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Biology

एक प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम अभिप्रेरण परख द्वारा जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स की विशेषता

Published: July 28, 2014 doi: 10.3791/51516
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, KU Leuven

Summary

यहाँ वर्णित प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के कार्यात्मक को सक्रिय ligand (ओं) की पहचान के लिए एक मध्यम throughput रिवर्स औषध विज्ञान स्क्रीनिंग प्रणाली है.

Abstract

20 से अधिक वर्षों के लिए, रिवर्स औषध अनाथ जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के सक्रिय करने ligands को खोजने के लिए preeminent रणनीति रही है. एक रिवर्स औषध विज्ञान परख की शुरुआत एक सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली में ब्याज की एक GPCR की क्लोनिंग और बाद अभिकर्मक है. heterologous व्यक्त रिसेप्टर तो रिसेप्टर को सक्रिय ligand (ओं) की पहचान करने के लिए उम्मीदवार ligands की एक यौगिक पुस्तकालय के साथ चुनौती दी है. रिसेप्टर सक्रियण कैल्शियम या शिविर की तरह दूसरा दूत संवाददाता अणुओं की एकाग्रता में परिवर्तन को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. यहाँ वर्णित प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख एक बार इस्तेमाल मध्यम throughput के औषध विज्ञान परख रिवर्स है. अनाथ GPCR transiently मानव भ्रूण गुर्दे 293T (HEK293T) कोशिकाओं में व्यक्त की है और एक अनेक Gα 16 निर्माण सह ट्रांसफ़ेक्ट है. Ligand बाध्यकारी बाद, Gα 16 सबयूनिट की सक्रियता कैल्शियम च की रिहाई लातीजालिका रोम. पिछले ligand स्क्रीनिंग के लिए, रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक, Fluo 4 acetoxymethyl से भरी हुई हैं. Fluo 4 के फ्लोरोसेंट संकेत विश्राम परिस्थितियों में कोशिकाओं में नगण्य है, लेकिन रिसेप्टर सक्रियण के बाद जारी किए हैं कि कैल्शियम आयनों के साथ बातचीत पर एक 100 गुना से भी अधिक परिलक्षित किया जा सकता. वर्णित तकनीक ट्रांसफ़ेक्ट आनुवंशिक सामग्री मेजबान सेल जीनोम में एकीकृत है जिसमें stably ट्रांसफ़ेक्ट सेल लाइनों का समय लेने वाली स्थापना की आवश्यकता नहीं है. इसके बजाय, एक क्षणिक अभिकर्मक, लक्ष्य जीन की अस्थायी अभिव्यक्ति, सृजन स्क्रीनिंग परख करने के लिए पर्याप्त है. सेटअप यौगिकों के सैकड़ों के मध्यम throughput प्रदर्शन की अनुमति देता है. सबसे GPCRs के लिए जोड़े, चाहे अंतर्जात SETT में देशी संकेतन मार्ग की, intracellular संकेतन मार्ग कैल्शियम की रिहाई की दिशा में निर्देशित कर दिये जाने की अनुमति देता है, जो अनेक Gα 16, सह अभिकर्मकबैठकों. HEK293T कोशिकाओं को संभालना आसान कर रहे हैं और रिसेप्टर deorphanization assays में साल भर में अपनी क्षमता को साबित किया है. हालांकि, विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए परख का अनुकूलन आवश्यक रह सकती है.

Introduction

जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) सभी सेल सतह प्रोटीन के बीच सबसे बड़ा और सबसे विविध परिवारों में से एक का गठन. रीढ़ में उनकी उपस्थिति, अकशेरूकीय, पौधों, खमीर, और कीचड़ ढालना है, साथ ही प्रोटोजोआ और जल्द से जल्द डिप्लोब्लासटिक में Metazoa GPCRs संकेत पारगमन 1 के साथ जुड़ा हुआ सबसे पुराना अणुओं के बीच में हैं कि इंगित करता है. उनके प्राकृतिक सक्रिय करने ligands पेप्टाइड्स, biogenic amines, odorants, ग्लाइकोप्रोटीन, और फोटॉनों 2 सहित बाहरी उत्तेजनाओं की एक विस्तृत विविधता शामिल है. जैसे, इन रिसेप्टर ligand संकेतन सिस्टम शारीरिक प्रक्रियाओं के एक महान विविधता में शामिल हैं. व्यापक कार्यात्मक स्पेक्ट्रम मानव रोगों की एक विस्तृत रेंज को कवर कि चिकित्सीय औषधियों के विकास के लिए उन्हें आदर्श अनुकूल बनाता है. वर्तमान दवा लक्ष्य के बारे में 50-60% GPCRs 3,4 द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. दवा उद्योग में उनके महान महत्व के अलावा, GPCRs एक के विकास के लिए सुर्खियों में भी कर रहे हैंसामान्य रूप में प्रजातियों विशिष्ट कीटनाशकों 5,6 और कीटनाशकों की नई पीढ़ी. कई GPCRs की प्राकृतिक ligands अभी भी अज्ञात होते हैं, क्योंकि वे अनाथ GPCRs के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. इन रिसेप्टर्स की deorphanization जीवों में उनके शारीरिक भूमिकाओं की समझ में सुधार होगा और नई दवा आवेदन पत्र 7 के लिए ख्यात लक्ष्य को उजागर कर सकते हैं.

जीनोमिक युग के बाद से, रिवर्स औषध विज्ञान रणनीति व्यापक रूप से GPCRs 8 deorphanization के लिए लागू किया जाता है. दृष्टिकोण एक अनाथ रिसेप्टर 'मछली बाहर' करने के लिए एक 'हुक' एक जैविक निकालने से या सिंथेटिक यौगिकों का एक पुस्तकालय से अपने को सक्रिय ligand के रूप में प्रयोग किया जाता है कि निकलता है. ब्याज की GPCR इसलिए क्लोन और बाद में एक सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली में ट्रांसफ़ेक्ट है. सबसे अधिक इस्तेमाल किया तरीकों में, रिसेप्टर सक्रियण दूसरा दूत अणुओं की एकाग्रता में बदलाव को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है 9 (जैसे, aequorin) 10 या फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक (जैसे, Fluo 4) 11 कैल्शियम के प्रति संवेदनशील bioluminescent प्रोटीन पर निर्भर हैं. रिसेप्टर व्यक्त कोशिकाओं पूर्व ligand स्क्रीनिंग के लिए एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक के साथ लोड कर रहे हैं जिसमें प्रतिदीप्ति आधारित assays, वे कारण उपयोग, कम पढ़ने के समय के उनके आराम करने के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग की अनुमति है कि लाभ, और स्क्रीनिंग का लचीलापन है एक ही थाली 12 पर कई अनाथ रिसेप्टर्स.

इधर, प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख अच्छी तरह से वर्णित है और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर कम neuropeptide एफ (sNPF) रिसेप्टर की deorphanization प्रक्रिया से यह साफ है. इस neuropeptidergic सिगनल प्रणाली मूल रूप से Mertens एट अल द्वारा विशेषता थी. 2002 में चीनी हम्सटर अंडाशय (चो) कोशिकाओं में प्रदर्शन एक कैल्शियम bioluminescence परख के साथ 1314 और द्वारा फेंग एट अल. 2003 में उपयोग करते हुए एक electrophysiological परख के साथ Xenopus 15 oocytes. sNPF सिगनल प्रणाली की मौजूदगी इसे खिला, विकास, तनाव प्रतिक्रियाओं, हरकत, और circadian लय 16 के नियमन सहित प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसा है, जहां आर्थ्रोपोड़ा, की जाति तक सीमित किया जा रहा है.

कीड़ों में neuropeptidergic संकेतन सिस्टम पर रिसर्च ही कीटनाशकों के विकास के लिए नए लक्ष्य के लिए नेतृत्व नहीं कर सकते, लेकिन उनके कामकाज के ज्ञान के रूप में भी कई संकेत प्रणाली आम तौर पर अच्छी तरह से विकास 17 भर में संरक्षित किया गया है अन्य जीवों के प्रति extrapolated किया जा सकता है. पिछले दशक में, महान प्रगति कीट neuropeptide GPCRs की deorphanization प्रक्रिया में किया गया है. इन प्रयासों के बावजूद, रिसेप्टर्स की केवल एक छोटा सा संख्या में उनके आत्मीय ligand करने के लिए मिलान, और अनुक्रम जानकारी के भार के लिए कर दिया गया हैनई अनाथ GPCRs कारण जीनोमिक्स 18 के तेजी के लिए उपलब्ध हो गया है. एक व्यापक रूप से लागू तकनीक 9,18 साबित हो गया है कि प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख जैसे मध्यम / उच्च throughput स्क्रीनिंग दृष्टिकोण, की उपलब्धता, इसलिए अमूल्य है.

यहाँ वर्णित के रूप में प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख मानव भ्रूण गुर्दे 293T (HEK293T) सेल लाइन में प्रदर्शन किया और रिसेप्टर सक्रियण पर intracellular कैल्शियम की सांद्रता में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करता है. उच्च अभिव्यक्ति और रिसेप्टर के अनुवाद के स्तर की गारंटी करने के लिए, एक कोज़ाक आम सहमति अनुक्रम 19 बाद में एक अभिव्यक्ति वेक्टर (स्तनधारी सेल लाइनों के लिए जैसे, pcDNA वेक्टर श्रृंखला) में क्लोन है जो रिसेप्टर कोडन अनुक्रम, के 5 'अंत में जोड़ा जाता है. यह क्रम सूचना के आधार पर एक अनाथ GPCR की अंतर्जात जी प्रोटीन युग्मन की भविष्यवाणी करना मुश्किल है जैसाअकेले, रिसेप्टर सक्रियण के बाद संग्राहक हैं कि दूसरा दूत अणुओं (जैसे, कैल्शियम या शिविर) अक्सर पूर्व ligand पहचान करने के लिए अनजान रहते हैं. इस समस्या को दरकिनार करने के लिए, सबसे GPCRs के साथ बातचीत और कहा कि जी क्यू परिवार (जैसे, murine Gα 15 या [यहां इस्तेमाल] मानव Gα 16) या chimeric जी प्रोटीन (जैसे, Gα qi5) के अनेक जी प्रोटीन कैल्शियम की रिहाई पैदा कर सकते हैं 20,21,22 सह व्यक्त किया. इसके रिसेप्टर ligand के बंधन पर, GPCR विशिष्ट intracellular रास्ते की सक्रियता की ओर जाता है कि एक गठनात्मक बदलाव आए. Gα 16 सबयूनिट को आराम की शर्तों के तहत बाध्य ग्वानोसिन diphosphate (जीडीपी) अणु, एक ग्वानोसिन triphosphate (जीटीपी) अणु द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा. यह एक Gα 16 और Gβγ सबयूनिट में heterotrimeric जी प्रोटीन की हदबंदी भड़काती. Gα 16 सबयूनिट phospholipase सी और सक्रिय हो जाता है# 946; बदले में झिल्ली ही सीमित diacylglycerol में जिसके परिणामस्वरूप phosphatidylinositol बाइफोस्फेट (रंज 2) (डेग) और inositol trisphosphate (आईपी 3) hydrolyzes जो (PLCβ),. आईपी ​​3 cytoplasm भर में फैला है और कोशिका द्रव्य में कैल्शियम की रिहाई लाती है जो जालिका, की झिल्ली में मौजूद आईपी 3 निर्भर कैल्शियम चैनल को सक्रिय करेंगे.

रिसेप्टर सक्रियण पर कैल्शियम रिहाई सेकंड के भीतर होता है और Fluo 4 acetoxymethyl (AM) 11 तरह, एक कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई के साथ स्क्रीनिंग परख से पहले कोशिकाओं लोड करके पता लगाया जा सकता है. AM एस्टर समूह कोशिका झिल्ली को पार करने के लिए फ्लोरोफोरे सक्षम बनाता है और एक बार सेल के अंदर cytoplasmic esterases द्वारा बंद cleaved है. नतीजतन, फ्लोरोसेंट डाई के नकारात्मक आरोप सेल के बाहर diffusing और यह कैल्शियम आयनों के साथ बातचीत करने की अनुमति से रोकने, बेपर्दा कर रहे हैं. फ्लोरोसेंट संकेत ओच Fluo 4 केवल nanomolar रेंज में कैल्शियम की सांद्रता युक्त विश्राम परिस्थितियों में कोशिकाओं में नगण्य है. कैल्शियम रिसेप्टर सक्रियण पर जारी की है हालांकि, जब संकेत एतद्द्वारा एक बड़ा संकेत करने वाली शोर अनुपात सुनिश्चित करने, अधिक से अधिक 100 गुना करने के लिए एकाग्रता-dependently बढ़ा सकते हैं. Fluo 4 भी कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में physiologically प्रासंगिक कैल्शियम परिवर्तन को मापने के लिए यह उपयुक्त बनाने, 345 एनएम के एक कश्मीर (डी कैल्शियम) के आसपास [कैल्शियम] रिपोर्टिंग के लिए एक बड़ी गतिशील रेंज दर्शाती है. Fluo 4 की उत्तेजना 488 एनएम पर होता है और उत्सर्जन प्रतिदीप्ति 525 एनएम 11 पर मापा जाता है. प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्लेट पाठक (FLIPR) 23, NOVOstar, या FlexStation (स्टेशन डिवाइस) 12 तरह Fluorimeters हर अच्छी तरह से करने के लिए एक साथ मिश्रित अलावा और रिसेप्टर सक्रियण पर Fluo 4 संकेत का पता लगाने की अनुमति है कि मध्यम / उच्च throughput व्यवस्था कर रहे हैं एक परख थाली में. यहाँ वर्णित कैल्शियम जुटाना परख स्टेशन पर निर्भर करता हैडिवाइस 96 अच्छी तरह से microplate प्रणाली.

SoftMax प्रो सॉफ्टवेयर (सॉफ्टवेयर) के आंकड़ों के विश्लेषण के लिए और साथ ही स्टेशन डिवाइस संचालित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कार्यक्रम तुरंत 96 अच्छी तरह प्रारूप में रेखांकन के रूप में परिणाम प्रदर्शित करता है. एकाधिक कुओं ही ग्राफ पर इन कुओं के परिणाम की तुलना करने के लिए एक साथ चुना जा सकता है. प्रत्येक स्तंभ में कुओं के रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाई (RFU) मानों एक साथ वेल्स को यौगिकों के अलावा पहले शुरू करने और रिसेप्टर सक्रियण के बाद फ्लोरोसेंट संकेत की माप के बाद जारी, दो मिनट की अवधि के लिए मापा जाता है. एक सक्रिय यौगिक फ्लोरोसेंट संकेत की एक तेजी से वृद्धि हुई है, जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं को जोड़ा जाता है जब तक आम तौर पर, एक agonist वक्र की प्रवृत्ति आधार रेखा के साथ संरेखित करता है. शिखर ऊंचाई कुएं में अंतिम agonist एकाग्रता के साथ जोड़ा जाता है. शिखर के बाद, फ्लोरोसेंट संकेत धीरे धीरे आधारभूत स्तर की ओर चला जाता है. RFU माप सीएN एक ligand के चुनाव आयोग 50 मूल्य (आधा अधिक से अधिक प्रभावी एकाग्रता) निर्धारित करने के लिए एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता में परिवर्तित किया. सामान्य में, कम से कम तीन स्वतंत्र स्क्रीन, एक एकाग्रता श्रृंखला की तीन प्रतिकृतियां सहित प्रत्येक, एक विश्वसनीय एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र शांत करने के लिए किया जाना चाहिए.

यह प्रयोगात्मक डिजाइन में कई सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण शामिल करने के लिए सिफारिश की है. सबसे पहले, एक अभिकर्मक नियंत्रण, एक ज्ञात ligand के साथ एक रिसेप्टर के कार्यान्वयन यानी, परीक्षण किया जाना चाहिए. इस अभिकर्मक एजेंट परिचालन किया गया था कि क्या की पुष्टि करने की अनुमति देता है. सेल लाइन और एक नकारात्मक नियंत्रण (जैसे, धोने बफर) के एक अंतर्जात रिसेप्टर के लिए एक agonist के साथ एक नियंत्रण प्रयोग का समावेश भी कोशिकाओं के स्वास्थ्य और व्यवहार्यता पर नजर रखने के लिए और धोने बफर के साथ दूषित था कि संभावना को बाहर करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं एक ऑटो fluore बटोर सकता है कि एक कारकखुशबू प्रतिक्रिया. अक्सर इस्तेमाल एगोनिस्ट acetylcholine रिसेप्टर को सक्रिय करता है जो एक सममूल्य 1 चयनात्मक एगोनिस्ट, या carbachol, के रूप में कार्य करता है जो प्रोटीज सक्रिय रिसेप्टर -1 (PAR 1), से व्युत्पन्न एक पेप्टाइड हैं. एक खाली अभिव्यक्ति वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को भी सक्रिय यौगिकों सेल की अंतर्जात रिसेप्टर्स के साथ बातचीत है कि बाहर करने के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. नीचे प्रोटोकॉल में वर्णित कई मानकों के अनुकूलन अलग संकेतन सिस्टम के लिए आवश्यक हो सकता है. पूरा प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख का एक योजनाबद्ध चित्रा चित्र 1 में दिखाया गया है.

चित्रा 1
प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख की चित्रा 1. समग्र योजना. स्वचालित तरल हैंडलिंग और एक साथ प्रतिदीप्ति माप स्टेशन के साथ प्रदर्शन कर रहे हैंसॉफ्टवेयर के द्वारा संचालित डिवाइस microplate रीडर,. सेल प्लेट के लिए एक मिश्रित थाली और टिप रैक: स्टेशन युक्ति तीन दराज होता है. निर्माण में pipettor स्थानान्तरण मिश्रित थाली के एक स्तंभ से सेल प्लेट (चरण 1) के संगत स्तंभ के लिए यौगिकों. सेल प्लेट की हर अच्छी तरह से ब्याज की GPCR और अनेक Gα 16 सबयूनिट के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट किया गया है कि HEK293T कोशिकाओं की एक monolayer होता है. एक यौगिक रिसेप्टर को सक्रिय करते हैं, Gα 16 बाध्य सकल घरेलू उत्पाद जीटीपी की जगह है. Gα 16 सबयूनिट बाद Gβγ परिसर से dissociates और बदले में phosphatidylinositol बाइफोस्फेट (रंज 2) diacylglycerol (डेग) और inositol trisphosphate (आईपी 3) में जिसके परिणामस्वरूप hydrolyzes जो phospholipase Cβ (PLCβ), सक्रिय. आईपी ​​3 कैल्शियम INT की रिहाई उत्प्रेरण, जालिका की झिल्ली में मौजूद आईपी 3 निर्भर कैल्शियम चैनल को सक्रिय करता हैकोशिका द्रव्य ओ. Fluo 4 (कोशिकाओं अलावा मिश्रित करने के लिए पूर्व लोड कर रहे हैं जिसके साथ) के साथ कैल्शियम की बातचीत एक फ्लोरोसेंट संकेत (चरण 2) में यह परिणाम है. सॉफ्टवेयर रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाई समय के समारोह में (RFU) मान के रूप में परिणाम प्रस्तुत करता है, और चोटी ऊंचाइयों एक एकाग्रता पर निर्भर ढंग से ligand एकाग्रता के साथ सहसंबंधी. ये आंकड़े तो एक ligand रिसेप्टर जोड़ी (कदम 3) के चुनाव आयोग 50 मूल्य निर्धारित करने के लिए एक एकाग्रता प्रतिक्रिया की अवस्था में परिवर्तित किया जा सकता है.

Protocol

नोट: कोशिकाओं को शामिल किया जाता है जिसमें सभी कार्यों एक लामिना का प्रवाह में काम करके एक बाँझ वातावरण में बाहर किया जाना चाहिए.

HEK293T सेल लाइन के 1. रखरखाव

  1. एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टी -75 फ्लास्क में HEK293T कोशिकाओं को विकसित.
  2. बीतने 80% का संगम तक पहुँच जाता है जब कोशिकाओं. नोट: यह आमतौर पर 3 से 4 दिन लगते हैं. निरंतर संस्कृति में कोशिकाओं स्क्रीनिंग के लिए 20-25 प्रयोग करने योग्य मार्ग अनुमति देते हैं.
    1. कैल्शियम क्लोराइड और मैग्नीशियम क्लोराइड, पीबीएस trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के बिना Dulbecco फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) प्लेस और मध्यम विकास (500 मिलीलीटर (500 मिलीलीटर पीबीएस 10 मिलीलीटर trypsin-EDTA समाधान और 4.5 मिलीलीटर 4% EDTA के साथ पूरक) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम - उच्च ग्लूकोज [DMEM] अग्रिम में कमरे के तापमान पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस] और 1 मिमी पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन [पुनश्च]) में आधे घंटे के साथ पूरक.
    2. हटानाकोशिकाओं से पुराने मध्यम विकास. 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ मृत कोशिकाओं को बंद कुल्ला और फिर पीबीएस हटा दें.
    3. , 3 मिलीलीटर पीबीएस trypsin-EDTA जोड़ें कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं और समाधान नोट हटाने: कक्षों की आकृति विज्ञान से बदल जाएगा स्टार के आकार का क्षेत्र के आकार को.
    4. कोमल दोहन द्वारा कुप्पी के नीचे से कोशिकाओं को ढीला और ताजा मध्यम विकास के 10 एमएल के साथ नीचे कई बार rinsing द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा.
    5. 14 मिलीलीटर ताजा मध्यम विकास युक्त, और एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते एक नया टी -75 फ्लास्क में स्थानांतरण सेल संस्कृति के 1 मिलीलीटर.

HEK293T कोशिकाओं के 2. क्षणिक अभिकर्मक

  1. 3 दिनों के वास्तविक कैल्शियम जुटाना परख से पहले एक टी -75 फ्लास्क में HEK293T कोशिकाओं को विकसित होता है. यकीन तीन टी 75 बोतल, रिसेप्टर का निर्माण, एक खाली अभिव्यक्ति वेक्टर, के रूप में नकारात्मक नियंत्रण, और ओ के साथ अभिकर्मक के लिए एक साथ अभिकर्मक के लिए एक का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करेंअभिकर्मक नियंत्रण के लिए पूर्वोत्तर के. नोट: 1.2 चरण में वर्णित के रूप में कोशिकाओं के passaging किया जाता है. एकाधिक 96 अच्छी तरह प्लेटें जांच की जानी है, तो टी 150 बोतल (कदम 1.2.5, 2.3, 3.1.3 और 3.1.4 में ऐसा करने के लिए, डबल सभी सूचीबद्ध मात्रा) कोशिकाओं के एक उच्च उपज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है .
  2. सेल संस्कृतियों 50-70% संगम दृष्टिकोण जब तक 20-24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बोतल सेते हैं.
  3. ब्याज और Gα 16 निर्माण की GPCR, खाली वेक्टर और Gα 16 निर्माण के साथ दूसरे फ्लास्क, और अभिकर्मक नियंत्रण और Gα 16 निर्माण के साथ तीसरे एन्कोडिंग अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ कोशिकाओं के सह transfect एक जनसंख्या. नोट: इस प्रोटोकॉल में, ड्रोसोफिला sNPF रिसेप्टर एक pcDNA3.1 स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर 13 में क्लोन किया गया था. JetPRIME अभिकर्मक प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, लेकिन अन्य अभिकर्मक अभिकर्मकों के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. पर जोड़ें7.8 माइक्रोग्राम डीएनए (3.9 माइक्रोग्राम रिसेप्टर का निर्माण या खाली वेक्टर, और 3.9 ग्राम Gα 16 अभिव्यक्ति का निर्माण) एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब और JetPRIME बफर के 500 μl जोड़ने के otal. ट्यूब vortexing द्वारा अच्छी तरह मिक्स, और कुछ ही देर में नीचे स्पिन.
    2. JetPRIME अभिकर्मक, भंवर के 37.5 μl जोड़ें और एक्स छ 14,000 पर 1 मिनट के लिए नीचे स्पिन. कमरे के तापमान पर अभिकर्मक मिश्रण 10 मिनट सेते हैं.
    3. सेल संस्कृति के माध्यम से अभिकर्मक मिश्रण dropwise जोड़ें और संस्कृति कुप्पी की दीवारों के साथ संपर्क से बचने माध्यम में सीधे पिपेट सुनिश्चित करें. 20-24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बोतल सेते हैं.

3. कैल्शियम अभिप्रेरण परख

  1. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को इकट्ठा और 96 अच्छी तरह से काला दीवारों, स्पष्ट नीचे प्लेटों में बीज उन्हें.
    1. पीबीएस, पीबीएस ट्रिप्सिन-EDTA और DMEM स्थानांतरण मध्यम 10% dialyzed FBS के साथ पूरक (500 मिलीलीटर DMEM रखेंऔर अग्रिम में 1% पी एस) कमरे के तापमान पर आधे घंटे.
    2. कोट 96 अच्छी तरह से (प्लेट प्रति 5.85 मिलीलीटर पीबीएस और 150 μl फ़ाइब्रोनेक्टिन [0.1%]) अच्छी तरह से प्रति फ़ाइब्रोनेक्टिन (0.0025%) के साथ पीबीएस के 60 μl के साथ काले रंग की दीवारों, स्पष्ट नीचे प्लेटों. पर ढक्कन के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटें सेते हैं. कुओं से समाधान निकालें और कमरे के तापमान पर ढक्कन पर बिना 1 घंटे के लिए फिर से प्लेटें सेते हैं. वैकल्पिक रूप से, यह बढ़ाया सेल लगाव के लिए पूर्व में लिपटे प्लेटों का उपयोग करना संभव है.
    3. कोशिकाओं से पुराने मध्यम विकास उतारो और 3 मिलीलीटर पीबीएस के साथ मृत कोशिकाओं को बंद कुल्ला और पीबीएस हटा दें.
    4. , 3 मिलीलीटर पीबीएस ट्रिप्सिन-EDTA जोड़ें 1 मिनट के लिए सेते हैं, तो समाधान निकालने. नोट: करने के लिए क्षेत्र के आकार स्टार के आकार से कोशिकाओं में परिवर्तन की आकारिकी.
    5. कोमल दोहन द्वारा कुप्पी के नीचे से कोशिकाओं को ढीला और DMEM हस्तांतरण माध्यम के 10 एमएल के साथ कई बार rinsing द्वारा उन्हें इकट्ठा. एक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में कोशिकाओं स्थानांतरण.
    6. गणनामिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या (यहाँ एक NucleoCounter के साथ प्रदर्शन किया, लेकिन एक Burker चैंबर स्वीकार्य है). एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में सेल संस्कृति के 100 μl जोड़ें. 100 μl lysis बफर जोड़ें और ट्यूब दोहन से मिश्रण. 100 μl स्थिर बफर जोड़ें और दोहन से मिश्रण.
    7. सेल निलंबन के साथ एक NucleoCassette भरें और काउंटर के साथ कोशिकाओं गिनती. सेल जोड़ने और कदम 3.1.6 में बफर स्थिर जब कोशिकाओं को एक कारक तीन से पतला कर रहे थे, के रूप में तीन से कोशिकाओं की संख्या को गुणा करें.
    8. 600,000 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं पतला और अच्छी तरह / प्रति के बारे में 90,000 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए लेपित प्लेट में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की 150 μl बीज. हवाई बुलबुले से बचने और एक सन्निहित सेल परत पाने के लिए समान रूप से कोशिकाओं का प्रसार करने के लिए थाली नल. 16-24 घंटे के लिए एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते हैं.
  2. फ्लोरोसेंट डाई के साथ कोशिकाओं लोड और सह तैयारmpound थाली.
    1. हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) तैयार / HEPES / सीए 2 + / गोजातीय सीरम albumin (BSA) बफर: (आसुत जल में एम 1 2 CaCl [DH 2 ओ] - कमरे के तापमान पर स्टोर) 165 μl 2 CaCl शेयर समाधान जोड़ने, 500 μl HEPES शेयर समाधान (1 एम HEPES DH 2 हे, 7.4 पीएच में - कमरे के तापमान पर स्टोर), और 50 मिलीलीटर HBSS के लिए 0.05 जी बीएसए. फैटी एसिड ब्याज की रिसेप्टर की कैल्शियम संकेत आई. विशिष्ट रिसेप्टर्स को सक्रिय कर सकते हैं कि फैटी एसिड मुक्त बीएसए, कैल्शियम assays के लिए उपयोग किया जाता है.
    2. प्रोबेनेसिड समाधान (100x 250 मिमी) तैयार: 5 मिलीलीटर NaOH (एम 1) में 0.71 जी प्रोबेनेसिड भंग करने और 50 μl HEPES शेयर समाधान और HBSS / HEPES / सीए 2 + / बीएसए बफर के 5 एमएल जोड़ें - हमेशा ताजा समाधान तैयार करें. नोट: प्रोबेनेसिड जिससे फ्लोरोसेंट संकेत को कम करने, कोशिका द्रव्य से Fluo 4 बेदखल कर सकते हैं कि अकार्बनिक आयनों ट्रांसपोर्टरों को रोकता है. यह डाई लोड हो रहा है में प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की हैप्रोबेनेसिड की उपस्थिति और अनुपस्थिति प्रोबेनेसिड भी एगोनिस्ट की मध्यस्थता संकेत कमी हो सकती है के रूप में अकार्बनिक आयनों ट्रांसपोर्टरों, जांच के तहत विशेष सेल लाइनों में एक संभावित समस्या मौजूद है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए.
    3. धोने बफर तैयार:, 50 मिलीलीटर HBSS / HEPES / सीए 2 + / बीएसए बफर करने के लिए 500 μl प्रोबेनेसिड समाधान जोड़ने 7.4 पीएच को समायोजित और बफर समाधान छानना. हमेशा ताजा बफर तैयार करते हैं, और थाली की आवश्यकता है प्रति 50 मिलीलीटर बफर.
    4. 10% pluronic एसिड समाधान तैयार: 50 μl DMSO के साथ 50 μl मिश्रण pluronic एसिड (डाइमिथाइल-sulfoxide में 20% w / वी [DMSO]) - क्रिस्टलीकरण होता है, गर्मी 37 डिग्री सेल्सियस और हमेशा ताजा समाधान तैयार करें.
    5. Fluo-4:00 समाधान (1 मिमी) तैयार: यह पूरी तरह से भंग कर दिया है जब तक 50 माइक्रोग्राम Fluo 4 बजे और भंवर है जिसमें एक शीशी 44 μl 10% pluronic एसिड समाधान जोड़ने. फ्लोरोफोरे के विरंजन रोकने के प्रकाश के संपर्क से बचें.
    6. लोड हो रहा है बफर तैयार: जोड़ने के 8.8 मिलीलीटर DMEM supplemente10 मिमी HEPES और Fluo-4:00 समाधान (44 μl) और भंवर 2.5 मिमी प्रोबेनेसिड (7.4 पीएच) के साथ डी. हमेशा ताजा बफर का उपयोग करें.
    7. कोशिकाओं से मध्यम त्यागें, अच्छी तरह से प्रति 200 μl पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें और पीबीएस हटा दें.
    8. अच्छी तरह से प्रति 55 μl लोड हो रहा है बफर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं. प्रकाश के लिए थाली के प्रदर्शन को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में थाली लपेटें.
    9. वे सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली के लिए हानिकारक (जैसे, acetonitrile) कर रहे हैं कि विलायकों में भंग कर रहे हैं, तो स्क्रीन से पहले यौगिकों सुखाने के लिए सुनिश्चित करें.
    10. Siliconized 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में धोने बफर में पेप्टाइड्स solubilize. एक एकाग्रता प्रतिक्रिया विश्लेषण करने के लिए और एक ligand के चुनाव आयोग 50 मूल्य निर्धारित करने के लिए एक कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें. यौगिक प्लेट (वी के आकार का 96 अच्छी तरह प्लेटें) की अच्छी तरह से इसी में ligand के 70 μl जोड़ें और एक थाली पर सकारात्मक (अंतर्जात agonist) और नकारात्मक नियंत्रण (धोने बफर) शामिल हैं. नहीं ई: एक यौगिक धोने बफर में घुलनशील नहीं है, ऐसे ही एक पानी या तेल और अन्य जल अघुलनशील पदार्थ (जैसे, Kolliphor ईएल) रासायनिक पायसी और solubilize कि समाधान के रूप में जांच के तहत कोशिकाओं के लिए हानिकारक नहीं हैं कि अन्य विलायकों, कोशिश कर सकते हैं .
    11. तीन प्रतियों में सभी नमूनों के उपाय. मिश्रित थाली से एक ligand के 50 μl परख के दौरान सेल प्लेट के 100 μl धोने बफर के साथ एक कुएं में स्थानांतरित कर दिया जाएगा ध्यान रखें कि, तो उनके वांछित अंतिम एकाग्रता 3x पर यौगिकों तैयार करते हैं.
    12. सेल थाली से लोड हो रहा है बफर त्यागें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl धो बफर जोड़ें. कमरे के तापमान पर थाली 15 मिनट सेते हैं और प्रकाश के लिए जोखिम को रोकने के.
    13. सेल थाली से धोने बफर त्यागें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl नई धोने बफर जोड़ें.
    14. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेल प्लेट, मिश्रित थाली, और एक टिप रैक (96 अच्छी तरह से, स्टेशन डिवाइस विंदुक युक्तियाँ) सेते
स्टेशन डिवाइस पर शीर्षक "> 4. परख

  1. बनाएँ और सॉफ्टवेयर के साथ वांछित प्रोटोकॉल फाइल लोड और पढ़ने के चैम्बर के लिए तापमान नियंत्रण इकाई को सक्रिय करें. यहाँ, 525 एनएम (एक पूर्ण 96 अच्छी तरह से थाली में लगभग 25 मिनट लगते हैं मापने) लगातार रीडिंग के बीच 1.52 सेकंड के अंतराल के साथ एक समय पर 2 मिनट के एक पंक्ति के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को मापने. 488 एनएम Fluo 4 की उत्तेजना सेट और 26 μl / सेकंड में सेट बग़ैर गति और 135 μl की एक पिपेट ऊंचाई के साथ, सेल प्लेट, पढ़ना शुरू करने के बाद 18 सेकंड के लिए परिसर के 50 μl की कुल मात्रा के हस्तांतरण.
  2. स्टेशन डिवाइस का उचित दराज में मिश्रित और सेल थाली, और टिप रैक रखें.
  3. फ्लेक्स मोड में वास्तविक स्क्रीन शुरू करने से पहले, Endpoint मोड में एक ही उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य में सेल प्लेट की एक भी पढ़ें प्रदर्शन करना. नोट: यह माप रिश्तेदार प्रतिदीप्ति इकाई (RFU) मान देता है और हम बीच परिवर्तनशीलता का पता लगाने के लिए अनुमति देता हैथाली की LLS. 20,000 और 40,000 के बीच मूल्यों स्वीकार्य के रूप में माना जाता है.
  4. परख शुरू करें और सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण.

Representative Results

50 माइक्रोन से 0,001 एनएम को लेकर एकाग्रता श्रृंखला सभी चार ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स (: AQRSPSLRLRFamide, Drome-sNPF-2: SPSLRLRFamide, Drome-sNPF-3: PQRLRWamide, Drome-sNPF-4: PMRLRWamide Drome-sNPF -1) के लिए परीक्षण किया गया क्षणिक ड्रोसोफिला sNPF रिसेप्टर और अनेक Gα 16 सबयूनिट व्यक्त कि HEK293T कोशिकाओं पर. GPCR 0.1 एनएम अप करने के लिए अंतिम सांद्रता में सभी चार पेप्टाइड्स से सक्रिय है, और रिसेप्टर सक्रियण एकाग्रता पर निर्भर था. चित्रा 2 Drome-sNPF -1 एकाग्रता श्रृंखला की तीन प्रतिकृतियां में से एक के लिए इसी रेखांकन को दर्शाया गया है. (- 1 माइक्रोन PAR 1) के मजबूत सक्रियण हासिल अंतर्जात प्रोटीज सक्रिय (30,000 RFU ±) एक उच्च फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए अग्रणी, रिसेप्टर 1 नकारात्मक नियंत्रण (बफर धोने) सकारात्मक नियंत्रण है, जबकि एक फ्लोरोसेंट संकेत प्रेरित नहीं किया. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि की एक विचलनठेठ वक्र असामान्यताओं का संकेत हो सकता. उदाहरण के लिए, आधारभूत पर लौटने के बिना वक्र की एक सतत वृद्धि जैसे कैल्शियम ionophores की उपस्थिति, या कैल्शियम लीक के कारण एक बाधित लिपिड bilayer के रूप में गैर रिसेप्टर की मध्यस्थता का संकेत है, से संबंधित हो सकता है.

सॉफ्टवेयर सक्रियण के प्रतिशत या अन्य लोगों के अलावा विभिन्न सांद्रता के मानक त्रुटियों को निर्धारित करने के फार्मूले में प्रवेश करने की अनुमति देता है. चित्रा 3 में चार Drome-sNPF पेप्टाइड्स के लिए दिखाया के रूप में परिणामी डेटा, चुनाव आयोग 50 मूल्यों अनुमान लगाने के लिए प्रारंभिक एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता शांत करने के लिए उपयोग किया जाता है. चित्रा 3 से घटता भी नकारात्मक नियंत्रण जहां एकाग्रता श्रृंखला के लिए डेटा शामिल Drome-sNPF पेप्टाइड्स एक खाली pcDNA3.1 वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट HEK293T कोशिकाओं पर परीक्षण किया गया. परिणाम है कि इन कोशिकाओं को पेप्टाइड्स के अलावा अंतर्जात रिसेप्टर्स पर कोई प्रभाव नहीं है कि संकेत मिलता है, लेकिन वास्तव में activब्याज की रिसेप्टर खा लिया. प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख तो तीन बार स्वतंत्र रूप से दोहराया गया था. प्रारंभिक स्क्रीन के प्रारंभिक एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता के आधार पर परीक्षण किया सांद्रता वक्र के गतिशील रेंज (चित्रा 4) को कवर करने के लिए अनुकूलित किया गया. Drome-sNPF -1 (2.04 ± 1.48 NM [95% विश्वास अंतराल]), Drome-sNPF -2 (5.89 ± 3.74 एनएम), Drome-sNPF -3 (5.55 ± 3.95 एनएम) और Drome-sNPF के EC50 मूल्यों 4 (0.50 ± 1.01 एनएम) वे रिसेप्टर को सक्रिय करने के लिए समान रूप से शक्तिशाली हैं यह दर्शाता है कि इसी तरह के हैं.

चित्रा 2
एक एकाग्रता श्रृंखला (50 माइक्रोन से 0,001 एनएम को लेकर). बारह अंतिम सांद्रता ओ की एक रिसेप्टर की मध्यस्थता प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया के लिए सॉफ्टवेयर की चित्रा 2. ग्राफिकल उत्पादनच Drome-sNPF -1 पेप्टाइड Drome-sNPF रिसेप्टर पर परीक्षण किया गया. सक्रियण सापेक्ष फ्लोरोसेंट इकाई (RFU) मूल्यों में व्यक्त किया है. ऊपरी ग्राफ छह उच्चतम सांद्रता के परिणामों और छह सबसे कम सांद्रता के निचले ग्राफ देता है. (-) धोने बफर है सकारात्मक नियंत्रण (+) PAR 1 (1 माइक्रोन) और नकारात्मक नियंत्रण है.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक एकल प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख द्वारा निर्धारित ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स की प्रारंभिक एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता. Transiently चार ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स के लिए HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त ड्रोसोफिला sNPF रिसेप्टर की एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता नीले रंग में दिखाया गया है. (लाल रंग में दिखाया गया है) नकारात्मक नियंत्रण के लिए, पेप्टाइड्स HEK293T पर परीक्षण किया गयाएक खाली pcDNA3.1 वेक्टर साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं. फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं उच्चतम मूल्य (100% सक्रियण) के सापेक्ष (%) के रूप में दिखाया गया है. घटता प्रत्येक एकाग्रता श्रृंखला तीन प्रतियों में मापा गया था जिसमें एक प्रयोग के परिणाम हैं. ऊर्ध्वाधर सलाखों (उस मामले में, केवल चिह्न चित्रित कर रहे हैं) कभी कभी प्रयोग किया जाता चिह्न से छोटे हैं जो मतलब (SEM), के मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करते हैं.

चित्रा 4
चित्रा 4. एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता है और तीन स्वतंत्र प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना assays के द्वारा निर्धारित ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स के चुनाव आयोग 50 मूल्यों के इसी. Transiently चार ड्रोसोफिला sNPF पेप्टाइड्स के लिए HEK293T कोशिकाओं में व्यक्त Drosopihla sNPF रिसेप्टर की एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता परिणाम हैं तीन स्वतंत्र मुझे काasurements प्रत्येक तीन प्रतियों में प्रदर्शन (एन ≥ 9). फ्लोरोसेंट प्रतिक्रियाओं उच्चतम मूल्य (100% सक्रियण) के सापेक्ष (%) के रूप में दिखाया गया है. सितारे n ≤ 9. त्रुटि सलाखों कभी कभी (उस मामले में, केवल चिह्न चित्रित कर रहे हैं) का इस्तेमाल किया प्रतीकों से छोटे हैं जो SEM, संकेत मिलता है जिसके लिए सांद्रता संकेत मिलता है. चुनाव आयोग 50 मानों उनके 95% विश्वास अंतराल के साथ दिखाया गया है.

Discussion

प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख सफलतापूर्वक पहले से ही Mertens एट अल द्वारा किया गया था जो ड्रोसोफिला sNPF पेप्टिडर्जिक सिगनल प्रणाली के कार्यात्मक विशेषता पुष्टि करने के लिए लागू किया गया था. एक bioluminescence परख के साथ और फेंग एट अल द्वारा. एक electrophysiological परख 13,15 साथ. Drome-sNPF-; Fluo = 2.04 एनएम, LUMI = 51 एनएम: HEK293T कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति परख के साथ प्राप्त की चुनाव आयोग 50 मूल्यों के बारे में चो कोशिकाओं (Drome-sNPF -1 में प्रदर्शन bioluminescence परख के साथ प्राप्त की तुलना में कम से कम 10 गुना कर रहे हैं 2: Fluo = 5.89 एनएम, LUMI = 42 एनएम; Drome-sNPF-3: Fluo = 5.55 एनएम, LUMI = 31 एनएम; Drome-sNPF-4: Fluo = 0.50 एनएम, LUMI = 75 एनएम). इन बदलावों का इस्तेमाल किया अभिव्यक्ति प्रणालियों में से एक एक दिया रिसेप्टर के कार्यात्मक अभिव्यक्ति के लिए बेहतर अनुकूल हो सकता है, या कुछ रिसेप्टर्स की तह सी में कम कुशल हो सकता है कि तथ्य यह सहित कई कारकों से समझाया जा सकता हैertain प्रकार की कोशिकाओं. आम तौर पर इन विवो में उनके पेप्टाइड रिसेप्टर बातचीत की शारीरिक प्रासंगिकता समर्थन, प्रतिदीप्ति और bioluminescence परख दोनों के साथ उनके रिसेप्टर पर परीक्षण किया जब सभी चार Drome-sNPF पेप्टाइड्स के चुनाव आयोग 50 मूल्यों nanomolar रेंज में हैं.

ड्रोसोफिला sNPF सिगनल प्रणाली सामान्य रूप से प्रयोगात्मक setups में अभिकर्मक नियंत्रण है क्योंकि सक्रिय करने ligand में जाना जाता है, जिसके लिए एक रिसेप्टर के साथ कोई अभिकर्मक नियंत्रण, यहाँ प्रस्तुत स्क्रीन में शामिल किया गया था कि ध्यान दें. HEK293T कोशिकाओं (PAR 1) और नकारात्मक नियंत्रण (धोने बफर) के एक अंतर्जात ligand के साथ सकारात्मक नियंत्रण स्क्रीन में शामिल थे. PAR 1 के परिणामों कोशिकाओं को एक अच्छी हालत में थे कि पता चला है. नकारात्मक नियंत्रण (बफर धोने) पेप्टाइड्स भंग कर रहे हैं, जिसमें मध्यम inf सकता है कि किसी भी contaminants से मुक्त किया गया है कि जो इंगित करता है, एक फ्लोरोसेंट संकेत नहीं बटोरपरिणाम luence.

पहले से विशेषता ड्रोसोफिला sNPF सिगनल प्रणाली प्रतिदीप्ति आधारित कैल्शियम जुटाना परख की व्याख्या करने के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था. इस प्रयोजन के लिए सक्रिय करने ligands की एकाग्रता श्रृंखला तुरंत परीक्षण किया गया. एक अनाथ रिसेप्टर यौगिकों के सैकड़ों युक्त एक पुस्तकालय का परीक्षण करने के लिए एक स्क्रीनिंग परख में overexpression लिए लाया जाता है हालांकि, जब यह ligands (जैसे., 10 या 1 माइक्रोन) के अपेक्षाकृत उच्च अंतिम सांद्रता के साथ पहली बार परदे की सिफारिश की है. एक सक्रिय यौगिक का पता लगाने के बाद, कि परिसर के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला एक एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र रचना करने और चुनाव आयोग 50 मूल्य निर्धारित करने के लिए जांच की जा सकती है.

एक रिसेप्टर की सक्रिय करने ligand निर्धारित किया जाता है एक बार, intracellular संकेतन मार्ग आगे प्रोटोकॉल आदत डाल द्वारा जांच की जा सकती है. परख ऊपर वर्णित के रूप में प्रदर्शन किया, लेकिन जी सह transfecting बिना ^ जा सकता है5, 16 सबयूनिट. एक कैल्शियम प्रतिक्रिया मापा जाता है, तो इसका मतलब है कि रिसेप्टर सेलुलर अभिव्यक्ति प्रणाली का एक अंतर्जात Gα क्ष सबयूनिट के साथ जोड़े. कोई फ्लोरोसेंट संकेत मनाया जाता है, अन्य माध्यमिक दूत (जैसे., शिविर) की सांद्रता में परिवर्तन को मापने के लिए प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है.

संरचना गतिविधि संबंध (एसएआर) पढ़ाई भी रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक पेप्टाइड के मुख्य अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए किया जा सकता है. पहला, छोटा दृश्यों अभी भी रिसेप्टर को सक्रिय करने में सक्षम है कि पेप्टाइड का न्यूनतम अमीनो एसिड अनुक्रम को परिभाषित करने के लिए मूल्यांकन कर रहे हैं. अगला, पेप्टाइड्स व्यवस्थित ढंग से हर एमिनो एसिड एक alanine अवशेषों के लिए प्रतिस्थापित किया गया है जो में परीक्षण किया जा सकता है. रिसेप्टर पर सिंथेटिक alanine प्रतिस्थापन श्रृंखला का परीक्षण रिसेप्टर सक्रियण 24,25 के लिए अमीनो एसिड में से प्रत्येक के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है.

इसके लगातार उपयोग और साबित effi के बावजूदcacy, यह यहाँ वर्णित परख हित के विशिष्ट रिसेप्टर्स के लिए अधिकतम परिणाम हासिल करने के लिए कुछ रूपांतरों की आवश्यकता हो सकती है कि बल दिया जाना है. Gα 16 सबयूनिट यह सबसे GPCRs को बांधता है कि लाभ दिया है, लेकिन यह भी रिसेप्टर्स पर एक प्रमुख नकारात्मक प्रभाव हो सकता है कि endogenously Gα क्यू 22 के माध्यम से जोड़े. इस मामले में, यह एक उपन्यास कैल्शियम परख के अनुकूलन के दौरान जी प्रोटीन के विभिन्न संयोजनों का परीक्षण करने और Gα 16 की अनुपस्थिति या उपस्थिति में Gα क्ष युग्मित रिसेप्टर्स के लिए परिणामों की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है. रिसेप्टर सक्रियण पता लगाने के लिए बातचीत जी प्रोटीन से सम्बंधित वैकल्पिक assays भी ऐसी GFP लेबल arrestin के स्थानान्तरण, या झिल्ली क्षमता (उदाहरण., FLIPR झिल्ली क्षमता परख किट द्वारा) में परिवर्तन का पता लगाने के रूप में, प्रदर्शन किया जा सकता है. Fluo 4 बजे, यहाँ अन्य कैल्शियम के प्रति संवेदनशील fluorophores की एक विस्तृत सरणी, अपने स्वयं के वर्णक्रमीय और chemic के साथ प्रत्येक प्रयोग किया जाता है इसके अलावाअल गुण, उपलब्ध है. सबसे उपयुक्त फ्लोरोफोरे GPCR, सेल प्रकार और उपलब्ध प्लेट रीडर के आधार पर चुना जा सकता है, लेकिन प्रयोगात्मक सत्यापन आवश्यक है. ट्रांसफ़ेक्ट डीएनए और प्रत्येक रिसेप्टर अभिकर्मक अभिकर्मक सेल लाइन संयोजन के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए डीएनए / अभिकर्मक अभिकर्मक अनुपात की जरूरत के बराबर है. अंत में, यह निरंतर संस्कृति में कोशिकाओं केवल 20-25 प्रयोग करने योग्य मार्ग स्क्रीनिंग assays प्रदर्शन करने की अनुमति है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों रिसर्च फाउंडेशन फ़्लैंडर्स (FWO-Vlaanderen, बेल्जियम, G.0601.11) और यू लोवेन रिसर्च फाउंडेशन GOA/11/002 को स्वीकार करते हैं. FWO-Vlaanderen से एक फैलोशिप से आईबी, टी जे और लेफ्टिनेंट लाभ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HEK293T cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Trypsin-EDTA solution (0.25%) Sigma-Aldrich T4049
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) MP Biomedicals 195173
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose  (DMEM) Sigma-Aldrich D5796
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F7524
Penicillin-Streptomycin (P-S) Sigma-Aldrich P4333
jetPRIME Polyplus transfection 114-01 FuGENE HD Transfection Reagent (Promega); Lipofectamine LTX & Plus Reagent (Life technologies)
Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma-Aldrich F0392
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Reagent A100, Lysis buffer Chemometec 910-0003
Reagent B, Stabilizing buffer Chemometec 910-0002
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A4503
HBSS buffer: Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich H8264
Probenecid Sigma-Aldrich P8761
NaOH (1 M) Vel 2781
Pluronic acid Invitrogen P-3000MP
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
Fluo-4 AM Invitrogen F14201 Fluo-3, Rhod-2, Fluo-5, Calcium Green-1, ... (Invitrogen)
TPP tissue culture flasks (T-75 and T-150) Sigma-Aldrich Z707503 and Z707554
FlexStation device Molecular Devices NOVOstar (BMG Labtechnologies); FLIPR (Fluorometric Imaging Plate Reader) (Molecular Devices)
Black-walled polystyrene plates (96 wells) with clear bottom Greiner Bio-One 655090 Corning 96-well flat clear bottom black polystyrene poly-D-lysine coated microplates
NucleoCassette Chemometec 941-0001
NucleoCounter NC-100 Chemometec
Microcentrifuge tubes, siliconized BioCision BCS-2470
Polystyrene V-shaped 96-well plates Greiner Bio-One 651101
96-Well, FlexStation pipette tips Molecular Devices 9000-0912
Soft Max Pro software Molecular Devices

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