Summary
山毛榉树皮病是由喂养，在树皮真菌创建入口点的山毛榉介壳虫活动启动。树木能够抵抗介壳虫也是疾病的抵抗力。在这里，我们提出，我们已经发展到筛选山毛榉规模抵抗个别山毛榉树的协议。
Abstract
山毛榉树皮病（BBD）的结果在高水平的初始死亡率，留下幸存者的树木被大大削弱和变形。本病是由喂养侵入山毛榉介壳虫， 隐球菌fagisuga，它由Neonectria种真菌中的一种创造切入点感染活动启动。如果没有规模为患，对于真菌感染的机会很少。使用规模鸡蛋人为侵扰的严重影响BBD看台的健康树木证明，这些树是耐病情复杂1的介壳虫部分。在这里，我们提出，我们已经开发的基础上，由休斯敦2人为侵扰的技术，它可以用于筛查的领域和更小的盆栽苗木移植和规模性树木的协议。规模性树木识别是对BBD的管理，通过树的重要组成部分改进方案和造林操纵。
Introduction
山毛榉树皮病（BBD）自19世纪90年代后期3引入了入侵的山毛榉介壳虫， 隐球菌fagisuga，在新斯科舍省的加拿大省已在北美地区于美国山毛榉产生了不利影响。当山毛榉介壳虫其插入喂食管芯到树皮制作的小裂缝，提供入口感染的Neonectria种真菌（Neonectria ditissima或Neonectria faginata）中的一本昆虫病情复杂启动。由于真菌菌丝体生长，大面积的组织可能会死，最终完全环剥树。从疾病的伤害削弱了树，使它容易出现抢购的大风4。在疾病的第一波死亡率水平已报道高达50％5。幸存的树木往往严重变形，溃疡形成降低了树的值作为木材产品。0;这种树有一个倾向根萌这导致了“山毛榉树丛”，以防止其他更理想的物种建立，减少了支架6的经济和生态价值的形成。虽然山毛榉树皮病是不是很可能导致美国山毛榉灭绝，它改变立场的组成和健康导致食物和栖息地减少对野生动物的7,8。
在受BBD多年看台上，有报道称，依然无任何疾病症状的树木。人工接种试验表明，这些树是耐介壳虫2。如果没有规模虫蛀，有一个Neonectria感染的机会很少，尽量减少真菌的影响。大规模死亡的美国榉木，由于Neonectria感染在没有事先规模为患从未据报道，所以抗阻为BBD山毛榉介壳虫结果。
对BBD的管理最近的研究集中在识别，繁殖，饲养，并保留美国山毛榉树与阻力山毛榉介壳虫的。遗传研究表明，抗介壳虫是可以遗传的，耐树木的精心选育可能会导致在一个世代9显著改善。这一发现得益于在美国的州和国家森林经理努力建立抵抗美国榉木的区域种子园提供遗传多样性BBD性种子的来源进行恢复种植10,11。研究还表明立场遗传学造林操纵去除易感树木和保留性的树木可能会导致林分改造9,12。 </ P>
BBD通过树木改良活动，或通过开展造林处方管理需要来选择和山毛榉规模性和易感树木区分的能力。这里介绍的方法已经改编自一个方法首先由戴维·休斯顿引入人工接种苗木榉规模鸡蛋1。该方法可以作为一种筛选工具，以确定数量性状基因座（QTL）与电阻或在遗传研究抗性和易感盆栽幼苗或接枝分株区分相关联。另外，它可用于筛选成熟的树木在现场以确定种子园的发展，或保留在现场耐树木。易感树木可以识别并删除，以减少疾病的影响。
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Protocol
1植物材料：成熟的领域树木，盆栽苗木，盆栽或移植
- 现场测试中，选择显示比例虫蛀或疾病进行检测的可能的阻力的迹象成熟健康的美国山毛榉树。明显地容易树木也将需要确定被用作对照（ 图1）。
- 为了测试盆栽苗或移植物，收集和在科赫和凯里，2004或在凯里等人 ，2013描述的接穗嫁接描述发芽山毛榉。
- 育苗移植或在盆栽土壤混合修订，47克微量营养素，477克缓释肥料15N-3.9P-9.9K，700克粗珍珠岩和每2.8立方米75克硫酸铝。英尺袋。如果在生长季节后需要，植物施肥每周用可溶性17N-1.3P-14.1K在200 ppm的氮。
- 在生长季节，保持在阴凉处室内植物。让植物外面在秋天之前，移动它们进入休眠状态要控制温度储存设施（〜4℃）从十一月至四月。
榉木秤鸡蛋2个。收藏
- 在一个BBD出没的展台，检查严重感染的树木（通过他们的“粉刷”的出现， 图1A易于识别）用一只手放大镜来确认鸡蛋，通常从丰富七月中旬到八月中旬的存在。
- 使用画笔轻轻刷成人介壳虫，鸡蛋等杂物的白色蜡状团块，成塑料密封1加仑收集袋（ 图1B）。从至少三个不同的树木收集至少12米外。
- 如果需要，在密封的收集袋长达两个星期的鸡蛋存放在4°C。带的湿的聚乙烯泡沫的袋子，以防止鸡蛋从晒出的内部的小片（2.5厘米见方）。
- 从成年人（0.60毫米）和debri分开规模鸡蛋（0.15×0.25毫米）秒，用一段短的2'PVC管和一个耦合到支持一块方形的250微米的尼龙筛（ 图2）构建一个筛子。
- 清空成人，蜡，鸡蛋，并从收集袋碎片的混合物到筛子并用一个小漆刷轻轻地鼓励卵穿过网眼进入下面的玻璃培养皿中。应避免塑料培养皿中，因为它们容纳更多的静电，从而难以移动的鸡蛋。鸡蛋之前和筛分后示于图3。
- 纯化的蛋可以存储在培养皿中，在4℃下至少一周。为了防止鸡蛋变干，大盘潮湿的一块泡沫的盖子，用封口膜密封。
3，卵子活力测定
- 评估卵存活率，使用10毫升注射器，以涂上薄薄的凡士林的环围绕60mm的玻璃培养皿的底部（ 图4A中的圆周
- 转让约100个鸡蛋到环的中心，将盖子上的培养皿中，并用封口膜密封。允许所述密封培养皿，以保持原状在室温下放置2周，3周的时间，如果已存储的蛋在4℃下开始测定之前。
- 孵化的若虫会卡在凡士林，并且可以很容易地计算，并且空的鸡蛋很容易从未孵化的卵通过它们的颜色和光泽（ 图4B）不同。除以若虫的数量通过的空鸡蛋加余下的全蛋的总和计算存活率。良好的生存力应该在75％到90％孵出的卵范围。
4，规模性的现场大型成熟的山毛榉树的筛选
- 对于定量检测，计数出500个卵用解剖显微镜和使用小刮勺跨predampened，开孔10×15×1.3厘米聚乙烯泡沫塑料的矩形的中心轻轻地撒它们。至抑制泡沫，润湿它，然后挤压出尽可能多的水可能。对于定性试验，500鸡蛋可以算出来，放在一个小玻璃小瓶和一个“填充”行画，可用于测量约500个卵额外的批次。
- 将泡沫垫到测试树鸡蛋一边对树皮面对的问题。用绳，带，细绳，或涂塑丝硬件握住垫到位。塑料或金属基材料，应使用而非天然纤维材料，这些材料由野生动物更易于清理。
- 线的顶部和预切割23×30厘米的一块透蒸汽防水屋保鲜用乙硅氧烷基粘合剂的两侧，并将其放置在泡沫测试焊盘。请按殿裹边的树来创建一个防水密封。将尼龙绳或塑料涂层的硬线周围的树和房子包起来，使其保持在一定的地方，而粘台（ 图5）。
- 放置至少两测试焊盘上的每个测试树，最好是在树干的两侧。在每个站点，放置测试点上至少有2棵敏感（有明显的天然鳞片虫蛀）作为对照。在此之前放置在测试片上的控制树，取出用坚定的毛刷任何自然发生介壳虫或鸡蛋。
注意：泡沫垫用鸡蛋，也可放置在树上的饲养规模鸡蛋，这可以是特别有帮助的地区为患电平为低的目的。
5，规模性盆栽幼苗或移植物的筛选
- 为了进行测试，选择1厘米（卡尺5厘米以上的土壤线）是足够高的至少有2个独立的测试焊盘放置在它们的最小直径盆栽树木。必要时，以腾出空间供试片修剪小偏科。
- 用解剖显微镜来计算出150鸡蛋和撒在预切割和挫伤2.5×7.6×1.3厘米开孔polyethy溶解乙炔泡沫垫。
- 加盖泡沫垫与苗对树皮鸡蛋的一面，用涂塑丝。缠绕在幼苗只是泡沫上面有个小平米的房子保鲜膜和醋酸基有机硅密封（ 见图6A）。
- 包括已知的易感苗家庭或移植作为对照。
6，数据采集
注意：将所述泡沫垫和鸡蛋在测试树后约52至57周后，数据可以被收集。重要的是，不这样做，大人也开始产卵，使他们的繁殖能力才能确定之后。在一些树木耐它是很平常看到少数的成年人建立，但没有再生产发生。
- 小心地取下泡沫垫和计数的使用手镜或放大镜（10倍），在树皮上建立成人介壳虫的数量。
- 当泡沫垫被去除，它是非uncommon一些成人和最蛋同一簇的泡沫要被拉断树（参见图7）。使用解剖显微镜，算上卵块，而仍然附着在泡沫垫成年人。
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Representative Results
图6显示了抗苗（C）和两个易感苗（D，E）表现出不同程度的敏感性。一个什么样的易感成熟的树看起来像59周人工接虫试验成立后的一个例子如图5B所示。当泡沫被剥离的树，它是不寻常的介壳虫及其卵簇保持粘在泡沫如示于图7，这就是为什么它是必不可少的，以收集从树和泡沫衬垫的数据。
图8显示了每100鸡蛋放在两个不同的看台上，一个在阿勒格尼国家森林（ANF）在宾夕法尼亚州，另一个在拉丁顿州立公园（LSP），密歇根州建立了人工感染的树木成虫的平均数量。这两个看台上布满BBD和在每个展台，健康树的集群S为确定（LSP抗性和耐ANF），并确定要克隆基于DNA分析（数据未示出）。的BBD敏感之树木克隆群也被确定在LSP的LSP（易感），但在ANF五个不同的易感树木被使用（ANF易感）。在和克隆簇之间，大小不同的胸径范围2.1至12.8英寸。 图8显示，虽然有很多的变化对易感树木建立成人人数，被敏感和抗性树之间检测到明显的差异。有成人的数量变化在两个相对容易树木耐集群少。在ANF耐簇，被测试的所有12个克隆没有成人，而在该LSP耐簇一些克隆具有小数目的成年人。然而，在从两个站点的抗感树木的平均值的标准偏差没有重叠。
杂物tion在成人对LSP的克隆与树木的数量（LSP易感）大于尽管事实上，这些树是不是克隆和转基因有不同的ANF易感树木（ANF易感）比观察。可行性测试（数据未显示）表明这种变化不是由于在蛋的存活率差异较大。的变化可能是由于遗传和环境的差异，并说明有易感对照参考在每个测试点的重要性。
图1：从收集规模出没的美国榉树规模的鸡蛋。一 ，重规模出没的美国山毛榉树：B。画笔是用来刷成蚧虫及其虫卵进入下一个可密封的储物袋。
图2。施工筛从成人和其他污染物中分离尺度鸡蛋。250微米的尼龙网A 4×4英寸的预切正方形放置在4英寸片的2“直径的PVC管和一个联接件之间形成的筛。
前（A）和（b）后筛分图3。秤蛋。根据收集的树。 后B解剖显微镜 。混合的成人介壳虫，鸡蛋和杂物观看。经过筛后得到纯化的蛋。
图4。卵子活力测试。 a在培养皿陷阱若虫孵化。 后B环的石油。形成我若虫上的未孵化的蛋。 的C正确。孵化蛋的颜色和半透明的相对不透明的黄色蛋孵化前轻。
图5。成熟的美国榉木在该领域的人工为患。一 ，家裹贴有醋酸基硅，以防止多余的水分泡沫垫建立与蛋的下面。 乙 。房子包裹已被删除，泡沫垫去皮背部安置第52周揭示sCALE殖民之下在这个敏感的树。
图6。盆栽美国榉木苗人工为患。 A.与连接到阀杆上。B.房屋包裹覆盖泡沫。C.泡沫56周在苗期耐后取出鸡蛋泡沫，D.易感苗， 大肠杆菌和一个高度敏感的苗子。 请点击此处查看大图这个数字。
在两个独立的立场，在阿勒格尼国家森林公园，宾夕法尼亚州（ANF）和拉丁顿州立公园树木耐成立于人为地出没树成虫的平均数图8。比较 ，MI（LSP）进行比较，容易控制树。各组试验中树木的数量列在下面的括号，每100蛋应用于成人数在所有的树木在组内进行平均。的条表示从m个标准差EAN。
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Discussion
需要这种测定法的成功关键步骤包括对所述蛋的可行性测试和在每个站点测试使用容易控制的，并与盆栽材料。同样重要的是使用每树或幼苗多个测试垫。我们发现，无论是在现场，并于盆栽多控制测试中，错误的一个常见来源可以是键盘故障。例如，在现场，即使我们的覆盖测试垫与房子的包裹，以防止多余的水分，水向下流动阀杆可以偏向于树的一侧，并且产生一个测试垫的损失的修改。
为了获得精确的结果，它的得分垫下的树表面和泡沫垫本身都非常重要。除了成虫，卵群，在规模的生命周期中唯一流动相称为I型若虫，也可以观察到。这些手机最终若虫插入他们喂养管芯到树的树皮，成为II型若虫。这两种类型的若虫都非常相似的大小和外观的小，椭圆形的蛋，而较大的成年人有一个更接近球形的形状。我若虫的形式是从鸡蛋的区别在于它有红色的眼睛和被感动，但这种运动使得到一个准确计数非常困难。形式二若虫很容易被误认为是一个鸡蛋，用一只手的镜头记录现场数据或放大镜，而不是显微镜时尤其如此。基于这些原因，我们建议只计算成年人和卵块的数量，我们发现为我们提供了一个测试树来支持自我维持的规模侵扰的能力，可重复的数据。先前的研究表明，成年人数是高度相关的蛋簇号9。在许多情况下，它可能是足够的，只是计数成虫;然而，我们观察到某些情况下成年人有能力的建立对树木某些基因型，但不产生卵子。没有繁殖能力，规模虫蛀是不可持续的这些树。
在现场执行时，这个实验的一个意想不到的挫折时的测试点，以熊的吸引力。未来的修改议定书应着眼于使用的材料，可能是熊的吸引力或将测试垫在不同的高度。一个限制到这种测试方法是，它不应该在已对不具有至少一个光山毛榉规模侵扰的地区使用，以避免传染山毛榉树皮疾病的风险。
这种技术的效用是，它可以被用来评估母体性能的育种程序的一部分。对于这样的后代严格的测试标准，规模电阻通常跟随，只允许一名成人和零如克群作为阻力的标准。使用这些准则来选择父母，耐后代的比例应该是50％左右，这是一个相当大的改进，开放授粉种子15。然而，对于土地管理的目的，可能希望为自支持的介壳虫低水平树木可以保持相对健康护树木使用较不严格的标准。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者非常感谢来自美国林务局森林健康保护评估监测和特科技发展计划提供支持的开发，修改和应用在这里描述识别树木，抗性和敏感的山毛榉介壳虫的协议提供资金。我们也感谢霍顿植物园，柯特兰，俄亥俄州，为我们的美国榉木抗性筛选程序的继续合作和支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nylon Mesh Sheet, 250 micron |  Small Parts |
CMN-0250-D | Mesh opening size: 250 microns square, % of open area: 34, thread diameter: 180 micron, width: 24”, Length: 12”, Package quantity: 1 |
| Tyvek Home Wrap | DuPont |
D1349991 | 9 ft x 150 ft roll, can ask for it to be cut in half. |
| Polyethylene foam, ½” thick | Columbus Foam Products |
2 ft x 50 ft roll | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture |
2.8 cu. ft. bark, peat moss, vermiculite, bark ash, starter nutrient charge (with Gypsum), slow release nitrogen and dolomitic limestone. | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris |
E903206 | Standard 3-4 month release |
| Sight Savers 10X | Bausch & Lomb |
813434 | 10X magnification illuminated coddington |
| Nikon Mini Field Stereoscope | Nikon |
7314 | 20X magnification |
| Silicone II clear | GE |
159538 | 2.9 oz clear window & door caulk |
References
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