Summary
Getto microfluidica contro un doppio strato lipidico interfaccia gocciolina fornisce un modo affidabile per generare vescicole con controllo sulla asimmetria membrana, incorporazione di proteine transmembrana, e incapsulamento del materiale. Questa tecnica può essere applicata a studiare una varietà di sistemi biologici in cui sono determinanti biomolecole compartimenti.
Abstract
Bottom-up biologia sintetica presenta un nuovo approccio per lo studio e la ricostituzione di sistemi biochimici e, potenzialmente, organismi minime. Questo settore emergente coinvolge ingegneri, chimici, biologi e fisici per progettare e assemblare componenti biologiche di base nei complessi sistemi funzionanti dal basso verso l'alto. Tali sistemi bottom-up potrebbe portare allo sviluppo di cellule artificiali per le indagini biologiche fondamentali e terapie innovative 1,2. Vescicole unilamellari giganti (GUVs) possono fungere da piattaforma modello per la biologia sintetica a causa della loro struttura della membrana cellulare-like e dimensioni. Getto microfluidica, o microjetting, è una tecnica che consente la generazione di GUVs di dimensione controllata, la composizione della membrana, proteine transmembrana incorporazione, e l'incapsulamento 3. Il principio di base di questo metodo è l'uso di impulsi multipli, fluidi ad alta frequenza generati da un dispositivo a getto d'inchiostro piezo-azionato per deformare un l sospesabistrato IPID in un GUV. Il processo è simile a soffiando bolle di sapone da una pellicola di sapone. Variando la composizione della soluzione idromassaggio, la composizione della soluzione comprende, e / o le componenti inclusi nel doppio strato, i ricercatori possono applicare questa tecnica per creare vescicole personalizzate. Questo documento descrive la procedura per generare vescicole semplici da un bistrato un'interfaccia gocciolina da microjetting.
Introduction
E 'diventato sempre più chiaro che la biologia delle cellule è un problema multi-scala che coinvolge integrando la nostra comprensione dalle molecole alle cellule. Di conseguenza, sapere esattamente come le molecole lavorano individualmente non è sufficiente per capire i comportamenti cellulari complesse. Ciò è in parte dovuto all'esistenza di comportamenti emergenti dei sistemi a più componenti, come esemplificato dalla ricostituzione di interazione rete actina con vescicole doppio strato lipidico 4, del fuso mitotico in Xenopus estrarre 5, e le dinamiche spaziali della batteriche macchinari divisione cellulare 6. Un modo per integrare l'approccio riduzionista della dissezione dei processi molecolari dei sistemi viventi è quello di prendere l'approccio opposto di ricostituire comportamenti cellulari utilizzando un set minimo di componenti biologiche. Una parte importante di questo approccio comporta l'incapsulamento affidabile di biomolecole in un volume confinato, una caratteristica fondamentale di una cella.
e_content "> Esistono diverse strategie per incapsulare biomolecole per studiare sistemi biomimetici. Il sistema più biologicamente rilevante è membrane bistrato lipidico, che imitano i vincoli fisici e biochimici imposti dalla membrana plasmatica della cellula. Formazione di vescicole unilamellari giganti (GUVs) da electroformation 7, una delle tecniche più utilizzate per la generazione GUV 14, tipicamente ha una resa di incapsulamento povero a causa della sua incompatibilità con tampone di sali 8. Electroformation richiede anche grandi volumi di campione (> 100 ml), che potrebbe essere un problema per lavorare con proteine purificate , e incorpora inefficiente grandi molecole causa di difficoltà di diffusione tra strati lipidici ravvicinati. Sono stati sviluppati diversi approcci per la generazione microfluidici vescicole lipidiche. I metodi a doppio emulsione, che passano attraverso due componenti interfacce tra strati acqua-olio-acqua (W / O / W), si basa sul evaporazione di un volatile solvente per guidare la formazione di doppio strato lipidico 9. Altri hanno usato una linea di assemblaggio microfluidica che produce un flusso continuo di lipidi vescicole a doppio strato 10 o in due fasi indipendenti 11. Abbiamo sviluppato una tecnica alternativa basata su rapidamente applicare impulsi di fluido contro un bistrato un'interfaccia gocciolina 12 per produrre GUVs di dimensione controllata, composizione e incapsulamento. Il nostro approccio, noto come getto microfluidica, offre i vantaggi combinati di diverse tecniche di generazione vescicola esistenti, fornendo un metodo per la creazione di sistemi biomolecolari funzionali per investigare una varietà di problemi biologici.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Infinity Camera Fabrication
- Progettare la camera infinito (chiamato per la sua forma), utilizzando un software di progettazione assistita (CAD), e salvare il file in modo che sia compatibile con un cutter laser. Per creare questa forma, distinte due cerchi del diametro di 0.183 in una distanza da centro a centro di 0.15 dentro Tagliare la camera da 1/8- 3/16 in acrilico trasparente con il taglio laser. La forma dell'infinito facilita interfaccia gocciolina formazione doppio strato e stabilità.
- Praticare un 1/16 nel foro attraverso il bordo della camera acrilico al pozzo a forma di sfioro. Ripetere sul lato opposto. Tagliare un piccolo rettangolo da una lastra acrilica 0,2 millimetri con le forbici o un cutter laser per servire come fondo ai pozzetti.
- Applicare uno strato sottile di adesivo ma completa asciugatura rapida ad un lato della acrilico 0,2 mm di colla al fondo della camera. Tenere il acrilica 0,2 millimetri saldamente in posizione contro il fondo della camera ed erogarela colla all'interfaccia per consentire la colla per creare una tenuta ma evitare che copre l'area di visualizzazione. Assicurarsi di allineare l'acrilico in modo che il suo bordo è a filo con il bordo della parete della camera e copre completamente il ritaglio camera di sfioro. Ciò consentirà sufficiente penetrazione del getto e di evitare perdite del pozzo.
- Tagliate due piccoli pezzi di gomma naturale per coprire i fori. Applicare l'adesivo ad asciugatura rapida attorno al foro. Posizionare la gomma sopra il foro e premere su tutte le aree con un paio di pinze per fissare. Ripetere l'operazione per entrambi i fori. Assicurarsi che tutte le connessioni incollati guarnizioni complete in modo da evitare eventuali perdite.
- Utilizzando un 23 G, 1 in ago, fare un buco nella gomma naturale su entrambi i lati della camera di facilitare l'inserimento della punta a getto d'inchiostro piezoelettrica.
2. Preparazione Sperimentale
Conservare la soluzione magazzino lipidi in cloroformio in un -20 ° C freezer. Per questo studio, o 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (DPhPC) o 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (DOPC) è stato utilizzato. 2 ml di 25 mg / ml soluzione lipidica è tipicamente preparato in questo protocollo e durerà per due mesi se conservato a -20 ° C.
- Per risospendere il lipide n-decano, prima trasferirlo da uno stock flacone in un piccolo barattolo di vetro, e asciugare delicatamente sotto argon o azoto. Tenere il vaso in un angolo durante l'asciugatura per esporre più area al gas, permettendo il lipide asciugare più velocemente.
- Con il tappo del vaso solo leggermente avvitato, lasciare che la soluzione essiccata per sedersi sotto vuoto in essiccatore per 1-2 ore. Poi aggiungere n-decano a resolubilize lipide a 25 mg / ml. Vortex la soluzione brevemente lipidico e sonicare in un bagno sonicatore per 15 min. Conservare il lipide ricostituita in n-decano a -20 ° C.
- Preparare una soluzione madre di saccarosio. In una provetta da 1,5 ml, aggiungere 900 ml di saccarosio mm 300 e 100 ml1% di metilcellulosa (MC). Viene aggiunta metilcellulosa per aumentare la viscosità della soluzione, che aiuta a getto. Passaggio facoltativo: Aggiungi un optional 1 ml di colore scuro colorante alimentare o perline fluorescenti per dare più contrasto o fluorescenza per immagini, rispettivamente. Questa soluzione è una soluzione di 300 mOsm saccarosio progettato per abbinare osmolarità cellulare e per fornire contrasto durante microjetting.
- Aspirare la soluzione in una siringa monouso di plastica 1 ml. Tenendo la siringa con la punta rivolta verso l'alto, sfogliare l'albero ripetutamente per espellere eventuali bolle verso la punta, e spingere lo stantuffo per espellere l'aria intrappolata. Assicurati di evacuare tutta l'aria dalla siringa prima di procedere, in quanto essa possa interferire con la corretta contrazione piezoelettrico responsabile di getto.
- Installare un filtro da 0,22 micron sull'estremità della siringa. Per evitare che l'aria venga intrappolata nel filtro, tenere la siringa verticale e spingere lo stantuffo finché si forma una gocciolina sopra la punta. Nota: A33 millimetri di diametro unità filtro a siringa ha operato meglio, ma filtri alternativi piccolo come un filtro a siringa da 3 mm di diametro può essere utilizzato per ridurre il volume morto.
- Svitare l'adattatore Luer femmina del getto di inchiostro, e premere saldamente in posizione sopra l'estremità del filtro. Anche in questo caso, espellere il fluido per evitare di intrappolare aria. Avvitare la parte superiore del getto di inchiostro. Fluido deve recarsi presso la punta del getto di inchiostro dopo che è stato fissato completamente.
3. Preparazione dei componenti
- Utilizzando un v-clamp, montare il gruppo siringa sul palco microscopio. Collegare il filo dal getto d'inchiostro al controller a getto d'inchiostro. Nota: Una fase usanza è stata costruita per questo protocollo, mentre la scenografia può essere determinato dall'utente, è fondamentale avere il controllo xyz indipendente della siringa e del controllo xy del supporto del campione.
- Determinare l'ingrandimento e la combinazione obiettivo necessario per raggiungere la rappresentazione desiderata. Qui vengono utilizzati un obiettivo 10X e 10X oculare. Utilizzare una telecamera ad alta velocità (≥ 1.000 fps) per visualizzare il getto e la generazione di vescicole. Prima di imaging, effettuare la calibrazione fotocamera necessario. Utilizzare auto-trigger basato su immagini all'interno del software della fotocamera per avviare la cattura delle immagini.
- Montare la camera di sfioro sul palco microscopio. Fissare la camera con nastro adesivo in posizione sul palcoscenico.
- Allineare con cura la punta a getto d'inchiostro con il foro perforato in gomma naturale (cfr. figura 1b). A tale scopo, portare il getto d'inchiostro vicino alla camera e regolare il posizionamento a occhio, poi effettuare regolazioni più precise attraverso la lente microscopio. Procedere con cautela, in quanto i movimenti grossolani possono danneggiare la punta a getto d'inchiostro.
- Una volta che l'inchiostro è allineato, eseguire il montaggio siringa lontano dalla camera per evitare danni al getto di inchiostro durante il caricamento dei pozzetti. Assicurarsi che il moto del getto di inchiostro è unidirezionale in modo che rimanga allineato con il foro nella membrana.
- Premere delicatamente sulla plunger del gruppo siringa fino a piccole forme gocciolina presso l'ugello a getto d'inchiostro. Questo fornisce alcune contropressione iniziale.
- Inserire i parametri di getto. Per un'onda bipolare trapezoidale, utilizzare i seguenti parametri: frequenza di 20 kHz impulso, 3 tempo msec luogo, durata 35 msec impulso, 3 msec di tempo di caduta, 65 V di tensione applicata (ampiezza di impulso), e 100 impulsi al getto di innesco (numero di impulsi) . Tuttavia, la tensione applicata (ampiezza di impulso) e numero di impulsi (impulsi jet per scatto) possono essere variate per controllare le dimensioni delle vescicole.
4. Vesicle Generation
- Aggiungere 25-30 ml soluzione lipidica sospesa in n-decano alla camera all'infinito, che copre l'intera superficie di entrambi i pozzetti.
- Aggiungere 25 ml di glucosio (osmolarità della stessa come la soluzione di saccarosio) al bordo più esterno di un pozzo, pipettaggio lentamente ed uniformemente. Su deposizione, una goccia di glucosio dovrebbe costituire, perché la soluzione di glucosio e lipidi non si mescolano. Aggiungi un altro 251; l di glucosio al pozzo opposto, che farà un'altra goccia e formare la membrana a doppio strato lipidico nel centro della camera entro 5-10 min.
- Inserire l'inchiostro attraverso la gomma naturale, e guidare con attenzione verso il doppio strato di interfaccia gocciolina. Avvicinatevi al doppio strato lentamente, come il getto d'inchiostro introdotto sposti volume e può rompersi il doppio strato.
- Quando l'inchiostro è a ~ 200 micron, applicare il getto con le impostazioni descritte al punto 3.8. La distanza dal doppio strato può variare principalmente in funzione del numero di impulsi di tensione e, tra gli altri parametri. Questo protocollo raccomanda aumentando lentamente impostazioni (tensione e numero di impulsi) e osservando doppio strato deformazione.
5. Pulizia della Equipaggiamento
- Staccare il gruppo siringa dal palco microscopio, e smaltire la siringa in plastica da 1 ml e filtrare.
- Per pulire il getto di inchiostro, aspirare le seguenti soluzioni in ordine immergendo la punta della solution 7-10x ciascuno: il 70% di etanolo, 2% soluzione Neutrad in acqua calda, il 70% di etanolo, e DDH 2 O. Se il getto d'inchiostro non si adatta in modo sicuro sul pipetta di aspirazione, tagliare un puntale per formare un adattatore.
- Asciugare la camera con il tessuto. Posizionare la camera di infinito in un bicchiere da 250 ml con il 2% v / v Neutrad in acqua calda, e sonicare per 5-10 min. Dopo sonicazione, asciugare accuratamente i pozzetti sotto aria compressa. L'umidità nei pozzetti può compromettere la stabilità della membrana lipidica a due strati, per cui si raccomanda inoltre che le camere sono poste in un forno a 60 ° C per 15 min.
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Representative Results
Abbiamo messo insieme un setup getto microfluidica su un microscopio a fluorescenza convenzionale invertito con una fase personalizzata assemblato da parti lavorate e micrometri manuali (Figura 1). Caratterizzazione del getto di inchiostro permette di comprendere meglio il processo di generazione delle vescicole. Variando la distanza tra l'ugello a getto d'inchiostro e doppio strato lipidico colpisce la forza applicata per causare la deformazione della membrana. Vicinanza al doppio strato concentra la corrente a getto e impedisce la membrana di disperdere energia dal punto di generazione vescicola. Gli viaggio vortice aumenta con la tensione applicata all'attuatore piezoelettrico, coerenti con le nostre aspettative (Figura 2). Formazione di vescicole e rappresentante idromassaggio vescicole sono mostrati in Figura 3. Figura 3a mostra una sequenza rappresentante un'immagine per la formazione delle vescicole da microjetting. Dopo la formazione, la stabilità delle vescicole tende a variare con vescicole diameter, dove vescicole piccole erano più stabili.
Figura 1. Illustrazione della tecnica e attrezzature. (A) Schema del processo getto piezoelettrico guidato contro il doppio strato di interfaccia gocciolina. Impulsi multipli spinto fuori in rapida successione formano una struttura ad anello vortice che deforma il doppio strato per produrre GUVs. In basso a destra raffigurazione mostra la posizione di deposizione glucosio e la dimensione del pozzo. Una soluzione lipidica è stata aggiunta alla camera di sfioro, 25 microlitri glucosio viene aggiunto l'estremità della larghezza del pozzo, prima in (1), poi (2). (B) L'insieme montato siringa, piattaforma tenendo personalizzato, e la camera infinito. La camera è fissato in posizione, e la punta del getto di inchiostro sia allineato con il Hol e nella gomma naturale sul lato del bene. (C) Il montaggio completo microscopio e stage personalizzati. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Caratterizzazione del getto. (A) a getto d'inchiostro impulsi rapidi a 20 kHz (50 impulsi a 55 V ampiezza dell'impulso) si sovrappongono per formare un unico anello di vortice. (B) spostamento jet davanti liquido in funzione del tempo su impulso range di ampiezza (40-65 V) per il numero di impulsi fissa (200 impulsi). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Vesicle Generation. Immagini del processo di generazione vescicola e diverse vescicole prodotte. (A) Deformazione del doppio strato dell'interfaccia gocciolina (DPhPC) prodotto da rapidi impulsi di soluzione Causa membrana pizzicare fuori e formare una GUV. (B) Molti vescicole generate utilizzando getto microfluidica.
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Discussion
Sono state sviluppate molte tecniche per la generazione di vescicole, compresi electroformation, emulsione, e generazione gocciolina 14-16. Tuttavia, nuove tecniche sperimentali sono necessari per consentire la progettazione di sistemi biologici con crescente somiglianza ai sistemi viventi. Metodi di microfluidica, in particolare, hanno offerto un aumento del livello di controllo che regola unilamellarity membrana, monodispersity di dimensioni e contenuti interni 17,18, portando i modelli vescicole più vicino alla biologia. Inoltre, la caratterizzazione e la sperimentazione con getto microfluidica ha dimostrato efficace incorporazione di proteine di membrana orientate, membrana asimmetria, e l'incapsulamento 3,13.
Questa tecnica è semplice, ma include alcuni passaggi quali prestare attenzione. Sia il foglio acrilico e gomma naturale devono costituire sigilli completi con la camera a sfioro durante la fabbricazione. In caso contrario, i pozzi a forma di infinito coleranno e risk stabilità doppio strato. Durante la preparazione sperimentale, il ricercatore deve essere sicuro di evacuare tutto il gruppo siringa d'aria, inizialmente e dopo allegando ogni componente. Bubbles all'interno di questa assemblea creano un volume comprimibile nel getto e mitigare o negano l'effetto getto dell'attuatore piezoelettrico. Mentre preparando l'attrezzatura, la preoccupazione principale sta danneggiando l'ugello a getto d'inchiostro fragile. Infine, la deposizione del glucosio richiede più attenzione durante le fasi precedenti generazione vescicola, come questo stabilisce il doppio strato lipidico per il successivo getto.
Generazione Vesicle da getto microfluidica è affidabile e ripetibile, tuttavia, le discrepanze tra getto d'inchiostro richiedono una certa familiarità e la parametrizzazione. Nella nostra esperienza, l'introduzione dell'ugello a getto d'inchiostro nella camera di sfioro prima di getto può spostare fino a diversi microlitri di glucosio a seconda delle dimensioni dell'ugello, producendo una leggera curva nel doppio strato distantiil getto d'inchiostro. Con sproporzionatamente disperdere la soluzione di glucosio nello stabilire inizialmente il doppio strato, questo effetto può essere compensato e un bistrato planare risulterà. Questo non solo migliora la stabilità doppio strato, ma anche permette un migliore controllo la formazione di vescicole. Un orifizio 20 micron diametro del getto di inchiostro è stato usato per ottenere risultati mostrati in questo documento. Si raccomanda un diametro orifizio di 10-20 micron. Si raccomanda inoltre la minimizzazione delle vibrazioni; semplici ritagli di gomma sono stati usati per sostenere il tavolo microscopio e smorzare le vibrazioni di laboratorio.
Sebbene questo protocollo è applicabile a molti lipidi, DPhPC è stato scelto per la sua particolare chimica e alta stabilità bistrato. Altri lipidi primari provati erano 1,2-dipalmitoil-sn-glycero-3-fosfocolina (DPPC) e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocolina (DOPC). Comparativamente, DPhPC aveva una forte tendenza a formare una gocciolina un'interfaccia coerente doppio strato e di produrre vescicole unilamellari. Su inizialeformazione, il doppio strato in questo protocollo aveva uno spessore apparente causa di un'interfaccia planare e l'incorporazione di olio. La forma delle goccioline acquose formato un doppio strato curvo, e questo è apparso come uno spessore in un determinato campo di vista. DPhPC permesso la zona di contatto iniziale sull'interfaccia tra i due goccioline di espandersi, olio allontanare dal bistrato. A causa di questo processo energeticamente favorevole, più della zona di contatto tra le due goccioline diventato un doppio strato, e lo spessore osservabile diminuiscono nel tempo. Questa crescita della regione bistrato è stato provato nell'ambito variabilità della lunghezza del doppio strato, il progetto iniziale camera era leggermente regolato (il disegno seconda generazione consisteva di due cerchi di diametro 0,15 in separati da una distanza da centro a centro di 0,13 in) a richiedere i volumi più piccoli e portato in un doppio strato di interfaccia più piccolo. Sia il nuovo e disegno iniziale ha permesso per la generazione di vescicole accurate, ma né il design mostrato un Dominvantaggio formica in doppio strato di diradamento. Un'altra ottimizzazione provata era contropressione computer controllati applicata al getto d'inchiostro piezoelettrica. Mentre questo ha dato un controllo più quantitativa sulla portata mentre getto, non è stato utilizzato in tutta la maggioranza di sperimentazione.
Questo metodo offre i vantaggi combinati di diverse tecniche esistenti. Diverse GUVs possono essere generati a frequenza elevata (~ 200 Hz) a causa dell'elevata concentrazione di molecole lipidiche, anche se rapida generazione vescicola non era al centro di questo lavoro. Dal momento che questa tecnica getti contro un singolo doppio strato lipidico, membrana unilamellarity è previsto ed è stata osservata. Inoltre, una vasta gamma di soluzioni può essere incapsulato indipendente da specifiche proprietà soluto quali peso molecolare o carica, consentendo applicazioni più potenziali 17. Inoltre, a causa delle dimensioni delle vescicole formate (una gamma possibile di> 10 micron a <400 micron), osservazione da micro convenzionaletecniche di scopia è adeguata 13.
Getto microfluidica può essere applicato ad una varietà di problemi biologici. Un esempio specifico è biomeccanica cellulari; la deformabilità di GUVs li rende uno strumento ideale per studiare il gruppo di generazione di forze e auto di reti di actina incapsulati che ha mostrato effetti interessanti quando montato sulla superficie di un GUV 4,19. Ulteriori applicazioni includono sistemi di drug delivery, bioreattori cell-size e sistemi modulari per la biologia sintetica, biofisica, e una varietà di altri campi della scienza di base, industria e medicina, dove sono desiderati biomolecole compartimenti.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Mike Vahey dal Fletcher Lab presso l'Università della California, Berkeley per consigli sui parametri microjetting. Questo lavoro è stato sponsorizzato dal NIH concedere DP2 HL117748-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
| Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
| High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
| DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
| 33 mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| 1 ml Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
| n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
| Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
| Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
| 1/8 in Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
| 0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
| Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
| Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
| Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
| Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
| Custom stage | homemade | N/A | CAD designs are available upon request |
References
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