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Bioengineering

Pinzas Magnéticas para la Medición de Twist and Torque

Published: May 19, 2014 doi: 10.3791/51503
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

Summary

Pinzas magnéticas, una técnica de la manipulación de una sola molécula de gran alcance, pueden ser adaptadas para las mediciones directas de la torsión (usando una configuración llamada libremente en órbita alrededor de pinzas magnéticas) y el par (usando una configuración denominado pinzas de par magnético) en macromoléculas biológicas. Se dan directrices para efectuar estas mediciones, incluidas las aplicaciones para el estudio de ADN y filamentos de núcleo-proteínas asociadas.

Abstract

Técnicas de una sola molécula permiten investigar el comportamiento de las moléculas biológicas individuales en solución en tiempo real. Estas técnicas incluyen los denominados enfoques de espectroscopia de fuerza tales como microscopía de fuerza atómica, pinzas ópticas, el flujo de estiramiento, y pinzas magnéticas. Entre estos enfoques, pinzas magnéticas se han distinguido por su capacidad para aplicar torque, mientras que el mantenimiento de una fuerza de estiramiento constante. Aquí, se ilustra cómo una configuración experimental de pinzas magnéticas "convencional" puede, a través de una modificación sencilla de su configuración de campo para reducir al mínimo la magnitud del campo transversal, ser adaptado para medir el grado de torsión en una molécula biológica. Tales La configuración resultante se denomina las pinzas magnéticas libremente-en órbita. Además, se muestra cómo la modificación adicional de la configuración del campo puede producir un campo transversal con una magnitud intermedia entre la de la & #8220; "pinzas magnéticas convencionales y las pinzas magnéticas libremente-que orbitan, lo que hace posible medir directamente el par almacenada en una molécula biológica. Esta configuración se denomina las pinzas par magnético. El vídeo que acompaña explica en detalle cómo la conversión de pinzas magnéticas convencionales en libremente en órbita alrededor de pinzas magnéticas y pinzas de par magnético se puede lograr, y demuestra el uso de estas técnicas. Estas adaptaciones mantienen todos los puntos fuertes de pinzas magnéticas convencionales mientras se expande en gran medida la versatilidad de este instrumento poderoso.

Introduction

En los últimos años, las técnicas de una sola molécula han demostrado su amplia aplicabilidad en el estudio de las proteínas motoras processive y otras enzimas, dando una idea de su cinética y la mecanoquímica subyacente. En el contexto de espectroscopia de fuerza, importantes contribuciones han sido hechas por microscopía de fuerza atómica flujo de estiramiento y pinzas ópticas y magnéticas. Las pinzas ópticas y magnéticas (MT) en particular han logrado combinar una gran flexibilidad en cuanto a manipulación molecular con una alta resolución espacial y temporal. Aquí, nos centramos en MT, que se puede aplicar tanto a las fuerzas de estiramiento y los pares de moléculas biológicas atados entre una superficie y perlas superparamagnéticas 1-3.

Pinzas magnéticas (MT, Figura 1a) son una técnica de una sola molécula muy versátil que se ha utilizado para controlar tanto las propiedades mecánicas de los ácidos nucleicos, así como sus interacciones con las proteínas. MT tiene muchas fuerzass, incluyendo simplicidad y robustez general de la implementación experimental, aplicación fácil de par motor, la operación de calibración natural y sencilla en el modo de fuerza constante 4, la extensión a paralelo mediciones 5, 6, y la ausencia de calentamiento de la muestra y fotodaño. En comparación con otros enfoques de molécula única, MT proporciona una forma para llevar a cabo mediciones de la fuerza de dependencia a fuerzas tan bajas como ≈ 10 FN y tener la capacidad de controlar sin rodeos el grado de superenrollamiento. Mientras MTs predominantemente se han utilizado como una herramienta experimental para investigar los procesos biológicos que implican ácidos nucleicos 7, 8, que también han encontrado aplicación en estudios de las propiedades mecánicas de las proteínas de 9-13 o células 10, 14-17. Numerosas referencias útiles están disponibles que describen cómo crear y ejecutar una MT 4, 18-20.

Sin emer, MT convencional no rastrear el movimiento de rotación directamente, y, si bien se aplican par, no miden directamente el par. Además, restringen la rotación libre de la correa de sujeción de ácido nucleico. A continuación, presentamos dos extensiones de pinzas magnéticas. Las primeras pinzas magnéticas, denominados libremente en órbita alrededor de (FOMT, Figura 1b) 21, permite las mediciones de las fluctuaciones y los cambios en el giro de las moléculas de ácido nucleico atados ángulo de equilibrio, sin restringir el movimiento de rotación alrededor del eje de sujeción. El segundo, denominado pinzas par magnético (MTT, la Figura 1c), que tiene la capacidad de aplicar y medir directamente las fuerzas y pares de torsión a las biomoléculas individuales 22-27.

En el siguiente protocolo, se presumirá que el lector tiene a su / su disposición un instrumento MT "convencional". Remitimos al lector a la discusión de las referencias sobre cómo construir y ejecutar una MT establecido, así como consiraciones que deben ser tomados en cuenta en la selección de los granos magnéticos, los imanes, y rutinas de seguimiento. Además, las secciones 1 y 2 del Protocolo texto describen la forma en que suelen preparar e incubar una muestra de ADN para su uso en la MT, así como las medidas preliminares que se pueden realizar en un solo ADN en la MT convencional. Las secciones 3 y 4 del Texto Protocolo ilustran cómo un instrumento MT puede ser adaptado y utilizado para las mediciones FOMT y MTT fácilmente.

Protocol

1. Preparación e incubación de una muestra de ADN

  1. Preparar construcciones de ADN que se ligan a duplex extremos (normalmente emplear ≈ 600 pb fragmentos de DNA PCR) que están funcionalizados con múltiples biotina y digoxigenina grupos, respectivamente 18. Para empezar, un largo de la traba de ADN> 1 m, por ejemplo, un 7,9 kpb correspondiente a una longitud estirada de ~ 2,7 micras tal como se emplea aquí, se recomienda para la facilidad de uso; en particular, utilizando una longitud de ADN que es similar a o más corto que el radio de talón es problemático debido a la geometría de unión en el MTT y FOMT. Véase la discusión para una descripción de cómo la longitud del ADN influye en la respuesta temporal en el dominio angular.
  2. Montar las células de flujo para los experimentos de una sola molécula. Para las células de flujo, usar dos cubreobjetos de microscopio de vidrio separadas por una doble capa de Parafilm espaciador. El cubreobjetos microscopio superior debe tener dos orificios para el fluido de entradas y salidas a la célula. Es convenienteutilizar un chorro de arena para perforar los agujeros. El cubreobjetos parte inferior está recubierta con nitrocelulosa (0.1% peso / volumen en acetato de amilo). Coloque los espaciadores Parafilm en el lado de nitrocelulosa recubierto de las diapositivas de fondo y cerrar la parte superior con los mejores diapositivas limpias.
  3. Sellar las células de flujo. Usando las pinzas físicas, coloque la celda de flujo montado sobre una placa de calefacción ajustado a 80-100 º C durante aproximadamente 1 min. Preste atención a que la celda de flujo está bien sellada, que el Parafilm no cierra los agujeros que se conectan a la entrada y salida, y que las láminas de vidrio están bien alineados.
    Nota: Para asegurar un buen sellado, se recomienda a un accidente cerebrovascular a cabo burbujas en el Parafilm usando una gran hisopo de algodón. La celda de flujo se puede montar entonces en el instrumento de pinzas magnéticas.
  4. Preparar los tampones. Preparar tampón TE inmovilización (Tris-HCl 10, pH 8,0, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), y NaCl 200 mM). Alternativamente, se puede utilizar tampón PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, tampón de fosfato 10 mM, pH 7,4) suplementado WITH 100 mg / ml de BSA, 0,1% de Tween y azida de sodio 5 mM (PBS +) como tampón de inmovilización. Volúmenes 2-3 células Flush TE tampón tethering en la célula de flujo.
  5. Incubar 0,5 o 1,5 m de radio perlas de látex no magnéticas en la celda de flujo para ~ 30 min. Estas perlas actuarán como granos de referencia durante pinzas magnéticas mediciones que permiten reducir al mínimo el efecto de la deriva entre el objetivo y el soporte de muestra (es decir, la celda de flujo). Enjuague perlas no magnéticas solteras enjuagando con 2-3 volúmenes de células de tampón TE tethering.
  6. Funcionalizar la superficie inferior de la celda de flujo mediante incubación con anti-digoxigenina 100 g / ml en PBS durante al menos 1 hora (preferiblemente más larga; incubación puede llevarse a cabo durante la noche), para proporcionar para la fijación de ADN. Enjuague con 2-3 volúmenes de células de tampón TE tethering. Finalmente incubar la célula de flujo con 2 mg / ml de albúmina de suero bovino (BSA) en tampón de inmovilización TE durante 30 min para pasivación de la superficie.
  7. Tomar una alícuota de2 ml perlas MyOne superparamagnéticas recubiertas de estreptavidina (ver Discusión y Tabla de Materiales) y se diluye con 10 ml de tampón TE tethering. Lavar dos veces con 10 ml de tampón TE inmovilización usando un concentrador de partículas magnéticas, y resuspender en 10 ml de tampón TE inmovilización. Adjuntar ~ 1 ml de las moléculas de ADN (aproximadamente 1 ng) de estas perlas mediante incubación en tampón de inmovilización TE durante 30 min.
  8. Diluir la solución de las perlas superparamagnéticas-ADN atado de diez veces mediante la adición de 90 ml de tampón de inmovilización TE. Finalmente, inyectar la solución en la celda de flujo y se incuba durante ~ 1 hora para permitir que para la unión del ADN a la superficie anti-digoxigenina-revestido. Lavar la celda de flujo a fondo con tampón de inmovilización TE. Después de la incubación de los constructos de ADN de sujeción, lavar extensamente con tampón experimental (esto puede ser tampón de inmovilización TE) para eliminar todas las cuentas no inscritos.
  9. Para las mediciones que emplean un protocolo de seguimiento angular que requiere perlas de marcador de referencia unidos a las perlas magnéticas

2. Mediciones en un ADN de una sola molécula en las pinzas magnéticas convencionales

  1. El uso de un MT convencional (ver Discusión) con la configuración de campo apropiado (Figura 1a) y tanto de traslación y de rotación de control de la posición del imán, buscar moléculas de ADN rotacionalmente restringidos en la celda de flujo. Al tirar de las fuerzas de ≥ 1 pN (consultar las referencias 4, 19, 20, 28, 29 con respecto a calibración de fuerza en pinzas magnéticas), perlas atados fácilmente se pueden distinguir de los granos adheridos a la superficie de la corredera inferior por sus diferentes alturas en el foco . Si una molécula de ADN está limitada rotación puede ser evaluado mediante la introducción de un 20-30 a su vezs de los imanes en una fuerza de ≈ 0,25 pN: aquí, el largo de la traba debe disminuir en un 0,4 a 0,5 micras.
    Nota: Para ejecutar pinzas magnéticas experimentos, el procesamiento de imágenes se utiliza para determinar la x, y, y la posición Z de los granos de ADN atado. Software Labview personalizada para este propósito está disponible a partir de los autores que lo soliciten.
    1. Verifique que el cordón está unido por una sola correa de ADN. Esto se puede hacer mediante la comparación del comportamiento bajo giros positivos y negativos en las fuerzas de> 1 pN (Figura 2a). En este régimen de fuerza, la presencia de múltiples correas de ADN dará lugar a una disminución de aproximadamente simétrica en la extensión en la introducción de giros positivos y negativos, mientras que los amarres individuales de ADN darán lugar a una respuesta asimétrica.
  2. Búsqueda para los granos fijos apropiados pegado a la superficie inferior en las proximidades de la cinta de sujeción de interés que puede servir como perlas de referencia.
  3. Calibrar la longitud de tél de ADN, l. La posición de la superficie de la célula de flujo se puede determinar por lo que el cordón atado en contacto con la superficie (por ejemplo, mediante la rotación del imán por ~ 60 vueltas a una fuerza por debajo de 0,2 Pn). Las mediciones de la posición vertical del cordón atado con respecto a esta superficie a continuación, informan sobre el valor absoluto de L.
    Nota: Para minimizar los efectos posteriores de la deriva, se aconseja llevar a cabo mediciones de L respecto a la posición de un cordón de referencia fijado a la superficie.
  4. Grabación de una curva de rotación (es decir, una medición de la extensión de ADN como una función del número de vueltas) a una fuerza de estiramiento de ≈ 0,25 pN (Figura 2a).
    1. Determinar el número de vueltas en el que la extensión es máxima, ya que esto corresponde al estado en el que la molécula de ADN es la torsión relajada. Para ello, es útil para adaptarse a la curva de rotación localmente con una parabólica o una función gaussiana para determinar la positi centroen. Definir este punto como "cero vueltas".
      Nota: Una rutina personalizada-escrito para este propósito está disponible de los autores que lo soliciten.
  5. Para una serie de ~ 20 posiciones de imán, determinar la extensión media de la molécula de torsión-relajado (es decir, al "cero vueltas", véase la etapa 2.4.1) de la Z-traza.
  6. Para cada punto de medición en el paso 2.5, determinar con precisión la fuerza de estiramiento de las fluctuaciones en la posición X o Y 20, 28, 29, o, siempre que la magnetización de la perla es bien sabido, usando el conocimiento de la gradiente de campo local 4. Trazado de la fuerza de estiramiento frente a los resultados medios de extensión en una curva de fuerza-extensión (Figura 2b).
    1. Ajustar los datos de fuerza de extensión resultantes de la ecuación de la cadena con forma de gusano usando la aproximación polinómica por Bouchiat et al 30.
    Si la preparación para mediciones FOMT posteriores, lentamente girar los imanes durante la grabación excursiones de la perla magnética en (x, y).
    Nota: El menor es el radio del anillo que resulta en la configuración MT convencional, la más estrechamente la molécula de ADN está atado más cerca de la "polo sur" de la perla magnética. Cuando uno cambia a la configuración FOMT, una molécula de ADN se ató estrechamente a la "ecuador" de la perla magnética, que permite el seguimiento fiable del ángulo de rotación de la (x, y)-posición (ver Discusión).

3. Medidas de la torcedura de ADN con las pinzas magnéticas libremente-que orbitan

  1. Reemplazar manualmente los imanes cuadrados de las pinzas magnéticas convencionales por un imán cilíndrico que se utiliza para FOMT (Figura 1b). Esta operación se debe realizar de tal manera que la correa de sujeción de ADN seleccionada permanece dentro del campo de visión. Esto se puede lograr en menos de 1 min simplemente desenroscando la cabeza imán completa que contiene los imanes para la configuración de las pinzas convencionales y su sustitución por una cabeza de imán que tiene un imán cilíndrico para FOMT.
  • Las excursiones en (x, y) de una perla magnética atado por una sola correa de sujeción ADN de doble cadena dependen fuertemente de la posición de la correa de sujeción con respecto al eje del imán cilíndrico (Figura 1b, la Figura 3a). Registrar las excursiones (x, y) con el fin de determinar la ubicación correspondiente en el patrón de fluctuación característica (Figura 3a, Discusión).
  • Realice la alineación gruesa del imán en el FOMT. Esto puede lograrse moviendo el imán cilíndrico por encima de la celda de flujo utilizando (x, y) etapas de traducción. Si las excursiones (x, y) siguen un arco, el imán cilíndrico no está alineado y necesita ser movido adecuadamenteen la dirección apropiada (Figura 3b).
    1. Alineamiento grueso puede llevarse a cabo dentro de 15 min para el caso de perlas de MyOne con 7,9 amarres kbp, y se completa cuando la medición de las excursiones (X, Y) en los resultados de la observación de movimiento circular (Figura 3b, centro).
      Nota: alineación aproximada es típicamente suficiente para observar los cambios en giro ocasionados por la proteína de unión a ADN individuales atados en la configuración FOMT 21, 31 (Los resultados representativos, Figura 5), a pesar de el histograma bidimensional acompaña no pueden tener sus recuentos absolutamente distribuido de manera uniforme a lo largo del anillo circular (figura 3c).
  • Si es necesario para experimentos adicionales, realizar la alineación fina en el FOMT. Esto se puede lograr usando tornillos micrométricos de alta resolución o una etapa automatizada de alta resolución para desplazar el imán o la célula de flujo a cientoer el imán cilíndrico en la perla dentro de ~ 10 micras. En la etapa de alineación fina, el imán se coloca cuidadosamente de tal manera que las fluctuaciones en el círculo anillo son casi uniforme, que corresponde a una situación en la que la barrera de energía a la rotación completa debido a que el imán es k B T (Figura 4).
    Nota: Una secuencia de comandos de MATLAB para trazar las fluctuaciones en un histograma o termograma como en la figura 4 está disponible a partir de los autores que lo soliciten.
    Nota: Fine alineación se puede lograr dentro de 45 min para el caso de los granos MyOne con 7,9 kbp ataduras, y en la reducción de los plazos para los granos más pequeños y correas más cortas se emplean (ver Discusión).
    Nota: Fine alineación que normalmente se requiere para llevar a cabo mediciones de la rigidez a la torsión del ADN desnudo o recubierto de proteína (Resultados representante, Figura 4).
  • Si es necesario para el análisis, calibrar la fuerza en el FOMT. Esto puede llevarse a ina manera análoga a la MT, utilizando ya sea las fluctuaciones radiales del talón <r 2> (donde los corchetes angulares denotan el promedio de tiempo) como se muestra en el vídeo que acompaña y detallada en Lipfert et al 21, o, siempre que la magnetización de la perla es así conocida, utilizando el conocimiento del gradiente de campo local 21.

    • 4. Medidas de ADN de par con las pinzas par magnético

    1. Reemplazar manualmente el imán cilíndrico que se utiliza para FOMT por un imán cilíndrico más un lado imán (permanente) para el MTT (Figura 1c). Esta operación se debe realizar de tal manera que la correa de sujeción de ADN seleccionada permanece dentro del campo de visión.
      1. La forma más sencilla de lograr esto es agregar manualmente el imán lado en su ubicación adecuada, que se puede lograr dentro de 1 min. No más alineamiento es necesario.
        Nota: Una alternativa a un imán lado es el usode electroimanes 32.
    2. Si es necesario para el análisis, calibrar la fuerza de una manera análoga a la MT, utilizando ya sea x de la perla o las fluctuaciones de Y o, siempre que la magnetización de la perla es bien conocido, usando el conocimiento de la gradiente de campo local 21.
    3. Seguir las fluctuaciones angulares como una función de θ tiempo (t) utilizando el protocolo basado fiducial de seguimiento 23 o, como se muestra en el vídeo que acompaña, el protocolo de seguimiento angular basado en el control de la (x, y)-posición (ver Discusión). En el primer caso, grabar las imágenes completas de la perla como una función del tiempo para el procesamiento de imágenes subsecuente. En este último caso, es suficiente para grabar (x, y) las fluctuaciones del talón en este paso.
      Nota: Una secuencia de comandos de MATLAB para determinar θ (t) a partir de imágenes completas de la perla como una función del tiempo en el protocolo de seguimiento basado fiducial es unvailable de los autores que lo soliciten.
      1. Como se describe en la discusión, para el protocolo de seguimiento angular sobre la base de la vigilancia de la (x, y) de la posición también es aconsejable para grabar una curva del tiempo en que los imanes son lentamente (por lo general en el 0,1 Hz) girado por varias vueltas. Esto permitirá una para convertir con precisión las coordenadas cartesianas (x, y) en coordenadas polares (r, θ) utilizando las ecuaciones 3-5 de la discusión.
        Nota: Una secuencia de comandos de MATLAB para el script de seguimiento angular sobre la base de un seguimiento de la (x, y)-posición está disponible a partir de los autores que lo soliciten.
        Nota: El tiempo de medición depende principalmente de la resolución torque deseado. Un argumento detallada se da en Lipfert et al 24. Para cuentas MyOne y 8 correas de ADN kbp, medición de 30 a 100 segundos deben ser suficientes para dar una resolución de par en el rango de 1 ~ pN · nm.
    4. Determinar la rigidez de la trampa de torsión de the varianza de las fluctuaciones angulares (σ θ 2, en radianes) usando:
      k θ = k B T / σ θ 2 (1)
      Nota: típicos rigideces trampa de rotación obtenidos en el MTT están en el intervalo de 10-1.000 pN · Nm / rad, menor que para pinzas magnéticas convencionales.
    5. Además, registre la posición z del talón y usar esto para determinar el largo de la traba l (véase también los pasos 2.4 hasta 2.7).
    6. Girar N vueltas y otra vez grabar θ (t) y L (t).
      Nota: La trampa reducida rigidez rotacional del MTT en comparación con MT hace que sea adecuado para las mediciones del par de torsión de una sola molécula, pero implica que el par máximo que puede ser ejercida se reduce. Esto implica que el MTT puede no ser capaz de contrarrestar los altos pares de fricción causada por la rotación rápida. Por lo tanto, debe tener cuidado de no exceder la velocidad máxima; typically girar a tasas cercanas al 0,1 Hz.
    7. Determinar el par acumulado en la correa de sujeción de ácido nucleico después de N vueltas usando:
      Γ = - k θ <θ N - θ 0> (2)
      Donde <...> indica la media y θ 0 y θ n son el ángulo a cero vueltas (correspondiente a una correa de sujeción a la torsión relajada, cf. Paso 2.3 y N vueltas, respectivamente.
    8. Repita los pasos 4.5 y 4.6, según sea necesario con el fin de determinar a profundidad la respuesta de par de una molécula en un solo ciclo de medición (resultados representativos, Figura 6).

    Representative Results

    Los resultados representativos de la MT (Figura 1a) se muestran en la Figura 2. Figura 2a muestra las curvas de rotación-extensión de DNA 7,9 kb tomada en F = 0.25, 0.5, y 2.0 pN. La respuesta de un solo ADN a la rotación debe ser simétrica a las fuerzas más bajas (0,25 PN), con la extensión de la ADN disminuyendo como resultado de la formación de supercoils plectonemic positivos o negativos. Conocimiento cualitativo de esta respuesta es útil cuando inicialmente la búsqueda de una correa de sujeción de ADN en rotación restringida (paso 2.1). Tenga en cuenta que se requiere una inspección adicional de la correa de sujeción para verificar que consta de una sola molécula de ADN: aquí, la respuesta asimétrica de una sola ADN a rotación a fuerzas superiores a 0,5 pN ayuda a distinguirla de múltiples ADN (paso 2.1.1). Una vez que esto ha sido verificada, uno vuelve a la respuesta rotacional en 0,25 pN con el fin de determinar el número exacto de imán gira en la que el único ADN is torsión relajado, donde se toma una curva de fuerza-extensión, que debe ser similar a la figura 2 b. Para esta medición en particular, un ajuste de los datos al modelo de cadena con forma de gusano (línea continua) produjo una cocina equipada contorno longitud L C = 2,71 my longitud de plegado persistencia L P = 45 nm. Para ADN de doble cadena, los valores ajustados de la longitud de persistencia debe estar en el rango de 40-55 nm, dependiendo de las condiciones del tampón 33, y la longitud de contorno equipada deben estar cerca (típicamente dentro de 10%) al valor esperado para la construcción de ADN que se utiliza en las mediciones, usando la relación L de ADN = 0,34 nm / pb · número de pares de bases.

    La Figura 3 muestra los procedimientos y resultados de la alineación en el FOMT (Figura 1b). Las excursiones iniciales (x, y) registrados en el paso 3.2 se pueden comparar con la visión de conjunto de las fluctuaciones como una función Of la posición del imán transversal se muestra en la figura 3a, que muestra un patrón de "vórtice" que se puede utilizar para guiar la posterior desplazamiento relativo entre el imán y el talón-ADN atado celebrada en la FOMT. Cuando alineación aproximada posterior es completa, del talón (x, y)-fluctuaciones trazan una trayectoria circular, como se muestra también por la traza negro en la Figura 3b. En este punto, el par de los imanes sobre el eje z se reduce hasta el punto de que las fluctuaciones térmicas son suficientes para hacer girar el cordón alrededor de su punto de fijación. El círculo de radio R del anillo circular resultante (círculo ajustado se muestra en rojo) representa la distancia radial entre el punto de unión del ADN y el centro del talón (Figura 1b). Como se muestra en la Figura 3c, sin embargo, un histograma de los datos de la Figura 3b muestra que alineación aproximada no garantiza la cobertura uniformede todas las posiciones posibles a lo largo del anillo circular. A pesar de que las fluctuaciones térmicas son suficientes para explorar todo ángulo de rotación en el círculo, sigue habiendo una barrera de energía pequeña (del orden de la energía térmica k B T) para la rotación libre.

    Cuando la alineación más fina se lleva a cabo en el FOMT (paso 3.4), el instrumento se puede utilizar para determinar el módulo de torsión de ADN (Figura 4). En primer lugar, la alineación fina de la muestra se utiliza para obtener movimiento circular (Figura 4a) cuyo histograma bidimensional ahora debe mostrar una cobertura uniforme (Figura 4b). El q correspondiente tiempo trace (t) de las fluctuaciones angulares (obtenidos a partir de la conversión de los (x, y)-posiciones, véase más abajo) no muestra la periodicidad correspondiente a 360 ˚ (Figura 4c) y revela grandes excursiones correspondientes a varios giros completos (Figura 4d). El panorama energético implicadoes armónica en un intervalo de> 1.000 ˚ (Figura 4e). La desviación estándar de las fluctuaciones es σ θ = 223 °, correspondiente a una trampa de rigidez angular de K θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 pN · Nm / rad, que a su vez da una estimación de la longitud de persistencia de torsión eficaz de ADN igual a C = L C / σ θ 2 ~ 76 nm (L C = 1,150 nm para el ADN de 3,4 kpb se utiliza en esta medición) en la fuerza medida.

    Un ejemplo de cómo FOMT se puede utilizar para medir el cambio en el giro inducido en la molécula de ADN atado a través de la unión de las proteínas 31, 34 se muestra en la Figura 5. Aquí, hemos supervisado la unión de la proteína RAD51 para duplicar-ADN de cadena; RAD51 se sabe que tanto alargar y relajarse de ADN, ya que forma un filamento de nucleoproteína 31. Tras el lavado de RAD51 en la celda de flujo, se observa que el cordón se somete a una trayectoria en espiral en el FOMT (Figura 5a). Mediante la conversión de rastro de (x, y) de movimiento como una función del tiempo de q (t) como se describe anteriormente, podemos co-parcela el efecto que tiene en la RAD51 largo de la traba de ADN y su grado de desenrollar (Figura 5b, c) .

    Un enfoque alternativo para la medición de las propiedades de torsión de ADN son el MTT (Figura 1c, Figura 6). La esquemática en la Figura 6a ilustra el principio de la medición: después de la sobretensión (o subenrollado) la atadura ADN por N espiras, el ADN ejerce un par antagonista en la perla que conduce a un cambio en la posición angular del equilibrio desde θ 0 a θ N. En el MTT la componente transversal del campo magnético se reduce en comparación con el MT, que facilita la medición de estos cambios angulares mientras que todavía permite la rotación del talón (Figura 1). La magnitud del desplazamiento angular medida después de la aplicación de N = 45 se convierte en un ADN 7,9 kpb se muestra en la Figura 6b. La secuencia completa del protocolo de medición de MTT y el resultado que resulta de un par de torsión frente a la curva de rotación para el ADN se muestra en la Figura 6c-f. Aquí, las mediciones de la desviación estándar (Figura 6c) y la media (Figura 6d) de la coordenada angular se muestran como una función de sobre-y subenrollado, con la desviación estándar es inversamente proporcional a la trampa de rigidez angular (Ecuación 1). Tomados en conjunto, estas cantidades permiten una para construir un par de torsión frente a la curva de rotación para el ADN (Figura 6f), que debe mostrar una región de respuesta lineal centrada alrededor de 0 vueltas unaND dos mesetas en la que los ácidos grasos saturados de par, en rotaciones positivas y negativas, respectivamente. Un par Tal frente a la curva de rotación complementa la información en una extensión frente a la curva de rotación (figura 6e), la cuantificación de ese modo las transiciones que acompañan el pandeo y la desnaturalización del ADN.

    Figura 1
    Figura 1. Esquema de pinzas magnéticas convencionales (MT), que orbitan libremente pinzas magnéticas (FOMT), pinzas de torsión magnética (MTT), y dos estrategias para el seguimiento de ángulo de rotación. (A) En todos los tres implementaciones de pinzas magnéticas, perlas magnéticas están atados a una superficie de celda de flujo por macromoléculas funcionalizadas, por ejemplo, las moléculas de ADN de doble cadena muestran esquemáticamente. Perlas de referencia están unidos a la superficie de la célula de flujo y realiza un seguimiento de Drifcorrección t. Todos los tres MT configuraciones emplean imanes para aplicar una fuerza de estiramiento hacia arriba en la perla magnética y, por lo tanto, la correa de ADN. En MT convencional, un par de imanes ejerce un campo magnético que está orientado transversalmente con respecto al eje de sujeción, bien limitando la rotación del talón alrededor del eje-ADN de sujeción. En FOMT, un imán de forma cilíndrica proporciona un campo magnético que orienta a lo largo de la dirección de sujeción. Cuando la correa de sujeción se alinea con el centro del imán de forma cilíndrica, los campos transversales restantes se reducen al mínimo, permitiendo la rotación libre alrededor del eje de sujeción de MTT, se añade un imán lado para el imán de forma cilíndrica utilizada en FOMT con el fin de proporcionar un pequeño campo transversal (reducida en magnitud en comparación con MT). Este pequeño campo transversal permite la aplicación del par de torsión, así como su medición. (B) Se muestran dos estrategias para medir el ángulo de rotación de una perla magnética alrededor del eje de ADN-Tether. 1): un cordón marcador (gradon) unido a la perla magnética (marrón) da una imagen asimétrica que permite el ángulo de seguimiento por análisis de imaginar. Dos imágenes CCD de una perla magnética de 1.4 m de radio con un marcador de referencia de 0,5 m de radio se muestran, en foco y fuera de foco. 2): cuando el ADN está atado a la perla magnética en una posición alejada del polo sur de la perla, el centro de la perla fluctúa a lo largo de un arco cuyo centro define una posición angular. De cualquier estrategia se puede utilizar para realizar un seguimiento de ángulo de rotación y para monitorear los cambios en la posición de ángulo que la correa se tensa por torsión (trazas a la derecha), permitiendo así mediciones del par de torsión de una sola molécula.

    Figura 2
    Mediciones de la Figura 2. Calibración de ADN en la MT convencional. (A) curvas de rotación-extensión para un ADN 7,9 kb tomada en F = 00,25, 0,5 y 2,0 pN. La respuesta asimétrica en rotación a giros positivos y negativos de correas de sujeción individuales de ADN de doble cadena se puede utilizar como una prueba conveniente de la unión de la correa. (B) la curva de fuerza-extensión para un ADN 7,9 kb, junto con un ajuste para el gusano- como modelo de la cadena (línea continua), produciendo una cocina equipada contorno longitud L C = 2,71 micras y flexión persistencia longitud L P = 45 nm. Todas las mediciones se realizaron en tampón PBS.

    Figura 3
    Figura 3. Alineación en FOMT. (A) (x, y) de las fluctuaciones de talón-ADN atado celebradas en el FOMT como una función de la posición del imán. La posición del imán cilíndrico se escaneó a una altura constante de 3 mm a través de la superficie de la célula de flujo en pasos de 250 micras en x y (x, y) patrón de fluctuación con la posición del imán se asemeja a un ciclón o vórtice son evidentes. Este patrón "vórtice" se puede utilizar para guiar el desplazamiento del imán (o, alternativamente, la correa de sujeción mientras se mantiene el imán fijo) en x e y (indicada por las flechas grandes) para lograr la alineación. Cuando alineación aproximada es completa, del talón (x, y) las fluctuaciones trazan una trayectoria circular (trazo azul en el centro de la parcela). Este seguimiento se registró en un experimento separado después de alinear los imanes en pasos más pequeños sobre el centro y se muestra por ejemplo en esta trama. (B) (x, y) las fluctuaciones de un cordón de ADN-tethered celebrada en tél FOMT tras éxito grueso alineación del imán (trazo negro). Las fluctuaciones se encuentran en un anillo circular y las fluctuaciones térmicas son suficientes para explorar todas las rotaciones ángulos en el círculo. Un círculo equipada se muestra en rojo. (C) Un histograma correspondiente a los datos en (b), que muestra que la alineación gruesa no garantiza una cobertura uniforme de todas las posiciones posibles a lo largo del anillo circular. A pesar de que las fluctuaciones térmicas son suficientes para explorar todo ángulo de rotación en el círculo, sigue existiendo una barrera de energía (en el orden de la energía térmica k B T) para la rotación libre.

    Figura 4
    Figura 4. Medición de la rigidez a la torsión de ADN usando FOMT. (X, y)-trayectoria (A) y el histograma (b) de un ADN-tetEred fluctuaciones de los talones después de ajuste fino de la posición relativa de imán de sujeción en el FOMT. Bajo estas circunstancias, el histograma revela la cobertura esencialmente uniforme de las posiciones en el círculo. (C) las fluctuaciones de rotación del grano determinado a partir de la (x, y)-posiciones. (D) Histograma de las fluctuaciones de rotación. La línea roja es un ajuste gaussiano con σ ° θ = 223. (E) El panorama energético que supone la densidad de fluctuación de rotación a partir de (c) y (d). La diferencia entre el paisaje de energía implicado por las fluctuaciones de rotación y una aproximación armónica (con k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 pN-nm/rad) es mucho menor que la energía térmica k B T sobre varias vueltas. Los datos se compensan por claridad tal que θ 0 = 0. El ancho delas fluctuaciones pueden ser utilizados para determinar la rigidez a la torsión de ADN, véase el texto principal. La medición se llevó a cabo en tampón PBS a una fuerza de estiramiento de ~ 1 pN. Los datos se han adaptado de Lipfert et al 21.

    La figura 5
    Figura 5. La unión de la proteína RAD51 con el ADN midió usando FOMT. (A) de la Asamblea de la proteína RAD51 en una tethered 7,9 kpb dsDNA controló a 3,5 pN. La (x, y, z)-trayectoria ejecutada por la perla magnética (diámetro 1,0 mm) durante los primeros 200 segundos de la asamblea se muestra, con el tiempo, un código de colores, desde el azul al rojo. (B) La extensión de la dsDNA deduce de la componente z de la trayectoria del talón en (a) como una función del tiempo. (c) El ángulo de rotación alrededor del eje de sujeción dsDNA deducidasDesde la X, componentes Y de la trayectoria del talón en (a) como una función del tiempo.

    La figura 6
    Figura 6. Mediciones de par en una sola correa de sujeción de ADN en el MTT. (A) esquemático que muestra el principio de la medición de par. Después de más de-(o bajo-) enrollar la correa de sujeción de ADN por N vueltas, el ADN ejerce un par de recuperación sobre el talón que conduce a un cambio en la posición angular de equilibrio de θ 0 a N θ. (B) Ejemplo de trazas de ángulo utilizados para medir el par:. fluctuaciones angulares de un cordón atado a una molécula de ADN 7,9 kpb torsión relajado antes (azul) y después de la introducción de 40 vueltas (rojo oscuro) (cf) Medición del par en una molécula de ADN 7,9 kpb en tampón PBS que tuvo lugar en una víaarcadas fuerza de ~ 3 PN utilizando el cordón de marcador de referencia basada en protocolo de seguimiento angular. Fluctuaciones angular como se muestra en (b) se registraron como una función del número de vueltas aplicadas. (C) La desviación estándar de las fluctuaciones angulares como una función de los giros aplicados. La anchura de las fluctuaciones es aproximadamente constante, lo que indica trampa angular constante rigidez. (D) El cambio en el ángulo medio de rotación como una función de los giros aplicados. Cambios sistemáticos del ángulo medio en exceso de subenrollado y son evidentes. (E) La extensión de sujeción ADN monitorizado de forma simultánea como una función de los giros aplicados. (F) El par ejercido por la correa de sujeción de ADN determinada a partir del ángulo medio se muestra en (d) , ver el texto principal. El exceso de subenrollado y alrededor de cero, se da lugar a un par de torsión frente a lineal convierte la respuesta de la ADN-Tether (iones de pistas de grises armarios (d) y (f)) que se puede utilizar para determinar la longitud de persistencia de torsión eficaz (~ 77 nm para este conjunto de datos). La sobretensión además conduce a pandeo y la formación de supercoils plectonemic (mostrados esquemáticamente en las inserciones), que corresponde a una meseta de par (línea de color negro en las curvas positivos en (f) a ~ 26 pN · nm) y una disminución lineal de la correa de sujeción con el número de extensión de vueltas (pendiente negro en (e)). El desenrollar más allá del régimen lineal provoca que el ADN para fundir localmente (que se muestra en las inserciones a la izquierda), marcado por una meseta de par igual al par de fusión (línea de color negro a las vueltas negativas en (f) a -11 ~ pN · nm).

    Discussion

    Al ejecutar experimentos utilizando el MTT o la FOMT, una serie de opciones deben hacerse con respecto perlas, los imanes, los protocolos de seguimiento, etc Los mejores decisiones que tomar dependerán del experimento de interés. A continuación, se describen las ventajas y desventajas que acompañan a las diferentes opciones, lo que debería facilitar la selección para un experimento particular. A continuación se describen varios pasos críticos que acompañan a la alineación y el funcionamiento de las MTT y FOMT experimentos. Por último, se discute la importancia de la MTT y FOMT con respecto a los métodos existentes, así como futuras aplicaciones.

    Consideraciones antes del inicio de MTT y FOMT Experimentos

    Cualquier experimento requiere que se seleccione un tipo de perla magnética para su uso. Se puede seleccionar entre varias cuentas disponibles comercialmente recubiertas de estreptavidina superparamagnéticas, por ejemplo, 0,25 micras perlas radio, 0.5 micras cuentas RADIUS o 1,4 micras cuentas de radio (see la tabla de Materiales). Perlas más grandes tendrán un mayor momento magnético en comparación con los granos más pequeños (aproximadamente de escala como el volumen) y por lo tanto su uso facilitará la aplicación de fuerzas superiores (por fuerzas típicos obtenidos en nuestros instrumentos, véase el cuadro 1). Cuando se desea el seguimiento angular utilizando cuentas de marcadores, por lo general trabajamos con 1,4 m de radio y el uso de 0,5 m de radio perlas biotina no magnéticos como perlas marcadoras (véase el párrafo 1.9 para el protocolo adjunto correspondiente). El uso de los granos más pequeños se recomienda especialmente para la FOMT, como escala de tiempo característica para τ rotación de cuentas C es igual a la proporción de arrastre del sistema a través de su resorte constante γ / k θ; importante, el coeficiente de arrastre de rotación relevante para las escalas de escala de tiempo de medición angular que R ~ 3 del talón, es decir, con la tercera potencia del radio (ver Tabla 2 para losel tiempo característico escalas por varias combinaciones de ADN del grano en FOMT y mediciones MTT). Reducciones acompañante en la fuerza máxima que puede ser aplicada puede dirigirse mediante el uso de una pila volteado de imanes cilíndricos 27. Sin embargo, en mediciones FOMT a veces puede ser necesario un compromiso entre la mejor resolución temporal alcanzable y la fuerza máxima aplicada.

    Además, un experimento requiere la selección de una configuración de imán. En la configuración de pinzas magnéticas convencionales (Figura 1a), por lo general usamos un par de 5x5x5 mm imanes cúbicos en orientación vertical con un espacio de 0,5 o 1 mm entre los imanes 4. Cuando los imanes están espaciados a lo largo del eje x (y), esto produce un campo magnético que se dirige principalmente a lo largo del eje x (y). Para los experimentos de FOMT, se selecciona un imán de forma cilíndrica en cuyo centro el campo magnético se dirige principalmentea lo largo del eje z (Figura 1b). En la práctica, se utiliza una pila de tres de tales imanes de forma cilíndrica, cada uno con un diámetro de 6 mm y un orificio central 2 mm de diámetro, para un espesor total de 6 mm. Cuando se desean fuerzas de tracción superiores, se prefiere una configuración imán "pila volteada" en el que el imán inferior está apilado con magnetización opuesta. Para lograr la configuración de MTT (Figura 1c), añadimos un imán adicional para el lado de la pila principal imán de la configuración FOMT, típicamente un cilindro sólido con 4 mm de diámetro y una altura de 7 mm. Para ver cómo las fuerzas máximas alcanzadas en nuestros instrumentos dependen de la configuración del imán, ver Tabla 1.

    La alineación de MTT y FOMT Experimentos

    Desde perlas magnéticas tienen una superficie funcionalizada de manera uniforme (aproximadamente) (típicamente estreptavidina) y dado que el accesorio de tanto el n funcionalizadocorreas de ácido ucleic y perlas de marcador (en caso de que se emplea el marcador de seguimiento angular basado en perlas) se produce a través de simple incubación en solución, uno no controla donde la correa de sujeción y / o perla marcador se unen a la perla magnética. Las perlas magnéticas tienen un eje de magnetización preferido que tiende a alinearse a lo largo de la dirección del campo externo. Si denotamos los puntos donde el eje de magnetización preferente intersecta la superficie de la perla como los polos norte y sur, a continuación, los granos, donde el ADN de la correa se une cerca del ecuador se trazará un anillo circular con un radio de cerca o ligeramente mayor que el radio del talón en la FOMT; en contraste, los granos que se unen cerca del polo sur fluctuarán en un anillo circular con radio muy pequeño en el FOMT, lo que puede impedir montaje del círculo usando las ecuaciones 3-5. Observamos que por la geometría esférica sencilla, la probabilidad de fijación cerca del ecuador es mucho más grande que un archivo adjunto exactamente en los polos; Por lo tanto, la mayor parte bserán atados eads de tal manera que el seguimiento angular (x, y) basado en la puede llevar a cabo con éxito.

    Un argumento similar es válido para la fijación de las perlas de marcadores para el marcador de seguimiento basada angular fiducial. El cordón marcador se utiliza para crear una asimetría en la imagen de la perla magnética que permite el seguimiento de ángulo. Si el cordón de marcador se une exactamente al norte o al polo sur de la perla (es decir, directamente en la parte superior o en la parte inferior), la imagen resultante es todavía simetría de rotación y no el protocolo de seguimiento angular. Sin embargo, por el mismo argumento geometría esférica, la posibilidad de un cordón marcador para conectar directamente a uno de los polos es relativamente pequeña; nos encontramos con que en la práctica la mayoría de las perlas de marcadores dan una asimetría suficiente para habilitar el seguimiento de angular. Por último, observamos que en las pinzas magnéticas convencionales la dirección del campo es en el (x, y) del plano; Por lo tanto, el eje de magnetización preferidas de la perla se alinearán en the (x, y) del plano y los polos norte y sur, como se definió anteriormente, van a estar en los lados de la perla, poco probable que la situación en el FOMT o MTT, donde los polos están en la parte superior e inferior.

    En experimentos FOMT, un paso crítico es la alineación del imán cilíndrico de tal manera que el campo magnético radial es despreciable en proximidad a la perla. Esta alineación se lleva a cabo para una única perla a la vez. Para juzgar si el movimiento del talón en la FOMT se distribuye uniformemente sobre un anillo circular, el tiempo de medición debe exceder de 20 · C τ. Como τ es igual a C ~ 45 seg de 8 kpb de ADN y un cordón de 0,5 mm de radio, el tiempo de medición es de ~ 900 segundos en la etapa final de la alineación. Para la comparación, el uso de 1,9 kpb de ADN y 0,25 mm perlas de radio reduce τ C veinte veces a ~ 2 seg (ver también la Tabla 2).

    Etapas críticas y Consideraciones para el seguimiento Durante FOMT y MTT experimentos

    Para el seguimiento de las fluctuaciones del grano en el plano, es decir, su (x, y)-posición, empleamos un análisis de correlación cruzada de los perfiles de intensidad mostrados por un cordón a intervalos de tiempo posteriores 35, 36. Esto puede llevarse a cabo a la resolución sub-píxel con una precisión de unos pocos nanómetros 20. Para seguir el movimiento del talón en Z, que normalmente utilizan un método primera diseñada por Gosse y croqueta, en el que el plano focal del objetivo (OFP) se desplaza con precisión en la dirección vertical mientras que las imágenes de los anillos de difracción de la perla unido al ácido nucleico 20 . De esta manera, un perfil de calibración se genera correlacionar el patrón de difracción de la perla a la distancia entre el talón y la OFP 19. Cuando se interpola este perfil de calibración, los desplazamientos verticales de la perla pueden ser también midieron con una precisión de hasta unos pocos nm 20.Remitimos al lector a las referencias adicionales que describen los algoritmos más refinados de seguimiento de 37, 38, así como su aplicación en paralelo de seguimiento de múltiples cuentas de 5, 6, 37.

    Cuando se utiliza el seguimiento angular que se basa en la conversión de (x, y) las posiciones en coordenadas angulares, le aconsejamos seguir los siguientes pasos. A partir de una curva del tiempo en el que el cordón traza un anillo circular, utilice el (x i, y i) posiciones (donde el índice i indica puntos de valoración posterior) para encajar el centro del círculo (x 0, y 0) y el radio del círculo R (Figura 2a), reduciendo al mínimo:

    (3)

    donde la suma se extiende sobre todos los puntos de datos. Después fitting x 0, y 0, y R círculo, determinar las coordenadas polares (r i, θ i) de cada punto de datos en la curva del tiempo usando:

    (4)

    (5)

    Tenga en cuenta que se debe tener cuidado para "desenvolver" el ángulo θ, es decir, añadir saltos de fase de ± π en su caso. Código escrito por encargo para el ajuste y la conversión de (x, y) a (r, θ) en coordenadas está disponible a partir de los autores que lo soliciten. En la FOMT, un tiempo de seguimiento en la que el cordón de traza un anillo circular puede obtenerse a través de la consecución de alineación aproximada (véase paso 3.3) y el registro de las fluctuaciones térmicas de la perla. En el MTT, fluctuación térmicaciones son insuficientes para trazar el anillo circular; en su lugar, utilizar una curva del tiempo en que los imanes son lentamente (por lo general en el 0,1 Hz) girado por varias vueltas para adaptarse al círculo usando las ecuaciones 3-5.

    Observamos que para el MTT, es importante elegir el enfoque adecuado de seguimiento angular, es decir, a través de un marcador de seguimiento angular (Figura 1c, Figura 1d, Figura 3a) o a través de la conversión de (x, y)-posiciones en coordenadas angulares ( la Figura 1d, Figura 2b). Aunque normalmente la precisión de la seguimiento angular desde (x, y)-posiciones y el uso de perlas de marcadores son comparables, es importante darse cuenta de que la diafonía se produce entre las fluctuaciones de un cordón en (x, y) y en ángulo, como se describe en Janssen et al 32: por lo tanto, el seguimiento angular desde (x, y)-posiciones sólo es válido a condición de que las fluctuaciones browniano en (x, Y) contribuyen sólo insignificantemente a la incertidumbre en la coordenada angular, y su uso apropiado de (x, y)-seguimiento puede requerir un ajuste de la trampa de rigidez rotacional a través de ajuste de la posición del imán lado. Típicamente, el uso de la trampa de mayor rigidez requiere el uso de seguimiento angular usando perlas de marcadores. El uso de perlas de marcadores requiere un paso de fijación adicional, que puede reducir el número de ataduras utilizables (véase el protocolo adjunto en el paso 1.9). Cuando se utiliza el seguimiento basado en perlas marcador, es importante seleccionar perlas magnéticas que tienen un cordón marcador está unido cerca del ecuador para obtener mejores resultados.

    Importancia del FOMT y MTT Enfoques comparación con los métodos y aplicaciones existentes

    En lo anterior, hemos demostrado cómo se puede, a partir de MT convencional, modificar fácilmente las configuraciones de imán para convertir el instrumento en MTT o FOMT. Este sencillo mODIFICACIÓN, que puede estar acompañada de la introducción de seguimiento angular cuando se desea el uso de un marcador de seguimiento angular, es un punto fuerte de ambas configuraciones inmediata, ya que permite que el usuario aplique par de torsión, medir el par, o medir el giro en función de la experimentar a la mano. Como se mencionó en la introducción, tanto FOMT y MTT se benefician de muchas de las fortalezas existentes de MT, en particular su simplicidad, con el MTT, en particular, también se benefician de la capacidad de las mediciones paralelas 5, 6 (estos no son alcanzados con la misma facilidad en FOMT dado el requisito de alineación de la correa de sujeción con respecto al centro del imán cilíndrico). Notablemente, MTT y FOMT no requieren, en contraste con otras técnicas, especialmente las nanopartículas manufacturadas de 22, 39, 40, diseño óptico complejo 41, o la introducción de cuentas adicionales dentro del atado (DNA) 42. Tal otécnicas ther pueden, no obstante, proporcionar otras ventajas, como una mayor resolución temporal de 27, 43, 44. Tanto FOMT y MTT deben encontrar futuras aplicaciones en el estudio de procesamiento de genoma, como el comportamiento de motores moleculares en el ADN es a la vez influenciado por y tiene consecuencias para el toque local y par motor. Las aplicaciones adicionales pueden ser encontrados en el campo emergente de la nanotecnología de ADN 27 o en el campo más amplio de motores giratorios activados en el procesamiento biológico 7, 45.

    M270 (cordón de R = 1,4 m) MyOne (cordón de R = 0,5 m) Ademtech (cordón de R = 0,25 micras)
    Convencional MT (par de cúbicos 5 x 5 x 5 mm 3 imanes, 1 mm de separación, alineación vertical) 70 pN 8 pN 1.6 pN
    FOMT o MTT * (pila de tres imanes cilíndricos, 6 mm de diámetro, 2 brecha diámetro mm) 9 pN 1 pN 0.2 pN
    FOMT o MTT * (pila de tres imanes cilíndricos, 6 mm de diámetro, 1 mm de distancia de diámetro) 18 pN 2 pN 0.4 pN
    FOMT o MTT * (pila de tres imanes cilíndricos con último volteado, brecha 1 mm de diámetro) ~ 50 pN 9 pN 1.8 pN

    * La presencia del imán lado pequeña en el MTT tiene un efecto insignificante en la fuerza de estiramiento

    Tabla 1. Fuerzas máximas alcanzan típicamente para diferentes configuraciones de imán y tipos de cuentas.

    R grano = 1,4 m R grano = 0,5 m R grano =0,25 m
    Coeficiente de fricción * 120 pN · nm · seg 5,5 pN · nm · seg 0,7 pN · nm · seg
    Escala de tiempo característica: FOMT, 10 kpb de ADN ** 1200 seg 55 seg 7 seg
    Escala de tiempo característica: FOMT, ADN 1 kpb 120 seg 5.5 seg 0,7 seg
    Escala de tiempo característica: MTT, k q = 100 pN · nm / rad 1.2 seg 0.06 seg 0.007 sec
    Escala de tiempo característica: MTT, k q = 1,000 pN · nm / rad 0.12 seg 0,006 seg = 6 mseg 0,0007 s = 0,7 ms

    * Coeficiente de fricción para la rotación alrededor de un eje a través de la "ecuador" (es decir, la situación mostrada en la Figura 1b), Dada por 14 · p · h · R talón 3, donde h es la viscosidad de la memoria intermedia.
    ** En el FOMT, la trampa rigidez rotacional está dada por la rigidez a la torsión del ADN, k q, ADN = C · k B T / L de C, donde C es la longitud de persistencia de torsión efectivo, supone que es 80 nm aquí ( que es característico de un régimen de fuerza intermedia, F ~ 1 Pn) y L C es la longitud de contorno de ADN, 0,34 nm por par de bases.

    Tabla 2. Coeficientes de fricción y tiempo característico escalas para FOMT y MTT.

    Disclosures

    Una patente relacionada con este trabajo se ha archivado bajo PCT/NL2011/050446 referencia.

    Acknowledgments

    Este trabajo fue apoyado por la Universidad Tecnológica de Delft, la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), la Fundación para la Investigación Fundamental de la Materia, y por la Fundación Europea de la Ciencia.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sandblaster Great Lake Orthodontics 190-070 Microetcher II
    Nitrocellulose Life Technologies LC2001
    Magnetic particle concentrator Life Technologies 12002D
    Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) Polysciences 17010
    Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) Sanbio PV05N/2179
    Antidigoxigenin Roche 11 214 667 001
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) Ademtech 3150
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) Life Technologies 650.01
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) Life Technologies 653.05
    Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) Life Technologies F-8768
    Cubic magnets for conventional tweezers Supermagnete W-05-N50-G
    Cylindrical magnet for MTT and FOMT Supermagnete R-06-02-02G
    Side magnet for MTT Supermagnete S-04-07-N
    Linear stage Physik Instrumente M-126.PD
    Rotary stage Physik Instrumente C-150
    High-resolution automated sample stage Physik Instrumente P-733.2D
    Software for coding analysis routines The Mathworks MATLAB custom-written routines are available from the authors

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    References

    1. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271, 1835-1837 (1996).
    2. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421, 423-427 (2003).
    3. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods. 5, 491-505 (2008).
    4. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).
    5. Ribeck, N., Saleh, O. A. Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers. The Review of scientific instruments. 79, (2008).
    6. De Vlaminck, I., et al. Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering. Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).
    7. Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective. Cell. 142, 519-530 (2010).
    8. Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).
    9. Ajjan, R., et al. Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity. Blood. 111, 643-650 (2008).
    10. Mierke, C. T., et al. Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain. Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).
    11. Shang, H., Lee, G. U. Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction. Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).
    12. Shang, H. K. P., et al. The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries. J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).
    13. Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. Implementation of force differentiation in the immunoassay. Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).
    14. Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).
    15. Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).
    16. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).
    17. Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers. Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).
    18. Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases. Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).
    19. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorder, P., van Oijen, A. , Springer. (2009).
    20. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).
    21. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications. 2, 439 (2011).
    22. Celedon, A., et al. Magnetic tweezers measurement of single molecule torque. Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).
    23. Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics. The Review of scientific instruments. 82, (2011).
    24. Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments. Nature. 7, 977-980 (2010).
    25. Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers. Physical review letters. , 102 (2009).
    26. Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. Soft magnetic tweezers: A proof of principle. Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).
    27. Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami. Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).
    28. Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data. Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).
    29. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. The Review of scientific instruments. 83, (2012).
    30. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).
    31. Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament. Nucleic acids research. 41, (2013).
    32. Janssen, X. J., et al. Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque. Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).
    33. Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).
    34. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nat Commun. 2, 439 (2011).
    35. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).
    36. Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331, 450-453 (1988).
    37. Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification. Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).
    38. Kim, K., Saleh, O. A. A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements. Nucleic acids research. 37, 136 (2009).
    39. Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods. 4, 223-225 (2007).
    40. Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. Electron beam fabrication of birefringent microcylinders. ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).
    41. La Porta, A., Wang, M. D. Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles. Physical review letters. 92, (2004).
    42. Gore, J., et al. DNA overwinds when stretched. Nature. 442, 836-839 (2006).
    43. Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. Recent developments in single-molecule DNA mechanics. Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).
    44. Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).
    45. Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. Torque measurement at the single-molecule level. Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).

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    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O.,… More

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).

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