. I den konventionella magnetiska pincett konfiguration (Figur 1a), använder vi oftast ett par 5x5x5 mm cubic magneter i vertikalt läge med en 0,5 eller 1 mm mellan magneterna ^4. När magneterna är placerade på avstånd längs x axeln (y), ger detta ett magnetfält som i huvudsak är riktad längs med x (y) axel. För FOMT experiment används en cylindriskt formad magnet vald vid vars centrum magnetfältet är primärt inriktadutmed z-axeln (figur 1b). I praktiken använder vi en stapel av tre sådana cylindriskt formade magneter, var och en med en diameter av 6 mm och en 2 mm diameter centralt hål, till en total tjocklek av 6 mm. Vid högre dragkrafter är önskvärda, är en "spegelvänd stack" magnet konfiguration i vilken den nedre magneten är staplad med motsatt magnetisering föredragna. För att uppnå den MTT-konfiguration (Fig. 1c), vi lägga till ytterligare en magnet till sidan av huvudmagneten stacken hos FOMT konfiguration, vanligtvis en solid cylinder med 4 mm diameter och en höjd av 7 mm. För att se hur de maximala krafter som uppnåtts i våra instrument är beroende av magnetkonfigurationen, se tabell 1.

Anpassningen av MTT och FOMT Experiment

Eftersom magnetiska kulor har en (ungefär) jämnt funktion yta (vanligtvis streptavidin) och sedan fastsättning av både den funktion nucleic sura tjuder och markör pärlor (ifall markören pärla baserade vinkel tracking används) sker via enkel inkubation i lösning, behöver man inte styra var de tjuder och / eller markör pärla fäster vid magnetisk pärla. De magnetiska pärlorna har en föredragen magnetiseringsriktning axel som tenderar att rikta in längs riktningen av det yttre fältet. Om vi ​​betecknar de punkter där den föredrog magnetisering axeln skär pärlan yta som de nord-och sydpolen, då kulor där DNA-tjuder är fäst nära ekvatorn kommer att spåra ut en rund ring med en radie nära eller något större än vulst radie i FOMT; däremot kommer pärlor som är fästa nära sydpolen fluktuera på en rund ring med mycket liten radie i FOMT, vilket kan hindra montering av cirkeln med hjälp av ekvationerna 3-5. Vi noterar att med enkel sfärisk geometri, är sannolikheten för att fästa nära ekvatorn mycket större än en bifogad fil precis vid polerna; alltså, de flesta bEADS kommer att vara uppbundna sådan att (x, y)-baserad vinkelspårning kan genomföras framgångsrikt.

Ett liknande argument gäller för fastsättning av markör pärlor för referensmarkören baserad vinkel spårning. Markören pärla används för att skapa en asymmetri i bilden av den magnetiska pärla som gör att vinkelspårning. Om markören pärla är fäst precis vid norra eller södra polen på pärlan (dvs. direkt på toppen eller på botten), är den resulterande bilden fortfarande rotationssymmetrisk och vinkelspårningsprotokollet misslyckas. Men av samma sfäriska geometri argument, är chansen för en markör pärla att fästa direkt på en av polerna relativt liten; finner vi att i praktiken de flesta markör pärlor ger en tillräcklig asymmetri för att möjliggöra vinkelspårning. Slutligen kan vi konstatera att i de konventionella magnetiska pincett fältet riktningen är i (x, y)-planet; därför kommer de föredragna magnetisering axel vulsten rikta in the (x, y)-planet och de nord-och sydpolen, enligt definitionen ovan, kommer att vara på sidorna av pärlan, osannolika situationen i FOMT eller MTT, där polerna är på toppen och botten.

I FOMT experiment, är ett kritiskt steg i anpassningen av den cylindriska magneten, så att det radiella magnetfältet är försumbar i närhet till pärlan. Denna anpassning utförs för en enstaka kula i taget. För att bedöma om pärla rörelse i FOMT är jämnt fördelad på en cirkulär ring, bör mätningstiden överstiga 20 · τ _C. Eftersom τ _C motsvarar ~ 45 sek för 8 kb DNA och en 0,5 mm radie pärla, är tidsmätningen ~ 900 sek i slutskedet av anpassning. Som jämförelse, användning av 1,9 kb DNA och 0,25 mm radie pärlor reducerar τ _C tjugo gånger till ~ 2 sek (se även tabell 2).

Kritiska moment och Överväganden för spårning under FOMT och MTT Experiment

För att spåra bead s i planet fluktuationer, dvs sin (x, y)-positionen, använder vi en korskorrelationsanalys av intensitetsprofiler som visas av en vulst vid efterföljande tidsintervall ^{35, 36.} Detta kan utföras vid delpixel upplösning med en noggrannhet av några få nanometer ^20. Om du vill spåra pärlan rörelse i z, använder vi oftast en metod som först designad av Gosse och Croquette, där målet är fokalplan (OFP) är korrekt flyttas i vertikal riktning medan avbildning diffraktion ringar pärlan bifogas nukleinsyra ²⁰ . På detta sätt är en kalibreringsprofil genererad korrelering diffraktionsmönstret av vulsten till avståndet mellan vulsten och OFP ^19. När denna kalibreringsprofil interpoleras, kan de vertikala förskjutningar av fogen även mätas med en noggrannhet på upp till några nm ^20.Vi hänvisar läsaren till ytterligare referenser som beskriver mer förfinade spårningsalgoritmer ^{37, 38} samt deras tillämpning på parallell spårning av flera kulor ^{5, 6, 37.}

Vid användning av vinkelspårning som är beroende av omvandlingen av (x, y)-positioner i kantiga koordinater, rekommenderar vi att gör så här. Från en tidskurva där pärlan spårar ut en rund ring, använder du (x, _yi) positioner (där index i betecknar efterföljande mätpunkter) för att passa cirkelcentrum (x _0, y ₀₎ och radien R _cirkel (figur 2a) genom att minimera:

(3)

där summan löper över alla datapunkter. Efter fitting x _0, y _0, och R _cirkel, bestämma polära koordinater (r _jag, θ _i) för varje datapunkt i tidskurva med hjälp av:

(4)

(5)

Observera att man bör vara noga med att "packa upp" vinkeln θ, dvs att lägga fas hoppar av ± π där så är lämpligt. Custom-skriven kod för montering och konvertering från (x, y) till (r, θ) koordinater är tillgänglig från författarna på begäran. I FOMT kan en tidskurva i vilken vulsten spårar ut en cirkulär ring erhållas genom att åstadkomma grovinriktning (jfr steg 3,3) och registrering av termiska fluktuationer av pärlan. I MTT, termisk fluksamheten är otillräckliga för att spåra ur den runda ringen; Använd i stället en tidskurva där magneterna är långsamt (vanligen vid 0,1 Hz) roteras några varv för att passa cirkeln med hjälp av ekvationerna 3-5.

Vi noterar att för MTT, är det viktigt att välja rätt vinkel tracking metod, det vill säga via en vinkelspårnings markör (Figur 1c Figur 1d, figur 3a) eller genom omvandling av (x, y)-positioner i kantiga koordinater ( Figur 1d, figur 2b). Medan vanligtvis noggrannhet vinkel spårning från (x, y)-positioner och användning av markör pärlor är jämförbara, är det viktigt att inse att överhörning sker mellan en pärla s fluktuationer i (x, y) och i vinkel, enligt beskrivningen i Janssen et al ^32: alltså, gäller endast vinkel spårning från (x, y)-ståndpunkter, under förutsättning att de Brownsk fluktuationer i (x, Y) bidrar endast obetydligt av osäkerheten i vinkel samordna, och dess rätta användning av (x, kan y)-spårning kräver inställning av rotations fällan stelhet genom justering av positionen för sidomagneten. Typiskt kan användningen av högre fälla styvhet kräver användning av vinkelspårning med användning av markörpärlor. Användning av märk pärlor kräver en extra fäststeg, vilket kan minska antalet användbara tjuder (se den bifogade protokollet i steg 1.9). Vid användning av markerings vulsten baserade spårningssystem, är det viktigt att välja magnetiska pärlor som har en markör vulsten är fäst nära ekvatorn för bästa resultat.

Betydelsen av FOMT och MTT Approaches jämfört med existerande metoder och tillämpningar

I det ovanstående har vi visat hur en kan, utgående från konventionell MT, enkelt ändra magnet konfigurationer för att konvertera instrumentet till MTT eller FOMT. Denna okomplicerade mNDRING, vilket kan åtföljas av införandet av vinkelspårning när användningen av en vinkelspårningsmarkör önskas, är en omedelbar styrka i båda lägena, eftersom det tillåter användaren att tillämpa vridmoment, mäta vridmoment, eller mäta twist beroende på experimentera till hands. Som nämnts i inledningen, både FOMT och MTT nytta av många av de befintliga styrkorna i MT, särskilt deras enkelhet, med MTT särskilt gynnas också förmågan av parallella mätningar ^{5, 6} (dessa är inte så lätt att uppnå i FOMT givet kravet på inriktning av tjuder med avseende på mitten av den cylindriska magneten). Noterbart MTT och FOMT kräver inte, i motsats till andra tekniker, speciellt nanotillverkade partiklar ^{22, 39, 40,} komplex optisk design ^41, eller införande av ytterligare pärlor inom den bundna (DNA)-molekyl ^42. Sådan ovriga metoder kan dock ge andra fördelar såsom högre tidsupplösning ^{27, 43, 44.} Både FOMT och MTT bör finna framtida tillämpningar inom studiet av genomet behandling, eftersom beteendet hos molekylära motorer på DNA är både påverkas av och får konsekvenser för den lokala twist och vridmoment. Ytterligare program finns i det framväxande området DNA nanoteknik ²⁷ eller i den bredare roterande motorer verksamma inom biologisk behandling ^{7, 45.}

	M270 (R pärla = 1,4 mikrometer)	MyOne (R pärla = 0,5 mikrometer)	Ademtech (R vulst = 0,25 | im)
Konventionell MT (par kubik 5 x 5 x 5 mm 3 magneter, 1 mm gap, vertical alignment)	70 pN	8 pN	1,6 pN
FOMT eller MTT * (stapel av tre cylindriska magneter, 6 mm diameter, 2 gap mm diameter)	9 pN	1 pN	0,2 pN
FOMT eller MTT * (stapel av tre cylindriska magneter, 6 mm i diameter, ett gap mm diameter)	18 pN	2 pN	0,4 pN
FOMT eller MTT * (stapel med tre cylindriska magneter med senaste vänt, spalt 1 mm diameter)	~ 50 pN	9 pN	1,8 pN

* Förekomst av den lilla sidan magneten i MTT har en försumbar effekt på sträckkraften

Tabell 1. Maximala krafter normalt uppnås för olika magnetkonfigurationer och pärla typer.

	R vulst = 1,4 | im	R pärla = 0,5 nm	R vulst =0,25 | im
Friktionskoefficient *	120 pN · nm · sec	5.5 PN · nm · sec	0.7 PN · nm · sec
Karakteristiskt tidsskala: FOMT, 10 kb DNA **	1200 sek	55 sek	7 sek
Karakteristiskt tidsskala: FOMT, 1 kb DNA	120 sek	5,5 sek	0,7 sek
Karakteristiskt tidsskala: MTT, k q = 100 PN · nm / rad	1,2 sek	0,06 sek	0,007 sek
Karakteristiskt tidsskala: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad	0,12 sek	0,006 sek = 6 ms	0,0007 s = 0,7 ms

^* Friktionskoefficient för rotation kring en axel som går genom "ekvator" (det vill säga den situation som visas i figur 1b), Som ges av 14 • p * h * R _vulst ^3, där h är viskositeten i bufferten.
^** I FOMT är rotations fälla styvhet ges av vridstyvheten hos DNA, k _{q, DNA} = C • k _B T / L _C, där C är den effektiva vrid persistens längd, antas vara 80 nm here ( som är karakteristisk för en mellanliggande kraftordning, F ~ 1 PN) och L _C är konturlängd av DNA, 0,34 nm per baspar.

Tabell 2. Friktions koefficienter och karakteristiska tidsskalor för FOMT och MTT.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sandblaster	Great Lake Orthodontics	190-070 Microetcher II
Nitrocellulose	Life Technologies	LC2001
Magnetic particle concentrator	Life Technologies	12002D
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius)	Polysciences	17010
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius)	Sanbio	PV05N/2179
Antidigoxigenin	Roche	11 214 667 001
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius)	Ademtech	3150
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”)	Life Technologies	650.01
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”)	Life Technologies	653.05
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius)	Life Technologies	F-8768
Cubic magnets for conventional tweezers	Supermagnete	W-05-N50-G
Cylindrical magnet for MTT and FOMT	Supermagnete	R-06-02-02G
Side magnet for MTT	Supermagnete	S-04-07-N
Linear stage	Physik Instrumente	M-126.PD
Rotary stage	Physik Instrumente	C-150
High-resolution automated sample stage	Physik Instrumente	P-733.2D
Software for coding analysis routines	The Mathworks	MATLAB	custom-written routines are available from the authors