Summary
Magnetische pincet, een krachtige single-molecule manipulatie techniek kan worden aangepast voor de directe metingen van de twist (met een configuratie genoemd vrij-baan magnetische pincet) en koppel (met een configuratie genoemd magnetisch koppelpincet) in biologische macromoleculen. Richtlijnen voor het uitvoeren van dergelijke metingen worden gegeven, met inbegrip van toepassingen aan de studie van DNA en bijbehorende nucleo-eiwit filamenten.
Abstract
Single-molecule technieken maken het mogelijk om het gedrag van individuele biologische moleculen in oplossing in real time onderzoeken. Deze technieken omvatten zogenaamde kracht spectroscopie benaderingen zoals atomaire kracht microscopie, optische pincetten, stromen stretching, en magnetische pincet. Onder deze benaderingen, hebben een magnetisch pincet zich onderscheiden door hun vermogen om het koppel te passen met behoud van een constante strekkracht. Hier wordt getoond hoe een dergelijke "klassieke" magnetisch pincet experimentele configuratie, door een eenvoudige wijziging van de veldconfiguratie de omvang van de dwarse veld te minimaliseren, worden aangepast aan de mate van twist in een biologisch molecuul te meten. De resulterende configuratie wordt aangeduid als de vrij-baan om een magnetisch pincet. Bovendien wordt getoond hoe verdere modificatie van veldconfiguratie een transversaal veld kan opleveren met een grootte tussen die van de & #8220; conventionele "magnetische pincet en de vrij-baan magnetische pincet, waardoor het mogelijk rechtstreeks de koppel opgeslagen in een biologisch molecuul. Deze configuratie wordt genoemd de magnetische koppelpincet. De bijhorende video legt uit hoe de conversie van conventionele magnetische pincet in vrij baan om de magnetische pincet en magnetische koppelpincet kan worden bereikt, en toont het gebruik van deze technieken. Deze aanpassingen houden alle sterke punten van de conventionele magnetische pincet terwijl sterk uitbreiden van de veelzijdigheid van dit krachtige instrument.
Introduction
De afgelopen jaren hebben enkele molecule technieken hun brede toepasbaarheid bewezen in de studie van processive motorische eiwitten en andere enzymen, waardoor inzicht in de kinetiek en de onderliggende mechanochemistry. In het kader van kracht spectroscopie, zijn belangrijke bijdragen zijn gemaakt van atomaire kracht microscopie stroom stretching, en optische en magnetische pincet. Optische en magnetische pincet (MT) hebben met name erin geslaagd een grote flexibiliteit op het gebied van moleculaire manipulatie met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Hier richten we ons op MT, die zowel stretching krachten en momenten kunt toepassen op biologische moleculen gebonden tussen een oppervlak en superparamagnetische 1-3.
Magnetische pincet (MT figuur 1a) is een zeer veelzijdig individuele molecuul techniek die is gebruikt om zowel de mechanische eigenschappen van nucleïnezuren en hun interacties met eiwitten volgen. MT hebben veel sterktes, waaronder de algehele eenvoud en robuustheid van de experimentele uitvoering, gemakkelijke toepassing van het koppel, natuurlijke werking en eenvoudige kalibratie in constante kracht mode 4, uitbreiding van de metingen 5, 6 parallel, en de afwezigheid van het monster verwarming en photodamage. Vergeleken met andere single-molecule komt, MT bieden een manier om kracht-afhankelijkheid metingen uit te voeren op krachten zo laag als ≈ 10 fN en hebben de mogelijkheid om onomwonden de controle van de mate van supercoiling. Terwijl MT zijn voornamelijk gebruikt als een experimenteel middel om biologische processen waarbij nucleïnezuren 7, 8 onderzoeken, hebben zij ook toepassing gevonden in studies van de mechanische eigenschappen van eiwitten 9-13 of cellen 10, 14-17. Talrijke nuttige referenties zijn die beschrijven hoe te bouwen en uitvoeren van een MT 4, 18-20.
Howeveh, conventionele MT niet bijhouden roterende beweging direct, en, terwijl ze het koppel toe te passen, hebben ze geen koppel direct te meten. Verder zij beperken de vrije rotatie van de nucleïnezuur ketting. Hier presenteren we twee uitbreidingen van magneet pincet. De eerste, genaamd vrij-baan magnetische pincet (FOMT, figuur 1b) 21, maakt de metingen van evenwicht hoek fluctuaties en veranderingen in de twist van gebonden nucleïnezuurmoleculen, zonder beperken de rotatiebeweging rond de ketting as. De tweede, zogenaamde magnetische koppelpincet (MTT figuur 1c), die de mogelijkheid om zowel krachten en momenten gelden rechtstreeks meten enkele biomoleculen 22-27 heeft.
In het volgende protocol, veronderstellen we dat de lezer op zijn / haar karakter een 'conventionele' MT instrument. We verwijzen de lezer naar de discussieruimte voor referenties over het opbouwen en uitvoeren van een MT opgezet, evenals ontrantsoenen dat bij de selectie van magnetische korrels, magneten, en volgen routines rekening moet worden gehouden. Bovendien delen 1 en 2 van het protocol tekst beschrijven hoe wij doorgaans bereiden en incubeer een DNA monster voor gebruik in de MT en de voorlopige metingen die worden uitgevoerd op een enkel DNA in de conventionele MT. Paragrafen 3 en 4 van het Protocol tekst illustreren hoe een MT instrument gemakkelijk kan worden aangepast en gebruikt voor FOMT en MTT metingen.
Protocol
1. Voorbereiding en incubatie van een DNA-sample
- Bereid DNA-constructen die worden geligeerd aan uiteinden (meestal in dienst ≈ 600 bp DNA-PCR-fragmenten) die zijn gefunctionaliseerd met meerdere biotine en digoxigenine groepen, respectievelijk 18 duplex. Om te beginnen, een DNA ketting lengte> 1 urn, bijvoorbeeld een 7,9 kbp overeenkomende met een gestrekte lengte van ~ 2,7 urn zoals hier toegepast, wordt aanbevolen voor gebruiksgemak; in het bijzonder met behulp van een DNA lengte die gelijk is aan of korter dan de straal kraal is problematisch vanwege de geometrie bijlage in de MTT en FOMT. Zie de discussie voor een beschrijving van hoe DNA lengte beïnvloedt temporele respons in de hoekige domein.
- Monteer de stroom cellen voor single-molecule experimenten. Voor de stroom cellen, gebruik maken van twee glazen microscoop coverslips gescheiden door een double-layer Parafilm spacer. De bovenste microscoop dekglaasje moeten twee gaten voor het fluïdum in-en uitlaten voor de cel. Het is handig omgebruik een sandblaster om de gaten te boren. De onderste dekglaasje bedekt met nitrocellulose (0,1% gew / vol in amyl acetaat). Plaats de Parafilm spacers op de nitrocellulose-gecoate zijde van de bodem dia's en sluit de top met schone top glijbanen.
- Seal de stroom cellen. Met behulp van fysieke pincet, plaatst de verzamelde stroom cel op een verwarmingsplaat ingesteld op 80-100 ° C voor ~ 1 minuut. Let erop dat de stroom cel goed is afgedicht, dat de Parafilm niet afsluiten van de gaten die aansluiten op de in-en uitlaat, en dat de glazen plaatjes zijn goed uitgelijnd.
Opmerking: Om een goede afdichting te garanderen, is het raadzaam om een beroerte uit bubbels in de Parafilm behulp van een grote wattenstaafje. De doorstroomcel kan vervolgens de magnetische pincet instrument gemonteerd. - Bereid buffers. Bereid tethering TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en 200 mM NaCl). Als alternatief kan men PBS buffer (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM fosfaatbuffer, pH 7,4) aangevuld with 100 ug / ml BSA, 0,1% Tween en 5 mM natriumazide (PBS +) als tethering buffer. Flush 2-3 celvolumes TE-tethering buffer in de stroom cel.
- Incubeer 0,5 of 1,5 urn radius niet-magnetische latex kralen in de stroomcel voor ~ 30 minuten. Deze kralen geldt als referentie kralen tijdens magnetische pincet metingen die mogelijk maken om het effect van drift tussen de objectieve en de monsterhouder (dwz de stroom cel) te minimaliseren. Spoel losse niet-magnetische korrels door spoelen met 2-3 celvolumes van TE-tethering buffer.
- Functionaliseren het bodemoppervlak van de stroomcel door incubatie met 100 ug / ml anti-digoxigenine in PBS gedurende ten minste 1 uur (bij voorkeur langer, incubatietijd kan overnacht worden uitgevoerd), te voorzien in DNA bevestiging. Spoelen met 2-3 celvolumes TE tethering buffer. Tenslotte incubeer de stroomcel met 2 mg / ml runderserumalbumine (BSA) in TE-buffer tethering 30 min voor oppervlaktepassivering.
- Breng een hoeveelheid van2 ml-streptavidine beklede superparamagnetische MyOne kralen (zie Discussie en tabel van Materialen) en verdun met 10 ml TE-tethering buffer. Twee keer wassen met 10 ml TE-tethering-buffer met behulp van een magnetisch deeltje concentrator en resuspendeer in 10 ml TE-tethering buffer. Bevestig ~ 1 ml van de DNA-moleculen (ongeveer 1 ng) om deze kralen door incubatie in TE tethering buffer gedurende 30 minuten.
- Verdun de oplossing van het DNA-gebonden superparamagnetische tienvoudig door toevoeging van 90 ml TE-buffer tethering. Tenslotte, de injectie in de stroomcel en incubeer gedurende ~ 1 uur om DNA bevestiging aan de anti-digoxigenine coating. Was de stroom cel grondig met TE tethering buffer. Na incubatie van de DNA-tether-constructen, spoelen uitgebreid met experimentele buffer (dit kan TE tethering buffer) om alle niet-aangesloten kralen te verwijderen.
- Voor metingen die een hoekige volgen protocol dat referentiemerkteken kralen bevestigd aan de magnetische korrels vereist dienst
2. Metingen op een enkel DNA-molecuul in de conventionele magnetische pincet
- Met behulp van een conventionele MT (zie Overleg) met geschikte veld configuratie (figuur 1a) en zowel translatie en rotatie controle van de positie van de magneet, zoeken rotatie constrained DNA-moleculen in de stroom cel. Bij trekkrachten ≥ 1 pN (raadpleeg gevonden 4, 19, 20, 28, 29 over kracht kalibratie magnetische pincet) kan gebonden parels gemakkelijk worden onderscheiden van korrels het oppervlak van de onderste slede vast door hun verschillende hoogtes in de focus . Of een DNA-molecuul roterend wordt beperkt kan worden beoordeeld door het introduceren 20-30 turns van de magneten op een kracht van ≈ 0.25 PN: hier, moet de ketting lengte afnemen met 0,4-0,5 micrometer.
Opmerking: magnetische pincet experimenten uitvoert, wordt beeldverwerking gebruikt om de x, y en z-positie van DNA-gebonden kralen bepalen. Custom Labview software hiervoor is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag.- Controleer of de kraal wordt bevestigd door een enkel DNA-ketting. Dit kan door het vergelijken van het gedrag onder positieve en negatieve beurten krachten van> 1 pN (Figuur 2a). In deze kracht regime zal de aanwezigheid van meerdere DNA kettingen leiden tot een ongeveer symmetrisch daling van de verlenging bij invoering positieve en negatieve bochten, terwijl enkel DNA aanbinden aanleiding geeft tot een asymmetrische reactie.
- Zoeken naar geschikte vaste korrels vast aan het bodemoppervlak in de nabijheid van de ketting plaats die kan dienen als referentie kralen.
- Kalibreer de lengte van de thij DNA, l. De positie van de stroomcel oppervlak kan worden bepaald doordat de kraal gebonden in contact met het oppervlak (bijvoorbeeld door roteren van de magneet door ~ 60 slagen per kracht dan 0,2 pN). Metingen van de kraal is gebonden verticale positie ten opzichte van dit oppervlak rapporteren vervolgens absolute waarde van l.
Opmerking: Om latere effecten van drift zoveel mogelijk te beperken, is het raadzaam om metingen van l ten opzichte van uit te voeren om de positie van een verwijzing kraal aangebracht op het oppervlak. - Neem een rotatie curve (een meting van de DNA extensie als functie van het aantal windingen) en een strekkracht van ≈ 0,25 pN (Figuur 2a).
- Bepaal het aantal windingen waarbij het toestel maximaal is, omdat dit overeenkomt met de situatie waarbij het DNA-molecuul torsie ontspannen. Hiervoor is het nuttig om de rotatie curve plaatselijk te voorzien van een parabolische of een Gaussische functie het centrum positi bepalenop. Definieer dit punt als "zero bochten".
Opmerking: Een maat geschreven routine hiervoor is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag.
- Bepaal het aantal windingen waarbij het toestel maximaal is, omdat dit overeenkomt met de situatie waarbij het DNA-molecuul torsie ontspannen. Hiervoor is het nuttig om de rotatie curve plaatselijk te voorzien van een parabolische of een Gaussische functie het centrum positi bepalenop. Definieer dit punt als "zero bochten".
- Voor een reeks van ~ 20 magneet posities bepalen de gemiddelde verlenging van de torsie ontspannen molecuul (bijvoorbeeld bij "nul bochten", zie stap 2.4.1) van de z-trace.
- Voor elk meetpunt in stap 2.5, nauwkeurig bepalen rekkracht van de fluctuaties in de x-of y-positie 20, 28, 29, of, indien de magnetisatie van de kraal is bekend, met kennis van de lokale veldgradiënt 4. Plotten van de stretching kracht tegen de gemiddelde uitbreiding resulteert in een kracht-extensie curve (Figuur 2b).
- Monteer de resulterende kracht-extensie gegevens naar de worm-achtige keten vergelijking met de polynoom benadering door Bouchiat et al. 30.
Opmerking: Hoe kleiner de straal van de ring verkregen in de gebruikelijke configuratie MT, hoe dichter het DNA-molecuul wordt dichter bij de "zuidpool" van de magnetische parel gebonden. Wanneer men overschakelt naar de FOMT configuratie, zal een dergelijk DNA molecuul nauw vastgebonden aan de "evenaar" van de magnetische parel, waarvoor betrouwbare volgen van de rotatiehoek maakt van de (x, y)-positie (zie discussie).
3. Metingen van DNA Twist door de vrij-baan om een magnetisch pincet
- Handmatig vervangen magneet van de conventionele magnetische pincet door een cilindrische magneet die wordt gebruikt voor FOMT (Figuur 1b). Deze handeling moet worden uitgevoerd zodanig dat de geselecteerde DNA ketting binnen het gezichtsveld blijft.
- Grove uitlijning kan worden uitgevoerd binnen 15 minuten in het geval van MyOne kralen 7,9 kbp aanbinden, en is voltooid wanneer het meten van de (x, y) excursies resulteert in de waarneming van cirkelvormige beweging (figuur 3b, midden).
Opmerking: Ruwe uitlijning is meestal voldoende om de veranderingen in twist veroorzaakt door eiwitbinding aan enkele DNA gebonden in de FOMT configuratie observeren 21, 31 (Representatieve resultaten, figuur 5), hoewel het bijbehorende tweedimensionale histogram mag zijn tellingen absoluut gelijkmatig verdeeld over de cirkelvormige ring (figuur 3c).
Opmerking: Een MATLAB script voor het plotten van de fluctuaties in een histogram of thermogram zoals in figuur 4 is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag.
Opmerking: Fine uitlijning kan worden uitgevoerd binnen 45 minuten in het geval van MyOne kralen met 7,9 kbp aanbinden, en in verminderde termijnen voor de kleinere kralen en kortere aanbinden in dienst zijn (zie bespreking).
Opmerking: Fijn afstemming is normaal nodig is om metingen van de torsiestijfheid van naakt of met eiwit beklede DNA (Representatieve resultaten, figuur 4) uit te voeren.
4. Metingen van DNA Torque Met de Magnetic koppelpincet
- Handmatig vervangen cilindrische magneet die wordt gebruikt voor FOMT door een cilindrische magneet plus een (vaste) magneet voor de MTT (Figuur 1c). Deze handeling moet worden uitgevoerd zodanig dat de geselecteerde DNA ketting binnen het gezichtsveld blijft.
- De meest eenvoudige manier om dit te bereiken is de opzij magneten van de juiste locatie, die kan worden uitgevoerd binnen 1 min. handmatig. Geen verdere aanpassing nodig.
Opmerking: Een alternatief voor een secundaire magneet is het gebruikelektromagneten 32.
- De meest eenvoudige manier om dit te bereiken is de opzij magneten van de juiste locatie, die kan worden uitgevoerd binnen 1 min. handmatig. Geen verdere aanpassing nodig.
- Indien nodig voor analyse kalibreren de kracht op een wijze analoog aan MT, met behulp van x de korrel of y schommelingen of, mits de magnetisatie van de kraal is bekend, met kennis van de lokale veldgradiënt 21.
- Volg de hoekige fluctuaties als functie van de tijd θ (t) met behulp van het referentiemerkteken gebaseerd volgend protocol 23 of, zoals in de bijgaande video, de hoekige tracking-protocol op basis van de controle op de (x, y)-positie (zie discussie). In het eerste geval opnemen volledige beelden van de kraal als functie van de tijd voor verdere beeldverwerking. In het laatste geval volstaat het (x, y) schommelingen de hiel record bij deze stap.
Opmerking: Een MATLAB script voor het bepalen θ (t) van volledige beelden van de kraal als functie van de tijd in het referentiemerkteken gebaseerd volgend protocol is eenvailable van de auteurs op aanvraag.- Zoals beschreven in de discussie, voor de hoekige volgen protocol op basis van het toezicht op de (x, y)-positie is het ook raadzaam om een tijd trace waar de magneten zijn langzaam (typisch bij 0,1 Hz) gedraaid door verschillende bochten te nemen. Hierdoor kan men Cartesische coördinaten (x, y) nauwkeurig omzetten in polaire coördinaten (r, θ) met Vergelijkingen 3-5 van de discussie.
Opmerking: Een MATLAB script voor hoekige traceerscript gebaseerd op het monitoren van de (x, y)-positie is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag.
Opmerking: De meting tijd vooral afhankelijk van het gewenste koppel resolutie. Een gedetailleerde parameter gegeven in Lipfert et al. 24. Voor MyOne kralen en 8 kbp DNA aanbinden, meet voor 30-100 seconden moet voldoende zijn om een koppel resolutie in het bereik van ~ 1 pN · nm te geven.
- Zoals beschreven in de discussie, voor de hoekige volgen protocol op basis van het toezicht op de (x, y)-positie is het ook raadzaam om een tijd trace waar de magneten zijn langzaam (typisch bij 0,1 Hz) gedraaid door verschillende bochten te nemen. Hierdoor kan men Cartesische coördinaten (x, y) nauwkeurig omzetten in polaire coördinaten (r, θ) met Vergelijkingen 3-5 van de discussie.
- Bepaal de stijfheid van de torsie val van the variantie van de hoekige fluctuaties (σ θ 2, in radialen) met:
k θ = k B T / σ θ 2 (1)
Opmerking: Typische roterende val stijfheid bereikt de MTT in het bereik van 10-1000 pN · nm / rad, lager dan voor conventionele magnetische pincet. - Bovendien, de z-positie van de hiel opneemt en deze aan de ketting lengte l bepalen (zie ook stap 2,4-2,7).
- Roteren N wordt opnieuw opnemen θ (t) en l (t).
Opmerking: De gereduceerde rotatie val stijfheid van de MTT opzichte MT maakt het geschikt voor het meten van single molecule koppel, maar impliceert dat het maximumkoppel dat kan worden uitgeoefend wordt verminderd. Dit betekent dat de MTT niet in staat zijn om hoge weerstand koppel bij snelle rotatie compenseren. Er moet dus voor worden gewaakt dat de maximale snelheid overschrijdt; typically roteren met een snelheid dicht bij 0,1 Hz. - Bepaal het koppel opgebouwd in de nucleïnezuur ketting na N wordt gebruikt:
Γ = - k θ <θ N - θ 0> (2)
Wanneer <...> duidt de gemiddelde en θ 0 en θ N worden de hoek nul omwentelingen (overeenkomend met een torsie ontspannen ketting, zie. Stap 2.3 en N wordt respectievelijk. - Herhaal de stappen 4.5 en 4.6 als nodig is om het koppel reactie van een molecuul in een enkele meting run (Representatieve resultaten, Figuur 6) kunnen vaststellen.
Representative Results
Representatieve resultaten uit de MT (figuur 1a) zijn weergegeven in figuur 2. Figuur 2a toont rotatie-extensie curves voor een 7,9 kb DNA genomen F = 0.25, 0.5 en 2.0 pN. De reactie van een DNA rotatie worden symmetrisch aan scherpe krachten (0,25 pN), de verlenging van het DNA af als gevolg van de vorming van positieve of negatieve supercoils plectonemic. Kwalitatieve kennis van deze reactie is handig wanneer in eerste instantie zoeken naar een rotatie beperkt DNA tether (stap 2.1). Merk op dat aanvullende inspectie van de ketting is nodig om te controleren of het bestaat uit een enkel DNA-molecuul: hier, de asymmetrische reactie van een enkel DNA-rotatie op krachten van meer dan 0,5 pN helpt om het te onderscheiden van verschillende DNA's (stap 2.1.1). Zodra dit is geverifieerd, keert men de rotatie respons 0.25 pN om het exacte aantal magneet wordt bepaald waarbij de individuele DNA is torsie ontspannen, waar men een kracht-extensie curve, die figuur zou lijken op 2 b. Voor deze specifieke meting, een vlaag van de gegevens naar de worm-achtige keten model (vaste lijn) leverde een ingerichte omtreklengte L C = 2,71 micrometer en buigen persistentielengte L P = 45 nm. Voor dsDNA, moet het voorzien waarden van de persistentie lengte in het bereik 40-55 nm liggen, afhankelijk van de bufferomstandigheden 33 en de gemonteerde contourlengte moet afsluiten (meestal binnen 10%) om de verwachte waarde van het DNA-construct dat wordt gebruikt in de meting, met de verhouding L DNA = 0,34 nm / bp · aantal baseparen.
Figuur 3 toont de procedures en de resultaten van de aanpassing in de FOMT (Figuur 1b). De eerste (x, y) excursies die in stap 3.2 kan worden vergeleken met het algehele beeld van fluctuaties in functie of de transversale magneet positie getoond in figuur 3a, die een "vortex" patroon dat kan worden gebruikt als leidraad verdere relatieve verplaatsing tussen de magneet en DNA-gebonden kralen die in het FOMT toont. Bij latere grove uitlijning voltooid, de parel van de (x, y)-schommelingen sporen uit een cirkelvormige baan, zoals ook blijkt uit de zwarte sporen in figuur 3b. Op dit punt wordt het koppel van de magneten om de z-as gereduceerd tot het punt dat thermische fluctuaties volstaat om de kraal rond zijn bevestigingspunt. De straal R cirkel van de resulterende cirkelvormige ring (gemonteerd cirkel wordt weergegeven in rood) de radiale afstand tussen de DNA bevestigingspunt en het centrum van de kraal's (Figuur 1b). Zoals getoond in figuur 3c, maar een histogram van de gegevens in Figuur 3b toont dat grove uitlijning garandeert geen uniforme dekkingalle mogelijke posities langs de cirkelvormige ring. Hoewel thermische fluctuaties voldoende om alle rotaties hoek op de cirkel staand, blijft er een kleine energie barrière (de orde van de thermische energie kBT) om vrije rotatie.
Bij fijnere aanpassing in de FOMT (stap 3.4) wordt uitgevoerd, kan het instrument worden gebruikt om de torsie-modulus van DNA (figuur 4) te bepalen. Eerst wordt fijne instelling van het monster gebruikt om cirkelvormige beweging (figuur 4a), waarvan de twee-dimensionale histogram moet nu een uniforme dekking (figuur 4b) te verkrijgen. De bijbehorende tijd trace q (t) van hoekige fluctuaties (verkregen uit de omzetting van de (x, y)-posities, zie hieronder) toont geen periodiciteit die overeenkomt met 360 ˚ (figuur 4c) en onthult grote excursies overeenkomt met meerdere omwentelingen (Figuur 4d). De impliciete energielandschapis harmonisch over een bereik van> 1000 ˚ (figuur 4e). De standaardafwijking van de fluctuaties is σ θ = 223 °, wat overeenkomt met een hoek houden stijfheid van k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 pN · nm / rad, die op zijn beurt geeft een schatting van de effectieve torsie persistentielengte van DNA gelijk aan C = L C / σ θ 2 ~ 76 nm (L C = 1150 nm voor de 3,4 kbp DNA gebruikt in deze meting) op de gemeten kracht.
Een voorbeeld van hoe FOMT kan worden gebruikt om de verandering in draai geïnduceerd in de gebonden DNA-molecuul door de binding van eiwitten 31 te meten, 34 wordt getoond in figuur 5. Hier hebben we toezicht op de binding van RAD51 eiwit verdubbelenDNA; RAD51 is bekend dat zowel verlengen en tot rust komen DNA als het een nucleoprotein filament 31 vormt. Bij het spoelen van RAD51 in de stroom-cel, zien we dat de kraal ondergaat een spiraalvormige baan in de FOMT (figuur 5a). Door het omzetten spoor (x, y) beweging als functie van de tijd q (t) zoals hierboven beschreven, kunnen wij co-plot namelijk dat RAD51 heeft op de DNA ketting lengte en de mate van afwikkelen (figuur 5b, c) .
Een alternatieve benadering voor het meten van de torsie-eigenschappen van DNA de MTT (Figuur 1c, figuur 6). Het schema in Figuur 6a toont het principe van de meting: na het forceren (of underwinding) de DNA ketting door N wordt het DNA oefent een herstellende torsie op de kraal die leidt tot een verschuiving in het evenwicht hoekstand van 0 tot θ θ N. In de MTT de transversale component van de magnetische veld wordt verminderd in vergelijking met de MT, die meting van dergelijke hoekige verschuivingen vergemakkelijkt terwijl het toelaat kraal rotatie (figuur 1). De grootte van de hoekverschuiving gemeten na aanbrengen N = 45 wordt een 7,9 kbp DNA wordt getoond in figuur 6b. De volledige sequentie van de MTT meetprotocol en het verkregen resultaat van een koppel-rotatie kromme voor DNA worden getoond in Figuur 6c-f. Hier, metingen van de standaarddeviatie (figuur 6c) en de gemiddelde (figuur 6d) van de hoekcoördinaat weergegeven als functie van op-en underwinding, de standaardafwijking wordt omgekeerd evenredig met de hoekige houden stijfheid (vergelijking 1). Tezamen bieden deze hoeveelheden mogelijk maken om een koppel te bouwen versus rotatie curve voor DNA (figuur 6f), die een lineaire respons regio moet tonen gecentreerd rond 0 wordt eennd twee plateaus waarbij het koppel verzadigd, op positieve en negatieve rotaties, respectievelijk. Een dergelijk koppel-rotatie curve vult de gegevens in een verlenging versus rotatie curve (figuur 6e), waardoor het kwantificeren van de overgangen die het knikken en denaturatie van DNA begeleiden.
Figuur 1. Schema's van conventionele magnetische pincet (MT), vrij baan om de magnetische pincet (FOMT), magnetische koppelpincet (MTT), en twee strategieën voor het bijhouden draaihoek. (A) In de drie implementaties van magnetische pincet, magnetische korrels zijn gebonden om een stroom celoppervlak van gefunctionaliseerde macromoleculen, bijvoorbeeld de dubbelstrengs DNA-moleculen schematisch weergegeven. Referentie kralen zijn bevestigd aan de stroom celoppervlak en bijgehouden voor Drift correctie. Alle drie MT opstellingen gebruiken magneten om een opwaartse kracht uitoefenen strekken de magnetische parel en derhalve DNA ketting. In conventionele MT, een paar magneten oefent een magnetisch veld dat dwars gericht ten opzichte van de ketting as stevig beperken rotatie van de kraal rond de DNA-tether as. In FOMT, een cilindervormige magneet levert een magnetisch veld georiënteerd langs de ketting richting. Wanneer de ketting wordt afgestemd op het centrum van de cilindervormige magneet, worden de resterende transversale velden geminimaliseerd, waardoor vrije rotatie om de ketting hartlijn In MTT wordt een secundaire magneet toegevoegd aan de cilindervormige magneet gebruikt FOMT om te zorgen een kleine dwarse veld (gereduceerd in grootte in vergelijking met MT). Dit kleine dwarse veld maakt de toepassing van het koppel en de meting. (B) Twee strategieën om de rotatiehoek van een magnetische kraal over het DNA-tether assen worden getoond. 1): een marker kraal (green) verbonden aan het magnetische bolletje (bruin) geeft een asymmetrische afbeelding die hoek maakt het bijhouden van voorstellen analyse. Twee CCD beelden van een 1.4-um-radius magnetische kraal met een 0,5-um-radius referentiemerkteken worden getoond, in focus en out-of-focus. 2) wanneer het DNA gebonden aan de magnetische korrel op een positie weg van zuidpool de hiel van het midden van de kraal fluctueert langs een boog waarvan het middelpunt definieert een hoekpositie. Ofwel strategie kan worden gebruikt om rotatiehoek volgen en bewaken verschuivingen in de groothoekstand de ketting is gespannen torsie (sporen rechts), waardoor metingen van individuele moleculen koppel.
Figuur 2. DNA kalibratiemetingen op gebruikelijke MT. (A) rotatie-extensie curves voor een 7,9 kb DNA genomen F = 00,25, 0,5, en 2,0 pN. De asymmetrische reactie onder rotatie positieve en negatieve windingen van enkele dubbelstrengs DNA kettingen kunnen worden gebruikt als een geschikte test voor de ketting attachment. (B) kracht-verlenging kromme voor een 7,9 kb DNA, samen met een aansluiting op de worm- zoals chain model (vaste lijn), wat een ingerichte omtreklengte L C = 2,71 micrometer en buigen persistentielengte L P = 45 nm. Alle metingen werden uitgevoerd in PBS-buffer.
Figuur 3. Uitlijning in het FOMT. (A) (x, y) fluctuaties van DNA-gebonden kralen die in de FOMT als functie van magneetpositie. De positie van de cilindrische magneet werd afgetast bij een constante hoogte van 3 mm in de stroom celoppervlak in stappen van 250 urn x en
Figuur 4. Meting van DNA torsiestijfheid met FOMT. (X, y)-traject (a) en histogram (b) een DNA-tethEred schommelingen kraal na fijne instelling van de relatieve magneet-tether positie in de FOMT. Onder deze omstandigheden, het histogram toont hoofdzaak uniforme dekking van de posities op de cirkel. (C) Rotatie schommelingen van de hiel bepaald uit de (x, y)-positie. (D) Histogram van rotationele fluctuaties. De rode lijn is een Gauss fit met σ θ = 223 °. (E) Het energielandschap geïmpliceerd door de rotatie fluctuatie dichtheid van (c) en (d). Het verschil tussen de energielandschap geïmpliceerd door de rotationele fluctuaties en een harmonische benadering (met k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 pN-nm/rad) is veel kleiner dan de thermische energie kBT over meerdere windingen. Gegevens worden gecompenseerd voor de duidelijkheid zodat θ 0 = 0. De breedte vande fluctuaties kunnen worden gebruikt om de torsiestijfheid van DNA te bepalen, zie hoofdtekst. De meting werd uitgevoerd in PBS-buffer uitgevoerd bij een stretching kracht van ~ 1 pN. Gegevens zijn afgeleid Lipfert et al. 21.
Figuur 5. De binding van RAD51 eiwit aan DNA gemeten met behulp FOMT. (A) Montage van RAD51 eiwit op een tethered 7,9 kbp dsDNA gecontroleerd op 3,5 pN. De (x, y, z)-traject uitgevoerd door de magnetische bolletje (diameter 1,0 mm) in de eerste 200 seconden van de assemblage wordt getoond, met de tijd kleurcode van blauw naar rood. (B) De uitbreiding van de dsDNA afgeleid van de z-component van de kraal traject (a) als een functie van tijd. (c) De draaihoek de dsDNA ketting as afgeleidvan de x, y-componenten van de kraal traject (a) als een functie van tijd.
Figuur 6. Koppel metingen aan een enkel DNA ketting in de MTT. (A) Schematische toont het principe van de meting van het koppel. Na over-(of onder) het wikkelen van de DNA ketting door N wordt het DNA oefent een herstellende torsie op de kraal die leidt tot een verschuiving in het evenwicht hoekstand van θ 0 tot N θ. (B) Voorbeeld van de hoek lijnen voor om het koppel te meten:. hoekige schommelingen van een kraal vastgebonden aan een torsie ontspannen 7,9 kbp DNA-molecuul voor (blauw) en na de introductie van 40 slagen (donkerrood) (cf) meting van het koppel op een 7,9 kbp DNA-molecuul in PBS buffer gehouden op een stkokhalzen kracht van ~ 3 pN met de referentiemerkteken kraal gebaseerd hoekig volgen protocol. Hoekige fluctuaties zoals in (b) werden geregistreerd als functie van het aantal toegepaste windingen. (C) De standaarddeviatie van de hoekige fluctuaties als functie van de toegepaste bochten. De breedte van de fluctuaties bij benadering constant, wat aangeeft constante hoeksnelheid houden stijfheid. (D) De verschuiving in de gemiddelde rotatiehoek als functie van de toegepaste bochten. Systematische verschuivingen van de gemiddelde hoek bij over-en underwinding zijn duidelijk zichtbaar. (E) Het simultaan DNA ketting toestel als een functie van de toegepaste bochten. (F) Het koppel uitgeoefend door de DNA ketting bepaald uit de gemiddelde hoek getoond in (d) , zie hoofdtekst. Over-en underwinding rond nul draait ontstaat een lineair koppel-zet reactie van de DNA-ketting (gepaste grijze hellingen ion (d) en (f)) die kunnen worden gebruikt om de effectieve torsie persistentielengte bepalen (~ 77 nm voor deze dataset). Verdere forceren van leads te knikken en de vorming van plectonemic supercoils (schematisch weergegeven in de bijvoegsels), wat overeenkomt met een koppel plateau (zwarte lijn op positieve wendingen in (f) bij ~ 26 pN · nm) en een lineaire afname van de ketting uitbreiding met nummer windingen (zwarte helling in (e)). Afwikkelen buiten het lineaire regime zorgt het DNA plaatselijk smelten (in de inzetstukken aan de linkerkant), gekenmerkt door een koppel plateau gelijk is aan het smelten koppel (zwarte lijn op negatieve beurten (f) bij ~ -11 pN · nm).
Discussion
Bij het uitvoeren van experimenten met de MTT of FOMT moeten een aantal keuzen inzake kralen, magneten, volgen protocollen, etc. De beste keuzes worden gemaakt afhankelijk van het experiment plaats. De trade-offs die verschillende keuzes begeleiden Hieronder beschrijven we die keuze voor een bepaald experiment dient te vergemakkelijken. Vervolgens beschrijven we een aantal cruciale stappen die de afstemming en uitvoering van MTT en FOMT experimenten te begeleiden. Tot slot bespreken we de betekenis van de MTT en FOMT met betrekking tot bestaande methoden en toekomstige toepassingen.
Overwegingen Voorafgaand aan de start van MTT en FOMT Experimenten
Elk experiment vereist dat men een soort magnetische beads voor gebruik te selecteren. Men kan kiezen tussen verschillende commercieel verkrijgbare-streptavidine beklede superparamagnetische, bijvoorbeeld, 0,25 micrometer straal kralen, 0,5 micrometer straal kralen, of 1,4 micrometer straal kralen (see tafel Materials). Grotere beads een verhoogd magnetisch moment hebben vergeleken met kleinere korrels (ongeveer schaling als volume) en daarom zal het gebruik van de toepassing van hogere krachten vergemakkelijken (voor typische krachten bereikt onze instrumenten, zie tabel 1). Bij hoekige volgen met behulp van markering kralen gewenst is, we werken meestal met 1,4 micrometer straal en gebruiken 0,5 micrometer straal niet-magnetische gebiotinyleerd kralen als marker kralen (zie paragraaf 1.9 voor de bijbehorende bijlage protocol). Het gebruik van kleinere korrels wordt bijzonder aanbevolen voor de FOMT, zoals de karakteristieke tijdschaal voor kraal rotatie τ C gelijk aan de verhouding van de weerstand van het systeem ten opzichte van zijn veerconstante γ / k θ; Belangrijker, de rotatie weerstandscoëfficiënt relevant voor de hoekmeting tijdschaal schalen als ~ R kraal 3, dus met de derde macht van de straal (zie Tabel 2 voorde karakteristieke tijdschalen voor verschillende kraal-DNA combinaties in FOMT en MTT metingen). Begeleidende verlaging van de maximale kracht die kan worden toegepast kan worden aangepakt met een omgedraaid stapel cilindrische magneten 27. Niettemin, in FOMT metingen kan het soms nodig zijn om compromissen te sluiten tussen de best haalbare temporele resolutie en de maximale uitgeoefende kracht.
Daarnaast werd een experiment vereist de keuze van een magneet configuratie. In de conventionele magnetische pincet configuratie (figuur 1a), we gebruiken meestal een paar van 5x5x5 mm kubieke magneten in verticale richting met een 0,5 of 1 mm tussen de magneten 4. Wanneer de magneten zijn verdeeld langs de x (y-as), dit levert een magnetisch veld die primair gericht langs de x (y). Voor FOMT experimenten wordt een cilindervormige magneet gekozen waarvan het middelpunt het magneetveld primair gerichtlangs de z-as (Figuur 1b). In de praktijk gebruiken we een stapel van drie dergelijke cilindervormige magneten, elk met een diameter van 6 mm en 2 mm centraal gat, voor een totale dikte van 6 mm. Wanneer hogere trekkrachten gewenst zijn, wordt een "omgedraaid stack" magneet configuratie waarin de onderste magneet wordt gestapeld met tegengestelde magnetisatie voorkeur. De MTT configuratie (figuur 1c) bereiken, voegen we een magneet aan de kant van de magneet stapel de FOMT configuratie, meestal een massieve cilinder met 4 mm diameter en een hoogte van 7 mm. Om te zien hoe de maximale krachten bereikt onze instrumenten afhankelijk van de magneetconfiguratie, zie Tabel 1.
Het op elkaar afstemmen van MTT en FOMT Experimenten
Aangezien magnetische kralen hebben een (ongeveer) gelijkmatig gefunctionaliseerde oppervlak (meestal streptavidine) en sinds de bevestiging van zowel de gefunctionaliseerde nucleic zuur aanbinden en marker kralen (in het geval de marker-bead based hoekig opsporing wordt gebruikt) gebeurt via eenvoudige incubatie in oplossing is, is men niet bepalen waar de ketting en / of marker kraal hechten aan het magnetische bolletje. De magnetische kralen hebben een voorkeur magnetisatie-as die de neiging in de richting van het externe veld uitlijnen. Als we geven de punten waar de voorkeur magnetisatie snijdt het oppervlak van de kraal als de noord-en zuidpool, dan kralen waar de DNA-tether dicht bij de evenaar is aangesloten zal sporen uit een cirkelvormige ring met een straal dichtbij of iets groter dan de kraal straal in het FOMT; daarentegen zal kralen die dicht bij de zuidpool zijn bevestigd fluctueren op een ronde ring met een zeer kleine radius in de FOMT, die het aanbrengen van de cirkel met behulp van vergelijkingen 3-5 kunnen uitsluiten. We merken op dat bij gewone sferische geometrie, de waarschijnlijkheid van het bevestigen nabij de evenaar is veel groter dan een bijlage precies op de polen; Daarom zijn de meeste bEADS worden aangebonden zodat de (x, y)-gebaseerde hoekige volgen succes kan worden uitgevoerd.
Een soortgelijke redenering geldt voor de bevestiging van de marker kralen voor de referentiemerkteken gebaseerd hoekige tracking. De marker kraal wordt gebruikt om een asymmetrie in het beeld van de magnetische kraal die hoek volgen mogelijk maakt creëren. Als de marker kraal precies wordt bevestigd aan de noord-of zuidpool van de kraal (dwz direct boven of op de bodem), het resulterende beeld is nog steeds draaisymmetrische en de hoekige volgen protocol mislukt. Echter, door dezelfde sferische geometrie argument, de kans op een marker kraal direct bij een van de polen hechten relatief klein is; we vinden dat in de praktijk de meeste marker kralen geven een voldoende asymmetrie te hoekig bijhouden schakelen. Tenslotte merken we op dat de conventionele magnetische pincet het gebied richting de (x, y)-vlak; daarom zal de voorkeur magnetisatie-as van de kraal uitlijnen the (x, y)-vlak en de noord-en zuidpolen, zoals boven gedefinieerd, zullen worden aan de zijkanten van de hiel, waarschijnlijk de situatie in de FOMT of MTT, waarbij de polen aan de boven-en onderkant.
In FOMT experimenten, een cruciale stap is de uitlijning van de cilindrische magneet, zodat het radiale magneetveld verwaarloosbaar nabij de hiel. Deze uitlijning wordt uitgevoerd voor een kraal per keer. Om te beoordelen of kraal beweging in de FOMT gelijkmatig wordt verdeeld over een cirkelvormige ring, moet de meettijd meer bedragen dan 20 · τ C. Als τ C is gelijk aan ~ 45 sec voor 8 kbp DNA en een 0,5 mm radius kraal, de meettijd is ~ 900 sec in de laatste fase van de aanpassing. Ter vergelijking, gebruik van 1,9 kbp DNA en 0,25 mm radius kralen vermindert τ C twintigvoudige naar ~ 2 seconden (zie ook tabel 2).
Kritische stappen en overwegingen voor Tracking Tijdens FOMT en MTT Experimenten
De kraal in-plane schommelingen volgen, namelijk de (x, y)-positie, gebruiken we een kruiscorrelatie analyse van de intensiteit profielen weergegeven door een kraal op latere tijdstippen 35, 36. Dit kan bij sub-pixel resolutie met een nauwkeurigheid van enkele nanometers 20 uitgevoerd. Om beweging van de kraal in z volgen, wij gebruiken meestal een methode eerst gemaakt door Gosse en kroket, waarbij brandvlak van de doelstelling van (OFP) nauwkeurig verschoven in verticale richting, terwijl beeldvorming van de diffractie ringen van de hiel aan de nucleïnezuur 20 . Op deze wijze wordt een kalibratie-profiel gegenereerd correleren van het diffractiepatroon van de kraal om de afstand tussen de hiel en de OFP 19. Wanneer deze manier bereikt wordt geïnterpoleerd, kan de verticale verplaatsing van de kraal worden gemeten met een nauwkeurigheid tot een paar nm 20.We verwijzen de lezer naar aanvullende referenties die meer verfijnde volgen algoritmen 37, 38 en de toepassing daarvan op het volgen van meerdere kralen 5, 6, 37 parallel te beschrijven.
Bij het gebruik van hoekige tracking die is gebaseerd op de omzetting van (x, y)-posities in hoekige coördinaten, adviseren wij als volgt te werk. Uit een tijd trace waarbij de kraal sporen uit een cirkelvormige ring, gebruik maken van de (x i, y i) posities (waarbij de index i duidt daarop volgende meetpunten) aan de cirkel middelpunt (x 0, y 0) en straal R cirkel passen (Figuur 2a) door het minimaliseren:
(3)
waarbij de som loopt over alle datapunten. Na fitting x 0, y 0, en R cirkel, bepalen de polaire coördinaten (r i, θ i) van elk gegeven punt in de tijd te traceren:
(4)
(5)
Merk op dat men moet zorgen voor "uitpakken" de hoek θ, dwz fasesprongen van ± π waar nodig toe te voegen. Op maat geschreven code voor de montage en conversie van (x, y) (r, θ) coördinaten is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag. In de FOMT, kan een time trace waarbij de kraal sporen uit een cirkelvormige ring worden verkregen door het bereiken van grove uitlijning (zie stap 3.3) en het opnemen van de thermische fluctuaties van de kraal. In de MTT, thermische fluctuatiesaties zijn onvoldoende op te sporen uit de cirkelvormige ring; in plaats daarvan gebruik van een time trace waar de magneten zijn langzaam (typisch bij 0,1 Hz) gedraaid door verschillende slagen om de cirkel te passen met behulp van vergelijkingen 3-5.
Wij merken op dat de MTT, is het belangrijk om de juiste hoek volgen benadering, namelijk via een hoekige volgen merker (Figuur 1c Figuur 1d, figuur 3a) of via de omzetting van (x, y)-posities in hoekige coördinaten kiezen ( Figuur 1d, Figuur 2b). Terwijl gewoonlijk de nauwkeurigheid van de hoekige bijhouden van (x, y)-posities en het gebruik van merker kralen vergelijkbaar, is het belangrijk te realiseren dat overspraak optreedt tussen schommelingen een kraal in (x, y) en de hoek, zoals beschreven in Janssen et al. 32: zo hoekige volgen van (x, y)-posities is alleen geldig indien de Brownse fluctuaties in (x, Y) dragen slechts verwaarloosbaar aan de onzekerheid in de hoekcoördinaat en het juiste gebruik van (x, y)-volgen kan afstemming van de rotatie val stijfheid vereisen via aanpassing van de positie van de zij magneet. Typisch, het gebruik van hogere val stijfheid vereist het gebruik van hoekige volgen met behulp van markering kralen. Het gebruik van de marker kralen vereist een extra bevestiging stap, die het aantal bruikbare aanbinden kan verminderen (zie de bijlage protocol in stap 1.9). Wanneer de merker-kraal gebaseerd volgend, is het belangrijk om magnetische korrels die een marker kraal rond de evenaar verbonden voor beste resultaten.
Betekenis van de FOMT en MTT Benaderingen Vergeleken met bestaande methoden en toepassingen
In het bovenstaande hebben we aangetoond hoe men, uitgaande van conventionele MT, de magneet configuraties gemakkelijk aanpassen om het instrument te zetten in MTT of FOMT. Deze eenvoudige mIJZIGING, eventueel parallel met de invoering van hoekige volgen wanneer het gebruik van een hoekige volgen marker gewenst, een onmiddellijke sterk punt van beide configuraties, omdat het toelaat de gebruiker om torsie passen, meten koppel of maatregel draai afhankelijk experimenteren bij de hand. Zoals vermeld in de inleiding, zowel FOMT en MTT profiteren van veel van de bestaande sterke punten van MT, met name hun eenvoud, met de MTT in het bijzonder ook profiteren van de mogelijkheid van parallelle metingen 5, 6 (deze zijn niet zo gemakkelijk te realiseren in FOMT gegeven de vereiste uitlijning van de ketting ten opzichte van het midden van de cilindrische magneet). Met name hebben MTT en FOMT vereisen, in tegenstelling tot andere technieken, speciaal vervaardigd nano deeltjes 22, 39, 40, complexe optische ontwerp 41, of het introduceren van extra korrels binnen het gebonden (DNA) molecuul 42. Dergelijke other technieken kunnen echter zorgen voor andere voordelen zoals hogere temporele resolutie 27, 43, 44. Zowel FOMT en MTT moeten toekomstige toepassingen in de studie van genoom verwerking vinden, zoals het gedrag van moleculaire motoren op DNA zowel door en heeft gevolgen voor de lokale twist en koppel. Extra toepassingen zijn te vinden in de opkomende gebied van DNA nanotechnologie 27 of in het bredere gebied van roterende motoren actief in biologische verwerking 7, 45.
| M270 (R kraal = 1,4 micrometer) | MyOne (R bead = 0,5 pm) | Ademtech (R kraal = 0,25 pm) | |
| Conventionele MT (paar kubieke 5 x 5 x 5 mm 3 magneten, 1 mm tussenruimte, verticale uitlijning) | 70 pN | 8 pN | 1.6 pN |
| FOMT of MTT * (stapel van drie cilindrische magneten, 6 mm, 2 mm tussenruimte diameter) | 9 pN | 1 pN | 0.2 pN |
| FOMT of MTT * (stack van drie cilindrische magneten, 6 mm diameter, 1 mm gat diameter) | 18 pN | 2 pN | 0.4 pN |
| FOMT of MTT * (stapel van drie cilindrische magneten met laatste omgedraaid, 1 mm gat diameter) | ~ 50 pN | 9 pN | 1.8 pN |
* De aanwezigheid van de kleine kant magneet in de MTT heeft een verwaarloosbaar effect op de rekkracht
Tabel 1. Maximum krachten doorgaans bereikt voor verschillende magneetconfiguraties en modellen kraal.
| R kraal = 1,4 micrometer | R = 0,5 urn kraal | R kraal =0.25 pm | |
| Wrijvingscoëfficiënt * | 120 pN · nm · sec | 5.5 pN · nm · sec | 0.7 pN · nm · sec |
| Karakteristieke tijdschaal: FOMT, 10 kbp DNA ** | 1.200 sec | 55 sec | 7 sec |
| Karakteristieke tijdschaal: FOMT, 1 kbp DNA | 120 sec | 5.5 sec | 0.7 sec |
| Karakteristieke tijdschaal: MTT, k q = 100 pN · nm / rad | 1.2 sec | 0.06 sec | 0.007 sec |
| Karakteristieke tijdschaal: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad | 0.12 sec | 0.006 sec = 6 msec | 0,0007 s = 0,7 msec |
* Wrijvingscoëfficiënt voor rotatie om een as door de "evenaar" (dat wil zeggen de in figuur 1b situatie), Die door 14 · p · h · R kraal 3, waarin h de viscositeit van de buffer.
** In de FOMT, de rotatie val stijfheid wordt gegeven door de torsiestijfheid van het DNA, k q, DNA = C k B T / L C, waarbij C de effectieve torsie persistentielengte, aangenomen · 80 nm here ( die kenmerkend een tussenproduct kracht regime F ~ 1 pN) en L C is de omtrek lengte van DNA, 0,34 nm per basepaar.
Tabel 2. Friction coëfficiënten en karakteristieke tijdschalen voor FOMT en MTT.
Disclosures
Een patent met betrekking tot dit werk is ingediend onder verwijzing PCT/NL2011/050446.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de TU Delft, de Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO), de Stichting voor Fundamenteel Onderzoek der Materie, en door de European Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
| Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
| Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
| Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
| Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
| Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
| Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
| Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
| Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
| Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
| Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
| Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
| Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
| High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
| Software for coding analysis routines | The Mathworks | MATLAB | custom-written routines are available from the authors |
References
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271, 1835-1837 (1996).
- Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421, 423-427 (2003).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods. 5, 491-505 (2008).
- Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).
- Ribeck, N., Saleh, O. A. Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers. The Review of scientific instruments. 79, (2008).
- De Vlaminck, I., et al. Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering. Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).
- Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective. Cell. 142, 519-530 (2010).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).
- Ajjan, R., et al. Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity. Blood. 111, 643-650 (2008).
- Mierke, C. T., et al. Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain. Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).
- Shang, H., Lee, G. U. Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction. Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).
- Shang, H. K. P., et al. The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries. J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).
- Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. Implementation of force differentiation in the immunoassay. Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).
- Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).
- Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).
- Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).
- Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers. Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).
- Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases. Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).
- Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorder, P., van Oijen, A. , Springer. (2009).
- Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).
- Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications. 2, 439 (2011).
- Celedon, A., et al. Magnetic tweezers measurement of single molecule torque. Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).
- Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics. The Review of scientific instruments. 82, (2011).
- Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments. Nature. 7, 977-980 (2010).
- Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers. Physical review letters. , 102 (2009).
- Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. Soft magnetic tweezers: A proof of principle. Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).
- Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami. Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).
- Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data. Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).
- Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. The Review of scientific instruments. 83, (2012).
- Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).
- Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament. Nucleic acids research. 41, (2013).
- Janssen, X. J., et al. Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque. Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).
- Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).
- Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nat Commun. 2, 439 (2011).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).
- Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331, 450-453 (1988).
- Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification. Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).
- Kim, K., Saleh, O. A. A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements. Nucleic acids research. 37, 136 (2009).
- Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods. 4, 223-225 (2007).
- Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. Electron beam fabrication of birefringent microcylinders. ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).
- La Porta, A., Wang, M. D. Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles. Physical review letters. 92, (2004).
- Gore, J., et al. DNA overwinds when stretched. Nature. 442, 836-839 (2006).
- Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. Recent developments in single-molecule DNA mechanics. Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).
- Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).
- Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. Torque measurement at the single-molecule level. Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).
