Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

doi: 10.3791/51510 Published: February 21, 2014

Summary

jetting microfluidic נגד bilayer שומנים ממשק אגל מספק דרך אמינה כדי ליצור שלפוחית ​​עם שליטה על חוסר סימטריה בממברנה, שילוב של חלבונים הטרנסממברני, ואנקפסולציה של חומר. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מגוון רחב של מערכות ביולוגיות שבי ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

Abstract

ביולוגיה סינתטית מלמטה למעלה מציגה גישה חדשנית לבירור ולבנייה מחדש של מערכות ביוכימיות ו, באופן פוטנציאלי, אורגניזמים מינימאליים. תחום מתפתח זה עוסק מהנדסים, כימאים, ביולוגים, פיסיקאים ולעצב ולהרכיב רכיבים ביולוגיים בסיסיים למערכות מורכבות, פועלות מלמטה למעלה. מערכות מלמטה למעלה כזה יכול להוביל להתפתחות של תאים מלאכותיים לבירורים ביולוגיים בסיסיים וטיפולים חדשניים 1,2. שלפוחית ​​ענקית unilamellar (GUVs) יכולה לשמש כפלטפורמת מודל לביולוגיה סינתטית בשל המבנה שלהם כמו קרום תא וגודל. jetting microfluidic, או microjetting, הוא טכניקה המאפשרת לדור של GUVs עם גודל מבוקר, הרכב קרום, שילוב חלבון הטרנסממברני, ואנקפסולציה 3. העיקרון הבסיסי של שיטה זו הוא השימוש בפולסים מרובים, בתדירות גבוהה נוזל שנוצרו על ידי מכשיר הזרקת דיו ומונע piezo כדי לעוות l מושעהbilayer ipid לבוס. התהליך דומה לפיצוץ בועות סבון מסרט סבון. על ידי שינוי בהרכב הפתרון נשפו, ההרכב של הפתרון המקיף, ו / או הרכיבים הנכלל בbilayer, חוקרים יכולים ליישם טכניקה זו כדי ליצור שלפוחית ​​מותאמת אישית. מאמר זה מתאר את ההליך כדי ליצור שלפוחית ​​פשוטה מbilayer ממשק אגל ידי microjetting.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

זה הפך להיות יותר ויותר ברור שביולוגיה של תא היא בעיה רב היקף שיש בו שילוב של ההבנה שלנו ממולקולות לתאים. כתוצאה מכך, לדעת בדיוק כיצד מולקולות לעבוד בנפרד אינו מספיק כדי להבין התנהגויות הסלולר מורכבות. זה נובע בחלקו על קיומה של התנהגות מתהווה של מערכות מרובות רכיבים, כפי שהודגם על ידי הכינון מחדש של אינטראקציה ברשת אקטין עם שלפוחית ​​bilayer השומנים 4, הרכבה ציר mitotic בXenopus לחלץ 5, ואת הדינמיקה המרחבית של מנגנונים חלוקת תא חיידק 6. דרך אחת כדי להשלים את הגישה של הרדוקציוניסטית לנתח את התהליכים המולקולריים של מערכות חיות היא לקחת את הגישה ההפוכה של בנייה מחדש של התנהגויות הסלולר באמצעות מספר מינימלי של מרכיבים ביולוגיים. חלק קריטי של גישה זו כרוך אנקפסולציה אמינה של ביומולקולות בנפח מוגבל, תכונה מרכזית של תא.

e_content "> מספר אסטרטגיות קיימות לencapsulating ביומולקולות ללימוד מערכות biomimetic. הרלוונטי ביותר מבחינה הביולוגית המערכת היא קרומי bilayer שומנים, המחקים את האילוצים ביוכימי ופיזיים שהוטלו על ידי קרום הפלזמה של התא. היווצרות שלפוחיות ענקית unilamellar (GUVs) על ידי electroformation 7, אחת הטכניקות הנפוצה ביותר לייצור בוס 14, בדרך כלל יש תשואת אנקפסולציה עניים בשל חוסר התאימות שלה עם חיץ מלח גבוה 8. Electroformation גם דורש כמויות מדגם גדולות (> 100 μl), שעלולה להיות בעיה לעבודה עם חלבונים מטוהרים , ולא יעיל משלב מולקולות גדולות בשל קושי של דיפוזיה בין שכבות שומנים צפופות. מספר גישות microfluidic ליצירת שלפוחית ​​שומנים פותחו. שיטות התחליב כפולות, שעוברים רכיבים באמצעות שני ממשקים בין שכבות מים שמן ומים (W / O / W), מסתמך על האידוי של volatile ממס לנהוג היווצרות bilayer שומנים 9. אחרים השתמשו בקו ההרכבה microfluidic שמייצר זרם רציף של שלפוחית ​​השומנים bilayer 10 או בשני שלבים עצמאיים 11. פיתחנו טכניקה חלופית המבוססת על מהירות החלת פולסים נוזל נגד bilayer ממשק אגל 12 לייצר GUVs של גודל מבוקר, קומפוזיציה, ואנקפסולציה. הגישה שלנו, המכונה jetting microfluidic, מציעה את היתרונות בשילוב בין כמה טכניקות דור שלפוחית ​​קיימות, מתן גישה ליצירת מערכות biomolecular פונקציונליות לחקירת מגוון רחב של בעיות ביולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ייצור אינפיניטי הקאמרי

  1. לעצב את חדר האינסוף (על שם צורתו) באמצעות מחשב עיצוב בסיוע (CAD) תוכנה, ולשמור את הקובץ כך שהוא תואם עם חותך לייזר. כדי ליצור את הצורה הזו, שני מעגלים נפרדים של קוטר 0.183 במרחק של 0.15 פנימה מרכז למרכז חותכים את התא מ1/8- 3/16 באקריליק ברור עם חותך הלייזר. צורת האינסוף מאפשרת היווצרות טיפת ממשק bilayer ויציבות.
  2. מקדחה 1/16 בחור בקצה של חדר אקריליק גם בצורת אינסוף. חזור על פעולה בצד השני. לחתוך מלבן קטן מגיליון 0.2 מ"מ אקריליק עם מספריים או חותך לייזר לשמש כתחתית לבארות.
  3. למרוח שכבה דקה אך מלאה של דבק מהיר ייבוש לצד אחד של אקריליק 0.2 מ"מ ולהדביק אותו לחלק התחתון של החדר. החזק אקריליק 0.2 מ"מ בחוזקה במקום נגד התחתון של החדר ולוותרהדבק בממשק כדי לאפשר את הדבק ליצור חותם, אך להימנע מכסה את אזור התצוגה. הקפד ליישר אקריליק, כך שהקצה שלה הוא מיושר עם הקצה של קיר החדר והוא מכסה את נתק קאמרי אינסוף לחלוטין. זה יאפשר לחדירת מטוס מספיקה ולמנוע דליפה של הבאר.
  4. חותך שתי חתיכות קטנות של גומי טבעי כדי לכסות את החורים שנקדחו. החל דבק מהיר ייבוש סביב החור. הנח את הגומי מעל החור והעיתונות בכל התחומים עם זוג מלקחיים כדי לאבטח. חזור על פעולה עבור שני חורים שנקדחו. הקפד שכל חיבורים מודבקים הם חותמות מלאים כדי למנוע כל דליפה.
  5. באמצעות G 23, 1 במחט, לתקוע חור בגומי הטבעי בשני הצדדים של החדר כדי להקל על כניסה של קצה דיו פיזואלקטריים.

2. ניסיוני הכנה

פתרון שומנים מניית חנות בכלורופורם ב-20 ° C במקפיא. במחקר זה, או 1,2-diphytanoי.ל.-SN-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) או 1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (dOPC) היה בשימוש. 2 מיליליטר של 25 מ"ג פתרון שומנים מיליליטר / מוכן בדרך כלל בפרוטוקול זה ויימשך במשך חודשים כאשר מאוחסן ב -20 ° C.

  1. כדי resuspend השומנים בn-decane, להעביר ראשון אותו מבקבוקון המניה לצנצנת זכוכית קטנה, ועדינות יבשה תחת ארגון או חנקן. להחזיק את הצנצנת בזווית תוך ייבוש לחשוף יותר שטח פנים לגז, המאפשר לשומנים בדם לייבוש מהירים יותר.
  2. עם הכובע של הצנצנת הדפוקה רק מעט על, לאפשר הפתרון המיובש לשבת תחת ואקום בתא ייבוש ל1-2 שעות. לאחר מכן להוסיף n-decane לresolubilize השומנים ב25 מ"ג / מיליליטר. ורטקס בקצרה פתרון השומנים בדם וsonicate זה בsonicator אמבטיה במשך 15 דקות. אחסן את השומנים מחדש בn-decane ב -20 ° C.
  3. הכן פתרון סוכרוז המניות. בצינור microcentrifuge 1.5-מיליליטר, להוסיף 900 ​​μl של 300 סוכרוז מ"מ ו100 μlשל methylcellulose 1% (MC). Methylcellulose מתווסף להגדלת צמיגות של הפתרון, אשר מסייע בjetting. שלב אופציונאלי: הוסף 1 μl אופציונלי של צבע אוכל בצבע כהה או חרוזי ניאון להלוות יותר ניגוד או הקרינה בתחום הדמיה, בהתאמה. פתרון זה הוא פתרון 300 סוכרוז mOsm נועד להתאים osmolarity הסלולרי ולספק ניגוד במהלך microjetting.
  4. צייר את הפתרון לתוך מזרק פלסטיק 1 מיליליטר חד פעמי. בעוד מחזיק את המזרק עם הקצה כלפי מעלה, קפיצי המוט שוב ​​ושוב לגרש את כל בועות לכיוון הקצה, ולדחוף את הבוכנה כדי להוציא את האוויר שנלכד. הקפד לפנות את כל האוויר מהמזרק לפני שימשיך, כפי שהוא יפריע להתכווצות פיזואלקטריים נכונה אחראית לjetting.
  5. להתקין מסנן 0.22 מיקרומטר בסופו של המזרק. כדי למנוע מאוויר שנלכד במסנן, החזק את המזרק אנכי ולדחוף את הבוכנה עד טיפה נוצר מעל לקצה. הערה:יחידת מסנן מזרק בקוטר מ"מ 33 נמצאה עבודה הטובה ביותר, אבל מסננים חלופיים קטן כמו מסנן מזרק בקוטר 3 מ"מ יכולים לשמש כדי להפחית את הנפח מת.
  6. פתח את הברגת מתאם Luer הנשי של הזרקת הדיו, ובאופן מאובטח לחץ אותו במקום מעל הסוף של המסנן. שוב, להוציא את הנוזלים כדי למנוע לכידת אוויר. בורג בחלק העליון של הזרקת הדיו. נוזל צריך לנסוע לקצה לאחר הזרקת הדיו הוא מחובר לגמרי.

3. מכין את הציוד

  1. באמצעות v-מהדק, הר ההרכבה המזרק על הבמה מיקרוסקופ. צרף את החוט מהדיו אל הבקר הזרקת הדיו. הערה: שלב מותאם אישית נבנה עבור פרוטוקול זה, ואילו העיצוב במה יכול להיקבע על ידי המשתמש, זה הוא קריטי כדי לקבל שליטת XYZ עצמאית של המזרק ובקרת XY של בעל המדגם.
  2. לקבוע את ההגדלה ושילוב עדשה דרושה כדי להשיג את ההדמיה הרצויה. כאן מטרת 10X ועינית 10X משמשים. השתמש במצלמה במהירות גבוהה (≥ 1,000 תמונות בשנייה) כדי להמחיש את jetting ודור שלפוחית. לפני ההדמיה, לבצע כיול מצלמה הכרחי. לנצל מבוסס תמונה אוטומטית הדק בתוך תוכנת המצלמה ליזום לכידת תמונה.
  3. הר קאמרי אינסוף לבמה מיקרוסקופ. אבטח את התא על ידי הדבקתו למקומו על הבמה.
  4. בזהירות ליישר את קצה הזרקת הדיו עם החור המנוקב בגומי הטבעי (ראה איור 1b). כדי לעשות זאת, להביא את דיו הקרוב לחדר ולהתאים את המיקום לפי העין, ולאחר מכן לבצע התאמות מדויקות יותר דרך עדשת המיקרוסקופ. להמשיך בזהירות, כתנועות גסות עלולות לגרום נזק לקצה הזרקת הדיו.
  5. ברגע שהדיו מיושר, לגבות את מכלול המזרק מהחדר על מנת למנוע כל נזק להזרקת דיו במהלך הטעינה של הבארות. הקפד שתנועה של הזרקת הדיו היא חד כיווני, כך שהוא נשאר בקו אחד עם החור בקרום.
  6. לחץ בעדינות על plunגר של ההרכבה המזרק עד לקבלת טיפה קטנה בנחיר הזרקת הדיו. זה יספק כמה backpressure ראשוני.
  7. קלט הפרמטרים jetting. לגל דו קוטבי טרפז, השתמש בפרמטרים הבאים: תדירות 20 קילוהרץ דופק, 3 זמן μsec עלייה, 35 משך μsec דופק, 3 זמן μsec סתיו, 65 V מתח להחיל (משרעת דופק), ו100 פולסים סילון להדק (מספר דופק) . עם זאת, המתח להחיל (משרעת דופק) ומספר דופק (פולסים סילון להדק) יכולים להיות מגוון כדי לשלוט בגודל שלפוחית.

4. שלפוחית ​​דור

  1. הוספת 25-30 פתרון השומנים μl המושעה בn-decane לתא האינסוף, המכסה את פני השטח המלא של שני הבארות.
  2. הוסף 25 גלוקוז μl (של אותו osmolarity כפתרון סוכרוז) עד לקצה החיצוני של אחד טוב, pipetting באיטיות ובצורה חלקה. על התצהיר, ירידה של גלוקוז צריכה טופס, כי רמת הסוכר ושומנים בדם פתרון לא מתערבבות. הוסף 25 אחר1; ליטר של גלוקוז ולהפך, מה שיגרום עוד טיפה ויוצר את קרום bilayer שומנים באמצע החדר בתוך 5-10 דקות.
  3. הכנס את דיו דרך הגומי הטבעי, ולהדריך אותו בזהירות לכיוון bilayer ממשק טיפה. גישת bilayer לאט, כמו הזרקת הדיו הציג את מקומו של נפח ויכול להיקרע bilayer.
  4. כאשר דיו הוא בתוך ~ 200 מיקרומטר, להחיל jetting עם ההגדרות מתוארות בשלב 3.8. המרחק מ bilayer עשוי להשתנות בעיקר בהתאם למספר המתח ודופק, בין פרמטרים נוספים. פרוטוקול זה ממליץ להגדיל לאט הגדרות (מתח ומספר דופק) והתבוננות עיוות bilayer.

5. ניקוי הציוד

  1. לנתק את ההרכבה המזרק מבמת מיקרוסקופ, ולהשליך את מזרק פלסטיק 1 מיליליטר ומסנן.
  2. כדי לנקות את הזרקת הדיו, לשאוב את הפתרונות הבאים לפי סדר על ידי טבילת הקצה בsolution 7-10x כל: אתנול 70%, 2% פתרון Neutrad במים חמים, 70% אתנול, וDDH 2 O. אם דיו אינו מתאים באופן מאובטח על פיפטה השאיפה, לחתוך קצה פיפטה כדי ליצור מתאם.
  3. ייבש את החדר עם רקמה. מניחים את חדר האינסוף בכוס 250 מיליליטר עם 2% Neutrad V / V במים חמים, וsonicate ל5-10 דק '. לאחר sonication, להתייבש היטב הבארות תחת אוויר דחוס. כל לחות בבארות יכולה לסכן את היציבות של קרום bilayer השומנים בדם, ולכן מומלצת גם כי התאים ממוקמים בתנור ב 60 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

יש לנו התאספנו התקנת jetting microfluidic על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך קונבנציונלי עם במה מותאמת אישית מורכבת מחלקים במכונה ומיקרומטרים ידניים (איור 1). אפיון של דיו מספק תובנה על תהליך יצירת שלפוחית. משתנה המרחק בין נחיר דיו וbilayer שומנים משפיע על הכוח ליישם כדי לגרום לעיוות של הממברנה. בקרבת מקום לbilayer מתמקד זרם הסילון ומונע את הקרום מפיזור אנרגיה הרחק מהנקודה של דור שלפוחית. עליות נסיעות המערבולת עם המתח להחיל מפעיל פיזואלקטריים, עולה בקנה אחד עם הציפיות שלנו (איור 2). היווצרות שלפוחיות ונציג נשפו שלפוחית ​​מוצגות באיור 3. איור 3 א מציג תמונה ברצף נציג להיווצרות שלפוחית ​​ידי microjetting. בעקבות היווצרות, יציבות שלפוחית ​​נוטה להשתנות עם diamete שלפוחיתr, שבו שלפוחית ​​קטנה יותר היו יציבה יותר.

איור 1
איור 1. איור של הטכניקה והציוד. (א) סכמטי של תהליך jetting מונע פיזואלקטריים נגד bilayer ממשק טיפה. פולסים מרובים נדחפו החוצה ברצף מהיר ליצור מבנה טבעת מערבולת שמעוות את bilayer לייצר GUVs. תיאור ימני תחתון מציג את המיקום של בתצהיר גלוקוז וממד של הבאר. ברגע שפתרון שומנים בדם כבר הוסיף לתא האינסוף, 25 גלוקוז μl מתווסף לקצוות החיצוניים של הבאר, הראשון בבית (1), ולאחר מכן בבית (2). (ב) האסיפה רכוב המזרק, הפלטפורמה מחזיקה מותאם אישית, ותא אינסוף. התא מאובטח במקום, ואת הקצה של דיו מיושר עם חול דואר בגומי הטבעי בצד של הבאר. (ג) אסיפת מיקרוסקופ והבמה מותאמת אישית המלאה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. אפיון של הזרקת דיו. (א) פולסים הזרקת דיו מהירים ב20 קילוהרץ (50 פעימות ב 55 V משרעת דופק) חפיפה כדי ליצור טבעת מערבולת אחת. (ב) עקירה מול הסילון נוזלי כפונקציה של זמן על הטווח משרעת דופק (40-65 V) למספר דופק הקבוע (200 קטניות). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

תמיד "> איור 3
איור 3. שלפוחיות בדור. תמונות של תהליך יצירת שלפוחית ​​וכמה שלפוחיות המיוצרות. (א) דפורמציה של bilayer ממשק אגל (DPhPC) המיוצר על ידי פולסים מהירים של פתרון לגרום הקרום לצבוט וליצור בוס. (ב) שלפוחית ​​רבות נוצרה באמצעות jetting microfluidic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טכניקות רבות פותחו עבור דור שלפוחית, כולל electroformation, תחליב, ודור אגל 14-16. עם זאת, ניסיוני בטכניקות חדשות נחוצות כדי לאפשר את העיצוב של מערכות ביולוגיות עם דמיון הולך וגדל למערכות חיות. שיטות microfluidic בפרט הציעו רמה מוגברת של שליטת שלטון unilamellarity קרום, monodispersity של גודל, ותוכן פנימי 17,18, להביא דגמי שלפוחית ​​קרובה יותר לביולוגיה. יתר על כן, אפיון וניסויים באמצעות jetting microfluidic הראו שילוב יעיל של חלבונים בממברנה בכיוון, חוסר סימטריה בממברנה, ואנקפסולציה 3,13.

טכניקה זו היא פשוטה, אבל כוללת כמה שלבים שבם בזהירות יש לנקוט. שני גיליונות אקריליק וגומי טבעי חייבים ליצור חותמות להשלים עם תא האינסוף במהלך ייצור. אחרת, את הבארות בצורת האינסוף ידלפו וrיציבות bilayer ISK. במהלך הכנת ניסוי, החוקר חייב להיות בטוח לפינוי ההרכבה מזרק אוויר לחלוטין, בתחילה ולאחר חיבור כל רכיב. בועות בתוך מכלול זה יוצר נפח דחיסה בתוך המטוס ולהקטין או לשלול את ההשפעה המתפרצת של מפעיל פיזואלקטריים. אמנם מכין את הציוד, הדאגה העיקרית היא פגיעה בנחיר דיו השביר. לבסוף, בתצהיר של גלוקוז דורש את רוב תשומת הלב בשלבים הקודמים דור שלפוחית, כמו זה קובע את bilayer השומנים לjetting שלאחר מכן.

דור שלפוחית ​​ידי jetting microfluidic הוא אמין לשחזור, עם זאת, פערים בין מדפסות הזרקה דיו דורשים קצת היכרות וparameterization. מניסיוננו, כניסתה של נחיר דיו לתוך תא האינסוף לפני jetting עשויה לתפוס עד כמה מיקרוליטר של גלוקוז בהתאם לממדי הנחיר, ייצור עיקול קל בbilayer מןהזרקת הדיו. באופן לא פרופורציונלי על ידי פיזור פתרון גלוקוז כאשר במקור הקמת bilayer, השפעה זו ניתן לקזז וbilayer מישוריים יגרום. זה לא רק משפר את יציבות bilayer אלא גם מאפשר שליטה טובה יותר על היווצרות שלפוחית. קוטר פתח 20 מיקרומטר של הזרקת הדיו היה בשימוש כדי להשיג תוצאות שמוצגים במאמר זה. קוטר פתח של 10-20 מיקרומטר מומלץ. מזעור של תנודות מומלצים גם; מגזרות גומי פשוטות שימשו לתמיכה בשולחן מיקרוסקופ ולצנן את התנודות במעבדה.

למרות שפרוטוקול זה הוא ישים לשומנים רבים, DPhPC נבחר לכימיה המסוימת שלה ויציבות bilayer גבוהה. שומנים עיקריים אחרים שנבדקו היו 1,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (DPPC) ו1,2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (dOPC). יחסית, היה לי DPhPC נטייה חזקה יותר ליצירת bilayer ממשק טיפה עקבית ולייצר שלפוחית ​​unilamellar. על ראשוניהיווצרות, bilayer בפרוטוקול זה היה עובי נראית לעין בשל ממשק nonplanar ושילוב של שמן. הצורה של הטיפות מימיות יצרה bilayer מעוקל, וזה הופיע כעובי בתחום מסוים של תצוגה. DPhPC אפשר קשר האזור הראשוני בממשק שבין שתי הטיפות להרחבה, נהיגה נפט מbilayer. בשל התהליך החיובי האנרגטי הזה, יותר ויותר של קשר האזור בין שתי הטיפות הפכו bilayer, והעובי נצפים ירידה לאורך זמן. גידול זה של אזור bilayer נבדק תחת השתנות של האורך של bilayer; עיצוב התא הראשוני הותאם מעט (עיצוב הדור השני היה מורכב משני עיגולים בקוטר 0.15 במופרדים על ידי מרחק מרכז אל מרכז 0.13 ב) למחייב כמויות קטנות יותר והביא ממשק bilayer קטן יותר. גם העיצוב החדש וראשוני אפשר לדור שלפוחית ​​מדויק, עדיין לא הראה עיצוב dominיתרון נמלה בדילול bilayer. אופטימיזציה נבדקה נוסף הייתה backpressure מבוקר מחשב פנה להזרקת דיו פיזואלקטריים. אמנם זה נתן שליטה כמותית יותר על קצב הזרימה תוך jetting, זה לא היה בשימוש לאורך מרבית הניסויים.

שיטה זו מציעה את היתרונות בשילוב של מספר טכניקות קיימות. יכול להיות שנוצר GUVs מרובה בתדירות גבוהה (~ הרץ 200) בשל הריכוז הגבוה של מולקולות שומנים בדם, אם כי דור שלפוחית ​​מהיר לא היה המוקד של עבודה זו. מאז מטוסים בטכניקה זו נגד bilayer שומנים יחיד, unilamellarity הקרום צפוי וכבר נצפה. בנוסף, מגוון רחב של פתרונות יכול להיות במארז עצמאי של נכסי מומס ספציפיים, כגון משקל או תשלום מולקולרי, ובכך לאפשר יותר יישומים פוטנציאליים 17. כמו כן, בשל הגודל של שלפוחית ​​שנוצרה (טווח אפשרי של> 10 מיקרומטר <400 מיקרומטר), תצפית על ידי מיקרו הקונבנציונליטכניקות scopy היא 13 הולמים.

jetting microfluidic ניתן ליישם במגוון רחב של בעיות ביולוגיות. דוגמא ספציפית אחת היא ביומכניקה הסלולרית; deformability של GUVs הופך אותם לכלי אידיאלי ללמוד את ההרכבה דור כוח ועצמי של רשתות אקטין במארז שהראתה השפעות מעניינות כאשר התאספו על פני השטח של בוס 4,19. יישומים נוספים כוללים מערכות אספקת סמים, bioreactors תא בגודל, ומערכות מודולריות לביולוגיה סינתטית, ביופיסיקה, ומגוון רחב של תחומים אחרים במדע בסיסי, תעשייה ורפואה שבו ביומולקולות הממודרת הן רצויה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

אנו מודים למייק Vahey ממעבדת פלטשר באוניברסיטת קליפורניה, ברקלי לקבלת ייעוץ על הפרמטרים microjetting. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענק DP2 HL117748-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Piezoelectric Inkjet MicroFab Technologies MJ-AL-01-xxx xxx denotes orifice diameter in microns
Jet Drive III Controller MicroFab Technologies CT-M3-02
High-speed camera Vision Research MiroEX2
DPhPC lipid in chloroform Avanti 850356C Ordered in small aliquots in vials
33 mm PVDF filters, 0.2 µm Fisher Scientific SLGV033RS
1 ml Syringes Fisher Scientific 14823434
n-Decane Acros Organics 111871000
Glucose Acros Organics 410950010
Sucrose Sigma-Aldrich S7903-1KG
Methylcellulose Fisher Scientific NC9084958
1/8 in Acrylic McMaster Carr 8560K239 CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request
0.2 mm Acrylic Astra Products Clarex clear 001
Acrylic Cement TAP Plastics 10693
Loctite 495 Superglue Fisher Scientific NC9011323
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive Strobels Supply 30765
Natural rubber McMaster Carr 85995K14
Custom stage homemade N/A CAD designs are available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
  2. Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
  3. Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
  4. Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
  5. Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
  6. Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
  7. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
  8. Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
  9. Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
  10. Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
  11. Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
  12. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
  13. Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
  14. Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
  15. Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
  16. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
  17. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
  18. Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
  19. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).
השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).More

Coyne, C. W., Patel, K., Heureaux, J., Stachowiak, J., Fletcher, D. A., Liu, A. P. Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting. J. Vis. Exp. (84), e51510, doi:10.3791/51510 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter