Summary
Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.
Abstract
Tek moleküllü teknikleri mümkün gerçek zamanlı olarak çözelti içinde tek tek biyolojik moleküllerin davranışını incelemek için tercih. Bu teknikler atomik kuvvet mikroskobu olarak adlandırılan kuvvet spektroskopisi yaklaşımları, optik cımbız, germe, akış ve manyetik cımbız bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar arasında, manyetik cımbız sabit bir germe kuvveti muhafaza ederken, tork uygulamak için kabiliyetleri ile kendilerini seçkin. Burada, bu görüntülenmiştir örneğin, bir "geleneksel" manyetik cımbız deneysel yapılandırma, enine alanın büyüklüğünü en aza indirmek için alan konfigürasyonun basit tadilatı yoluyla, biyolojik bir molekül içinde bükümü derecesini ölçmek için adapte edilebilir. Edilen yapılandırma özgürce yörüngedeki manyetik cımbız denir. Buna ek olarak, bu alan konfigürasyonun başka değişiklik ve içinde arasında ara bir değeri olan bir enine alanı elde nasıl gösterilmektedir8220; geleneksel "manyetik cımbız ve mümkün doğrudan biyolojik molekül saklanan torkunu ölçmek için yapar özgürce yörüngesindeki manyetik cımbız,. Bu yapılandırma, manyetik momenti cımbız adlandırılır. Ekteki video özgürce yörüngesindeki manyetik cımbız ve manyetik tork cımbız içine konvansiyonel manyetik cımbız dönüşüm yapılabilir nasıl ayrıntılı olarak açıklar ve bu tekniklerin kullanımını gösterir. Büyük ölçüde bu güçlü aracın çok yönlülüğünü genişletilmesi sırasında bu uyarlamalar konvansiyonel manyetik cımbız tüm gücünü korumak.
Introduction
Son yıllarda, tek bir molekül teknikleri kinetiği ve temel Mekanokimya fikir verecek, ilerleyici motor proteinlerinin ve diğer enzimlerin çalışmada, geniş uygulanabilirliği kanıtlamıştır. Kuvvet spektroskopisi bağlamında önemli katkılar atomik kuvvet mikroskobu germe akışı, optik ve manyetik cımbız tarafından yapılmıştır. Optik ve manyetik cımbız (MT) özellikle yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip molekül manipülasyon açısından büyük esneklik birleştirerek başardılar. Burada, bir yüzey ve süperparamanyetik boncuk 1-3 arasında gergin biyolojik moleküllerin hem germe kuvvetleri ve momentleri uygulayabileceğiniz, MT odaklanmak.
Manyetik cımbız (MT, Şekil 1a), mekanik, nükleik asitlerin özellikleri yanı sıra, proteinler ile etkileşimleri hem de izlemek için kullanılan bir çok ilginç bir tek moleküllü bir tekniktir. MT çok gücügenel basitlik ve sağlamlık deneysel uygulama, tork uyduruk uygulama, doğal çalışma ve sabit kuvvet modunda 4 basit kalibrasyon, ölçümleri 5, 6 paralel uzantısı ve numune ısıtma ve fotohasar yokluğu da dahil olmak üzere s. Diğer tek-molekül yaklaşımlar karşılaştırıldığında, MT ≈ 10 FN gibi düşük güçlerine güç-bağımlılık ölçümleri gerçekleştirmek ve sade bir dille süperburulma derecesini kontrol etmek yeteneğine sahip bir yol sağlar. MTS ağırlıklı olarak nükleik asitleri 7, 8 içeren biyolojik süreçleri araştırmak için deneysel araç olarak kullanılmış olsa da, aynı zamanda protein 9-13 ya da hücreler 10, 14-17 mekanik özelliklerinin çalışmalarda uygulama bulmuşlardır. Çok sayıda yararlı referanslar MT 4, 18-20 oluşturmak ve çalıştırmak için nasıl açıklamak olduğunu mevcuttur.
However, geleneksel MT onlar tork uygulamak iken, doğrudan tork ölçmek değil, doğrudan dönme hareketi izlemek ve yok. Buna ek olarak, nükleik asit şeridin serbest dönmesini sınırlamak. Burada, biz mıknatıs cımbız iki uzantıları mevcut. İlk olarak adlandırılan serbest yörüngeli manyetik cımbız (FOMT, Şekil 1b) 21 sağlar, ip ekseni etrafında dönme hareketini kısıtlayıcı olmayan denge açısı dalgalanmalar ve bağlı nükleik asit moleküllerinin büküm değişikliklerin ölçümleri. İkinci, manyetik tork cımbız tek biyomoleküllere 22-27 hem kuvvet ve tork uygulamak ve doğrudan ölçmek için yeteneğine sahiptir (MTT, Şekil 1c), olarak adlandırılan.
Aşağıdaki protokol, okuyucu onun / onu elden bir 'geleneksel' MT enstrüman anda sahip olduğunu tahmin. Biz oluşturmak ve çalıştırmak kurmak MT, hem de nasıl başvuruları için Tartışma okuyucu bakın consideManyetik boncuklar, mıknatıslar, ve izleme rutinleri seçiminde dikkate alınmalıdır oranlarını gösterir. Buna ek olarak, bölümler 1 ve Protokol Metin 2 biz genellikle hazırlamak ve MT kullanılmaya yönelik bir DNA örneği yanı sıra, geleneksel MT tek bir DNA üzerinde gerçekleştirilebilir, ön ölçümler inkübe açıklanmıştır. Protokol Metin Bölüm 3 ve 4 bir MT enstrüman kolayca adapte FOMT ve MTT ölçümler için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Protocol
DNA 1. Numunenin. Hazırlanması ve Kuluçka
- Sırasıyla, 18 çoklu biotin ve digoksigenin gruplar ile işlevselleştirilmiş uçları (tipik olarak ≈ 600 bp DNA PCR fragmanlarının kullanılması) dubleks ligate edilir DNA yapıları hazırlayın. Başlangıç olarak,> 1, bir DNA bağlama ipi uzunluğu um, örneğin, burada kullanıldığı üzere ~ 2.7 um'lik gerilmiş bir uzunluğa tekabül eden bir 7.9 kbp, kullanım kolaylığı için tavsiye edilir; özellikle de, benzer ya da topuk kısmı yarıçapından daha kısa olan bir DNA uzunluğu kullanarak nedeniyle MTT ve FOMT olarak bağlanma geometrisi nedeniyle sorunludur. DNA uzunluğu açısal etki geçici yanıtı etkiler nasıl bir açıklaması için Tartışma bakın.
- Tek-molekül deneyler için akış hücreleri birleştirin. Akış hücreleri için, bir çift katmanlı Parafilm aralayıcı ile ayrılmış iki cam mikroskop lamelleri kullanın. Üst mikroskop lamel-ve sıvı hücreye satış için iki delik olmalıdır. Bu uygundurdelikler Kumlama kullanın. Alt lamel nitroselüloz (amil asetat içinde% 0.1 wt / vol) ile kaplanır. Alt slaytlar nitroselüloz kaplanmış tarafında Parafilm aralayıcıları yerleştirin ve temiz üst slaytlar ile üst kısmını kapatın.
- Akış hücreleri Seal. Fiziksel cımbız kullanarak, yaklaşık 1 dakika boyunca 80-100 ° C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı plaka üzerine monte akış hücresi yerleştirin. Parafilm giriş ve çıkış ve cam slaytlar iyi hizalanmış olduğunu bağlanmak deliklerini kapatmak olmadığını, akış hücresi de mühürlü olmasına dikkat edin.
Not: iyi bir sızdırmazlık sağlamak için, büyük bir pamuklu çubuk kullanarak strok dışarı Parafilm kabarcıkları tavsiye edilir. Akış Hücre daha sonra manyetik cımbız alet monte edilebilir. - Tamponlar hazırlamak. TE bağlama tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA), ve 200 mM NaCI) hazırlayın. Alternatif olarak, bir (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM fosfat tamponu, pH 7.4) ile takviye edilmiş PBS w tampon kullanabilirith 100 ug / ml BSA, bağlama tamponu olarak% 0.1 Tween ve 5 mM sodyum azit (PBS +). Akış hücre içine gömme 2-3 hücre hacimleri TE bağlama tamponu.
- ~ 30 dakika boyunca akış hücresi içinde 0,5 veya 1,5 um çapı manyetik olmayan bir lateks boncuk inkübe edin. Bu boncuklar bir (akış hücresi yani) objektif ve numune tutucu arasındaki sürüklenme etkisini en aza indirmek için izin manyetik cımbız ölçümleri sırasında referans boncuklar olarak hareket edecektir. TE bağlama tamponu 2-3 hücre hacimleri ile durulama bekâr olmayan manyetik boncuk yıkayın.
- En az 1 saat boyunca PBS içerisinde 100 ug / ml anti-digoksijenin ile inkübasyon yoluyla akış hücresinin alt yüzeyi işlevselleştirilmesi (tercihen daha uzun; inkübasyon gece boyunca gerçekleştirilebilir), DNA bağlanması için elde edildi. TE bağlama tamponu 2-3 hücre hacimleri ile durulayın. Son olarak yüzey pasivasyonu için, 30 dakika boyunca birleştirme TE tamponu içinde 2 mg / ml sığır serum albümini (BSA) ile inkübe edin akış hücresi.
- Bir kısım arasında alın2 ml streptavidin-kaplı süperparamanyetik myone boncukları (Malzemelerin Tartışma ve Tablo) ve 10 ml TE birleştirme tamponu ile seyreltin. 10 ml TE bağlama tamponu içinde bir manyetik parçacık yoğunlaştırıcı ve tekrar süspansiyon kullanılarak 10 ml TE birleştirme tamponu ile iki kere yıkayın. 30 dakika boyunca TE bağlama tamponu içerisinde kuluçkalama ile bu boncuklara DNA moleküllerinin (yaklaşık 1 ng) ~ 1 ml takın.
- 90 ml TE tamponu ekleyerek birleştirme DNA-gergin süperparamanyetik boncuk on-kat çözeltisi ile seyreltilir. Son olarak, akış hücresi içine enjekte solüsyonu ve anti-digoksigenin kaplı yüzeye DNA tespit olmasına imkan vermek için yaklaşık 1 saat boyunca inkübe edilir. TE bağlama tamponu ile iyice akış hücresi yıkayın. DNA konstruktlarının halata inkübasyondan sonra, bağlı olmayan tüm tanelerin çıkarılması için (bu TE bağlama tamponu olabilir) deney tamponu ile yoğun yıkayın.
- Manyetik boncuklara bağlı referans işareti boncuk gerektiren bir açısal izleme protokolünü kullanan ölçümleri için
Geleneksel Manyetik Cımbız içinde tek bir DNA molekülü üzerinde 2. Ölçümler
- Akış hücresi içinde döner kısıtlanmış DNA molekülleri için arama, geleneksel bir MT (Tartışma) uygun alan yapılandırma ile (Şekil 1a) ve translasyon ve mıknatıs konumun dönme kontrolünü hem de kullanma. ≥ 1 PN çekme kuvvetleri de (manyetik cımbız Yürürlükteki kalibrasyon ile ilgili referanslar 4, 19, 20, 28, 29 bakınız), gergin boncuk kolayca odak onların farklı yükseklikleri ile alt sürgünün yüzeyine yapışmış boncuklar ayırt edilebilir . Bir DNA molekülü, döner kısıtlı olsun, 20-30 dönüş getirerek değerlendirilebilir≈ 0.25 pN bir kuvvette mıknatısların s: Burada, urgan uzunluğu 0,4-0,5 mikron ile düşmelidir.
Not: Manyetik cımbız deneyler çalıştırmak için, görüntü işleme DNA gergin boncuk x, y, ve z konumunu belirlemek için kullanılır. Bu amaç için özel Labview yazılım istek üzerine yazarların edinilebilir.- Boncuk tek bir DNA ip ile takılı olduğundan emin olun. Bu> 1 pN (Şekil 2a) kuvvetleri pozitif ve negatif sarım altında davranışı karşılaştırılarak yapılabilir. Bir DNA bağlama elemanları, asimetrik bir yanıta neden olacaktır, oysa bu kuvvet rejimde, birden çok DNA iplerini varlığı, pozitif ve negatif döner sokulması üzerine uzantısında yaklaşık olarak simetrik bir azalmaya neden olacaktır.
- Uygun sabit boncuk kullanıcı ara referans boncuk olarak hizmet edebilir, ilgi konusu şeridin yakın alt yüzeyine yapışmış.
- T uzunluğunu kalibre, DNA, l. Flowcell yüzeyinin pozisyonu (0,2 pN altında bir kuvvet ~ 60 dönüşümlü olarak döner mıknatıs ile, örneğin) yüzeyi ile temas halinde gergin boncuk getirerek belirlenebilir. Bu yüzey ile ilgili olarak gergin boncuk dikey konumda ölçümleri daha sonra l mutlak değeri hakkında rapor.
Not: sürüklenme daha sonra etkilerini en aza indirmek için, yüzeye tespit edilmiş bir referans boncuk pozisyonuna l nisbetle ölçümleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. - Bir dönüş eğrisi ≈ 0.25 pN (Şekil 2a) bir germe kuvveti de (sarım sayısının bir fonksiyonu olarak DNA uzantısının yani ölçümü) kaydedin.
- Bu DNA molekülü burarak rahat hangi durumuna karşılık olarak uzatma, maksimum olduğu anda dönüşlerin sayısını belirleyin. Bunu yapmak için, bu merkezi positi belirlemek için bir parabolik ya da bir Gauss fonksiyonu ile yerel olarak dönme eğri uyması için yararlıdırüzerinde. "Sıfır döner" olarak bu noktayı tanımlayın.
Not: Bu amaç için özel rutin yazılı talebi üzerine yazarların edinilebilir.
- Bu DNA molekülü burarak rahat hangi durumuna karşılık olarak uzatma, maksimum olduğu anda dönüşlerin sayısını belirleyin. Bunu yapmak için, bu merkezi positi belirlemek için bir parabolik ya da bir Gauss fonksiyonu ile yerel olarak dönme eğri uyması için yararlıdırüzerinde. "Sıfır döner" olarak bu noktayı tanımlayın.
- ~ 20 mıknatıs pozisyonların bir dizi için, ("sıfır döner" de, yani adım 2.4.1 bakınız) burarak rahat molekülünün ortalama uzantısı belirlemek z-iz,.
- Adım 2,5 her bir ölçüm noktası için, tam x veya y konuma 20, 28, 29 dalgalanmalardan germe kuvveti belirlemek ya da boncuk mıknatıslanma yerel alan gradyanı 4 bilgisini kullanarak, iyi bilinen da temin edilmektedir. Bir kuvvet-genişleme eğrisini ortalama uzantı sonuçlar karşı germe kuvveti çizimi (Şekil 2b).
- Bouchiat ark 30 tarafından polinom yaklaşımını kullanarak solucan benzeri zincir denklemine çıkan kuvvet-uzatma veri sığdırmak.
Not: geleneksel MT yapılandırmada elde edilen halka yarıçapı ne kadar küçük olursa, o kadar yakından DNA molekülü daha yakın manyetik boncuk "güney kutbu" gergin edilir. Bir FOMT konfigürasyona geçer, bu tür bir DNA molekülü, (x, y) konumu (Tartışma) arasındaki dönme açısı, güvenilir izleme sağlayan manyetik boncuk "ekvator", yakından gergin olacaktır.
Serbestçe-yörüngedeki Manyetik Cımbız kullanarak DNA Twist 3. Ölçümleri
- El FOMT (Şekil 1b) için kullanılan bir silindir mıknatıs tarafından, geleneksel manyetik cımbız kare mıknatıslar değiştirin. Bu işlem, seçilen DNA ip görüş alanı içinde kalacağı bir şekilde yapılmalıdır.
- Kaba hizalama 7.9 kbp iplerini ile myone boncuk durumunda 15 dakika içinde gerçekleştirilir ve edilebilir tam zaman dairesel hareketlerle (Şekil 3b, merkezi) gözlem (x, y) geziler sonuçlarının ölçülmesi.
Not: Kaba hizalama 21, 31 (Temsilcisi Sonuçlar, Şekil 5), rağmen eşlik eden iki boyutlu histogram onun sayıları olmayabilir FOMT yapılandırmada tethered tek DNA'lar için bağlayıcı protein occasioned büküm değişiklikleri gözlemlemek için genellikle yeterlidir kesinlikle eşit dairesel halka (Şekil 3c) boyunca dağıtılmıştır.
Not: Şekil 4 gibi bir histogram ya termogramında dalgalanmaları komplo için MATLAB komut istek üzerine yazarların edinilebilir.
Not: İnce hizalama 7.9 kbp iplerini ile myone boncuk durumda 45 dakika içinde yapılabilir ve daha küçük boncuklar ve daha kısa iplerini azaltılmış üretildikten (Tartışma) istihdam edilmektedir.
Not: İnce hizalama genellikle çıplak veya protein kaplı DNA burulma direnci ölçümleri (Temsilcisi Sonuçlar, Şekil 4) gerçekleştirmek için gereklidir.
4.. Manyetik Tork Cımbız kullanarak DNA Tork Ölçümleri
- El ile silindirik bir mıknatıs artı MTT için bir yan (kalıcı) mıknatıs (Şekil 1c) tarafından FOMT için kullanılan silindirik mıknatıs değiştirin. Bu işlem, seçilen DNA ip görüş alanı içinde kalacağı bir şekilde yapılmalıdır.
- Bunu başarmak için en basit yolu el 1 dakika içinde yapılabilir onun doğru yerde yan mıknatıs, eklemektir. Başka bir yeniden düzenlenmesi gereklidir.
Not: bir yan mıknatıs için alternatif bir kullanımı,32'yi Elektromıknatıslar.
- Bunu başarmak için en basit yolu el 1 dakika içinde yapılabilir onun doğru yerde yan mıknatıs, eklemektir. Başka bir yeniden düzenlenmesi gereklidir.
- Analiz için gerekli, yerel alan gradyanı 21 bilgisini kullanarak, boncuk X veya Y dalgalanmaları kullanarak, MT için benzer bir şekilde kuvvet kalibre, kordonun mıknatıslanma Resim iyi bilinmektedir.
- Fiducial tabanlı bir izleme protokolü 23 ya da eşlik eden videoda gösterildiği gibi, (x, y)-pozisyonu (Tartışma) izleme dayalı açısal izleme protokolünü kullanarak zaman θ (t) bir fonksiyonu olarak açısal dalgalanmalar izleyebilirsiniz. İlk durumda, sonraki görüntü işleme için zamanın bir fonksiyonu olarak kordonun tam görüntü kaydetmek. Bu son durumda, bu aşamada da boncuk (x, y) dalgalanmaları kaydetmek için yeterlidir.
Not: referans tabanlı bir izleme protokolünde, zamanın bir fonksiyonu olarak kordonun tam görüntülerden θ (t) saptanması için bir komut MATLAB biristek üzerine yazarlardan ULLANILABİLEN.- Bu mıknatıslar (tipik olarak 0.1 Hz), birkaç tur döndürülür yavaş yavaş olan bir zaman iz kaydetmek için de tavsiye edilir (x, y)-pozisyonunun izlenmesi göre açısal izleme protokolü için, Tartışma tarif edildiği gibi. Bu bir doğru Tartışma denklemleri 3-5 kullanılarak polar koordinatlara (θ r) içine kartezyen koordinatlar (x, y) dönüştürmek için izin verecektir.
Not: (x, y)-pozisyonu istek üzerine yazarların edinilebilir izleme dayalı açısal izleme komut dosyası için bir MATLAB komut dosyası.
Not: ölçüm zaman istenen tork çözünürlük çoğunlukla bağlıdır. Ayrıntılı bir tartışma Lipfert et al 24 'de verilmiştir. Myone boncuklar ve 30-100 saniye boyunca ölçme 8 kbp DNA bağlama elemanları, ~ 1 pN · nm aralığında bir tork kararı vermek için yeterli olmalıdır.
- Bu mıknatıslar (tipik olarak 0.1 Hz), birkaç tur döndürülür yavaş yavaş olan bir zaman iz kaydetmek için de tavsiye edilir (x, y)-pozisyonunun izlenmesi göre açısal izleme protokolü için, Tartışma tarif edildiği gibi. Bu bir doğru Tartışma denklemleri 3-5 kullanılarak polar koordinatlara (θ r) içine kartezyen koordinatlar (x, y) dönüştürmek için izin verecektir.
- Th burulma tuzak sertliğini belirlemekaçısal dalgalanmalar e varyans kullanılarak (σ radyan cinsinden, 2 θ):
k θ = k B T / σ θ 2 (1)
Not: MTT elde tipik dönme tuzak sertliği 10-1,000 pN · nm / rad, geleneksel manyetik cımbız için daha düşük bir aralık içindedir. - Buna ek olarak, kordonun z-konumunu kaydetmek ve (aynı zamanda bakınız 2,4-2,7 adım) olarak şeridin uzunluğu l belirlemek için kullanabilir.
- Döndür N döner ve tekrar (t) ve l (t) θ kaydedebilirsiniz.
Not: MT kıyasla MTT azaltılmış dönme tuzak sertliği tek bir molekül tork ölçümleri için uygun bir hale getirir, fakat tatbik edilebilecek maksimum tork azalır anlamına gelir. Bu MTT hızlı dönmesinden kaynaklanan yüksek çekme momentlerini dengelemek mümkün olmayabilir anlamına gelir. Bakım dolayısıyla maksimum hızı geçmeyecek şekilde alınmalıdır; typically 0.1 Hz yakın oranlarda döndürün. - N kullanarak kapandıktan sonra nükleik asit ipten biriken torku belirleyin:
Γ = - k θ <θ N - 0 θ> (2)
Burada <...> ortalama ve θ 0 ve θ N sıfır dönüşlerde açı (a torsiyonel olarak rahat bir ip için tekabül eden temsil eder, sırası ile, bkz. 2.3 adım ve N döner. - Tekrar tam olarak tek bir ölçüm vadede bir molekülün tork tepkisi (Örnek Sonuçlar, Şekil 6) tespit etmek için 4.5 ve gerektiğinde 4.6 adımları tekrarlayın.
Representative Results
MT (Şekil 1a) gelen Örnek sonuçlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Şekil 2a, F alındığı bir 7.9 kb DNA = 0.25, 0.5, ve 2.0 pN için dönme uzantısı eğrilerini göstermektedir. Dönüş için tek DNA yanıt pozitif veya negatif plectonemic sarımları oluşumunun bir sonucu olarak azalan DNA uzantısı ile en düşük güçler (0.25 pN) seviyesinde simetrik olmalıdır. Başlangıçta bir dönel kısıtlı DNA sabrının (2.1 adım) ararken, bu tepkinin niceliksel bilgi yararlıdır. Şeridin ek kontrol, tek bir DNA molekülü içerir doğrulamak için gerekli olduğunu Not: Burada, 0.5 PN aşan kuvvetlerine rotasyona tek bir DNA yanıt birden fazla asimetrik DNA'lar (aşama 2.1.1) ayırmak için yardımcı olur. Bu doğrulandıktan sonra, bir döner mıknatıs tam sayısını belirlemek için 0.25 pN de dönme tepki döner hangi tek bir DNA ibir Şekil 2 b benzemesi gerektiğini bir kuvvet-uzatma eğrisi, nereye götürürse, burarak rahat s. Bu özel ölçüm için, solucan benzeri zincir modeli (düz çizgi) için bir veri uygun donanımlı bir kontur uzunluğu L C = 2.71 mikron ve bükme kalıcı uzunluğu L P = 45 nm vermiştir. DsDNA için, kalıcılık uzunluğunun monte değerleri, tampon koşulları 33 bağlı olarak, aralık 40-55 nm bulunmalıydı ve monte kontur uzunlukta DNA yapısı için beklenen değere yakın bir (tipik haliyle% 10 içerisinde) olması gerektiğini ilişki L DNA = 0.34 nm / bp · baz çifti sayısı kullanarak ölçümleri kullanılır.
Şekil 3, FOMT prosedürleri ve hizalama sonuçlarını (Şekil 1b) göstermektedir. Adım 3.2 'de kaydedilen ilk (x, y) geziler bir işlev olarak o dalgalanmaların genel görünümüne göre olabilirf FOMT düzenlenen mıknatıs ve DNA-gergin kordonu arasında daha sonra nispi yer değiştirmeyi yol göstermek için kullanılabilecek bir "vorteks" modelini göstermektedir Şekil 3a'da gösterildiği enine mıknatıs konumu. Takip eden kaba ayar tamamlandığında da Şekil 3b'de siyah iz ile gösterildiği gibi, boncuk (x, y)-dalgalanmaları, dairesel yörünge dışarı iz. Bu noktada, z-ekseni etrafında mıknatıslardan tork termal dalgalanmaların bağlantı noktası etrafında döndürmek için boncuk yeterli olduğu noktaya kadar azaltılır. Çıkan dairesel halkadan (monte daire kırmızı gösterilir) ve yarıçapı R daire DNA bağlanma noktası ve boncuk merkezine (Şekil 1b) arasındaki radyal mesafeyi temsil eder. Şekil 3c'de gösterildiği gibi, ancak, Şekil 3b'de verilerin bir histogram kaba hizalama yeknesak bir şekilde kaplanmasını garanti etmez göstermektedirdairesel annulus boyunca tüm olası pozisyonları. Termal dalgalanmalar çember üzerindeki bütün rotasyonlar açısını keşfetmek için yeterli olsa da, serbest rotasyona (termal enerji k B T düzeni), küçük bir enerji engeli orada kalır.
Ince hizalama FOMT (adım 3.4) de gerçekleştirildiği zaman, alet DNA bükülme modülüne (Şekil 4) tespit için de kullanılabilir. İlk olarak, numunenin ince hizalama olan iki boyutlu histogram hemen (Şekil 4b) yeknesak bir şekilde kaplanmasını göstermelidir dairesel hareket (Şekil 4a) elde etmek için kullanılır. ((X, y)-pozisyonlar dönüşümünden elde edilen, aşağıya bakınız) açısal dalgalanmalar gelen zaman iz q (t) hiçbir dönemsellik 360 ˚ (Resim 4c) tekabül gösterir ve birkaç tam dönüşler tekabül büyük geziler (Şekil ortaya 4d). Ima enerji manzara> 1000 ˚ (Şekil 4e) bir aralığı üzerinde harmonik. Dalgalanmalar standart sapması k bir açısal tuzak sertlik karşılık, σ θ = 223 ° θ = k B T / σ θ 2 = 0.27 pN · sırayla etkili burulma sebat uzunluğunda bir tahmin verir nm / rad, ölçülen kuvvetinde C = C L / σ θ 2 ~ 76 nm (bu ölçümünde kullanılan 3.4 kbp DNA L C = 1.150 nm) eşit DNA.
FOMT proteinlerin 31 bağlanması ile gergin DNA molekülüne bağlı büküm değişikliği ölçmek için nasıl kullanılabileceğini bir örnek, 34, Şekil 5'te gösterilmektedir. Burada, çift için RAD51 proteininin takip adresSarmallı DNA; RAD51 Uzatmak hem bilinen ve bir Nukleoprotein filaman 31 formları olarak DNA gevşeyin edilir. Akış-hücre içine Rad51 basması üzerine, biz boncuk FOMT (Şekil 5a) bir sarmal yörünge uğradığını görüyoruz. Yukarıda tarif edildiği gibi q (t) için, zamanın bir fonksiyonu olarak (x, y) hareket dönüştürme iz, biz RAD51 DNA bağlama ipi uzunluğu ve sökülme derecesinin üzerinde sahip olduğu etkiyi-Plot birlikte (Şekil 5b, c) .
DNA burulma özelliklerini ölçmek için alternatif bir yaklaşım, MTT (Şekil 1C, Şekil 6) bulunmaktadır. Şekil 6A'da şematik ölçüm ilkesini göstermektedir: aşırı dönme sonra (ya da underwinding) N ile DNA ip döner DNA θ N-0 θ arasındaki denge açısal pozisyonunda bir değişikliğe yol açar tane üzerinde bir geri dönüş torku uygular. MTT manyetik alanın enine bileşen hala boncuk rotasyon (Şekil 1) izin verecek şekilde bu tür açısal kaymaların ölçümü kolaylaştırır MT ile karşılaştırıldığında azalır. N = 45 uygulandıktan sonra ölçülen açısal kaymasının büyüklüğü 7.9 kbp DNA döner Şekil 6b'de gösterilmiştir. MTT ölçüm protokolü ve DNA için dönüş eğrisi bir tork elde edilen sonucu tam sekansı, Şekil 6c-f olarak gösterilmektedir. Burada, koordinat açısal standart sapma (Şekil 6c) ve ortalama (Şekil 6d) ölçümleri, standart sapma açısal tuzak sertlik (Denklem 1) ile ters orantılı olmak üzere, aşırı ve underwinding bir fonksiyonu olarak gösterilmektedir. Birlikte ele alındığında, bu miktarlar merkezli bir lineer tepki bölge göstermelidir DNA dönüş eğrisi (Şekil 6f), karşı bir tork oluşturmak için izin yaklaşık 0 a dönüşürnd iki plato, bu pozitif ve negatif olarak dönüş moment doymuş, sırasıyla. Rotasyon eğrisi böyle bir tork böylece DNA'nın çökertme ve denatürasyonunu eşlik geçişleri miktarının, rotasyon eğrisi (Şekil 6e) karşı bir uzantısı bilgileri tamamlar.
Şekil 1.. Konvansiyonel manyetik cımbız Şeması (MT), serbestçe yörüngesindeki manyetik cımbız (FOMT), manyetik tork cımbız (MTT) ve dönme açısı izleme için iki strateji. (A) manyetik cımbız her üç yürütmesinde, manyetik boncuk işlevselleştirilmiş makromoleküllerin bir akış hücresi yüzeyine gergin olan, örneğin, iki-şeritli DNA molekülleri, şematik olarak gösterilmiştir. Referans boncuk akış hücre yüzeyine bağlı ve Drif için izlenirt düzeltme. Her üç MT set-up, bu nedenle, DNA urgan manyetik boncuk üzerinde yukarı yönlü bir germe kuvveti uygulamak için mıknatıslar kullanır ve. MT Geleneksel olarak, mıknatıs bir çift sıkıca DNA-ip ekseni etrafında dönmesini sınırlayıcı kordonun enine ip eksenine göre yönlendirilmiş bir manyetik alan uygular. FOMT olarak, silindir şeklinde bir mıknatıs ip doğrultu boyunca yönlendirilmiş bir manyetik alan sağlar. Ip silindir şeklindeki mıknatıs merkezine hizalandığında, kalan enine alanları MTT olarak ip ekseni etrafında serbest dönüşünü sağlayan, en aza indirilir, bir yandan mıknatıs sağlamak amacıyla FOMT kullanılan silindir şeklindeki mıknatıs ilave edilir (MT göre büyüklük olarak azaltılmış) küçük bir enine alan. Bu küçük alan enine torkun uygulanmasını yanı sıra ölçüm sağlar. (B) DNA-bağlama ipi ekseni manyetik boncuk dönme açısını ölçmek için iki strateji gösterilmiştir. 1): Bir işaretleyici boncuk (Green) manyetik boncuk (kahverengi) bağlı analizler hayal izleme açısını sağlayan asimetrik bir görüntü verir. 0.5-mikron yarıçaplı fiducial işaretleyici ile 1.4-mikron yarıçaplı manyetik boncuk iki CCD görüntüleri odak ve out-of-odak, gösterilmektedir. 2): DNA uzak boncuğa güney kutbu bir pozisyonda manyetik boncuk gergin olduğu zaman, kordonun merkezi olan merkezi bir açısal konumunu tanımlayan bir yay boyunca değişiklik gösterir. Ip burarak böylece tek bir molekül tork ölçümleri sağlayan, (sağda izleri) gergin olarak iki strateji dönüş açısı izlemek için ve açı konumunda vardiya izlemek için kullanılabilir.
Geleneksel MT Şekil 2,. DNA kalibrasyon ölçümleri. F = 0 alındığı bir 7.9 kb DNA için (a) Dönüş-uzatma eğrisi.25, 0.5, ve 2.0 pN. Bir çift sarmallı DNA iplerini pozitif ve negatif döner dönme altında, asimetrik yanıt ip bağlanma için uygun bir test olarak kullanılabilir. Birlikte bir uyum ile bir 7.9 kb DNA için (b), kuvvet-uzatma eğrisi, solucan- Bir monte kontur uzunluğu L C elde zinciri modeli (düz çizgi) gibi = 2.71 mikron ve bükme kalıcı uzunluğu L P = 45 nm. Tüm ölçümler PBS tampon maddesi içinde gerçekleştirildi.
FOMT Şekil 3.. Hizalama. (A) (x, y) mıknatıs konumunun bir fonksiyonu olarak FOMT düzenlenen DNA-gergin kordonun dalgalanmaları. Silindirik mıknatısın konumu x 250 um 'lik adımlarla akış hücre yüzeyi üzerinde 3 mm'lik sabit bir yükseklikte taranır ve daha
Şekil 4,. FOMT kullanılarak DNA burulma sertliğinin ölçülmesi. (X, y)-yörünge (a) ve histogram (b) bir DNA-tethFOMT göreli mıknatıs-halata konumunun ince uyum sonra boncuk dalgalanmaları uzanırlar. Bu koşullar altında, histogram daire üzerine pozisyonların esasen homojen kaplama ortaya koymaktadır. (X, y)-konumları. (D) dönme dalgalanmaların Histogram saptanan kordonun (c) Dönme dalgalanmaları. Kırmızı çizgi σ θ = 223 ° ile bir Gauss uyum olduğunu. (E) dönme dalgalanma (c) dan yoğunluğu ve (d) ima enerji manzara. Dönel değişimlerinden ima enerji manzara ve (k θ = k B T / σ θ 2 = 0.27 pN-nm/rad) ile bir harmonik yaklaşım arasındaki fark, birkaç tur fazla termal enerji k B T çok daha küçüktür. Veri böyle netlik için ofset olması 0 = 0 θ. Genişliğidalgalanmalar, DNA'nın burulma sertliğini belirlemek ana metni görmek için kullanılabilir. Ölçüm ~ 1 pN bir germe kuvveti de PBS tamponu içinde gerçekleştirildi. Veri Lipfert et al 21 uyarlanmıştır.
Şekil 5,. DNA'ya RAD51 protein bağlanma FOMT kullanılarak ölçülmüştür. (A) gergin 7.9 kpb'lik dsDNA'nın üzerine RAD51 protein Meclisi 3.5 pN izlenmektedir. (X, y, z) meclisin ilk 200 sn boyunca manyetik boncuk (çap 1.0 mm) tarafından yürütülen-yörünge süresi maviden kırmızıya renk kodlu ile gösterilmektedir. (B) dsDNA'nın uzantısı çıkarılabilir çıkarsanan dsDNA ip ekseni (a), zamanın bir fonksiyonu olarak. (c) dönme açısı içinde, topuk kısmı yörünge z-bileşeninden, x, zamanın bir fonksiyonu olarak, (a) 'de boncuk yörünge y bileşenleri.
MTT tek bir DNA ip Şekil 6. Tork ölçümleri. (A) şematik tork ölçüm prensibini gösteren. (Altı-ya da fazla) N, DNA bağlama ipi döner sarma sonra, DNA θ N-0 θ arasındaki denge açısal pozisyonunda bir değişikliğe yol açar tane üzerinde bir geri dönüş torku uygulamaktadır. Kullanılan açı izlerinin (b) Örnek torkunu ölçmek için:. bir st düzenlenen PBS tamponunda 7.9 kbp'lik DNA molekülü üzerinde (mavi) ve 40 dönüşleri (koyu kırmızı) tanıttıktan sonra bir burarak rahat 7.9 kbp'lik DNA molekülüne gergin bir boncuk açısal dalgalanmalar (cf) Tork ölçümüfiducial işaretleyici boncuk tabanlı açısal izleme protokolü kullanılarak ~ 3 pN kuvveti öğürme. Açısal dalgalanmalar (b) uygulanan dönüş sayısının bir fonksiyonu olarak kaydedildi. (C) açısal dalgalanmalar standart sapması uygulanan döner bir fonksiyonu olarak gösterildiği gibi. Dalgalanmaların genişliği sabit bir açısal tuzak sertlik gösteren, yaklaşık olarak sabittir. (D) uygulanan döner bir fonksiyonu olarak ortalama dönüş açısındaki değişim. Aşırı ve underwinding üzerine ortalama açı sistematik değişimleri görülür. (E) uygulanan döner bir fonksiyonu olarak aynı anda kontrol DNA bağlama ipi uzatma. (F) (d) 'de gösterilen ortalama açıdan belirlenen DNA şeridin tarafından uygulanan tork , ana metni görürsünüz. Aşırı ve sıfır etrafında döner underwinding doğrusal bir tork vs doğurur (~ 7 etkili burulma kalıcılık uzunluğunu belirlemek için kullanılan DNA-halata (takılı gri yamaçlar iyon (d) ve (f)) tepkisini dönerBu veri seti boyunca 7 nm). Daha fazla burkulma ve (şematik ilavelerde gösterilmiştir) plectonemic sarımları oluşumu, (~ 26 pN · nm'de (f) pozitif dönüşlerde siyah çizgi) bir tork ve plato sayısı ile halata uzantısının bir doğrusal azalmaya karşılık gelen yol aşırı dönme sarım () e (siyah eğim). Doğrusal rejimin ötesinde Sağılma ((f) de ~ -11 pN · nm olumsuz dönüşlerde siyah çizgi) erime tork eşit bir tork plato ile işaretlenmiş, (soldaki ilavelerde gösterilen) yerel eritmek için DNA olur.
Discussion
MTT veya FOMT kullanarak deneyler çalıştırırken, seçimler bir numarası vb boncuk, mıknatıs, izleme protokolleri, yapılacak en iyi seçenek ilgi deney bağlıdır konusunda yapılması gerekmektedir. Aşağıda, belirli bir deney için seçimi kolaylaştırmak gereken, farklı seçimler eşlik dengeler açıklar. Sonra, MTT ve FOMT deneylerin uyum ve çalışan eşlik çeşitli kritik adımları anlatacağız. Son olarak, biz mevcut yöntemlere göre hem de gelecekteki uygulamaları ile MTT ve FOMT önemini tartışmak.
Önceki MTT ve FOMT Deneylerin Başlat Hususlar
Herhangi bir deneme kullanımı için manyetik boncuk bir türünü seçmek için birini gerektirir. Bir kaç piyasada bulunan streptavidin kaplı süperparamanyetik boncuklar, örneğin, 0.25 mikron yarıçapı boncuk, 0.5 mikron yarıçapı boncuk, veya 1.4 mikron yarıçapı boncuklar (ler arasında seçim yapabilirsiniz) malzemeleri tablo ee. Daha büyük taneleri (yaklaşık hacim olarak ölçekleme) daha küçük boncuklar ile karşılaştırıldığında, artan bir manyetik an olacaktır ve bu nedenle bunların kullanımı, daha yüksek kuvvetlerinin uygulanmasını kolaylaştıracak (eden araçlar sağlanmıştır tipik kuvvetleri için Tablo 1 'e bakınız). Işaretleyici boncuklar kullanılarak açısal izleme istendiği zaman, tipik olarak 1.4 mikron çapa sahip çalışma ve (karşılık gelen bağlanma protokolü için paragraf 1.9) işaret boncuklar olarak 0,5 um çapı manyetik olmayan bir biyotinile boncuk kullanır. Küçük boncuk kullanımı özellikle boncuk rotasyon τ için karakteristik zaman ölçeği olarak C gerçekten yay sabiti γ / k θ üzerinden sistemin sürükle oranına eşittir, FOMT için tavsiye edilir; önemlisi, ~ R boncuk 3, yani yarıçapının üçüncü gücü gibi açısal ölçüm zamanı gam hakkında dönme sürükleme katsayısı için (bkz. Tablo 2karakteristik zaman birkaç FOMT boncuk-DNA kombinasyonları ve MTT ölçümler) için ölçekler. Uygulanabilecek maksimum kuvvete eşlik eden azalmalar silindirik mıknatıslar 27 ters çevrilmiş bir yığın kullanılarak ele alınabilir. Bununla birlikte, FOMT ölçümlerde bazen en iyi elde zamansal çözünürlük ve maksimum uygulanan kuvvet arasında uyum sağlamak için gerekli olabilir.
Buna ek olarak, bir deney bir mıknatıs konfigürasyonun seçimi gerektirir. , Geleneksel manyetik cımbız konfigürasyonu (Şekil 1a) olarak, tipik olarak, 4 mıknatıslar arasında bir 0.5 veya 1 mm bir boşluk ile dikey olarak 5x5x5 mm kübik bir çift mıknatıs kullanın. Mıknatıslar x (y) ekseni boyunca aralanmıştır, bu esas olarak x (y) ekseni boyunca yönlendirilen bir manyetik alan oluşur. FOMT deneyler için, silindir şeklinde bir mıknatıs kimin merkez manyetik alan esas yöneliktir seçilirz ekseni boyunca (Şekil 1b). Uygulamada, 6 mm toplam kalınlık için, bu tür üç silindirik şekilli mıknatıslar, 6 mm çapında ve 2 mm çaplı bir merkezi deliği olan, her bir yığın kullanın. Daha yüksek çekme kuvvetleri arzu edildiği zaman, alt mıknatıs karşı manyetizasyon ile istiflenmiş edildiği bir "ters çevrilmiş yığın" mıknatıs konfigürasyonu tercih edilir. MTT konfigürasyonu (Şekil 1c) elde etmek için, biz, FOMT yapılandırma, 4 mm çaplı ve 7 mm yükseklikte tipik olarak, bir katı silindirin ana mıknatıs yığının tarafına ek bir mıknatıs ilave edin. Bizim araçların elde maksimal kuvvetleri mıknatıs yapılandırmaya bağlı görmek bkz. Tablo 1 için.
MTT ve FOMT Deneylerin Hizalama
Manyetik boncuklar (yaklaşık olarak) eşit işlevselleştirilmiş yüzeye sahip olduğu için (tipik olarak streptavidin) ile fonksiyonelleştirilmiş n her ikisinin de bağlanması bu yanaucleic asit bağlama elemanları, ve işaretleyici boncuk (durumda markör boncuk esaslı açısal izleme kullanılır) bağlayıcı ve / veya manyetik işaretleyici boncuk boncuk takmak burada çözelti içinde basit bir kuluçkalama ile, tek bir kontrol etmez oluşur. Manyetik boncuklar dış alanın yönü boyunca hizalamak eğilimi tercih edilen bir mıknatıslanma eksene sahiptir. Biz tercih mıknatıslanma ekseni kuzey ve güney kutupları olarak boncuk yüzeyini kesen kredi ifade, daha sonra DNA-bağlama ipi ekvatora yakın bağlı olduğu boncuklar yakın ya da hafif daha büyük bir çapa sahip dairesel bir halkaya üzerinden yazacaktır FOMT boncuk yarıçapı; aksine, güney kutbuna yakın bağlı boncuk Denklem 3-5 kullanılarak dairenin uydurma engel, hangi FOMT çok küçük yarıçaplı dairesel bir halkanın üzerinde dalgalanma olacaktır. Biz basit küresel geometri ile, ekvatora yakın bağlama olasılığı tam kutuplarda bir eki çok daha büyük olduğuna dikkat; Bu nedenle, en bEADS gergin olacak (x, y) dayalı açısal izleme başarılı bir şekilde gerçekleştirilebilir şekildedir.
Benzer bir tartışma referans işaretçi göre açısal takibi için markör boncukların bağlanması için de geçerlidir. Işaretleyici boncuk açısı izlemeyi sağlayan manyetik boncuk görüntüde bir asimetri oluşturmak için kullanılır. Işaretleyici boncuk boncuk (yani doğrudan üstünde veya altında) kuzey ya da güney kutbunda tam bağlıysa, çıkan görüntü yine rotasyona simetrik ve açısal izleme protokol başarısız olur. Ancak, aynı küresel geometri argüman tarafından, bir işaretleyici boncuk kutuplarından birinde doğrudan eklemek için şans nispeten küçük; pratikte en işaretleyici boncuk açısal izlemeyi etkinleştirmek için yeterli bir asimetri vermek bulabilirsiniz. Son olarak, geleneksel manyetik cımbız alan yönünde (x, y)-düzleminde olduğuna dikkat ediniz; bu nedenle, kordonun tercih edilen bir mıknatıslanma eksen th hizalanacaktıre (x, y)-düzlemi ve kuzey ve güney kutupları, yukarıda tanımlandığı gibi, kordonun kenarlarında olması muhtemel kutuplar üst ve alt kısmında FOMT veya MTT, durum. olacak
FOMT deneylerde, önemli bir adım, radyal manyetik alan boncuk yakınlık ihmal edilebilir olduğu şekilde silindirik mıknatısın hizalamasıdır. Bu uyum, bir seferde tek bir boncuk için yapılır. FOMT boncuk hareket eşit bir dairesel halkanın üzerinde dağıtılmış olup olmadığını yargıç için, ölçüm süresi 20 · τ C'yi aşmamalıdır. Τ C 8 kbp DNA ve 0.5 mm çapında boncuk için ~ 45 sn eşit olarak, ölçüm süresi uyum son aşamalarında ~ 900 sn. 1.9 kbp DNA karşılaştırılması, kullanımı ve 0.25 mm çapında boncuklar için τ C yirmi katlık bir ~ 2 saniye (ayrıca tablo 2'yi görünüz) azaltır.
F sırasında Takip için Kritik Adımlar ve DüşüncelerOMT ve MTT Deneyleri
Boncuk düzlem dalgalanmaları izlemek için, onun (x, y)-konumunda, yani, daha sonra biz zaman aralıkları 35, 36 bir boncuk tarafından görüntülenen yoğunluk profilleri bir çapraz-bağıntı analizi kullanılabilir. Bu birkaç nanometre 20 bir doğruluk alt-piksel çözünürlükte yapılabilir. Z boncuk hareketi izlemek için, tipik olarak, nükleik asit, 20 bağlı olan boncuk kırılma halkaları görüntüleme sırasında amacı, odak düzlemi (OFP) doğru dikey yönde kaydırılır, burada ilk olarak, Gosse ve Kroket tarafından tasarlanan bir yöntem kullanınız . Bu şekilde, bir kalibrasyon profil çubuk ile OFP 19 arasındaki mesafeye göre boncuğun kırılma motifi arasında ilişki üretilir. Bu kalibrasyon profili interpolasyon zaman, boncuk, dikey yer değiştirmeler de birkaç nm, 20 kadar bir hassasiyetle ölçülebilir.Biz daha rafine izleme algoritmaları 37, 38 yanı sıra birden fazla boncuk 5, 6, 37 izleme paralel uygulamalarını açıklayan ek başvurular okuyucu bakın.
Açısal koordinatlara (x, y)-pozisyonların dönüşüm dayanır açısal izlemeyi kullanırken, biz şöyle devam tavsiye. Boncuk kullanmak, dairesel bir halkasını dışarı izleri hangi bir zaman izlemesi (x i, y i) pozisyonları (ben nerede sonraki ölçüm noktaları gösterir indeks) daire merkezini (x 0, y 0) ve yarıçapı R daire sığacak en aza indirerek (Şekil 2a):
(3)
toplamı tüm veri noktaları üzerinde çalışır nerede. Fitti sonrang x 0, y 0 ve R daire kullanarak zaman iz her veri noktasının kutupsal koordinatları (r i, θ i) belirler:
(4)
(5)
Bir fazlı ± bir atlayış π uygun durumlarda eklemek için, yani açı θ "açmak" için bakmak gerektiğini unutmayın. (R, θ) koordinatları (x, y) montaj ve dönüşüm için özel yazılmış kod istek üzerine yazarların edinilebilir. FOMT olarak, boncuk bir dairevi çark üzerinden izler iz hangi bir zaman hizalama kaba (bakınız adım 3.3) sağlanması ve boncuk termal dalgalanmaları kayıt ile elde edilebilir. MTT, termal olarak fluctuations dairevi çark dışarı iz yetersiz; Bunun yerine, Denklemler 3-5 kullanarak daire sığacak şekilde birkaç tur döndürülür mıknatıslar (genellikle 0.1 Hz) yavaş yavaş olan bir zaman iz kullanın.
Biz, (MTT için, bu açısal izleme işaretleyici (Şekil 1 c, Şekil 1d, Şekil 3a) ile veya açısal koordinatları halinde (x, y)-pozisyonların dönüşüm yoluyla, yani uygun bir açısal izleme yaklaşımı, seçim için önemli olduğuna dikkat Şekil 1d, Şekil 2b). Tipik olarak (x, y)-pozisyonları ve işaretleyici boncuk kullanımından açısal izleme doğruluk karşılaştırılabilir iken, tarif edildiği gibi bu çapraz-karışma, (x, y) ve açısında bir boncuk dalgalanmalar arasında meydana gerçekleştirmek için önemlidir Janssen ve diğerleri 32: Bu şekilde, (x, y)-pozisyonlarından açısal izleme Resim geçerli olduğu (x Brownian dalgalanmalar, Y) koordinat açısal belirsizlik ve (x, y) izleme yan mıknatısın konumunun ayarlanması ile dönme tuzak sertliğinin ayarlama gerektirebilir onun doğru kullanımı için sadece önemsiz ölçüde katkıda bulunur. Tipik olarak, daha yüksek sertlik tuzak kullanılmasıdır işaretleyici boncuklar kullanılarak açısal takip kullanımını gerektirir. Işaretleyici boncuk kullanılması (aşama 1.9 'de bağlanma protokolü) kullanılabilir iplerini sayısını azaltabilir bir başka ek bir adım gerektirir. Işaretleyici boncuk-tabanlı izleme kullanırken, bir işaretleyici boncuk iyi sonuçlar için ekvatora yakın bağlı olan manyetik boncuk seçmek önemlidir.
FOMT ve MTT Önemi Mevcut Yöntemleri ve Uygulamaları karşılaştırıldığında Yaklaşımlar
Yukarıda, kolaylıkla MTT veya FOMT içine aleti dönüştürmek için mıknatıs yapılandırmaları ve değişiklikler, bir geleneksel MT başlangıç nasıl göstermiştir. Bu basit modification, bir açısal izleme marker kullanımı istenen açısal izleme giriş eşlik edilebilir, bu bağlı olarak, tork uygulamak tork ölçmek veya büküm ölçmek için kullanıcıya izin verir gibi, her iki yapılandırmaları derhal bir güçlü noktası eldeki deneme. Giriş kısmında belirtildiği gibi, FOMT ve aynı zamanda paralel ölçümler 5 yeteneği yararlanan özellikle de MTT ile, özellikle sadeliği, MT mevcut güçlü birçok ikinci MTT yarar her ikisi de 6 (verilen bu kadar kolay FOMT elde değildir silindirik mıknatısın merkezi ile ilgili olarak şeridin hizalanma gerekliliği). Özellikle, MTT ve FOMT diğer tekniklerle, özel olarak imal edilmiş nano-parçacıklar 22, 39, 40, karmaşık bir optik tasarım 41, ya da gergin içinde ek boncuk tanıtımı (DNA) molekülü, 42 aksine, gerektirmez. O Bu türorada teknikler de bu tür daha yüksek zamansal çözünürlüğü 27, 43, 44 gibi başka avantajlar sağlayabilir. DNA moleküler motorların davranışı hem de etkilenir ve yerel büküm ve tork için sonuçlara sahip olarak FOMT MTT ve her ikisi de, genom işleme çalışmaya gelecek uygulamalar bulmak gerekmektedir. Ek uygulamalar DNA nanoteknoloji 27 çıkan alanında veya biyolojik işleme 7, 45 aktif döner motorların daha geniş bir alan bulunabilir.
| M270 (R boncuk = 1.4 um) | Myone (R boncuk = 0.5 um) | ADEMTECH (R boncuk = 0.25 um) | |
| Konvansiyonel MT (kübik 5 x 5 x 5 mm 3 mıknatıs çifti, 1 mm boşluk, dikey hizalama) | 70 pN | 8 pN | 1.6 pN |
| FOMT veya MTT * (üç silindirik mıknatıslar yığını, 6 mm çaplı, 2 mm çaplı boşluk) | 9 pN | 1 pN | 0.2 pN |
| FOMT veya MTT * (üç silindirik mıknatıslar yığını, 6 mm çapında, 1 mm çaplı boşluk) | 18 pN | 2 pN | 0.4 pN |
| FOMT veya MTT * (sonuncusu üç silindirik mıknatıslar yığını saygısız, çapı 1 mm boşluk) | ~ 50 pN | 9 pN | 1.8 pN |
* MTT küçük yan mıknatısın varlığı germe kuvveti üzerinde önemsiz bir etkiye sahip
Tablo 1. Maksimum kuvvetler tipik olarak farklı mıknatıs konfigürasyonları ve boncuk türleri için elde etti.
| R boncuk = 1.4 um | R boncuk = 0.5 um | R boncuk =0.25 mikron | |
| Sürtünme katsayısı * | 120 pN · nm · sn | 5.5 pN · nm · sn | 0.7 pN · nm · sn |
| Karakteristik zaman ölçeği: FOMT, 10 kbp'lik DNA ** | 1200 san | 55 sn | 7 sn |
| Karakteristik zaman ölçeği: FOMT, 1 kbp'lik DNA | 120 sn | 5.5 sn | 0.7 sn |
| Karakteristik zaman ölçeği: MTT, k, q = 100 pN · nm / rad | 1.2 sn | 0.06 sn | 0.007 sn |
| Karakteristik zaman ölçeği: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad | 0.12 sn | 0.006 sn = 6 milisaniye | 0.0007 s = 0.7 msn |
* "Ekvator" aracılığıyla bir eksen etrafında dönmek için sürtünme katsayısı (Şekil 1b de gösterildiği gibi bir durum, yani), 14 ile verilen p · · s · s tampon viskozitesidir R boncuk 3,.
** FOMT olarak, dönme tuzak sertlik DNA burulma sertliği, k, q ile verilir, DNA = C · C, etkin burulma kalıcılık uzunluğudur k B T / L C, (burada 80 nm olduğu varsayılmıştır bir ara kuvvet rejimi, F ~ 1 pN edilmiş) ve L C karakteristik olan DNA, baz çifti başına 0.34 nm kontur uzunluğudur.
Tablo 2.. Sürtünme katsayıları ve karakteristik zaman FOMT ve MTT için ölçekler.
Disclosures
Bu işle ilgili bir patent başvurusu PCT/NL2011/050446 altında açılmıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma TU Delft, Bilimsel Araştırma Hollanda Örgütü (NWO), Maddenin üzerine Temel Araştırma Vakfı ve Avrupa Bilim Vakfı tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
| Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
| Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
| Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
| Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
| Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
| Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
| Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
| Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
| Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
| Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
| Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
| High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
| Software for coding analysis routines | The Mathworks | MATLAB | custom-written routines are available from the authors |
References
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271, 1835-1837 (1996).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421, 423-427 (2003).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods. 5, 491-505 (2008).
- Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).
- Ribeck, N., Saleh, O. A. Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers. The Review of scientific instruments. 79, (2008).
- De Vlaminck, I., et al. Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering. Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).
- Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective. Cell. 142, 519-530 (2010).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).
- Ajjan, R., et al. Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity. Blood. 111, 643-650 (2008).
- Mierke, C. T., et al. Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain. Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).
- Shang, H., Lee, G. U. Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction. Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).
- Shang, H. K. P., et al. The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries. J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).
- Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. Implementation of force differentiation in the immunoassay. Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).
- Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).
- Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).
- Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers. Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).
- Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases. Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).
- Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorder, P., van Oijen, A. , Springer. (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).
- Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications. 2, 439 (2011).
- Celedon, A., et al. Magnetic tweezers measurement of single molecule torque. Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).
- Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics. The Review of scientific instruments. 82, (2011).
- Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments. Nature. 7, 977-980 (2010).
- Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers. Physical review letters. , 102 (2009).
- Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. Soft magnetic tweezers: A proof of principle. Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).
- Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami. Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).
- Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data. Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).
- Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. The Review of scientific instruments. 83, (2012).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).
- Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament. Nucleic acids research. 41, (2013).
- Janssen, X. J., et al. Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque. Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).
- Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).
- Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nat Commun. 2, 439 (2011).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).
- Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331, 450-453 (1988).
- Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification. Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).
- Kim, K., Saleh, O. A. A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements. Nucleic acids research. 37, 136 (2009).
- Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods. 4, 223-225 (2007).
- Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. Electron beam fabrication of birefringent microcylinders. ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).
- La Porta, A., Wang, M. D. Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles. Physical review letters. 92, (2004).
- Gore, J., et al. DNA overwinds when stretched. Nature. 442, 836-839 (2006).
- Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. Recent developments in single-molecule DNA mechanics. Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).
- Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).
- Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. Torque measurement at the single-molecule level. Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).
