Abstract
Bottom-up syntetisk biologi præsenterer en ny tilgang for at undersøge og rekonstituere biokemiske systemer og potentielt minimale organismer. Dette nye område engagerer ingeniører, kemikere, biologer og fysikere til at designe og samle grundlæggende biologiske komponenter i komplekse og velfungerende systemer fra bunden op. Sådanne bottom-up-systemer vil kunne føre til udvikling af kunstige celler til grundlæggende biologiske undersøgelser og innovative behandlinger 1,2. Giant unilamelvesikler (GUVs) kan tjene som en model platform for syntetisk biologi på grund af deres celle-lignende membran struktur og størrelse. Mikrofluid jetting eller microjetting, er en teknik, der giver mulighed for generering af GUVs med kontrolleret størrelse, membranens sammensætning, transmembrant protein inkorporering og indkapsling 3. Det grundlæggende princip i denne metode er brugen af flere, højfrekvente væske pulser genereret af en piezo-aktiverede inkjet-enhed til at deformere et ophængt lipid dobbeltlaget i en GUV. Processen er beslægtet med at blæse sæbebobler fra en sæbe film. Ved at variere sammensætningen af jetted opløsning sammensætningen af omfattende opløsning og / eller komponenter, der indgår i dobbeltlaget, kan forskerne anvende denne teknik til at oprette tilpassede vesiklerne. Dette papir beskriver den procedure, til at generere simple vesikler fra en dråbe grænseflade dobbeltlaget ved microjetting.
Introduction
Det er blevet mere og mere klart, at cellebiologi er en multi-skala problem, der involverer integration af vores forståelse fra molekyler til celler. Derfor vide præcis, hvordan molekyler arbejder individuelt, er ikke tilstrækkeligt til at forstå komplekse cellulære adfærd. Dette skyldes til dels eksistensen af emergente adfærd af multi-komponent systemer, som eksemplificeret ved rekonstituering af actin netværk interaktion med lipiddobbeltlagsvesikler 4, mitotiske spindel samling i Xenopus ekstrakt 5, og rumlige dynamik bakterielle celledeling machineries 6. En måde at supplere reduktionistiske tilgang af dissekere de molekylære processer i levende systemer er at tage den modsatte tilgang rekonstituering cellulære adfærd ved hjælp af et minimalt sæt af biologiske komponenter. En kritisk del af denne tilgang indebærer pålidelig indkapsling af biomolekyler i et begrænset volumen, et centralt element i en celle.
e_content "> Der findes flere strategier for at indkapsle biomolekyler til at studere biomimetiske systemer. Den mest biologisk relevant system er lipiddobbeltlagsmembraner, der efterligner de biokemiske og fysiske begrænsninger, som cellens plasmamembran. Dannelse af gigantiske unilamellare vesikler (GUVs) ved electroformation 7, en af de mest udbredte teknikker til GUV generation 14, har typisk en dårlig indkapsling udbytte på grund af dets uforenelighed med højsaltbuffer 8. electroformation kræver også store prøvevolumener (> 100 ul), som kunne være et problem for arbejdet med oprensede proteiner og ineffektivt inkorporerer store molekyler på grund af vanskeligheden ved diffusion mellem tætliggende lipidlag. Adskillige mikrofluide fremgangsmåder til generering af lipidvesikler er blevet udviklet. De dobbelte emulsions metoder, der passerer komponenter gennem to grænseflader mellem lag vand-olie-vand (W / O / W), afhængig af fordampning af en volatile opløsningsmiddel til at drive lipiddobbeltlag dannelse 9. Andre har brugt en mikrofluid samlebånd der producerer en kontinuerlig strøm af lipiddobbeltlagsvesikler 10 eller i to uafhængige trin 11. Vi har udviklet en alternativ teknik baseret på hurtigt at anvende væske pulser mod en dråbe-interface-dobbeltlag 12 til at producere GUVs af kontrolleret størrelse, sammensætning og indkapsling. Vores tilgang, der er kendt som microfluidic jetting tilbyder de kombinerede fordele fra flere eksisterende vesikel generation teknikker, som giver en metode til at skabe funktionelle biomolekylære systemer til at undersøge en række biologiske problemer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
33 mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
1 ml Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
1/8 in Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
Custom stage | homemade | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).