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Bioengineering

Magnetische Pinzette zur Messung von Dreh-und Drehmoment

Published: May 19, 2014 doi: 10.3791/51503
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Bionanoscience, Kavli Institute of Nanoscience, Delft University of Technology

Summary

Magnetische Pinzette, ein leistungsfähiges Einzelmolekül-Manipulation Technik kann für die direkte Messung der Verdrehung angepasst werden (unter Verwendung einer Konfiguration mit der Bezeichnung frei umlaufenden magnetischen Pinzette) und Drehmoment (mit einer Konfigurations bezeichnet magnetischen Drehmoment Pinzette) in biologischen Makromolekülen. Richtlinien zur Durchführung solcher Messungen gegeben sind, einschließlich Anwendungen auf die Untersuchung von DNA und zugehörige nucleo-Protein Filamente.

Abstract

Einzelmolekültechniken machen es möglich, das Verhalten der einzelnen biologischen Molekülen in Lösung in Echtzeit zu untersuchen. Diese Techniken umfassen so genannte Kraft-Spektroskopie Ansätze wie Rasterkraftmikroskopie, optische Pinzette, fließen Stretching, und magnetische Pinzette. Zu diesen Ansätzen wurden magnetische Pinzette selbst durch ihre Fähigkeit, Drehmoment aufbringen, während eine konstante Spannkraft aus. Hier ist dargestellt, wie ein solches "konventionellen" magnetische Pinzette experimentellen Konfiguration kann durch eine einfache Änderung der Feldkonfiguration, um die Größe des Querfeldes zu minimieren, angepasst, um den Grad der Drehung in einer biologischen Moleküls zu messen. Die resultierende Konfiguration ist der frei umlaufenden magnetischen Pinzette bezeichnet. Zusätzlich wird gezeigt, wie weitere Modifikation der Feldkonfiguration kann eine Querfeld mit einer Stärke zwischen derjenigen der Pixel # Ausbeute8220; herkömmlichen "magnetische Pinzette und die frei umlaufende magnetische Pinzette, die es ermöglicht, direkt die in einem biologischen Molekül gespeicherte Drehmoment zu messen ist. Diese Konfiguration wird die magnetischen Drehmoment Pinzette bezeichnet. Die begleitende Video erklärt im Detail, wie die Umwandlung von herkömmlichen magnetischen Pinzette in frei umlaufenden magnetischen Pinzette und magnetische Drehmoment Pinzette durchgeführt werden kann, und zeigt die Verwendung dieser Techniken. Diese Anpassungen beibehalten alle Stärken der herkömmlichen magnetischen Pinzette, während stark erweitert die Vielseitigkeit dieses mächtige Instrument.

Introduction

In den letzten Jahren wurden Einzelmolekültechniken ihre breite Anwendbarkeit bei der Untersuchung der prozessiven Motorproteine ​​und andere Enzyme nachgewiesen, wodurch man einen Einblick in die Kinetik der zugrundeliegenden Mechanochemie. Im Rahmen der Kraftspektroskopie, haben wichtige Beiträge durch Rasterkraftmikroskopie Fluss Stretching und optische und magnetische Pinzette gemacht worden. Optische und magnetische Pinzette (MT) haben vor allem in der Kombination eine große Flexibilität in Bezug auf molekulare Manipulation mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung gelungen. Hier konzentrieren wir uns auf MT, der beide Strecken Kräfte und Drehmomente an biologische Moleküle zwischen einer Oberfläche und superparamagnetische Kügelchen 3.1 angebunden bewerben.

Magnet Pinzette (MT, Fig. 1a) eine sehr vielseitige Einzelmolekül-Technik, die verwendet wurde, um sowohl die mechanischen Eigenschaften von Nukleinsäuren sowie deren Wechselwirkungen mit Proteinen zu überwachen. MT haben viele Stärkes, einschließlich der Gesamt Einfachheit und Robustheit der experimentellen Umsetzung, einfache Anwendung von Drehmoment, natürliche Bedienung und einfache Kalibrierung in konstanten Kraft Modus 4, Erweiterung auf Messungen 5, 6 parallel, und das Fehlen von Probenheizung und Lichtschäden. Im Vergleich zu anderen Einzelmolekül nähert, MT bieten eine Möglichkeit, Kraft-Messungen in Abhängigkeit Kräfte so niedrig wie ≈ 10 fN durchführen und haben die Möglichkeit, unkompliziert steuern den Grad der Supercoiling. Während MTs haben überwiegend als experimentelles Werkzeug verwendet worden, um biologische Prozesse, die Nukleinsäuren 7, 8 untersuchen, haben sie auch Anwendung bei Untersuchungen der mechanischen Eigenschaften von Proteinen oder Zellen 9-13 10 14-17 gefunden. Zahlreiche nützliche Hinweise zur Verfügung, die, wie zu bauen und führen Sie ein MT 4, 18-20 beschreiben.

Howeväh, nicht konventionellen MT Drehbewegung direkt zu verfolgen, und während sie Drehmoment aufbringen, sie nicht Drehmoment direkt zu messen. Darüber hinaus beschränken sie die freie Drehung des Nukleinsäure Haltegurt. Hier präsentieren wir zwei Erweiterungen von Magnet Pinzette. Die erste, sogenannte frei umlaufenden magnetischen Pinzette (FOMT, 1b) 21 erlaubt die Messung der Gleichgewichtswinkelschwankungen und Änderungen in der Verdrillung des gebundenen Nukleinsäuremoleküle, ohne dabei die Drehbewegung um die Achse Haltegurt. Die zweite, genannt magnetische Drehmoment Pinzette (MTT, Abbildung 1c), die die Fähigkeit, einzelne Biomoleküle 22-27 gelten und direkt messen beide Kräfte und Momente hat.

In dem folgenden Protokoll, gehen wir davon aus, dass der Leser auf seine / ihre Anordnung eine "konventionelle" MT Instrument hat. Wir verweisen den Leser auf die Diskussion nach Referenzen, wie Bau und Betrieb eines MT einzurichten sowie consideRationen, die in der Auswahl der magnetischen Kügelchen, Magneten und Verfolgungsroutinen berücksichtigt werden müssen. Außerdem Abschnitte 1 und 2 des Protokolls Text beschreiben, wie wir in der Regel vorbereiten und Inkubation eine DNA-Probe für den Einsatz in der MT sowie die vorläufigen Messungen, die auf einem einzigen DNA in der herkömmlichen MT durchgeführt werden können. Abschnitte 3 und 4 des Protokolls Text zeigen, wie ein MT-Gerät kann leicht angepasst werden, und für FOMT und MTT-Messungen verwendet werden.

Protocol

1. Herstellung und Inkubation einer DNA-Probe

  1. Bereiten DNA-Konstrukte, die ligiert werden Enden (typischerweise ≈ 600 bp DNA-PCR-Fragmente), die mit mehreren Biotin und Digoxigenin Gruppen, bzw. 18 funktionalisiert sind beidseitig zu drucken. Um zu beginnen, ein DNA-Halteseil Länge> 1 um, z. B. ein 7,9 kbp entsprechend einer gestreckten Länge von ~ 2,7 um wie hier verwendet wird, ist für Benutzerfreundlichkeit empfohlen; insbesondere unter Verwendung eines DNA-Länge, die ähnlich zu oder kürzer als der Radius ist Wulst ist problematisch aufgrund der Anschlussgeometrie im MTT und FOMT. Siehe die Diskussion für eine Beschreibung, wie die DNA Länge beeinflusst zeitliche Reaktion in der Winkelbereich.
  2. Montieren Sie die Durchflusszellen für Einzelmolekül-Experimente. Für die Durchflusszellen, verwenden Sie zwei Glas-Objektdeckgläser durch eine Doppelschicht-Parafilm Abstandshalter getrennt. Die obere Deck Mikroskop müssen zwei Bohrungen für den Fluideinlass und-auslass in die Zelle. Es ist bequem,verwenden Sie ein Sandstrahler, um die Löcher zu bohren. Die untere Deckglas mit Nitrocellulose (0,1% Gewicht / Volumen in Amylacetat) beschichtet. Legen Sie die Parafilm Abstandshalter auf der Nitrozellulose-beschichtete Seite der Bodenrutschen und schließen Sie die obere mit sauberem oben gleitet.
  3. Verschließen Sie die Durchflusszellen. Mit physikalischen Pinzette, legen Sie die Durchflusszelle montiert auf einer Heizplatte auf 80-100 ° C für ca. 1 min eingestellt. Achten Sie darauf, dass die Durchflusszelle ist gut abgedichtet, dass der Parafilm nicht verschließen die Löcher, die der Ein-und Auslass, und dass die Glasobjektträger sind gut ausgerichtet zu verbinden.
    Hinweis: Um eine gute Abdichtung zu gewährleisten, sie zu streicheln, Luftblasen in der Parafilm empfohlen wird mit einem großen Wattestäbchen. Die Strömungszelle kann dann auf dem Magnet Pinzette Instrument angebracht werden.
  4. Bereiten Puffer. Vorbereitung TE Anbinden Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 200 mM NaCl). Alternativ kann man PBS-Puffer verwenden (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Phosphat-Puffer, pH 7,4) ergänzt with 100 ug / ml BSA, 0,1% Tween und 5 mM Natriumazid (PBS +) als Anbindung Puffer. Bündig 2-3 Zellvolumina TE-Puffer Anbindung in die Durchflußzelle.
  5. Inkubieren 0,5 oder 1,5 &mgr; m Radius nicht-magnetischen Latexkügelchen in der Strömungszelle für ~ 30 min. Diese Perlen werden als Referenz Perlen während der magnetischen Messungen, die Pinzette ein, um die Wirkung der Drift zwischen dem Objektiv und dem Probenhalter (dh der Durchflusszelle) zu minimieren damit zu handeln. Spülen Sie ungebunden nicht-magnetischen Kügelchen durch Spülen mit 2-3 Zellvolumina von TE-Tethering-Puffer.
  6. Funktionalisierung der unteren Oberfläche der Durchflusszelle durch Inkubation mit 100 &mgr; g / ml anti-Digoxigenin in PBS für mindestens 1 Stunde (vorzugsweise mehr, kann die Inkubation über Nacht durchgeführt werden), um für die DNA-Befestigung bereitzustellen. Spülen mit 2-3 Zellvolumina von TE-Tethering-Puffer. Schließlich inkubieren die Durchflusszelle mit 2 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) in TE-Puffer Anbindung für 30 min zur Oberflächenpassivierung.
  7. Einen aliquoten von2 ml Streptavidin-beschichtete superpara MyOne Perlen (siehe Diskussion und Tabelle der Materialien) und mit 10 ml TE-Tethering-Puffer verdünnen. Verwendung eines Magnetpartikel Konzentrator und Resuspension in 10 ml TE-Puffer Tethering Zweimal waschen mit 10 ml TE-Puffer-Tethering. Befestigen ~ 1 ml der DNA-Moleküle (etwa 1 ng) auf diese Kügelchen durch Inkubation in Puffer TE Anbindung für 30 min.
  8. Verdünnen Sie die Lösung des DNA-gebundenen superparamagnetische Kügelchen zehnfach durch Zugabe von 90 ml TE-Puffer-Tethering. Schließlich injizieren die Lösung in die Durchflusszelle und Inkubation für ungefähr 1 Std. bis zur DNA-Bindung an den Anti-Digoxigenin-beschichtete Oberfläche zu ermöglichen. Die Durchflusszelle gründlich mit TE-Tethering-Puffer waschen. Nach der Inkubation der DNA-Konstrukte, Halteseil, spülen Sie ausgiebig mit experimentellen Puffer (dies kann TE Tethering Puffer sein), um alle fraktionslosen Perlen zu entfernen.
  9. Für Messungen, die eine Winkel Tracking-Protokoll, das mit Bezugsmarken Perlen an die magnetischen Kügelchen angebracht erfordert beschäftigen

2. Messungen an einem einzelnen DNA-Molekül in der herkömmlichen Magnet Pinzette

  1. Bei Verwendung eines herkömmlichen MT (siehe Diskussion) mit geeigneten Feldkonfiguration (Abbildung 1a) und sowohl Translations-und Rotationssteuerung des Magnetposition, suchen Sie nach rotations eingeschränkte DNA-Moleküle in der Durchflusszelle. Auf Zugkräfte von ≥ 1 pN (konsultieren Referenzen 4, 19, 20, 28, 29 in Bezug auf Kraft-Kalibrierung in magnetischen Pinzette) können angebundene Perlen leicht von Perlen an die Oberfläche der Bodenschieber durch ihre unterschiedlichen Höhen im Fokus stecken unterschieden werden . Ob ein DNA-Molekül ist dreh eingeschränkt durch Einführen 20-30 wiederum beurteilts der Magnete bei einer Kraft von ≈ 0,25 pN: hier sollte das Halteseil Länge von 0,4-0,5 um zu verringern.
    Hinweis: Um die magnetischen Pinzette Experimente ausführen, wird die Bildverarbeitung verwendet, um die x-, y-und z-Position des DNA-gebundenen Perlen bestimmen. Benutzerdefinierte Labview-Software für diesen Zweck ist von den Autoren auf Anfrage erhältlich.
    1. Stellen Sie sicher, dass der Wulst wird von einem einzigen DNA-Halteseil befestigt. Dies kann durch den Vergleich des Verhaltens unter positiven und negativen Umdrehungen bei Kräften von> 1 pN (2a) durchgeführt werden. In dieser Kraft-Regime, wird die Anwesenheit von mehreren DNA-Fangbänder die zu einem etwa symmetrische Abnahme in der Verlängerung beim Einführen positiven und negativen Wendungen zu geben, während einzelne DNA Anbindehaltung wird Anlass zu einer asymmetrischen Antwort zu geben.
  2. Suche nach geeigneten festen Perlen stecken an der Bodenfläche in der Nähe des Haltebands von Interesse, die als Referenz dienen können Perlen.
  3. Kalibrieren Sie die Länge von ter DNA, l. Die Position der Oberfläche der Durchflusszelle kann, indem die Fessel Wulst in Kontakt mit der Oberfläche festgestellt werden (z. B. durch Drehen des Magneten um ~ 60 Umdrehungen bei einer Kraft von weniger als 0,2 pN). Messungen der vertikalen Lage des Fessel Wulst mit Bezug auf diese Oberfläche berichten dann auf absolute Wert von l.
    Hinweis: Um Folgewirkungen der Drift zu minimieren, ist es ratsam, um Messungen von L relativ zu der Position eines Referenz Wulst an der Oberfläche befestigt zuführen.
  4. Aufzeichnen einer Rotationskurve (dh ein Maß der DNA-Verlängerung als eine Funktion der Anzahl der Windungen) mit einer Streckkraft von ≈ 0,25 pN (Abbildung 2a).
    1. Bestimmen der Anzahl von Umdrehungen, bei der die Verlängerung maximal ist, so entspricht dies dem Zustand, in dem das DNA-Molekül dreh entspannt. Um dies zu tun, ist es nützlich, die Rotationskurve lokal mit einem parabolischen oder einer Gauß-Funktion, um den Mittelpunkt zu bestimmen passen Positiauf. Definieren Sie diesen Punkt als "Null-Runden".
      Hinweis: Ein individuell geschriebenen Routine für diesen Zweck ist von den Autoren auf Anfrage.
  5. Für eine Reihe von ~ 20 Magnetpositionen, bestimmen die mittlere Ausdehnung des dreh entspannt Molekül (dh auf "Null Umdrehungen", siehe Schritt 2.4.1) von der z-Spur.
  6. Für jeden Messpunkt in Schritt 2.5, genau zu bestimmen, die Streckkraft von den Schwankungen in der x-oder y-Position 20, 28, 29, oder, sofern die Magnetisierung der Wulst ist bekannt, unter Verwendung der Kenntnis der lokalen Feldgradienten 4. Trägt man die Streckkraft im Vergleich zu den Durchschnittserweiterung führt zu einer Kraft-Dehnungs-Kurve (Abb. 2b).
    1. Montieren Sie die resultierende Kraft-Verlängerung Daten an die wurmartige Kette Gleichung mit dem Polynom Näherung durch Bouchiat et al 30.
    Wenn die Vorbereitung für nachfolgende Messungen FOMT langsam rotieren die Magneten während der Aufnahme Ausflüge der magnetischen Kügelchen in (x, y).
    Hinweis: Je kleiner der Radius des resultierenden Annulus in der herkömmlichen MT-Konfiguration ist, desto genauer das DNA-Molekül näher an der "Südpol" der magnetischen Kügelchen gebunden. Wenn ein Schalter zum FOMT Konfiguration wird ein solches DNA-Molekül eng mit dem "Äquator" der magnetischen Kügelchen, die zuverlässige Verfolgung der Drehwinkel von der (x, y)-Position (siehe Diskussion) angebunden werden können.

3. Messungen der DNA-Twist mit dem frei umlaufenden Magnet Pinzette

  1. Manuell ersetzen die quadratischen Magnete der herkömmlichen magnetischen Pinzette von einem zylindrischen Magneten, der für FOMT (Fig. 1b) verwendet wird. Dieser Vorgang sollte in einer Weise, dass die ausgewählte DNA Haltegurt im Sichtfeld bleibt geführt werden. Dies kann in weniger als 1 min durch einfaches Abschrauben des kompletten Magnetkopf, der die Magnete für den herkömmlichen Pinzette Konfiguration hält und von einem Magneten Kopf, der einen zylindrischen Magneten für FOMT hält ersetzen erreicht werden.
  • Die Exkursionen in (x, y) einer magnetischen Kugel durch einen einzigen dsDNA Halteseil angebunden sind stark abhängig von der Position des Halteseils in Bezug auf die Achse des zylindrischen Magneten (Fig. 1b, Fig. 3a). Notieren Sie die (x, y) Ausflüge, um die entsprechende Stelle innerhalb der charakteristischen Fluktuationsmuster (Abbildung 3a zu bestimmen, Diskussion).
  • Führen grobe Ausrichtung des Magneten im FOMT. Dies kann durch Bewegen des zylindrischen Magneten oberhalb der Fließzelle unter Verwendung von (x, y)-Übersetzungsstufen erreicht werden. Wenn die (x, y) eine Lichtbogen Exkursionen folgen, wird der zylindrische Magnet nicht richtig ausgerichtet und bewegt werden mussin der entsprechenden Richtung (Fig. 3b).
    1. Grobe Ausrichtung kann innerhalb von 15 Minuten für den Fall von MyOne Perlen mit 7,9 kbp Halteseile erreicht werden, und ist abgeschlossen, wenn die Messung der (x, y) Ausflüge Ergebnisse in der Beobachtung der Kreisbewegung (Abbildung 3b, Mitte).
      Hinweis: Grobausrichtung ist in der Regel ausreichend, um die Änderungen in Twist-Protein verursacht durch die Bindung an einzelne DNAs in der FOMT Konfiguration angebunden beobachten, 21, 31 (Repräsentative Ergebnisse, Bild 5), obwohl die begleitende zweidimensionalen Histogramm möglicherweise nicht seine Zählungen haben absolut gleichmäßig entlang der kreisförmigen Ringraum (3c) verteilt.
  • Wenn für weitere Experimente erforderlich, führen Sie die Feinausrichtung in der FOMT. Dies kann mit hochauflösenden Mikrometerschrauben oder einen hochauflösenden automatisierten Bühne, um entweder den Magneten oder die Durchflusszelle zu Cent erreicht werdener die zylindrischen Magneten auf die Wulst innerhalb von ~ 10 um. Im Feinausrichtungsstufe wird der Magnet sorgfältig positioniert, dass die Schwankungen des Kreises Ring nahezu einheitlich sind, entsprechend einer Situation, in der die Energiebarriere, um volle Drehung durch die Magnet k B T (Fig. 4).
    Hinweis: Ein MATLAB-Skript für die Darstellung der Schwankungen in einem Histogramm oder Thermogramm wie in Abbildung 4 ist von den Autoren auf Anfrage.
    Hinweis: Feinausrichtung kann innerhalb von 45 min für den Fall von MyOne Perlen mit 7,9 kbp Anbindehaltung durchgeführt werden, und in reduzierter Zeitrahmen für kleinere Perlen und kürzeren Haltegurte eingesetzt (siehe Diskussion).
    Hinweis: Feinausrichtung ist in der Regel erforderlich, um Messungen der Torsionssteifigkeit des nackten oder Protein-beschichteten DNA (Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4) durchzuführen.
  • Wenn für die Analyse erforderlich, kalibrieren die Kraft in der FOMT. Dies kann i durchgeführt werdenna analog zu MT, entweder mit der Perle der Radialschwankungen (wo die spitzen Klammern bezeichnen die Zeitmittel) <R 2> wie in der beiliegenden Video gezeigt und in Lipfert et al 21 detaillierte, oder, die Magnetisierung der Wulst versehen ist gut bekannt ist, mit Kenntnis des lokalen Feldgradienten 21.

    • 4. Messungen der DNA-Torque Mit den Torque-Pinzette

    1. Ersetzen Sie manuell die zylindrischen Magneten, die für FOMT durch einen zylindrischen Magneten sowie eine Seite (Permanent-) Magneten für die MTT (Abbildung 1c) verwendet wird. Dieser Vorgang sollte in einer Weise, dass die ausgewählte DNA Haltegurt im Sichtfeld bleibt geführt werden.
      1. Die einfachste Möglichkeit, dies zu erreichen, ist die Seite Magneten an die richtige Stelle, die innerhalb von 1 min erreicht werden kann manuell hinzufügen. Keine weitere Neuausrichtung notwendig.
        Hinweis: Eine Alternative zu einer Seitenmagnet ist die VerwendungElektromagneten 32.
    2. Wenn für die Analyse erforderlich, kalibrieren die Kraft in analoger Weise, MT, entweder mit der Perle der x-oder y-Schwankungen oder, sofern die Magnetisierung der Perle ist bekannt, mit Kenntnis des lokalen Feldgradienten 21.
    3. Verfolgen Sie die Winkelfluktuationen als Funktion der Zeit θ (t) entweder mit dem Bezugs basierten Tracking-Protokoll 23 oder, wie in der beiliegenden Video gezeigt, die Winkel Tracking-Protokoll, das auf die Überwachung der (x, y)-Position (siehe Diskussion). Im ersteren Fall Aufnahme Vollbilder des Wulstes in Abhängigkeit von der Zeit für die anschließende Bildverarbeitung. Im letzteren Fall ist es ausreichend, (x, y) Schwankungen des Kornes in diesem Schritt aufgezeichnet.
      Hinweis: Ein MATLAB-Skript zum Bestimmen θ (t) von Vollbildern der Sicke als Funktion der Zeit im Bezugsbasiertes Tracking-Protokoll ist einvailable von den Autoren auf Anfrage.
      1. Wie in der Diskussion für die Winkelverfolgungsprotokoll, das auf die Kontrolle der (x, y)-Position ist es auch ratsam, eine Zeitspur in dem die Magnete langsam (typischerweise bei 0,1 Hz) mehrere Umdrehungen gedreht aufzuzeichnen, beschrieben. Dies ermöglicht eine präzise konvertieren kartesischen Koordinaten (x, y) in Polarkoordinaten (r, θ) unter Verwendung der Gleichungen 5.3 der Diskussion.
        Hinweis: Ein MATLAB-Skript für Winkel Tracking-Skript basiert auf der Überwachung der (x, y)-Position verfügbar ist von den Autoren auf Anfrage.
        Hinweis: Die Messzeit hängt vor allem von der gewünschten Drehmomentauflösung. Eine detaillierte Argument wird in Lipfert et al 24 gegeben. Für MyOne sollten Perlen und 8 kbp DNA Halteseile, Mess für 30-100 Sekunden ausreichen, um ein Drehmoment Auflösung im Bereich von ~ 1 pN · nm geben.
    4. Bestimmen Sie die Steifigkeit des Drehfalle von the Varianz der Winkelschwankungen (σ θ 2, in Radiant) mit:
      θ k = k B T / σ θ 2 (1)
      Hinweis: Typische Drehfalle Steifigkeiten in der MTT erzielten im Bereich von 10-1000 · pN nm / rad, geringer als bei herkömmlichen magnetischen Pinzette.
    5. Darüber hinaus zeichnen Sie die z-Position der Wulst und nutzen diese, um das Halteseil Länge l zu bestimmen (siehe auch die Schritte von 2,4 bis 2,7).
    6. N-Umdrehungen wieder aufnehmen θ (t) und L (t).
      Hinweis: Die reduzierte Drehfalle Steifigkeit des MTT gegenüber MT macht es für die Messung von Einzelmolekül Drehmoment geeignet, sondern bedeutet, dass das maximale Drehmoment, ausgeübt werden kann, verringert wird. Dies bedeutet, dass der MTT nicht in der Lage, hohe Schleppmomente durch schnelle Rotation verursacht ein Gegengewicht sein. Es muss daher geachtet werden, dass die maximale Geschwindigkeit überschreiten; typically drehen mit Raten nahe an 0,1 Hz.
    7. Bestimmen Sie die in der Nukleinsäure Halteseil angesammelt Moment nach N Windungen mit:
      Γ = - k θ <θ N - θ 0> (2)
      Wobei <...> zeigt die mittlere und θ 0 und θ N werden der Winkel bei null Umdrehungen (entsprechend einer dreh entspannt Haltegurt, vgl.. Schritt 2.3 und N Windungen auf.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 4.5 und 4.6 als notwendig, um ein Molekül Drehmomentreaktion in einem einzigen Messlauf (Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 6) zu ermitteln.

    Representative Results

    Repräsentative Ergebnisse der MT (Fig. 1a) sind in Abbildung 2 dargestellt. Fig. 2a rotationsDehnungsKurven für eine 7,9 kb DNA in F genommen = 0,25, 0,5, und 2,0 pN. Die Reaktion einer einzelnen DNA, um eine Drehung in der niedrigsten Kräfte (0,25 pN) symmetrisch ist, mit der Verlängerung der DNA-Abnahme als Folge der Bildung von positiven oder negativen plectonemic supercoils. Qualitative Kenntnis dieser Reaktion ist nützlich, wenn zunächst die Suche nach einem dreh eingeschränkt DNA Halteseil (Schritt 2.1). Beachten Sie, dass zusätzliche Überprüfung des Haltegurts ist erforderlich, um sicherzustellen, dass sie aus einem einzigen DNA-Molekül: hier die asymmetrische Reaktion eines einzelnen DNA zu Kräfte über 0,5 pN Rotation hilft, sie aus mehreren DNAs (Schritt 2.1.1) unterscheiden. Sobald dies bestätigt ist, gibt man zu der Dreh Reaktion bei 0,25 pN, um die genaue Anzahl von Magnet stellt fest, in dem die einzelnen DNA-is dreh entspannt, wo man eine Kraft-Dehnungs-Kurve, die Figur ähneln soll 2 b nimmt. Für diese besondere Messung, eine Anpassung der Daten an die wurmartige Kette Modell (durchgezogene Linie) ergab eine Einbaukonturlänge L C = 2,71 um-und Biege Persistenzlänge P L = 45 nm auf. Für dsDNA, sollten die Einbauwerte der Persistenz Länge im Bereich von 40 bis 55 nm liegen, abhängig von den Pufferbedingungen 33 und die Einbaukonturlänge sollte in der Nähe (in der Regel innerhalb von 10%) auf den Wert für die DNA-Konstrukt zu erwarten, dass wird in den Messungen verwendet wird, unter Verwendung der Beziehung L = 0,34 nm DNA / bp · Anzahl der Basenpaare.

    Abbildung 3 zeigt die Verfahren und Ergebnisse der Ausrichtung in der FOMT (Abbildung 1b). Die ersten (x, y), Ausflüge in Schritt 3.2 aufgenommen wurden, können auf die Gesamtansicht der Schwankungen als Funktion o verglichen werdenf die in Fig. 3a, die eine "Vortex"-Muster, das verwendet werden kann, um nachfolgende Relativbewegung zwischen dem Magneten und DNA-gebundenen Wulst in der Führung gehalten FOMT zeigt gezeigten Quermagnetposition. Wenn nachfolgende grobe Ausrichtung abgeschlossen ist, wird der Wulst (x, y)-Schwankungen zu verfolgen, eine Kreisbahn, wie es auch durch die schwarze Kurve in Fig. 3b gezeigt. Zu diesem Zeitpunkt wird das Drehmoment von den Magneten um die z-Achse zu dem Punkt, dass Temperaturschwankungen aus, um den Wulst um seinen Befestigungspunkt drehen reduziert. Der Radius R Kreis der resultierenden Kreisring (Einbau Kreis wird rot dargestellt) den radialen Abstand zwischen der DNA Befestigungspunkt und dem Wulst Zentrum (Abbildung 1b). Wie in Fig. 3c gezeigt ist, jedoch ein Histogramm der Daten in Fig. 3b zeigt, dass die Grobausrichtung nicht gleichförmige Bedeckung zu gewährleistenaller möglichen Positionen entlang der Kreisring. Auch wenn Temperaturschwankungen sind ausreichend, um alle Winkeldrehungen auf dem Kreis zu erkunden, bleibt eine kleine Energiebarriere (in der Größenordnung der thermischen Energie k B T) um eine freie Drehung.

    Wenn feinere Ausrichtung wird in FOMT (Schritt 3.4) durchgeführt wird, kann das Instrument verwendet, um die Torsions-Elastizitätsmodul von DNA (Fig. 4) zu bestimmen. Zunächst Feinausrichtung der Probe wird zur Kreisbewegung (Abbildung 4a), deren zweidimensionale Histogramm sollte nun eine gleichmäßige Abdeckung (Abbildung 4b) zeigen, zu erhalten. Die entsprechende Zeitverlauf q (t) der Winkelschwankungen (aus der Umwandlung von der (x, y)-Positionen erhalten, siehe unten) zeigt keine Periodizität entsprechend 360 ˚ (Abbildung 4c) und offenbart große Ausflüge, die mehreren Umdrehungen (Abbildung 4d). Die implizite Energielandschaftharmonisch ist über einen Bereich von> 1.000 ˚ (4e). Die Standardabweichung der Schwankungen ist σ θ = 223 °, was einer Winkelfalle Steifigkeit k θ = k B T / σ θ 2 = 0,27 · pN Nm / rad, was wiederum eine Schätzung des effektiven Dreh Persistenzlänge DNA gleich C = L C / σ θ 2 bis 76 nm (L c = 1,150 nm für die bei dieser Messung verwendete 3,4-kbp-DNA) bei der gemessenen Kraft.

    Ein Beispiel, wie FOMT kann verwendet werden, um die Änderung in der Drehung um die Bindung von Proteinen, 31 in den gebundenen DNA-Molekül induziert messen, 34 ist in Fig. 5 gezeigt. Hier haben wir überwacht die Bindung des RAD51-Proteins zu verdoppelnDNA; RAD51 ist sowohl bekannt verlängern und entspannen DNA, da es eine Nucleoproteinfilaments 31 bildet. Nach Spülen RAD51 in die Durchflusszelle, beobachten wir, dass der Wulst und Weise durchläuft eine Spirale in der FOMT (Fig. 5a). Durch die Umwandlung Spur von (x, y) Bewegung als eine Funktion der Zeit, q (t), wie oben beschrieben, können wir zusammen Grundstück den Effekt, dass RAD51 hat auf dem DNA-Halteseil Länge und der Grad der Auflösung (5b, c) .

    Ein alternativer Ansatz zur Messung der Dreheigenschaften der DNA sind die MTT (Fig. 1c, Fig. 6). Das Schema in Fig. 6a veranschaulicht das Prinzip der Messung: Nach Überdrehen (oder Unterwinde) die DNA-Linker um N dreht, die DNA, die ein Rückstellmoment auf der Kugel, die zu einer Verschiebung des Gleichgewichts Winkelposition θ von 0 bis θ N führt übt. Im MTT die Querkomponente des Magnetfelds reduziert ist im Vergleich zu dem MT, die Messung solcher Winkelverschiebungen ermöglicht, während immer noch erlaubt Wulstrotation (Abbildung 1). Die Größe der Winkelverschiebung nach dem Auftragen N = 45 gemessen wird zu einem 7,9 kbp-DNA ist in Fig. 6b gezeigt. Die vollständige Sequenz des MTT Messprotokoll und das erhaltene Ergebnis eines Drehmoments gegen die Rotationskurve für DNA sind in Fig. 6c-f gezeigt. Hier werden Messungen der Standardabweichung (6c) und dem Mittelwert (Fig. 6d) des Winkelkoordinaten in Abhängigkeit von Über-und Unterwinde gezeigt, wobei die Standardabweichung umgekehrt proportional zu der Winkelsteifigkeit Falle (Gleichung 1). Zusammengenommen sind diese Mengen erlauben es, ein Drehmoment gegenüber Rotationskurve für DNA (6f), die eine lineare Reaktion Region zeigen sollte konstruieren zentriert um 0 schaltet einnd zwei Plateaus bei dem die Drehmoment sättigt bei positiven und negativen Drehungen auf. Ein solches Drehmoment über Rotationskurve ergänzt die Informationen in einer Verlängerung gegenüber Rotationskurve (Fig. 6e), wodurch die Quantifizierung der Übergänge, die das Knicken und Denaturierung der DNA zu begleiten.

    Figur 1
    Fig. 1 ist. Schema des herkömmlichen magnetischen Pinzette (MT), frei umlaufenden magnetischen Pinzette (FOMT), magnetische Drehmoment Pinzette (MTT) und zwei Strategien zum Verfolgen Drehwinkel. (A) In allen drei Implementierungen magnetischen Pinzette, magnetischen Kügelchen in eine Durchflußzelle Oberfläche funktionalisierten Makromoleküle angebunden, z. B. schematisch dargestellten doppelsträngigen DNA-Molekülen. Bezugs Kügelchen zur Strömungszelloberfläche gebunden und DRIF verfolgtt-Korrektur. Alle drei MT-Set-ups sind Magnete, um eine Aufwärtsstreckkraft auf dem Magnetperle gelten und daher DNA-Kräfte. Bei herkömmlichen MT, ein Paar von Magneten ein Magnetfeld ausübt, die quer zu den Halteseil-Achse orientiert ist, dicht Zwangsdrehung des Wulstes um die DNA-Haltegurt-Achse. In FOMT stellt ein zylinderförmiger Magnet ein Magnetfeld, das entlang der Haltegurt-Richtung ausgerichtet. Wenn das Halteband mit der Mitte des zylinderförmigen Magneten ausgerichtet sind, werden die verbleibenden Querfelder minimiert, die eine freie Drehung um die Achse Haltegurt In MTT ist eine Seitenmagneten an den zylinderförmigen Magneten in FOMT um bereitzustellen hinzugefügt eine kleine Querfeld (in der Größe reduziert im Vergleich zu MT). Diese kleine Querfeld ermöglicht die Anwendung eines Drehmoments sowie die Messung. (B) zwei Strategien, um die Drehwinkel einer magnetischen Kugel zu den DNA-Haltegurt Achse messen gezeigt. 1): ein Marker Wulst (Gradn) an die magnetischen Kügelchen (braun) befestigt gibt ein asymmetrisches Bild, das Winkel ermöglicht die Verfolgung von Analyse vorstellen. Zwei CCD-Bildern eines 1,4 &mgr; m Radius magnetischen Kügelchen mit einem 0,5 &mgr; m-Radius Bezugsmarkierung dargestellt sind, in ihrer Ausrichtung und out-of-focus. 2): wenn die DNA gebunden an die magnetischen Kügelchen an einer Position entfernt von dem Wulst Südpol, der Mittelpunkt der Wulst schwankt entlang eines Bogens, dessen Mitte definiert eine Winkelposition. Entweder Strategie kann verwendet werden, um Drehwinkel zu verfolgen und zu Verschiebungen der Winkelposition zu überwachen, während das Halteseil gespannt ist dreh (Spuren auf der rechten Seite), so dass Messungen von Einzelmolekül Drehmoment.

    Figur 2
    2. DNA Kalibrierungsmessungen bei der herkömmlichen MT. (A) Rotation-Dehnungskurven für eine 7,9 kb-DNA bei F = 0 getroffen0,25, 0,5 und 2,0 pN. Die asymmetrische Reaktion unter Rotation mit positiven und negativen Drehungen der einzelnen doppelsträngigen DNA Halteseile können als eine bequeme Prüfung des Bandbefestigungs verwendet werden. (B) Kraft-Dehnungs-Kurve für ein 7,9 kb-DNA zusammen mit einer Anpassung an die schnecken wie Chain-Modell (durchgezogene Linie), was eine Einbaukonturlänge L C = 2,71 um-und Biege Persistenzlänge P L = 45 nm auf. Alle Messungen wurden in PBS-Puffer durchgeführt.

    Fig. 3
    Abbildung 3. Ausrichtung im FOMT. (A) (x, y) Schwankungen des DNA-gebundenen Sicke im FOMT als Funktion der Position des Magneten gehalten wird. Die Position des zylindrischen Magneten auf einer konstanten Höhe von 3 mm über dem Strömungszellenoberfläche in Schritten von 250 um x abgetastet und (x, y)-Fluktuationsmuster mit Magnetposition ähnlich einem Zyklon bzw. Wirbel sind offensichtlich. Dieses "Vortex"-Muster verwendet werden, um die Verschiebung der Magnetführung (oder alternativ dem Halteseil während die festen Magneten) in x-und y (durch die großen Pfeile angedeutet), um die Ausrichtung zu erzielen. Als grobe Ausrichtung abgeschlossen ist, der Perle der (x, y)-Schwankungen verfolgen eine Kreisbahn (blaue Kurve in der Mitte des Grundstücks). Diese Spur wurde in einem getrennten Experiment nach dem Ausrichten der Magnete in kleineren Schritten zu der Mitte und ist zur Veranschaulichung in diesem Diagramm gezeigt, (b) (x, y)-Schwankungen eines DNA-gebundenen Perlen, t gehalten aufgezeichnet.FOMT er nach der erfolgreichen Grobausrichtung des Magneten (schwarze Kurve). Die Schwankungen liegen auf einem Kreisring und Temperaturschwankungen aus, um alle Drehungen Winkel auf dem Kreis zu erkunden. Eine Einbau Kreis wird rot dargestellt. (C) Ein Histogramm entsprechend den Daten in (b), die zeigen, dass die Grobausrichtung nicht gleichmäßige Abdeckung aller möglichen Positionen entlang der Kreisring zu garantieren. Auch wenn Temperaturschwankungen sind ausreichend, um alle Winkeldrehungen auf dem Kreis zu erkunden, bleibt eine Energiebarriere (auf der Reihenfolge der Wärmeenergie k B T) um eine freie Drehung.

    Fig. 4
    4. Messung der DNA Torsionssteifigkeit mit FOMT. (X, y)-Trajektorie (a) und das Histogramm (b) einer DNA-tethEred Schwankungen Wulst nach der Feinausrichtung der relativen Magnet-Halteseil Position in der FOMT. Unter diesen Umständen zeigt das Histogramm im wesentlichen gleichmäßige Abdeckung der Positionen auf dem Kreis. (C) Rotationsschwankungen der von der (x, y)-Positionen. (D) Histogramm der Drehfluktuationen bestimmt Wulst. Die rote Linie ist ein Gauß-Fit mit σ θ = 223 °. (E) Die Energielandschaft durch die Rotationsschwankungen Dichte aus (c) und (d) impliziert. Der Unterschied zwischen der Energielandschaft durch die Drehschwankungen impliziert und eine harmonische Näherung (mit k = θ k B T / σ θ 2 = 0,27 pN-nm/rad) viel kleiner als die thermische Energie k B T über mehrere Umdrehungen. Die Daten werden für die Klarheit, wie Offset θ 0 = 0 ist. Die Breite derdie Schwankungen kann die Torsionssteifigkeit der DNA zu bestimmen, siehe Haupttext werden. Die Messung wurde in PBS-Puffer bei einer Dehnkraft von ~ 1 pN geführt. Die Daten werden von Lipfert et al 21 angepasst.

    Figur 5
    5. Die Bindung des RAD51-Proteins an DNA unter Verwendung FOMT. (A) Montage der RAD51-Proteins auf die Anbindung an eine 7,9 kbp dsDNA überwacht bei 3,5 pN. Die (x, y, z)-Kurve der magnetischen Kügelchen (Durchmesser 1,0 mm) während der ersten 200 Sekunden der Baugruppe ausgeführt wird, dargestellt ist, mit von blau nach rot Zeit farbcodiert. (B) Die Verlängerung der dsDNA ableiten von der z-Komponente des Wulstes und Weise in (a) als eine Funktion der Zeit. (c) der Drehwinkel um die Achse abgeleitet dsDNA Haltegurtvon der x, y Komponenten des Wulstes und Weise in (a) als eine Funktion der Zeit.

    Fig. 6
    6. Drehmomentmessungen auf einem einzigen DNA-Haltegurt im MTT. (A) Schematische Darstellung des Prinzips des Drehmomentmessung. Nach über-(oder Unter-) Wicklung der DNA Haltegurt von N Windungen, die DNA übt eine Rückstellmoment auf der Kugel, die zu einer Verschiebung des Gleichgewichts Winkelposition θ von 0 bis θ N führt. (B) Beispiel für die Winkel Spuren verwendet Drehmoment messen:. Winkelfluktuationen eines Wulstes vor (blau) und nach dem Einführen 40 Umdrehungen (dunkelrot), um eine dreh entspannten 7,9 kbp-DNA-Molekül angebunden (vgl.) Drehmomentmessung an einer 7,9-kbp-DNA-Molekül in PBS-Puffer bei einer st gehaltenWürgen Kraft von ~ 3 PN mit der Bezugsmarken Wulst basierend Winkel Tracking-Protokoll. Winkelfluktuationen, wie in (b) wurden als eine Funktion der Anzahl von Windungen aufgebracht als eine Funktion der angelegten Windungen aufgezeichnet. (C) die Standardabweichung der Winkelfluktuationen gezeigt. Die Breite der Schwankungen ungefähr konstant ist, was anzeigt, konstanten Winkelfalle Steifigkeit. (D) Die Verschiebung der mittleren Drehwinkel als eine Funktion der angelegten Windungen. Systematischen Verschiebungen des mittleren Winkel auf Über-und Unterwinde sind offensichtlich. (E) gleichzeitig überwacht DNA Haltegurt Erweiterung als Funktion der angelegten Windungen. (F) Das durch die DNA-Haltegurt aus dem mittleren Winkel in (d) gezeigt, bestimmt ausgeübte Drehmoment , siehe Haupttext. Über-und Unterwinde um Null Umdrehungen führt zu einer linearen Drehmoment vs dreht Reaktion der DNA-Haltegurt (montiert grau Hänge-Ion (d) und (f)), die verwendet werden können, um die effektive Torsionssteifigkeit Persistenzlänge bestimmen (~ 77 nm für diesen Datensatz). Weitere Überdrehen führt zu Knicken und Bildung plectonemic supercoils (in den Einsätzen schematisch dargestellt), das entspricht einem Drehmomentplateau (schwarze Linie auf positive Wendungen in (f) bei ~ 26 pN · nm) und eine lineare Abnahme der Fessel-Erweiterung mit der Nummer von Drehungen (schwarze Piste in (e)). Abwicklung über den linearen Bereich bewirkt, dass die DNA lokal schmelzen (in den Einsätzen auf der linken Seite), von einem Drehmomentplateau gleich der Schmelz Drehmoment (schwarze Linie bei negativen Wendungen in (f) bei ~ -11 pN · nm) markiert.

    Discussion

    Bei der Ausführung von Experimenten unter Verwendung des MTT oder FOMT, eine Reihe von Entscheidungen müssen über Perlen, Magneten, Tracking-Protokolle, etc. Die besten Entscheidungen getroffen werden wird auf das Experiment von Interesse abhängig gemacht werden. Im Folgenden beschreiben wir die Kompromisse, die verschiedenen Möglichkeiten zu begleiten, die Auswahl für ein bestimmtes Experiment zu erleichtern sollte. Weiter beschreiben wir einige kritische Schritte, die die Ausrichtung und Durchführung der MTT und FOMT Experimente zu begleiten. Schließlich diskutieren wir die Bedeutung der MTT und FOMT in Bezug auf bestehende Methoden sowie zukünftige Anwendungen.

    Überlegungen vor dem Start der MTT und FOMT Experimente

    Jedes Experiment benötigt man, um eine Art von magnetischen Kügelchen für den Einsatz auswählen. Man kann zwischen mehreren im Handel erhältlichen Streptavidin-beschichtete superparamagnetische Perlen, z. B. 0,25 um Radius Perlen, 0,5 um Radius Perlen oder 1,4 um Radius-Perlen (s wählenee die Materialien Tabelle). Größere Perlen wird eine erhöhte magnetische Moment haben im Vergleich zu kleineren Kügelchen (etwa Skalierung wie das Volumen) und damit ihre Verwendung werden die Anwendung von höheren Kräften zu vereinfachen (für unsere Instrumente erreicht typischen Kräfte siehe Tabelle 1). Wenn Winkel Tracking mit Marker Perlen gewünscht wird, wir in der Regel mit 1,4 um Radius arbeiten und 0,5 um Radius nicht-magnetischen biotinylierten Perlen als Marker Perlen (siehe Absatz 1.9 für die entsprechenden Befestigungs-Protokoll). Die Verwendung kleinerer Perlen ist besonders zu empfehlen für die FOMT, wie die charakteristische Zeitskala für Wulstrotation τ C gleich dem Verhältnis der Drag des Systems über die Federkonstante γ / k θ; wichtiger ist, die Drehwiderstandskoeffizienten für die Winkelmesszeitskala Skalen als ~ R Wulst 3, dh mit der dritten Potenz des Radius relevant (siehe Tabelle 2die charakteristische Zeitskalen für mehrere Kügelchen-DNA-Kombinationen in FOMT und MTT-Messungen). Begleitenden Verringerung der Maximalkraft, die angewendet werden können, können durch die Verwendung eines Stapels von dreht zylindrischen Magneten 27 gerichtet werden. Dennoch, in FOMT Messungen kann es manchmal notwendig sein, zwischen dem besten erreichbare zeitliche Auflösung und die maximale Kraft angewendet gefährden.

    Zusätzlich wurde ein Experiment erfordert die Auswahl einer Magnetanordnung. In dem herkömmlichen Magnet Pinzette Konfiguration (1a), die wir verwenden typischerweise ein Paar von 5x5x5 mm kubischen Magnete in vertikaler Ausrichtung mit einer 0,5 oder 1 mm Abstand zwischen den Magneten 4. Wenn die Magnete entlang der x (y) Achse angeordnet sind, ergibt sich ein Magnetfeld, das in erster Linie entlang der x (y)-Achse gerichtet ist. Für FOMT Experimenten wurde ein zylinderförmiger Magnet, in dessen Zentrum das Magnetfeld hauptsächlich gerichtet ausgewählt istentlang der z-Achse (Fig. 1b). In der Praxis verwenden wir einen Stapel von drei solchen zylinderförmigen Magneten mit einem Durchmesser von 6 mm und einem zentralen Loch von 2 mm Durchmesser bei einer Gesamtdicke von 6 mm. Wenn höhere Zugkräfte gewünscht werden, wird bevorzugt ein "Stapel umgedreht" Magnetanordnung, in der die Bodenmagnet mit entgegengesetzter Magnetisierung gestapelt. Um den MTT-Konfiguration (Fig. 1c) zu erzielen, einen zusätzlichen Magneten fügen wir zu der Seite des Hauptmagneten Stapel des FOMT Konfiguration, typischerweise einem festen Zylinder mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Höhe von 7 mm. Um zu sehen, wie die in unserer Instrumente erreicht Maximalkräfte sind abhängig von der Magnetanordnung, siehe Tabelle 1.

    Die Ausrichtung der MTT und FOMT Experimente

    Da magnetische Kügelchen haben einen (ungefähr) gleichmäßig funktionalisierten Oberfläche (typischerweise Streptavidin), und da die Befestigung der beiden funktionalisierten nucleic Säure Leinen-und Marker-Perlen (im Falle der Marker Wulst-basierte Tracking-Winkel verwendet wird) erfolgt über einfache Inkubation in Lösung, muss man nicht steuern, wo das Halteseil und / oder Marker Wulst heften sich an die magnetischen Kügelchen. Die magnetischen Kügelchen eine bevorzugte Magnetisierungsachse, die sich entlang der Richtung des externen Feldes auszurichten neigt. Bezeichnen wir die Punkte, wo die bevorzugte Magnetisierungs Achse die Perle der Oberfläche, wie die Nord-und Südpol, dann Perlen, wo die DNA-Halteseil der Nähe des Äquators befestigt wird mit einem Radius in der Nähe oder etwas größer als die Spuren ein Kreisring Perlenradius in der FOMT; wird dagegen Perlen, befestigt in der Nähe des Südpols sind auf einem Kreisring mit sehr kleinen Radius im FOMT schwanken, die Montage des Kreises unter Verwendung der Gleichungen 3-5 ausschließen können. Wir bemerken, dass durch einfache sphärische Geometrie, viel größer ist als ein Befestigungs genau an den Polen der Wahrscheinlichkeit des Anbringens der Nähe des Äquators; Daher sind die meisten bEADS angebunden werden, so dass die (x, y)-basierte Winkelverfolgung kann erfolgreich durchgeführt werden.

    Ein ähnliches Argument gilt für die Befestigung der Markierungsperlen für die Bezugsmarkierung basierend Winkelverfolgung. Der Marker Wulst verwendet, um eine Asymmetrie in dem Bild der magnetischen Kügelchen, die Spurwinkel erzeugen zu können. Wenn der Marker Wulst genau an der Nord-oder Südpol des Wulstes (dh direkt auf der Oberseite oder auf der Unterseite) angebracht ist, ist das resultierende Bild noch rotationssymmetrisch und die Winkelverfolgungsprotokoll fehlschlägt. , Nach dem gleichen Kugelgeometrie Argument ist jedoch die Möglichkeit für eine Markierung Wulst direkt an einem der Pole befestigen relativ klein; wir finden, dass in der Praxis die meisten Marker Perlen geben eine ausreichende Asymmetrie der Winkelverfolgung aktivieren. Schließlich stellen wir fest, dass in den herkömmlichen magnetischen Pinzette die Feldrichtung in der (x, y)-Ebene; Daher wird die bevorzugte Magnetisierungsachse des Wulstes in th ausrichtene (x, y)-Ebene und die Nord-und Südpol, wie oben definiert, werden in Zukunft an den Seiten der Perle sein, unwahrscheinlich, dass die Situation in der FOMT oder MTT, wo die Pole sind am oberen und unteren Rand.

    In FOMT Experimenten ist ein kritischer Schritt der Ausrichtung des zylindrischen Magneten, so dass das radiale Magnetfeld vernachlässigbar in der Nähe des Wulstes. Diese Ausrichtung ist für eine einzelne Perle zu einem Zeitpunkt durchgeführt. Um zu beurteilen, ob Wulst Bewegung in der FOMT wird gleichmäßig über einen Kreisring verteilt, sollte die Messzeit 20 · τ C überschreiten. Τ ist gleich wie C ~ 45 Sekunden für 8 kbp DNA und einem Radius von 0,5 mm Perlen, ist die Messzeit ~ 900 sec in der Endphase der Ausrichtung. Zum Vergleich, die Verwendung von 1,9 kbp DNA und 0,25 mm Radius Perlen reduziert τ C Zwanzigfache auf ~ 2 Sekunden (siehe auch Tabelle 2).

    Kritische Schritte und Überlegungen für die Verfolgung Während FOMT und MTT-Experimente

    So verfolgen die Sicke in-plane-Schwankungen, dh seine (x, y)-Position setzen wir ein Kreuzkorrelationsanalyse der Intensitätsprofile durch einen Wulst angezeigt in nachfolgenden Zeitintervallen 35, 36. Dies kann bei Subpixel-Auflösung mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern 20 durchgeführt werden. Um die Bewegung der Wulst in z verfolgen, verwenden wir typischerweise einen zuerst von Gosse und Kroketten ausgelegt, in dem die Objektivbrennebene (OFP) wird genau in der vertikalen Richtung verschoben wird, während die Abbildung der Beugungsringe des Wulstes zu der Nukleinsäure 20 befestigt . Auf diese Weise wird eine Eichprofil Korrelieren des Beugungsmusters von dem Wulst zu dem Abstand zwischen dem Wulst und der OFP 19 erzeugt. Wenn diese Kalibrierung Profil interpoliert wird, können die vertikalen Verschiebungen der Wulst auch mit einer Genauigkeit von bis zu einigen 20 nm gemessen werden.Wir verweisen den Leser auf weitere Referenzen, die mehr raffinierte Tracking-Algorithmen 37, 38 sowie deren Anwendung auf Verfolgung mehrerer Perlen 5, 6, 37 parallel zu beschreiben.

    Bei der Verwendung von Winkelverfolgung, die auf der Umwandlung von (x, y)-Positionen in Winkelkoordinaten stützt, empfehlen wir, wie folgt vorzugehen. Von einer Zeit, in der die Spur Perle zeichnet einen Kreisring, verwenden Sie die (x i, y i)-Positionen (wobei der Index i bezeichnet nachfolgenden Messpunkte), um den Kreismittelpunkt (x 0, y 0) und Radius R Kreis passen (Abbildung 2a) durch Minimierung:

    (3)

    wobei die Summe läuft über alle Datenpunkte. Nach Fitting x 0, y 0 ist und R Kreis bestimmen die Polarkoordinaten (r i, θ i) von jedem Datenpunkt in der Zeitspur mit:

    (4)

    (5)

    Beachten Sie, dass sollte man darauf achten, "auspacken" den Winkel θ, dh Phasensprünge von ± π gegebenenfalls hinzuzufügen. Individuell geschriebenen Code für den Ein-und Umbau von (x, y) (r, θ)-Koordinaten ist von den Autoren auf Anfrage erhältlich. Im FOMT kann ein Zeitverlauf, in dem der Wulst Spuren ein Kreisring durch Erreichen Grobausrichtung (vgl. Schritt 3.3) und die Aufzeichnung der Temperaturschwankungen des Wulstes erhalten werden. In der MTT, thermische SchwankungenATIONEN nicht ausreichen, um die Spurenkreisring; Verwenden Sie stattdessen eine Zeitspur, wo die Magnete sind langsam (in der Regel bei 0,1 Hz) um einige Umdrehungen gedreht, um den Kreis zu passen unter Verwendung der Gleichungen 3-5.

    Wir stellen fest, dass für die MTT, ist es wichtig, die richtige Winkelverfolgungs Ansatz, also über einen Winkelpositionsmarkierung (1c, 1d, 3a) oder durch die Umwandlung von (x, y)-Positionen in Winkelkoordinaten wählen ( 1d, 2b). Während typischerweise die Genauigkeiten der Winkelverfolgung von (x, y)-Positionen und die Verwendung von Markerperlen vergleichbar sind, ist es wichtig zu erkennen, dass das Übersprechen tritt zwischen Schwankungen eines Wulstes in (x, y) und im Winkel, wie in Janssen et al 32: so ist Winkel Tracking von (x, y)-Positionen nur dann gültig, sofern die Brownsche Schwankungen (x, Y) tragen nur unwesentlich auf die Unsicherheit in der Winkel koordinieren und dem richtigen Gebrauch von (x, y)-Tracking kann Abstimmung der Drehfalle Steifigkeit über die Einstellung der Position der Seitenmagnet erfordern. Typischerweise ist die Verwendung von höheren Steifigkeit Falle erfordert die Verwendung von Winkelortung mittels Markerperlen. Die Verwendung von Marker-Perlen ist eine zusätzliche Befestigung Schritt, der die Anzahl der nutzbaren Haltegurte reduzieren kann (siehe den Anhang Protokoll in Schritt 1.9). Bei der Verwendung der Marker Wulst-basierte Tracking, ist es wichtig, an magnetische Kügelchen, die ein Marker Wulst der Nähe des Äquators für beste Ergebnisse angeschlossen haben wählen.

    Bedeutung der FOMT und MTT Ansätze im Vergleich zu bestehenden Methoden und Anwendungen

    In dem oben haben wir gezeigt, wie man, ausgehend von konventionellen MT, die Magnetkonfigurationen leicht ändern, um das Gerät in den MTT oder FOMT konvertieren. Diese einfache mNDERUNG, die durch die Einführung der Winkel Tracking, wenn die Verwendung eines Winkelpositionsmarkierung gewünscht begleitet werden kann, ist eine sofortige Stärke der beiden Konfigurationen, wie es dem Benutzer erlaubt, Drehmoment aufbringen, Drehmoment messen oder messen Twist je nach Experimentieren auf der Hand. Wie in der Einleitung erwähnt, sowohl FOMT MTT und profitieren Sie von vielen der vorhandenen Stärken der MT, vor allem ihre Einfachheit, mit der MTT insbesondere profitiert auch von der Fähigkeit der parallelen Messungen 5, 6 (diese sind nicht mehr so leicht erreicht FOMT gegeben das Erfordernis der Ausrichtung des Halteseils in Bezug auf die Mitte des zylindrischen Magneten). Insbesondere, MTT und FOMT nicht erforderlich, im Gegensatz zu anderen Techniken, speziell Nano-Teilchen hergestellt 22, 39, 40, komplexen optischen Aufbau 41, oder die Einführung von zusätzlichen Kügelchen innerhalb der gebundenen (DNA)-Molekül 42. Solche other Techniken können dennoch andere Vorteile wie höhere zeitliche Auflösung 27, 43, 44. Sowohl FOMT und MTT sollten zukünftige Anwendungen in der Studie des Genoms Verarbeitung zu finden, da das Verhalten der molekularen Motoren auf DNA sowohl durch beeinflusst und hat Folgen für die lokale Drehung und Drehmoment. Zusätzliche Anwendungen können in dem neuen Gebiet der DNA-Nanotechnologie 27 oder im weiteren Bereich der Drehmotoren in biologischen Verarbeitung 7, 45 aktive gefunden werden.

    M270 (R = 1,4 Wulst um) MyOne (R Wulst = 0,5 &mgr; m) Ademtech (R = 0,25 Wulst um)
    Konventionelle MT (Paar Kubik 5 x 5 x 5 mm 3 Magneten, 1 mm Abstand, vertikale Ausrichtung) 70 pN 8 pN 1,6 pN
    FOMT oder MTT * (Stack aus drei zylindrischen Magneten, 6 mm Durchmesser, 2 mm Durchmesser Spalt) 9 pN 1 pN 0,2 pN
    FOMT oder MTT * (Stack aus drei zylindrischen Magneten, 6 mm Durchmesser, 1 mm Durchmesser Spalt) 18 pN 2 pN 0,4 pN
    FOMT oder MTT * (Stack aus drei zylindrischen Magneten mit letzte umgedreht, 1 mm Durchmesser Spalt) ~ 50 pN 9 pN 1,8 pN

    * Das Vorhandensein der kleinen Seitenmagneten im MTT einen vernachlässigbaren Effekt auf die Streckkraft hat

    Tabelle 1. Maximalkräfte in der Regel für unterschiedliche Magnetkonfigurationen und Perlenarten erreicht.

    R = 1,4 um Wulst R = 0,5 um Wulst R = Wulst0,25 um
    Reibungskoeffizient * 120 pN · nm · s 5.5 pN · nm · s 0,7 pN · nm · s
    Charakteristischen Zeitskala: FOMT, 10 kbp DNA ** 1200 s 55 sec 7 Sek.
    Charakteristischen Zeitskala: FOMT, 1 kbp DNA 120 Sekunden 5,5 sec 0,7 s
    Charakteristischen Zeitskala: MTT, k q = 100 pN · nm / rad 1,2 s 0,06 sec 0.007 Sek.
    Charakteristischen Zeitskala: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad 0,12 sec 0,006 sec = 6 ms 0,0007 s = 0,7 ms

    * Der Reibungskoeffizient für eine Drehung um eine Achse durch den "Äquator" (dh der in Fig. 1b gezeigten Situation) Von 14 angegeben · p · h · R Wulst 3, wobei h die Viskosität des Puffers.
    ** Im FOMT wird die Drehfalle Steifigkeit der Torsionssteifigkeit der DNA, k q gegeben, DNA = C · k B T / L C, wobei C die effektive Torsionssteifigkeit Persistenzlänge, hier angenommenen bis 80 nm ( welche charakteristisch für eine Zwischen Kraft Regime, F ~ 1 pN) und L C ist der Konturlänge der DNA, 0,34 nm pro Basenpaar.

    Tabelle 2. Reibungskoeffizienten und charakteristische Zeitskalen für FOMT und MTT.

    Disclosures

    Ein Patent auf diese Arbeit bezogen hat unter Bezugnahme PCT/NL2011/050446 eingereicht.

    Acknowledgments

    Diese Arbeit wurde von der TU Delft, der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), der Stiftung für Grundlagenforschung auf Materie, und von der European Science Foundation unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sandblaster Great Lake Orthodontics 190-070 Microetcher II
    Nitrocellulose Life Technologies LC2001
    Magnetic particle concentrator Life Technologies 12002D
    Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) Polysciences 17010
    Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) Sanbio PV05N/2179
    Antidigoxigenin Roche 11 214 667 001
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) Ademtech 3150
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) Life Technologies 650.01
    Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) Life Technologies 653.05
    Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) Life Technologies F-8768
    Cubic magnets for conventional tweezers Supermagnete W-05-N50-G
    Cylindrical magnet for MTT and FOMT Supermagnete R-06-02-02G
    Side magnet for MTT Supermagnete S-04-07-N
    Linear stage Physik Instrumente M-126.PD
    Rotary stage Physik Instrumente C-150
    High-resolution automated sample stage Physik Instrumente P-733.2D
    Software for coding analysis routines The Mathworks MATLAB custom-written routines are available from the authors

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    References

    1. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271, 1835-1837 (1996).
    2. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421, 423-427 (2003).
    3. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature methods. 5, 491-505 (2008).
    4. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical journal. 96, 5040-5049 (2009).
    5. Ribeck, N., Saleh, O. A. Multiplexed single-molecule measurements with magnetic tweezers. The Review of scientific instruments. 79, (2008).
    6. De Vlaminck, I., et al. Highly parallel magnetic tweezers by targeted DNA tethering. Nano letters. 11, 5489-5493 (2011).
    7. Koster, D. A., Crut, A., Shuman, S., Bjornsti, M. A., Dekker, N. H. Cellular strategies for regulating DNA supercoiling: a single-molecule perspective. Cell. 142, 519-530 (2010).
    8. Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nature reviews. Genetics. 14, 9-22 (2013).
    9. Ajjan, R., et al. Common variation in the C-terminal region of the fibrinogen beta-chain: effects on fibrin structure, fibrinolysis and clot rigidity. Blood. 111, 643-650 (2008).
    10. Mierke, C. T., et al. Mechano-coupling and regulation of contractility by the vinculin tail domain. Biophysical journal. 94, 661-670 (2008).
    11. Shang, H., Lee, G. U. Magnetic tweezers measurement of the bond lifetime-force behavior of the IgG-protein A specific molecular interaction. Journal of the American Chemical Society. 129, 6640-6646 (2007).
    12. Shang, H. K. P., et al. The application of magnetic force differentiation for the measurement of the affinity of peptide libraries. J Magn Magn Mater. 293, 382-388 (2005).
    13. Lee, G. U., Metzger, S., Natesan, M., Yanavich, C., Dufrene, Y. F. Implementation of force differentiation in the immunoassay. Analytical biochemistry. 287, 261-271 (2000).
    14. Smith, A. S., Sengupta, K., Goennenwein, S., Seifert, U., Sackmann, E. Force-induced growth of adhesion domains is controlled by receptor mobility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6906-6911 (2008).
    15. Kanger, J. S., Subramaniam, V., van Driel, R. Intracellular manipulation of chromatin using magnetic nanoparticles. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 16, 511-522 (2008).
    16. Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. Magnetic tweezers in cell biology. Methods in cell biology. 83, 473-493 (2007).
    17. Bausch, A. R., Moller, W., Sackmann, E. Measurement of local viscoelasticity and forces in living cells by magnetic tweezers. Biophysical journal. 76, 573-579 (1999).
    18. Lipfert, J., Koster, D. A., Vilfan, I. D., Hage, S., Dekker, N. H. Single-molecule magnetic tweezers studies of type IB topoisomerases. Methods Mol Biol. 582, 71-89 (2009).
    19. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Handbook of Single-Molecule Biophysics. Hinterdorder, P., van Oijen, A. , Springer. (2009).
    20. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical journal. 82, 3314-3329 (2002).
    21. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nature communications. 2, 439 (2011).
    22. Celedon, A., et al. Magnetic tweezers measurement of single molecule torque. Nano letters. 9, 1720-1725 (2009).
    23. Lipfert, J., Kerssemakers, J. J., Rojer, M., Dekker, N. H. A method to track rotational motion for use in single-molecule biophysics. The Review of scientific instruments. 82, (2011).
    24. Lipfert, J., Kerssemakers, J. W., Jager, T., Dekker, N. H. Magnetic torque tweezers: measuring torsional stiffness in DNA and RecA-DNA filaments. Nature. 7, 977-980 (2010).
    25. Mosconi, F., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Measurement of the torque on a single stretched and twisted DNA using magnetic tweezers. Physical review letters. , 102 (2009).
    26. Mosconi, F., Allemand, J. F., Croquette, V. Soft magnetic tweezers: A proof of principle. Review of Scientific Instruments. 82 (12), (2011).
    27. Kauert, D. J., Kurth, T., Liedl, T., Seidel, R. Direct mechanical measurements reveal the material properties of three-dimensional DNA origami. Nano letters. 11, 5558-5563 (2011).
    28. Velthuis, A., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative Guidelines for Force Calibration through Spectral Analysis of Magnetic Tweezers Data. Biophysical journal. 99, 1292-1302 (2010).
    29. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. The Review of scientific instruments. 83, (2012).
    30. Bouchiat, C., et al. Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements. Biophysical journal. 76, 409-413 (1999).
    31. Lee, M., Lipfert, J., Sanchez, H., Wyman, C., Dekker, N. H. Structural and torsional properties of the RAD51-dsDNA nucleoprotein filament. Nucleic acids research. 41, (2013).
    32. Janssen, X. J., et al. Electromagnetic torque tweezers: a versatile approach for measurement of single-molecule twist and torque. Nano letters. 12, 3634-3639 (2012).
    33. Baumann, C. G., Smith, S. B., Bloomfield, V. A., Bustamante, C. Ionic effects on the elasticity of single DNA molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 6185-6190 (1997).
    34. Lipfert, J., Wiggin, M., Kerssemakers, J. W., Pedaci, F., Dekker, N. H. Freely orbiting magnetic tweezers to directly monitor changes in the twist of nucleic acids. Nat Commun. 2, 439 (2011).
    35. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophys. J. 81, 2378-2388 (2001).
    36. Gelles, J., Schnapp, B. J., Sheetz, M. P. Tracking kinesin-driven movements with nanometre-scale precision. Nature. 331, 450-453 (1988).
    37. Loenhout, M. T., Kerssemakers, J. W., De Vlaminck, I., Dekker, C. Non-bias-limited tracking of spherical particles, enabling nanometer resolution at low magnification. Biophysical journal. 102, 2362-2371 (2012).
    38. Kim, K., Saleh, O. A. A high-resolution magnetic tweezer for single-molecule measurements. Nucleic acids research. 37, 136 (2009).
    39. Deufel, C., Forth, S., Simmons, C. R., Dejgosha, S., Wang, M. D. Nanofabricated quartz cylinders for angular trapping: DNA supercoiling torque detection. Nature methods. 4, 223-225 (2007).
    40. Huang, Z., Pedaci, F., van Oene, M., Wiggin, M. J., Dekker, N. H. Electron beam fabrication of birefringent microcylinders. ACS nano. 5, 1418-1427 (2011).
    41. La Porta, A., Wang, M. D. Optical torque wrench: angular trapping, rotation, and torque detection of quartz microparticles. Physical review letters. 92, (2004).
    42. Gore, J., et al. DNA overwinds when stretched. Nature. 442, 836-839 (2006).
    43. Bryant, Z., Oberstrass, F. C., Basu, A. Recent developments in single-molecule DNA mechanics. Curr Opin Struct Biol. 22, 304-312 (2012).
    44. Oberstrass, F. C., Fernandes, L. E., Bryant, Z. Torque measurements reveal sequence-specific cooperative transitions in supercoiled DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 6106-6111 (2012).
    45. Forth, S., Sheinin, M. Y., Inman, J., Wang, M. D. Torque measurement at the single-molecule level. Annu Rev Biophys. 42, 583-604 (2013).

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    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O.,… More

    Lipfert, J., Lee, M., Ordu, O., Kerssemakers, J. W. J., Dekker, N. H. Magnetic Tweezers for the Measurement of Twist and Torque. J. Vis. Exp. (87), e51503, doi:10.3791/51503 (2014).

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