Summary
एक छोटी बूंद इंटरफ़ेस लिपिड bilayer के खिलाफ microfluidic jetting झिल्ली विषमता, transmembrane प्रोटीन का समावेश, और सामग्री के encapsulation पर नियंत्रण के साथ vesicles उत्पन्न करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है. इस तकनीक को बंटे biomolecules वांछित हैं जहां जैविक प्रणालियों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है.
Abstract
नीचे अप सिंथेटिक जीव विज्ञान संभावित जैव रासायनिक प्रणालियों और, कम से कम जीवों की जांच और पुनर्गठन के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. इस उभरते हुए क्षेत्र नीचे से जटिल कार्य कर प्रणाली में बुनियादी जैविक घटकों के डिजाइन और इकट्ठा करने के लिए इंजीनियर, दवा की दुकानों, जीव, और भौतिकविदों संलग्न है. इस तरह के नीचे अप सिस्टम मौलिक जैविक जांच और अभिनव चिकित्सा 1,2 के लिए कृत्रिम कोशिकाओं के विकास को ले जा सकता है. विशालकाय unilamellar पुटिका (GUVs) की वजह से उनके सेल की तरह झिल्ली संरचना और आकार को सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल के मंच के रूप में काम कर सकते हैं. Microfluidic jetting, या microjetting, नियंत्रित आकार, झिल्ली संरचना, transmembrane प्रोटीन समावेश, और encapsulation 3 के साथ GUVs की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है एक तकनीक है. इस विधि के बुनियादी सिद्धांत एक निलंबित एल ख़राब करने के लिए एक piezo actuated इंकजेट डिवाइस द्वारा उत्पन्न एकाधिक, उच्च आवृत्ति द्रव दालों का प्रयोग होता हैएक guv में ipid bilayer. प्रक्रिया एक साबुन फिल्म से साबुन के बुलबुले उड़ाने जैसा है. Jetted समाधान, को शामिल समाधान की रचना, और / या घटकों की रचना से अलग bilayer में शामिल, शोधकर्ताओं अनुकूलित पुटिका बनाने के लिए इस तकनीक को लागू कर सकते हैं. इस पत्र microjetting से एक छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer से सरल vesicles उत्पन्न करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन है.
Introduction
यह कोशिका जीव विज्ञान अणुओं से कोशिकाओं के लिए हमारी समझ को एकीकृत शामिल है कि एक बहु पैमाने पर समस्या यह है कि तेजी से स्पष्ट हो गया है. नतीजतन, अणुओं व्यक्तिगत काम ठीक कैसे जानते हुए भी जटिल सेलुलर व्यवहार को समझने के लिए पर्याप्त नहीं है. इस 5 निकालने Xenopus में लिपिड bilayer पुटिका 4, mitotic धुरा विधानसभा साथ actin नेटवर्क बातचीत के पुनर्गठन के उदाहरण के रूप में, आंशिक रूप से बहु घटक प्रणालियों के आकस्मिक व्यवहार के अस्तित्व के लिए है, और बैक्टीरिया कोशिका विभाजन मशीनरी 6 के स्थानिक गतिशीलता. जी प्रणालियों के आणविक प्रक्रियाओं विदारक के न्यूनकारी के दृष्टिकोण के पूरक के लिए एक तरह जैविक घटकों की एक न्यूनतम सेट का उपयोग सेलुलर व्यवहार पुनर्गठन के विपरीत दृष्टिकोण ले रहा है. इस दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण हिस्सा एक सीमित मात्रा में biomolecules के विश्वसनीय encapsulation, एक सेल की एक प्रमुख विशेषता शामिल है.
e_content "> कई रणनीतियों biomimetic प्रणालियों के अध्ययन के लिए biomolecules encapsulating के लिए मौजूद हैं. सबसे biologically प्रासंगिक प्रणाली सेल के प्लाज्मा झिल्ली द्वारा लगाए गए जैव रासायनिक और भौतिक बाधाओं की नकल है. electroformation 7 से विशाल unilamellar पुटिका (GUVs) के गठन के लिपिड bilayer झिल्ली, है, शुद्ध प्रोटीन के साथ काम करने के लिए एक समस्या हो सकती है, जो guv पीढ़ी 14 के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीकों में से एक, आम तौर पर उच्च नमक बफर 8 के साथ अपनी असंगति के कारण एक गरीब encapsulation उपज है. Electroformation भी बड़ा नमूना संस्करणों की आवश्यकता है (> 100 μl), , और निकम्मेपन से निकट दूरी लिपिड परतों के बीच प्रसार की कठिनाई की वजह से बड़े अणुओं को शामिल किया गया. लिपिड vesicles पैदा करने के लिए कई microfluidic दृष्टिकोण. w / ओ (परतों पानी तेल पानी के बीच दो इंटरफेस के माध्यम से घटकों पारित जो डबल पायस तरीकों, विकसित किया गया है / डब्ल्यू), एक Vo के वाष्पीकरण पर निर्भर करता हैलिपिड bilayer गठन 9 ड्राइव करने latile विलायक. दूसरों लिपिड bilayer पुटिका 10 या दो स्वतंत्र चरणों में 11 में से एक सतत प्रवाह है कि उत्पादन एक microfluidic विधानसभा लाइन का इस्तेमाल किया है. हम तेजी से नियंत्रित आकार, संरचना, और encapsulation के GUVs निर्माण करने के लिए एक छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer 12 के खिलाफ द्रव दालों को लागू करने पर आधारित एक वैकल्पिक तकनीक विकसित की है. Microfluidic jetting के रूप में जाना जाता है हमारा दृष्टिकोण, जैविक समस्याओं की एक किस्म की जांच के लिए कार्यात्मक biomolecular सिस्टम बनाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करने, कई मौजूदा पुटिका पीढ़ी की तकनीक से संयुक्त लाभ प्रदान करता है.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. इन्फिनिटी चैंबर निर्माण
- एक कंप्यूटर असिस्टेड डिजाइन (सीएडी) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर (अपने आकार के लिए नाम) अनंत कक्ष डिजाइन, और यह एक लेजर कटर के साथ संगत है कि इस तरह की फाइल को बचाने. लेजर कटर के साथ स्पष्ट ऐक्रेलिक में 1/8- 3/16 से चैम्बर कट अंदर 0.15 के एक केंद्र के लिए केंद्र की दूरी से में इस आकार, व्यास 0.183 के अलग दो हलकों बनाने के लिए. अनंत आकार छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer गठन और स्थिरता की सुविधा.
- अनंत के आकार का अच्छी तरह से करने के लिए ऐक्रेलिक कक्ष की बढ़त के माध्यम से एक 1/16 में छेद ड्रिल. विपरीत दिशा में दोहराएँ. कैंची के साथ एक 0.2 मिमी एक्रिलिक पत्र या वेल्स को एक नीचे के रूप में सेवा करने के लिए एक लेजर कटर से एक छोटे आयत में कटौती.
- 0.2 मिमी एक्रिलिक के एक तरफ करने के लिए जल्दी सुखाने चिपकने वाला की एक पतली लेकिन पूरा परत लागू करें और कक्ष के नीचे करने के लिए गोंद. कक्ष के नीचे के खिलाफ कस जगह में 0.2 मिमी ऐक्रेलिक पकड़ो और बग़ैरगोंद एक मुहर बनाने, लेकिन देखने के क्षेत्र को कवर से बचने के लिए अनुमति देने के लिए इंटरफेस में गोंद. इसके किनारे कक्ष की दीवार के किनारे से भरा है और यह पूरी तरह से अनंत चैम्बर कटआउट को शामिल किया गया है, ताकि ऐक्रेलिक संरेखित करने के लिए सुनिश्चित करें. यह पर्याप्त जेट प्रवेश के लिए अनुमति देते हैं और अच्छी तरह से रिसाव को रोकने जाएगा.
- Drilled छेद को कवर करने के लिए प्राकृतिक रबर के दो छोटे टुकड़े काट लें. छेद के आसपास जल्दी सुखाने चिपकने वाला लागू करें. सुरक्षित करने के लिए संदंश की एक जोड़ी के साथ सभी क्षेत्रों पर छेद और प्रेस पर रबर रखें. दोनों drilled छेद के लिए दोहराएँ. किसी भी रिसाव को रोकने के लिए सभी चिपके कनेक्शन पूरी सील कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें.
- सुई में एक 23 ग्राम, 1 का उपयोग करना, piezoelectric इंकजेट टिप की प्रविष्टि की सुविधा के लिए कक्ष के दोनों किनारों पर प्राकृतिक रबर में एक छेद प्रहार.
2. प्रयोगात्मक तैयारी
एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में क्लोरोफॉर्म में स्टोर स्टॉक लिपिड समाधान. इस अध्ययन के लिए, 1,2-diphytano या तोYL-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphocholine (DPhPC) या 1,2-dioleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphocholine (DOPC) का इस्तेमाल किया गया था. 2 मिलीलीटर 25 के मिलीग्राम / एमएल लिपिड समाधान आम तौर पर इस प्रोटोकॉल में तैयार किया जाता है और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब दो महीने के लिए पिछले जाएगा
- N-decane में लिपिड resuspend करने के लिए, पहले एक छोटे ग्लास जार को एक शेयर शीशी से हस्तांतरण, और आर्गन या नाइट्रोजन के तहत धीरे सूखी. लिपिड तेजी से सूखे की अनुमति, गैस के लिए अधिक सतह क्षेत्र को बेनकाब करने के लिए सुखाने जबकि एक कोण पर जार पकड़ो.
- केवल थोड़ा पर दबाव डाला जार की टोपी के साथ, सूखे समाधान 1-2 घंटे के लिए एक desiccator में शून्य के नीचे बैठने के लिए अनुमति देते हैं. तो 25 मिलीग्राम / एमएल में लिपिड resolubilize एन decane जोड़ें. भंवर लिपिड समाधान संक्षेप में और 15 मिनट के लिए एक स्नान sonicator में यह sonicate. -20 डिग्री सेल्सियस पर एन decane में पुनर्गठित लिपिड स्टोर
- एक शेयर sucrose के समाधान तैयार करें. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 300 मिमी sucrose के 900 μl और 100 μl जोड़ने1% methylcellulose (एमसी) के. Methylcellulose jetting में एड्स समाधान है, जो की चिपचिपाहट बढ़ाने के लिए कहा है. वैकल्पिक कदम: क्रमशः, इमेजिंग में अधिक विपरीत या प्रतिदीप्ति उधार देने के लिए काले रंग का भोजन डाई या फ्लोरोसेंट मोतियों की एक वैकल्पिक 1 μl जोड़ें. यह समाधान सेलुलर परासारिता मैच के लिए और microjetting दौरान विपरीत प्रदान करने के लिए बनाया गया एक 300 mOsm sucrose के समाधान है.
- एक डिस्पोजेबल 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज में समाधान ड्रा. टिप ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ सिरिंज पकड़े, टिप की ओर किसी भी बुलबुले को निष्कासित करने के लिए बार बार शाफ्ट झटका, और फँस हवा बेदखल करने के लिए सवार धक्का. यह jetting के लिए जिम्मेदार उचित piezoelectric संकुचन के साथ हस्तक्षेप करेगा, के रूप में आगे बढ़ने से पहले सिरिंज से सब हवा खाली करने के लिए सुनिश्चित करें.
- सिरिंज के अंत पर एक 0.22 माइक्रोन फिल्टर स्थापित करें. फिल्टर में फंस जाने से हवा को रोकने के लिए, खड़ी सिरिंज पकड़ और एक छोटी बूंद टिप ऊपर बनाई है जब तक सवार धक्का. नोट: एक33 मिमी व्यास सिरिंज फिल्टर यूनिट सबसे अच्छा काम करने के लिए मिला था, लेकिन एक 3 मिमी व्यास सिरिंज फिल्टर के रूप में छोटे रूप में वैकल्पिक फिल्टर मृत मात्रा को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- इंकजेट की महिला Luer एडाप्टर खोल देना, और सुरक्षित रूप से फिल्टर के अंत से अधिक जगह में यह दबाएँ. फिर, हवा फँसाने को रोकने के लिए तरल पदार्थ बाहर निकालें. इंकजेट के शीर्ष में भाड़ में. यह पूरी तरह से जुड़ा हुआ है के बाद तरल पदार्थ इंकजेट की नोक की यात्रा करनी चाहिए.
3. उपकरण तैयारी
- एक वि दबाना का प्रयोग, खुर्दबीन मंच पर सिरिंज विधानसभा माउंट. इंकजेट नियंत्रक को इंकजेट से तार देते. नोट: एक कस्टम चरण इस प्रोटोकॉल के लिए बनाया गया था, मंच डिजाइन उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, जबकि यह सिरिंज और नमूना धारक की XY नियंत्रण से स्वतंत्र xyz नियंत्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- वांछित इमेजिंग प्राप्त करने के लिए बढ़ाई और आवश्यक लेंस संयोजन निर्धारित करते हैं. यहाँ एक 10X उद्देश्य और 10X ऐपिस उपयोग किया जाता है. Jetting और पुटिका पीढ़ी कल्पना करने के लिए एक उच्च गति कैमरा (≥ 1000 एफपीएस) का प्रयोग करें. इमेजिंग के लिए पहले, आवश्यक कैमरा अंशांकन प्रदर्शन करते हैं. छवि पर कब्जा आरंभ करने के लिए कैमरा सॉफ्टवेयर के भीतर छवि के आधार पर स्वत: ट्रिगर का उपयोग.
- खुर्दबीन मंच पर अनंत कक्ष माउंट. मंच पर जगह में यह टेप से चैम्बर सुरक्षित.
- ध्यान से प्राकृतिक रबर में पंचर छेद (चित्रा 1B देखें) के साथ inkjet टिप संरेखित. ऐसा करने के लिए चैम्बर के करीब इंकजेट लाने और आंखों से स्थिति को समायोजित करने के लिए, तो माइक्रोस्कोप के लेंस के माध्यम से और अधिक सटीक समायोजन करें. मोटे आंदोलनों इंकजेट टिप नुकसान पहुंचा सकता है, के रूप में सावधानी से आगे बढ़ना.
- इंकजेट गठबंधन किया है एक बार, कुओं की लोडिंग के दौरान इंकजेट को कोई नुकसान को रोकने के लिए दूर कक्ष से सिरिंज विधानसभा बैक. यह झिल्ली में छेद के साथ गठबंधन बना हुआ है कि इतनी इंकजेट की गति दिशाहीन है कि सुनिश्चित करें.
- Plun पर धीरे प्रेसइंकजेट नोक पर एक छोटे से छोटी बूंद रूपों तक सिरिंज विधानसभा की हिट. यह कुछ प्रारंभिक backpressure प्रदान करेगा.
- इनपुट jetting मापदंडों. एक trapezoidal द्विध्रुवी लहर के लिए, निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: 20 kHz नाड़ी आवृत्ति, 3 μsec वृद्धि समय, 35 μsec स्पंद अवधि, 3 μsec गिरावट समय, 65 वी लागू वोल्टेज (स्पंद आयाम), और ट्रिगर प्रति 100 जेट दालों (पल्स संख्या) . हालांकि, लागू वोल्टेज (स्पंद आयाम) और नाड़ी संख्या (ट्रिगर प्रति जेट दालों) पुटिका आकार को नियंत्रित करने के लिए अलग किया जा सकता है.
4. पुटिका पीढ़ी
- दोनों कुओं की पूरी सतह को कवर, अनंत चैम्बर के लिए N-decane में निलंबित 25-30 μl लिपिड समाधान जोड़ें.
- एक अच्छी तरह से, pipetting धीरे से और आसानी से सबसे बाहरी किनारे करने के लिए (sucrose के समाधान के रूप में एक ही परासारिता के) 25 μl ग्लूकोज जोड़ें. ग्लूकोज और लिपिड समाधान मिश्रण नहीं है क्योंकि बयान पर, ग्लूकोज की एक बूंद, फार्म चाहिए. जोड़ें एक और 251; एक बूंद बनाने के लिए और 5-10 मिनट के भीतर चैंबर के बीच में लिपिड bilayer झिल्ली बनेगी जो विपरीत अच्छी तरह से, करने के लिए ग्लूकोज की एल.
- प्राकृतिक रबर के माध्यम से इंकजेट डालें, और ध्यान से छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer की दिशा में यह गाइड. पेश इंकजेट मात्रा विस्थापित होंगे और bilayer टूटना सकते हैं, धीरे धीरे bilayer दृष्टिकोण.
- इंकजेट ~ 200 माइक्रोन के अंदर है, कदम 3.8 में वर्णित सेटिंग्स के साथ jetting लागू होते हैं. bilayer से दूरी अन्य मानकों के बीच वोल्टेज और पल्स संख्या के आधार पर मुख्य रूप से भिन्न हो सकते हैं. इस प्रोटोकॉल धीरे धीरे सेटिंग्स (वोल्टेज और पल्स संख्या) में वृद्धि और bilayer विरूपण देख सिफारिश की गई है.
5. उपकरणों की सफाई
- खुर्दबीन मंच से सिरिंज विधानसभा को अलग करें, और 1 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज और फिल्टर के निपटान के.
- इंकजेट साफ करने के लिए, solutio में टिप सूई से आदेश में निम्नलिखित समाधान महाप्राणn 7-10x प्रत्येक: गर्म पानी, 70% इथेनॉल, और DDH 2 ओ में 70% इथेनॉल, 2% Neutrad समाधान इंकजेट आकांक्षा पिपेट पर सुरक्षित रूप से फिट नहीं करता है, एक एडाप्टर के लिए फार्म एक विंदुक टिप कटौती.
- ऊतक के साथ चैम्बर सूखी. 5-10 मिनट के लिए 2% v / वी गर्म पानी में Neutrad, और sonicate के साथ एक 250 मिलीलीटर बीकर में अनंत चैम्बर रखें. Sonication के बाद, अच्छी तरह संपीड़ित हवा के तहत कुओं सूखी. कुओं में किसी भी नमी लिपिड bilayer झिल्ली की स्थिरता समझौता कर सकते हैं, तो यह भी कक्षों में 15 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में रखा जाता है की सिफारिश की है.
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Representative Results
हम machined भागों और मैनुअल micrometers से इकट्ठे एक कस्टम मंच (चित्रा 1) के साथ एक पारंपरिक औंधा प्रतिदीप्ति खुर्दबीन पर एक microfluidic jetting सेटअप को इकट्ठा किया है. इंकजेट की विशेषता पुटिका पीढ़ी प्रक्रिया में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. इंकजेट नोक और लिपिड bilayer के बीच की दूरी परिवर्तनीय बल झिल्ली की विकृति पैदा करने के लिए आवेदन किया प्रभावित करता है. Bilayer से निकटता जेट स्ट्रीम केंद्रित है और दूर पुटिका पीढ़ी के बिंदु से ऊर्जा dispersing से झिल्ली से बचाता है. भंवर यात्रा हमारी अपेक्षाओं (चित्रा 2) के साथ संगत piezoelectric actuator, के लिए लागू वोल्टेज के साथ बढ़ जाती है. पुटिका गठन और प्रतिनिधि पुटिका 3 चित्र में दिखाया गया है jetted. चित्रा 3a microjetting द्वारा पुटिका गठन के लिए एक प्रतिनिधि छवि अनुक्रम से पता चलता है. गठन के बाद, पुटिका स्थिरता पुटिका diamete साथ भिन्न हो जाता हैआर, छोटे vesicles अधिक स्थिर थे जहां.
तकनीक और उपकरणों का आंकड़ा 1. चित्रण. छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer के खिलाफ piezoelectric संचालित jetting प्रक्रिया (क) योजनाबद्ध. एकाधिक दालों GUVs निर्माण करने के लिए bilayer विकृत कि एक भंवर अंगूठी संरचना के रूप में तेजी से उत्तराधिकार में बाहर धक्का दे दिया. नीचे सही चित्रण ग्लूकोज बयान और अच्छी तरह के आयाम का स्थान पता चलता है. लिपिड समाधान अनन्तता चैम्बर के लिए जोड़ दिया गया है एक बार, 25 μl ग्लूकोज तो (2) में, पहले (1) में, अच्छी तरह से सबसे बाहरी किनारों में जोड़ा जाता है. (ख) घुड़सवार सिरिंज विधानसभा, कस्टम पकड़े मंच, और अनन्तता चैम्बर. चैम्बर जगह में सुरक्षित है, और इंकजेट की नोक hol के साथ गठबंधन किया है अच्छी तरह से पक्ष पर प्राकृतिक रबर में ई. (ग) पूर्ण माइक्रोस्कोप और कस्टम चरण विधानसभा. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
Inkjet की चित्रा 2. विशेषता. (एक) 20 kHz (55 वी पल्स आयाम पर 50 दालों) पर रैपिड इंकजेट दालों एक एकल भंवर अंगूठी फार्म को ओवरलैप. पल्स आयाम सीमा तय की नब्ज संख्या (200 दालों) के लिए (40-65 वी) से अधिक समय के एक समारोह के रूप में (ख) तरल जेट सामने विस्थापन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. पुटिका पीढ़ी. पुटिका पीढ़ी प्रक्रिया की छवियां और कई vesicles का उत्पादन किया. (क) समाधान का तेजी से दालों का उत्पादन छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer (DPhPC) के विकार चुटकी और एक guv के लिए फार्म झिल्ली के कारण. (ख) microfluidic jetting उत्पन्न का उपयोग कर कई vesicles.
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Discussion
कई तकनीकों electroformation, पायस, और छोटी बूंद पीढ़ी 14-16 सहित पुटिका पीढ़ी के लिए विकसित किया गया है. बहरहाल, नए प्रयोगात्मक तकनीक रहने वाले सिस्टम के लिए बढ़ समानता के साथ जैविक प्रणालियों के डिजाइन के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक हैं. विशेष रूप से microfluidic तरीकों करीब जीव विज्ञान के लिए पुटिका मॉडल लाने, झिल्ली unilamellarity, आकार की monodispersity, और आंतरिक सामग्री 17,18 गवर्निंग नियंत्रण का एक बढ़ा स्तर की पेशकश की है. इसके अलावा, microfluidic jetting का उपयोग लक्षण वर्णन और प्रयोग प्रभावी उन्मुख झिल्ली प्रोटीन का समावेश, झिल्ली विषमता, और encapsulation 3,13 दिखाया गया है.
इस तकनीक को सरल है, लेकिन सावधानी से लिया जाना चाहिए जहां कुछ कदम भी शामिल है. ऐक्रेलिक शीट और प्राकृतिक रबर दोनों निर्माण के दौरान अनंत चैम्बर के साथ पूरा जवानों फार्म चाहिए. अन्यथा, अनंत के आकार कुओं रिसाव और आर जाएगाISK bilayer स्थिरता. प्रयोगात्मक तैयारी के दौरान शोधकर्ता शुरू में और प्रत्येक घटक संलग्न करने के बाद पूरी तरह से हवा की सिरिंज विधानसभा खाली करने के लिए सुनिश्चित किया जाना चाहिए. इस विधानसभा के भीतर बुलबुले विमान के भीतर एक सिकुड़ाया मात्रा बनाने और piezoelectric actuator के jetting प्रभाव को कम या नकारना. उपकरणों की तैयारी करते हुए मुख्य चिंता नाजुक इंकजेट नोक हानिकारक है. इस बाद के jetting के लिए लिपिड bilayer स्थापित करता है के रूप में अंत में, ग्लूकोज का बयान, पुटिका पीढ़ी पिछले चरणों के दौरान सबसे अधिक ध्यान देने की आवश्यकता.
Microfluidic jetting द्वारा पुटिका पीढ़ी विश्वसनीय और repeatable है, लेकिन, inkjets के बीच फ़र्क कुछ परिचित और parameterization की आवश्यकता होती है. हमारे अनुभव में, पूर्व jetting को अनंत चेंबर में इंकजेट नोक की शुरूआत दूर से bilayer में एक मामूली मोड़ के उत्पादन, नोक आयामों के आधार पर ग्लूकोज की कई microliters के लिए ऊपर विस्थापित हो सकते हैंइंकजेट. मूल रूप से bilayer की स्थापना जब disproportionally ग्लूकोज समाधान dispersing द्वारा इस आशय ऑफसेट किया जा सकता है और एक तलीय bilayer परिणाम होगा. इस bilayer स्थिरता को बढ़ाता है, लेकिन यह भी पुटिका गठन पर बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देता है ही नहीं. इंकजेट की एक 20 माइक्रोन छिद्र व्यास इस पत्र में यह परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. 10-20 माइक्रोन की एक छिद्र व्यास की सिफारिश की है. कंपन के न्यूनतम भी सिफारिश की है, सरल रबर कटआउट माइक्रोस्कोप तालिका का समर्थन और प्रयोगशाला कंपन गीला हो जाना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे.
इस प्रोटोकॉल कई लिपिड के लिए लागू है, DPhPC अपने विशेष रसायन शास्त्र और उच्च bilayer स्थिरता के लिए चुना गया था. का परीक्षण अन्य प्राथमिक लिपिड 1,2-dipalmitoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphocholine (DPPC) थे और 1,2-dioleoyl-एस.एन. ग्लिसरो-3-phosphocholine (DOPC). तुलनात्मक रूप से, DPhPC एक सुसंगत छोटी बूंद इंटरफ़ेस bilayer के लिए फार्म और unilamellar पुटिका के उत्पादन के लिए एक मजबूत प्रवृत्ति थी. प्रारंभिक परगठन, इस प्रोटोकॉल में bilayer कारण एक nonplanar इंटरफेस के लिए एक स्पष्ट मोटाई और तेल का समावेश था. जलीय बूंदों के आकार एक घुमावदार bilayer का गठन, और यह देखने का एक भी क्षेत्र में एक मोटाई के रूप में दिखाई दिया. DPhPC दो बूंदों के बीच इंटरफेस पर आरंभिक संपर्क जोन दूर bilayer से तेल ड्राइविंग, विस्तार करने की अनुमति दी. इस वजह से यह energetically अनुकूल प्रक्रिया के लिए, दो बूंदों के बीच संपर्क क्षेत्र के अधिक से अधिक एक bilayer बन गया है, और नमूदार मोटाई समय के साथ कम किया है. Bilayer क्षेत्र की यह वृद्धि bilayer की लंबाई की परिवर्तनशीलता के तहत परीक्षण किया गया था, प्रारंभिक कक्ष डिजाइन थोड़ा समायोजित किया गया (दूसरी पीढ़ी के डिजाइन में व्यास 0.15 के दो हलकों के शामिल में 0.13 की एक केंद्र के लिए केंद्र की दूरी के द्वारा अलग) छोटे संस्करणों की जरूरत है और एक छोटे bilayer अंतरफलक में हुई है. सही पुटिका पीढ़ी के लिए अनुमति दी नए और प्रारंभिक डिजाइन, अभी तक न तो डिजाइन दोनों एक Domin दिखायाbilayer पतले में चींटी लाभ. एक और परीक्षण किया अनुकूलन piezoelectric इंकजेट के लिए लागू कंप्यूटर नियंत्रित backpressure था. Jetting जबकि इस प्रवाह की दर के ऊपर एक और मात्रात्मक नियंत्रण दिया है, यह प्रयोग के बहुमत भर में इस्तेमाल नहीं किया गया था.
यह विधि कई मौजूदा तकनीक का संयुक्त लाभ प्रदान करता है. तेजी से पुटिका पीढ़ी इस काम का ध्यान नहीं था, हालांकि एकाधिक GUVs, कारण लिपिड अणु के उच्च एकाग्रता के लिए उच्च आवृत्ति (~ 200 हर्ट्ज) पर उत्पन्न किया जा सकता है. एक एकल लिपिड bilayer के खिलाफ इस तकनीक के विमानों के बाद से, झिल्ली unilamellarity उम्मीद है और देखा गया है. इसके अतिरिक्त, समाधान की एक विस्तृत श्रृंखला के इस प्रकार अधिक संभावित अनुप्रयोगों 17 को सक्षम करने, ऐसे आणविक वजन या प्रभारी के रूप में विशिष्ट घुला हुआ पदार्थ संपत्तियों की स्वतंत्र समझाया जा सकता है. इसके अलावा, के कारण का गठन vesicles के आकार के लिए (एक श्रृंखला> 10 माइक्रोन से संभव है <400 माइक्रोन तक) पारंपरिक सूक्ष्म से, अवलोकनscopy तकनीक पर्याप्त 13 है.
Microfluidic jetting जैविक समस्याओं की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है. एक विशिष्ट उदाहरण सेलुलर बायोमैकेनिक्स है; GUVs की विरूपता उन्हें एक guv 4,19 की सतह पर इकट्ठा जब रोचक प्रभाव से पता चला है कि समझाया actin नेटवर्क के बल पीढ़ी और आत्म विधानसभा अध्ययन करने के लिए एक आदर्श उपकरण प्रदान करता है. अतिरिक्त अनुप्रयोगों दवा वितरण प्रणाली, सेल आकार बायोरिएक्टर, और सिंथेटिक जीव विज्ञान, बायोफिज़िक्स, और बुनियादी विज्ञान, उद्योग, और compartmentalized biomolecules वांछित हैं जहां चिकित्सा के क्षेत्र में अन्य क्षेत्रों की एक किस्म के लिए मॉड्यूलर प्रणाली में शामिल हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम microjetting मापदंडों पर सलाह के लिए कैलिफोर्निया, बर्कले विश्वविद्यालय में फ्लेचर लैब से माइक Vahey धन्यवाद. इस काम एनआईएच अनुदान DP2 HL117748-01 के द्वारा प्रायोजित किया गया था.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Piezoelectric Inkjet | MicroFab Technologies | MJ-AL-01-xxx | xxx denotes orifice diameter in microns |
Jet Drive III Controller | MicroFab Technologies | CT-M3-02 | |
High-speed camera | Vision Research | MiroEX2 | |
DPhPC lipid in chloroform | Avanti | 850356C | Ordered in small aliquots in vials |
33 mm PVDF filters, 0.2 µm | Fisher Scientific | SLGV033RS | |
1 ml Syringes | Fisher Scientific | 14823434 | |
n-Decane | Acros Organics | 111871000 | |
Glucose | Acros Organics | 410950010 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903-1KG | |
Methylcellulose | Fisher Scientific | NC9084958 | |
1/8 in Acrylic | McMaster Carr | 8560K239 | CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request |
0.2 mm Acrylic | Astra Products | Clarex clear 001 | |
Acrylic Cement | TAP Plastics | 10693 | |
Loctite 495 Superglue | Fisher Scientific | NC9011323 | |
Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive | Strobels Supply | 30765 | |
Natural rubber | McMaster Carr | 85995K14 | |
Custom stage | homemade | N/A | CAD designs are available upon request |
References
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function. Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).
- Yeh, B. J., Lim, W. A. Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry. Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).
- Richmond, D. L., et al. Forming giant vesicles with controlled membrane composition, asymmetry, and contents. Proc. Natl. Acad. Soc. U.S.A. 108, 9431-9436 (2011).
- Liu, A. P., et al. Membrane-induced bundling of actin filaments. Nat. Phys. 4, 789-793 (2008).
- Brown, K. S., et al. Xenopus tropicalis egg extracts provide insight into scaling of the mitotic spindle. J. Cell Biol. 176, 765-770 (2007).
- Loose, M., Fischer-Friedrich, E., Ries, J., Kruse, K., Schwille, P. Spatial regulators for bacterial cell division self-organize into surface waves in vitro. Science. 320, 789-792 (2008).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Disc. Chem. Soc. 81, 301-311 (1986).
- Bucher, P., Fischer, A., Luisi, L. P., Oberholzer, T., Walde, P. Giant Vesicles as Biochemical Compartments: The Use of Microinjection Techniques. Langmuir. 14, 2712-2721 (1998).
- Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T., Weitz, D. A. Double emulsion templated monodisperse phospholipid vesicles. Langmuir. 24, 7651-7653 (2008).
- Matosevic, S., Paegel, B. M. Stepwise Synthesis of Giant Unilamellar Vesicles on a Microfluidic Assembly Line. J. Am. Chem. Soc. 133, 2798-2800 (2011).
- Hu, P. C. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic Fabrication of Asymmetric Giant Lipid Vesicles. ACS Appl. Mater. Inter. 3, 1434-1440 (1021).
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. J. Am. Chem. Soc. 130, 5878-5879 (2008).
- Stachowiak, J. C., Richmond, D. L., Li, T. H., Brochard-Wyart, F., Fletcher, D. A. Inkjet formation of unilamellar lipid vesicles for cell-like encapsulation. Lab Chip. 9, 2003-2009 (2009).
- Meleard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation from lipid mixtures to native membranes under physiological conditions. Methods Enzymol. 465, 161-176 (2009).
- Nishimura, K., Suzuki, H., Toyota, T., Yomo, T. Size control of giant unilamellar vesicles prepared from inverted emulsion droplets. J. Colloid Interface Sci. 376, 119-125 (2012).
- Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet Microfluidics. Lab Chip. 8, 198-220 (2008).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).
- Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis. Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).
- Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys. J. 91, 4064-4070 (2006).