Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي

Published: July 24, 2014 doi: 10.3791/51519
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

Introduction

قدرة hPSCs للتمييز نحو أنسجة البالغين multilineage فتحت آفاقا جديدة لعلاج المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية الشديدة التي تنطوي، الكبد، البنكرياس، والنظم العصبية 1-4. أن مختلف أنواع الخلايا المشتقة من hPSCs أيضا توفير منصات الخلوية قوية لنمذجة المرض، والهندسة الوراثية، وفحص المخدرات، واختبار السمية 1،4. القضية الرئيسية التي تضمن التطبيقات السريرية والدوائية مستقبلهم هو الجيل أعداد كبيرة من hPSCs السريرية الصف من خلال زراعة الخلايا في المختبر. ومع ذلك، ونظم الثقافة الحالية هي إما غير كافية أو متغيرة بطبيعتها، تضم مختلف المغذية وخالية من تغذية ثقافات hPSCs كما المستعمرات 5،6.

مستعمرة من نوع نمو أسهم hPSCs العديد من الميزات الهيكلية من كتلة الخلايا الداخلية (ICM) الأجنة الثدييات المبكرة. الحركة الدستورية هو عرضة للتمييز في طبقات الجرثومية الثلاثفي بيئة متعددة الخلايا بسبب وجود تدرجات إشارات غير المتجانسة. وبالتالي، يعتبر اكتساب التجانس في التطور الجنيني المبكر كعملية المطلوبة للتمايز، ولكن ميزة غير المرغوب فيها من ثقافة hPSC. وغالبا ما يسببها عدم التجانس في الثقافة hPSC بواسطة إشارات أفكارك المفرطة والتمايز عفوية بسبب ظروف النمو الأمثل. وهكذا، في مستعمرة من نوع الثقافة، وكثيرا ما لوحظ الخلايا غير المتجانسة في محيط المستعمرات 7،8. وقد تبين أيضا أن الخلايا الجنينية البشرية في الخلايا الجذعية (HESC) مستعمرات الردود التفاضلية المعرض إلى إشارات الجزيئات مثل BMP-4 9. وعلاوة على ذلك، وأساليب الثقافة مستعمرة تنتج غلة الخلية المنخفض، وكذلك معدلات الاسترداد الخلية منخفضة جدا من الحفظ بالتبريد نظرا لمعدلات النمو لا يمكن السيطرة عليها وإشارات أفكارك مسارات 6،9. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت مختلف الثقافات تعليق لhPSCs زراعة، particulآرلي للتوسع كميات كبيرة من hPSCs في وحدة تغذية خالية من مصفوفة الشروط 6،10-13. من الواضح، ونظم الثقافة المختلفة لها مزاياها وعيوبها. بشكل عام، وطبيعة غير متجانسة من hPSCs تمثل واحدة من العوائق الرئيسية في مستعمرة من نوع والثقافة المجمعة الأساليب، والتي هي دون المستوى الأمثل لتقديم مواد الحمض النووي والحمض النووي الريبي في hPSCs للهندسة الوراثية 6.

ومن الواضح أن هناك حاجة ملحة لتطوير نظم جديدة أن تحايل بعض أوجه القصور في أساليب الثقافة الحالية. اكتشافات مثبطات جزيء صغير (مثل مثبط ROCK Y-27632 وJAK المانع 1) التي تعمل على تحسين البقاء على قيد الحياة وحيدة الخلية تمهيد الطريق للثقافة فصلها-hPSC 14،15. مع استخدام هذه الجزيئات الصغيرة، وقد وضعنا في الآونة الأخيرة طريقة ثقافة قائمة على نوع غير مستعمرة (NCM) نمو فصلها-hPSCs 9. هذا الأسلوب يجمع بين كل من الثقافة رواية الركض وحيدة الخلية وذات الكثافة السكانية العاليةأساليب الطلاء، مما يسمح لنا لإنتاج كميات كبيرة من hPSCs متجانسة في إطار دورات نموا ثابتا دون شذوذ الكروموسومات الرئيسية 9. بدلا من ذلك، يمكن أن تنفذ الثقافة NCM مع جزيئات صغيرة ومصفوفات محددة (مثل laminins) المختلفة من أجل تحسين الأسلوب الثقافة لتطبيقات واسعة. هنا، نقدم عدة بروتوكولات مفصلة على أساس الثقافة NCM وتحدد الإجراءات التفصيلية للهندسة الوراثية. للتدليل على براعة بروتوكولات NCM، ونحن أيضا اختبار الثقافة NCM مع مثبطات ROCK المتنوعة ومع laminin الإسوي واحد 521 (أي LN-521).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

خلية واحدة غير القائمة على مستعمرة من نوع أحادي الطبقة (NCM) ثقافة hPSCs.

1. الاستعدادات

  1. جعل 500 مل من المتوسط ​​للثقافة الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs): المتوسطة DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 2 مم L-الجلوتامين، و 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA).
  2. عزل الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs) الخلايا المشتقة من سلالة CF1 بعد بروتوكول روتيني 16 و ثقافة MEFs على 0.1٪ 6 جيدا لوحة خلية ثقافة المغلفة الجيلاتين في DMEM المتوسطة. بدلا من ذلك، شراء أسهم في مرور 3 MEF من الموارد التجارية.
  3. إعداد لوحات Matrigel.
    1. تمييع 5 مل من HESC المؤهلين Matrigel الأسهم مع 5 مل من DMEM/F12 المتوسطة (برود في ~ 4 ° C) وتخزين 50٪ مأخوذة في الفريزر -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد في الأسهم Matrigel المجمدة في الثلاجة (4 ~ ° C) O / N والمزيد من تمييع Matrigel في البرد المتوسطة DMEM/F12 (أن تؤدي إلى تركيز العمل 2.5٪).
    2. إزالة لوحة Matrigel من الثلاجة، والسماح لوحة لتدفئة في RT في هود زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 30 دقيقة (ملاحظة: لا تدفئة لوحة في حاضنة الثقافة الخلية)، ونضح DMEM المتوسطة قبل الطلاء hPSCs.
  4. جعل 500 مل HESC المتوسطة: 80٪ DMEM/F12 المتوسطة، و 20٪ KSR، 2 مم L-الجلوتامين، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، 0.1 ملم β المركابتويثانول، و 4 نانوغرام / مل من جمعية جيل المستقبل-2.
  5. تحضير 10 مل من 2X hPSC تجميد المتوسطة: 60٪ FBS، 20٪ DMSO و 20 ميكرومتر Y-27632 في mTeSR1 المتوسطة، تعقيم عن طريق الترشيح، واستخدام المتوسط ​​في حدود 1 في الاسبوع.

2 بروتوكول 1 (الأساسية): تنمو المستعمرات hPSC على مغذيات

  1. استخدام أرقام مرور MEF في 5 أو 6 (تسمى P5 P6 و) للثقافة hPSC من أجل الحصول على بالنتيجه متسقةنهاية الخبر. ميتوتيكلي تعطيل MEFs عن طريق علاج الخلايا مع 10 ميكروغرام / مل C ميتوميسين لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا 3x أخرى مع 1X Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS)، ثم فصل MEFs مع 0.05٪ التربسين في 0.53 ملم EDTA. بدلا من ذلك، أشرق MEFs بجرعة 8،000 راد مع irradiator الأشعة السينية.
  2. حساب الأرقام الخلية باستخدام التريبان الأزرق طريقة وصمة عار الإقصاء تحت المجهر. بدلا من ذلك، استخدام عداد الخلايا التلقائي.
  3. لوحة MEFs المشع على لوحات البوليسترين 6 جيدا المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪ في كثافة 1.88 × 10 5 خلايا لكل بئر (أي 1.96 × 10 4 خلية / سم 2). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.
  4. إزالة مستنبت MEF بواسطة الشفط مع ماصة باستور (ملاحظة: لا يغسل الخطوات اللازمة في هذا الوقت).
  5. المستعمرات يسحن hPSC من الثقافة السابقة في كتل صغيرة، ودراسة كتل تحت المجهر لضمان أحجامها تتراوح الابام 50-100 ميكرون في أقطار، وكتل لوحة hPSC على الجزء العلوي من طبقات MEF المغذية في واحدة تحتوي أيضا 2 مل من hPSC المتوسط.
  6. تغيير HESC المتوسطة يوميا لمدة 3 إلى 5 أيام، والنمو مستعمرة سجل عن طريق الصورة، علامة على أي مستعمرات تغييرها شكليا أو متمايزة (~ 5٪)، ويدويا إزالة المستعمرات التي تميزت تطلع بلطف مع ماصة باستور.
  7. شطف المستعمرات المتبقية على MEFs مرتين (2 دقيقة لكل منهما مع مد برنامج تلفزيوني)، واحتضان المستعمرات مع 2 مل من 1 ملغ / مل كولاجيناز الرابع في hPSC متوسطة لمدة 10 إلى 30 دقيقة)، ودراسة مفرزة من المستعمرات hPSC من سطح MEF المغلفة (ملاحظة: استخدام مكشطة للمساعدة في عملية مفرزة إلا إذا تعلق المستعمرات بإحكام لوحة).
  8. إضافة 5 مل من hPSC المتوسطة إلى كل بئر للحد من التفاعلات الإنزيمية، المستعمرات نقل إلى أنبوب 15 مل، والسماح للمستعمرات hPSC الرواسب لمدة 3 إلى 5 دقائق على RT، وضمان الترسيب من المستعمرات التي كتبها التصور المباشر من جأذرع في الجزء السفلي من الأنبوب (ملاحظة: لا أنبوب الطرد المركزي في هذه الخطوة).
  9. إزالة supernatants تحتوي على MEFs المتبقية وفصل الخلايا واحد، resuspend والمستعمرات مع 5 مل من HESC المتوسطة، وكرر الخطوة الترسيب مرتين.
  10. إزالة المتوسطة، المستعمرات hPSC يسحن إلى كتل صغيرة، وتخزينها في 1X hPSC تجميد المتوسطة (أو CryoStore CS10 المتوسطة التجميد) لحفظ البرودة (1 متكدسة جيدا في قنينة مجمدة) أو لوحة على لوحة 6 جيدا لالركض الخلية.

3 بروتوكول 2: تحويل hPSC المستعمرات من مغذيات لNCM

  1. شطف الكريات hPSC في مد PBS مرة واحدة، واحتضان الكريات مع 1 مل من 1X Accutase لمدة 10 دقيقة، ودراسة رد الفعل الأنزيمية تحت المجهر للتأكد من التفكك وحيدة الخلية.
  2. إنهاء التفاعلات الإنزيمية عن طريق إعادة التعليق بلطف الخلايا في 5 مل من mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 تليها الطرد المركزي في 200 x ج في RT لمدة 5 دقائق(ملاحظة، لا تستخدم القوات الطرد المركزي المفرطة التي تسبب تلف الخلايا).
  3. إضافة 5 مل من mTeSR1 المتوسطة إلى بيليه، resuspend الكرية كما الخلايا واحدة، ومرشح فصل الخلايا من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر (لإزالة أي خلايا المجاميع المتبقية).
  4. البذور 1،3-2 × 10 6 hPSCs في بئر واحدة (1،4-2،1 × 10 5 خلية / سم 2) من لوحة 6 جيدا المغلفة مع 2.5٪ HESC المؤهلين Matrigel، إضافة mTeSR1 المتوسطة ما يصل الى 2.5 مل، وتشمل 10 ميكرومتر Y-27632 في المتوسط ​​(لتسهيل الأولي 24 ساعة الطلاء وحيدة الخلية). بدلا من ذلك، استخدام الجزيئات الصغيرة التالية لاستبدال 10 ميكرومتر Y-27632 لتعزيز وحيدة الخلية تصفيح: 1 ميكرومتر Y-39983 (ROCK أنا المانع)، 1 ميكرومتر phenylbenzodioxane (ROCK الثاني المانع)، 1 ميكرومتر thiazovivin (أ ROCK المانع رواية) ، و 2 ميكرومتر المانع JAK 1.
  5. استبدال المتوسطة مع خالية من المخدرات mTeSR1 المتوسطة في اليوم التالي (في غضون 24 ساعة)، فصل الخلايا من واحد إضافيأيضا، وحساب عدد الخلايا لتحديد خلية واحدة كفاءة الطلاء (ملاحظة: حوالي 50 إلى 90٪ من خلية واحدة والطلاء الكفاءة التي يمكن تحقيقها في هذه المرحلة).
  6. تسمح للخلايا أن تنمو باعتبارها شكلت خلية واحدة أحادي الطبقة لبضعة أيام مع 3 مل من mTeSR1 المتوسط. تغيير المتوسطة اليومية.
  7. تجريبيا تحديد جدول زمني لالركض تكييفها NCM اعتمادا على كثافة الخلية. مرور عندما يصل نمو الخلايا التقاء في اليوم 3 أو 4 أيام، أو في نقطة زمنية 4 ساعة بعد اختفاء الخلية الى خلية الحدود. فصل الخلايا في 1 مل من Accutase، استخدم 1-3 نسبة تقسيم (أي 1 متكدسة جيدا من الخلايا مطلي في 3 آبار من لوحة 6 جيدا) لالركض الخلايا، وتحقيق الاستقرار تكييفها NCM بنسبة 5 مقاطع.
  8. تجميد الخلايا
    1. الاستفادة من بئر واحدة متموجة (5-6 ~ X10 6 خلايا) لقنينة واحدة مجمدة: فصل خلايا متكدسة من بئر واحدة مع 1 مل من Accutase لمدة 10 دقيقة.
    2. تمييع ثإيث 5 مل من الخلايا المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي mTeSR1 كما هو موضح أعلاه.
    3. resuspend وبيليه في 500 ميكرولتر من mTeSR1 المتوسطة ثم قم بإضافة ببطء 500 ميكرولتر من 2X hPSC تجميد المتوسطة (التي تحتوي على 20 ميكرومتر Y-27632) في قارورة الحفظ بالتبريد. بدلا من ذلك، resuspend الخلايا في 1X hPSC تجميد المتوسطة التي تحتوي على 2 ميكرومتر المانع JAK 1 أو 1X CryoStor CS10 المتوسطة في وجود إما 10 ميكرومتر Y-27632 أو 2 ميكرومتر المانع JAK 1.
    4. وضع قارورة المجمدة إلى cryocontainer الجليد المبرد (شغل القاع مع isopranol) ونقل cryocontainer إلى -80 ° C الثلاجة على الفور.
    5. نقل الخلايا من الفريزر -80 درجة مئوية إلى خزان النتروجين السائل (في اليوم التالي) لحفظ البرودة على المدى الطويل.
  9. ذوبان الخلية
    1. استخدام واحد قارورة الحفظ بالتبريد لتصفيح 1 بئر من لوحة 6 جيدا.
    2. قبل الدافئة المتوسطة mTeSR1 في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وخلايا ذوبان الجليد في نفس الحمام المائي لمدة 2 دقيقة،إسقاط الحكيم إضافة خلايا إلى 5 مل من قبل تحسنت المتوسطة mTeSR1 تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632، وأجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
    3. resuspend بلطف الخلايا الكريات مع 2 مل من mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632 وببطء نقل الخلايا إلى بئر المغلفة مسبقا مع Matrigel (ملاحظة: تجنب إنتاج فقاعات الهواء).
    4. تغيير متوسطة يوميا ونتوقع نموا hPSC للوصول إلى نقطة التقاء في اليوم 3 أو 4.

4 بروتوكول 3: تحويل hPSC المستعمرات على Matrigel لNCM الثقافة

  1. إزالة لوحة Matrigel المغلفة من الثلاجة، ووضع لوحة في الثقافة هود الأنسجة لمدة 10 إلى 30 دقيقة، وإزالة المتوسطة من كل بئر من لوحة، وإضافة 2 مل من قبل تحسنت المتوسطة mTeSR1 إلى كل بئر.
  2. نقل كتل hPSC المسحوقة من الثقافة المغذية (الخطوة 2.10 البروتوكول الأساسية) إلى لوحة Matrigel أعلاه. إضافة mTeSR1 المتوسطة ما يصل الى 2.5 مل الحجم النهائي في كل بئر.
  3. تغيير متوسطة يوميا لمدة 3 إلى 4 أيامق حتى مستعمرات تصل إلى 80 إلى 90٪ التقاء.
  4. لالركض الخلية: شطف المستعمرات مع D-PBS مرتين، علاج الخلايا مع 1 مل من 2 ملغ / مل dispase عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة، والرواسب ومرور الخلايا كما كتل.
  5. للثقافة NCM: تكرار الخطوات 3،1-3،9 الموصوفة في البروتوكول 2.

5 بروتوكول 4: NCM ثقافة hPSCs على LN-521

  1. ذوبان الجليد في المؤتلف LN-521 الحل في 4 درجات مئوية قبل يوم من الاستخدام ويجعل الحل laminin طلاء (LCS) من خلال تمييع laminin إذابة مع 1X PBS-D (التي تحتوي على الكالسيوم 2 + / + 2 ملغ) إلى تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل.
  2. إضافة 1 مل من LCS لاحد جيد في لوحة 6 جيدا (ملاحظة: تجنب الجفاف من خلال عملية الطلاء).
  3. ختم لوحة المغلفة مع parafilm لمنع التبخر وتخزينها في الثلاجة لوحة (4 ° C) O / N (ملاحظة: استخدام لوحة في حدود 1 في الاسبوع).
  4. بلطف إزالة LCS مع ماصة باستور دون لuching السطح المطلي وإضافة 2 مل من mTeSR1 المتوسط ​​إلى واحد أيضا.
  5. تدفئة جميع الحلول الثقافة (بما في ذلك مد PBS) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
  6. تحويل المستعمرات إلى hPSC NCM
    1. فصل الركام الخلية إلى الخلايا واحد مع Accutase كما هو موضح في البروتوكول 2.
    2. البذور 1،3-2 × 10 6 hPSCs في واحدة LN-521-المغلفة جيدا (1،4-2،1 × 10 5 خلية / سم 2) من دون وجود مثبطات ROCK.
    3. تغيير متوسطة يوميا لمدة 3 إلى 4 أيام.
    4. فصل الخلايا في 1 مل من Accutase في اليوم 3 أو 4 لالركض الخلية التالية باستخدام 1-3 نسبة تقسيم.

6 بروتوكول 5: NCM الثقافة للDNA البلازميد ترنسفكأيشن

  1. التكيف مع المستعمرات hPSC للثقافة NCM كما هو موضح في البروتوكولات 2-4.
  2. لوحة فصلها hPSCs في 12 لوحة جيدا مع كثافة خلية من 7.5 × 10 5 خلية / جيدا في mTeSR1 المتوسطة في ظل وجود 10 ميكرومتر Y-27632.
  3. استبدال mTeSR1 المتوسطة مع خالية من المخدرات mTeSR1 المتوسطة بين 4-8 ساعة بعد الطلاء الخلايا.
  4. لكل ترنسفكأيشن، وتمييع 2.5 ميكروغرام من البلازميدات التعبير (على سبيل المثال، pmaxGFP) و 5 ميكرولتر من Lipofectamine عام 2000 في أنابيب إيبندورف منفصلة في 125 ميكرولتر من كل غروب MEM المصل انخفاض متوسط.
  5. بعد 5 دقائق، مزج الكواشف المخفف واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT (على شكل مجمعات ترنسفكأيشن).
  6. إضافة 250 ميكرولتر المجمعات ترنسفكأيشن لتحتوي كل منها على hPSCs جيدا في 1 مل mTeSR1 المتوسطة واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 لمدة 24 ساعة.
  7. دراسة كفاءة ترنسفكأيشن تحت المجهر مضان وصورة عشوائيا لحساب كفاءة ترنسفكأيشن الفعلي.

7 بروتوكول 6: NCM الثقافة للترنسفكأيشن من MicroRNAs

  1. فصل hPSCs شبه متموجة في يوم 2 في ظل ظروف NCM بإضافة 1 مل من Accutase لكل بئر في 6 جيدا لوحة.
  2. إضافة 10 مل من mTeSR1 المتوسطة لتخفيف التفاعلات الإنزيمية وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. resuspend الكرية الخلية مع mTeSR1 المتوسطة، البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 7.5 × 10 5 خلايا لكل بئر في لوحة 12 جيدا في mTeSR1 المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرومتر Y-27632، والسماح للخلايا نعلق لمدة 4 ساعة.
  4. استبدال المتوسطة مع خالية من Y27632 mTeSR1 المتوسط.
  5. استخدام المتاحة تجاريا microRNAs (على سبيل المثال، وعدم استهداف miRIDIAN ميرنا تحكم ترنسفكأيشن المسمى مع Dy547). يعاير بتركيزات تتراوح 0-160 نانومتر باستخدام الكواشف المقدمة واتباع تعليمات الصانعين.
  6. تحسين كفاءة ترنسفكأيشن لكل تركيز في خطوط hPSC عن طريق التصوير مضان Dy547 من الخلايا الحية تحت المجهر في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
  7. حساب الكفاءة ترنسفكأيشن على أساس النسبة المئوية للخلايا إيجابية Dy547 على جميع الخلايا المصورة.
. TLE "> 8 بروتوكول 7: NCM الثقافة للتنبيغ من ناقلات Lentiviral

  1. كرر الخطوات من 7،1-7،4 البروتوكول 6.
  2. حساب كميات من الجسيمات الفيروسية لاستخدامها في تنبيغ: استخدام الصيغة التالية: = TU (وزارة الداخلية س CN) / VT، في حين TU يدل على العدد الإجمالي من وحدات تحويل، وزارة الداخلية يساوي تعدد المطلوب من العدوى في البئر (وزارة الداخلية أو TU / خلية)، CN يحدد عدد الخلايا في كل بئر، وVT يشير الأسهم التتر الفيروسية (TU / مل). على سبيل المثال، بالنظر إلى أن الأسهم التتر الفيروسية لSMART-shRNA ناقلات يساوي 1 × 10 9 TU / مل (وحدات تحويل لكل مل)، 7.5 × 10 5 خلايا لكل بئر في وقت تنبيغ، وزارة الداخلية المتوقعة من 20: استخدام 15 ميكرولتر من الأسهم الجسيمات الفيروسية لكل بئر (ملاحظة: ينصح هذا الشرط لعابرة lentiviral الاستقراء).
  3. قبل الدافئة 300 ميكرولتر من mTeSR1 المتوسطة مع 10 ملغ / مل من polybrene لمدة 30 دقيقة.
  4. إضافة 15 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية في الأسهمالمتوسط ​​mTeSR1 قبل حرارة تحتوي على polybrene والمزيج بلطف الحل.
  5. استبدال مستنبت الخلايا مع 300 ميكرولتر من المتوسطة prewarmed تحتوي على جسيمات فيروسية.
  6. بعد 4 ساعات الحضانة، دراسة turboGFP مضان (صانع للshRNA التعبير) لتحديد كفاءة تنبيغ.
  7. إضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة mTeSR1 إضافية إلى transducing بشكل جيد عندما تبدأ الخلايا في التعبير عن turboGFP.
  8. بعد 12-16 ساعة الحضانة، وإعادة النظر توربو GFP التعبير.
  9. أداء المطلوب التجارب المتابعة مع هذه الخلايا transduced في غضون 72 ساعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

والمخطط العام للثقافة NCM

يمثل الشكل 1 نموذجي NCM الثقافة مخطط يوضح التغيرات الدينامية من hPSCs بعد ارتفاع الكثافة الطلاء وحيدة الخلية في وجود المانع ROCK Y-27632. وتشمل هذه التغييرات المورفولوجية وصلات بين الخلايا بعد الطلاء، وتشكيل مجموعات الخلوية، ونمو الخلايا الأسي تليها التكثيف الخلية (الشكل 1A). تجربة تمثيلية يشير WA01 (H1) hESCs، مطلي على شكل خلايا وحيدة في مناطق ذات كثافة من 1.9 × 10 5 خلية / سم 2 في حضور 10 ميكرومتر Y-27632 في يوم 1 (1B الشكل، لوحة اليسار)، نشر مزيد من دون تشكيل مستعمرات (الشكل 1B، لوحة وسط) في يوم 2، ومكثف كما أحادي الطبقة المتجانسة التي هي مناسبة لإجراء التجارب المطلوبة أو الركض لخلية في اليوم 3 (الشكل 1B، اللوحة اليمنى).

<قوية> مثبطات ROCK مختلف دعم الثقافة NCM

تم استخدام لوحة 96 جيدا مقايسة لإثبات صحة مفهوم الإنتاجية العالية فحص المخدرات. وقد صمم أيضا لتحقيق الاستخدام الأمثل لمختلف مثبطات ROCK لدعم الثقافة NCM. تقريبا، 31،000 فصل الخلايا SCU-I10، والخلايا المحفزة التي يسببها الإنسان (hiPSCs) 17، كانت مطلية على واحد جيد في وجود تركيزات مختلفة من مثبطات ROCK المغلفة Matrigel. بعد 24 ساعة، وتعرض الخلايا إلى CCK-8 استنادا بقاء فحص لتحديد بقاء الخلية في ظل هذه الظروف. لقد أظهرنا سابقا أن الأسلوب NCM يتطلب استخدام المانع ROCK، Y-27632، في 10 ميكرومتر لتعزيز الطلاء وحيدة الخلية. في هذا التقرير، أن أكدت أن 10 ميكرومتر Y-27632 زيادة كبيرة على مدار 24 ساعة، خلية واحدة تصفيح كفاءة hiPSCs (P <0.05) (الشكل 2). وجدنا أيضا أن Y-39983 (ROCK أنا المانع)، phenylbenzodioxane (ROCK الثاني مثبطاتتور)، وthiazovivin (أ ROCK المانع رواية) تعدل بشكل ملحوظ وحيدة الخلية كفاءة الطلاء وتعزيز النمو NCM في 1 ميكرومتر بالمقارنة مع ضوابطها (P <0.05) (الشكل 2). علاوة على ذلك، كانت آثار مثبطات ROCK الثلاثة (في 1 ميكرومتر) على خلية واحدة كفاءة الطلاء مماثلة لتلك التي Y-27632 في 10 ميكرومتر (P> 0.05) (الشكل 2). ومن الجدير بالذكر أن ROCK أنا المانع (في 5 ميكرومتر) ويبدو لاظهار السمسة وضوحا مقارنة مع المخدرات في 1 ميكرومتر (P <0.05)، تورط تفاعل أكثر تحديدا من الجزيئات الأخرى. وبالتالي، يمكن استخدام مختلف مثبطات ROCK لدعم الثقافة NCM في المستقبل. ومع ذلك، فإن توصيف كاملة من كلا hESCs وhiPSCs تحت NCM مع هذه المثبطات الجديدة سوف تكون هناك حاجة لاستخدامها في المستقبل.

LN-521 تدعم الثقافة NCM من دون استخدام مثبطات ROCK

لتحديد رانه دور الإسوي laminin محددة في دعم النمو HESC، ونحن مثقف hiPSCs SCU-I30 على لوحات LN-521 المغلفة في خالية من XENO المتوسطة TeSR2. ومن المثير للاهتمام، LN-521 وحده، من دون وجود مثبطات ROCK، ويدعم الطلاء وحيدة الخلية والنمو NCM اللاحقة لمدة 15 ممرات تحت هذا الشرط (الشكل 3). وأشار المناعية للخلايا SCU-I30 مع الأجسام المضادة بولكلونل مكافحة NANOG أن الخلايا تحت هذا الشرط كان ارتفاع التعبير NANOG في نوى (الشكل 3A). وأظهر تحليل تدفق cytometric أن HESC علامة الشخصى التعبير كان مماثلة إلى الخلايا المزروعة كما NCM باستخدام مثبط ROCK Y-27632 (الشكل 3B).

كفاءة عالية التسليم الرنا الميكروي من دون استخدام جزيئات lentiviral

وأجري ترنسفكأيشن مع microRNAs قليل النوكليوتيد Dy547 المسمى في WA01 (H1) الخلايا تحت الظروف NCM. كانت تزرع hESCs WA01 كما NCM على 2.5٪ Matrigel في mTeSR1 ل2 (الشكل 4A) و 18 (الشكل 4B) مقاطع التوالي. وأظهرت هذه الخلايا عالية الكفاءة ترنسفكأيشن 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن (أرقام 4A و 4B). عموما، يمكننا الحصول على ترنسفكأيشن كفاءة تصل إلى 91٪ في hESCs في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

الشكل 1
الشكل 1 (أ) مخطط للثقافة NCM. الرسم البياني خط يحدد التغيرات الدينامية النقابية متعددة الخلايا في ثقافة نموذجية لمدة 3 أيام في ظل ظروف NCM. (B) وصور المرحلة ممثل WA01 (H1) hESCs نشر تحت شرط NCM على 2.5٪ Matrigel في mTeSR1 متوسطة لمدة 16 مقاطع (المعين كما WA01، mcp16). اللوحة السفلى هو رأي الموسع لوحة العلوي. أشرطة النطاق تشير إلى 100 ميكرومتر.EF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" الهدف = "_blank"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. وحيدة الخلية المقايسات بقاء باستخدام تنسيق 96 جيدا. تقريبا، كانت مطلية 31،000 hiPSCs SCU-I10 17 على 2.5٪ Matrigel بحضور مختلف مثبطات جزيء صغير كيناز رو المتعلقة المصاحب (ROCK) مسارات بتركيزات أشارت . بعد 24 ساعة، وتعرض الخلايا إلى CCK-8 بقاء الفحص عن طريق قياس الامتصاصية في 450 نانومتر (A450). كان يستخدم الطالب اختبار t لتحديد ما إذا كانت الاختلافات في وحيدة الخلية كفاءة الطلاء بين مختلف مثبطات ROCK هي ذات دلالة إحصائية. علامة النجمة المفرد (*) يشير إلى عدم وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين مثبطات (P & #62؛ 0.05)، في حين أن علامات نجمية مزدوجة (**) يدل على الفرق الملحوظ هو ذات دلالة إحصائية (P <0.05). الأعمدة في رسوم بيانية تعيين القيم يعني من المحددات quadruplicate والحانات تمثل الانحرافات المعيارية.

الرقم 3
تأسست الشكل 3. الثقافة NCM من hiPSCs على laminin-521 (LN-521) دون وجود مثبطات ROCK. خط hiPSC SCU-I30 في المعاهد الوطنية للصحة الجذعية وحدة الخلية. وقد نمت الخلايا SCU-I30 على LN-521 المغلفة 6 لوحات جيدة في خالية من XENO متوسطة لمدة 15 TeSR2 الممرات من دون استخدام مثبطات جزيء صغير مثل مثبطات ROCK (أ) من الخلايا المناعية SCU-I30 مع لمكافحة -NANOG بولكلونل الأجسام المضادة و counterstained مع هويشت 33342 (هويشت). والجدير بالذكر أن بعض الخلايا التي تحتوي على NANOG تلطيخ السلبية هي الخلايا ه تحت الانقسام. (B) تدفق تحليل cytometric من hPSC علامة التعبير في الخلايا SCU-I30 كما نمت NCM على 2.5٪ Matrigel مع استخدام 10 ميكرومتر Y-27632 (لوحة العلوي) أو NCM على LN-521 دون Y-27632 (لوحة السفلى). وقد وصفت الإجراءات لكلا المناعية وتحليل تدفق cytometric سابقا 5. أشرطة النطاق تصوير 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. كانت تزرع ثقافة NCM من hPSCs لالرنا الميكروي ترنسفكأيشن WA01 hESCs كما NCM على 2.5٪ Matrigel في mTeSR1 ل2 (أ) و 18 (ب) من المقاطع، على التوالي. المرحلة ومضان الصور ممثل الخلايا WA01 transfected مع دي547 المسمى microRNAs السيطرة لرصد كفاءة ترنسفكأيشن في 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن. أشرطة النطاق تمثل 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك طريقتان الرئيسية لhPSCs الثقافة في المختبر: الثقافة التقليدية مستعمرة من نوع (الخلايا على مغذيات أو مصفوفات خارج الخلية) والثقافة تعليق hPSCs كما المجاميع دون مغذيات 6. وتشمل القيود المفروضة على حد سواء من نوع المستعمرة وتعليق وسائل الثقافة التجانس المتراكمة وتغييرات جينية للتوريث. ثقافة NCM، استنادا إلى كل من الركض وحيدة الخلية وذات الكثافة السكانية العالية والطلاء الخلية، يمثل طريقة جديدة للثقافة hPSC نمو 6،18. على الرغم من أن تم توثيق مختلف أساليب الركض وحيدة الخلية في الأدب، ولكنها تستخدم أيا منها لانتشار روتينية. على سبيل المثال، استخدمت وو وزملاؤه طريقة الركض وحيدة الخلية لدراسة الآثار المترتبة على مختلف الجزيئات الصغيرة على النمو الكوكتيلات hPSC 19. ومع ذلك، منتجاتها النهائية هي ثقافة المستعمرات. لذلك، المستندة إلى منخفض الكثافة أساليب الركض وحيدة الخلية لا تزال تنتمي إلى مستعمرة من نوع الثقافة. فيما يتعلق الثقافة NCM، أوكار عاليةالطلاء إيتي يحول هذه الثقافة لطريقة جديدة، منذ المنتج النهائي الخلية هو أحادي الطبقة متجانسة. في الآونة الأخيرة، وتستخدم دفوراك وزملاؤه طريقة مماثلة لتحليل شامل خصائص hPSC تحت هذا الشرط النمو 18. كما تدعم نتائجها الاستنتاجات الرئيسية لدينا. فمن الواضح الآن أن الثقافة NCM هو أسلوب الناشئة التي تمتلك العديد من الخصائص الجديدة ويمكن تعديلها لمزيد من العديد من التطبيقات المحتملة في علم الأحياء الخلايا الجذعية المحفزة.

الخصائص الأساسية لhPSCs من الثقافة NCM

فمن المتصور أن hPSCs تحت NCM حصة الثقافة في العديد من الصفات مع نفس أنواع الخلايا كما نمت المستعمرات 9،18. مستويات التعبير عن علامات HESC في hPSCs، والتي تشمل 4 أكتوبر، NANOG، SSEA-3/4، ترا-1-60، ترا-1-81-1 وSSEA، متشابهة في كل NCM ومستعمرة من نوع ثقافة . خلايا NCM تكييفها أيضا الاحتفاظ أنماط التعبير مرنا عالمي مماثل للمستعمرات hPSC نمت على MEF طبقات المغذية 9. بوضوح، وخلايا NCM تكييفها-حفاظ على الدولة المحفزة على النحو الذي يحدده مسخي مقايسة 9،18. ولكن، خلافا المستعمرات hPSC، الخلايا تحت الظروف NCM يكون معدل النمو يمكن التنبؤ بها التي تتميز منحنيات النمو متسقة، ودورات الخليوي، وأرقام الخلية 9. ويرجع ذلك إلى ارتفاع الكثافة الطلاء وحيدة الخلية، hPSCs في ظل ظروف NCM تظهر النمو الهائل بين أيام 2 و 4 (الشكل 1B)، وبالتالي زيادة عدد الخلايا بنسبة 4 أضعاف بالمقارنة مع المستعمرات hPSC نمت على MEFs. الثقافة لفترات طويلة لا يزيد إنتاج خلايا، وإنما يزيد من أفكارك والتمايز الإجهاد 9. كما تمكن NCM الحفظ بالتبريد الأمثل، مما يسمح الانتعاش السريع للخلايا على الخلايا تصفيح إذابة (بروتوكول 1). علاوة على ذلك، NCM يسهل التكيف للثقافة hPSC لمختلف بروتوكولات خالية من XENO 9. بشكل عام، NCM يدعم نمو hPSCs، تحتفظ الدولة المحفزة، ويحافظ على الهياجالمكاني من hPSCs على التمايز إلى أنسجة البالغين من الطبقات الجرثومية الثلاث.

الاستقرار الكروموسومات في hPSCs تحت NCM

من حيث الاستقرار الكروموسومات، وليس هناك مقارنة مباشرة بين الخلايا من وسائل الثقافة المختلفة. غالبية hPSCs في ظل ظروف ثقافتنا NCM ديك كروتب] طبيعية والأرقام نسخة الجين على النحو الذي يحدده G-النطاقات، القائم على مجموعة التهجين الجينومي المقارن (aCGH)، ومضان التهجين في الموضع (FISH) 9. خطين (~ 13٪) وأظهرت كروتب] غير طبيعية، والتي سطر واحد (أي WA09) عرضت تعدد الصيغ الصبغية مرتفعة وآخر (ES01) كان 14٪ من الخلايا مع تثلث الصبغي 20 9. ومن غير الواضح ما إذا كانت هذه كروتب] الشاذة المستمدة من اختيار الخلايا المتحولة الموجودة مسبقا قبل الثقافة NCM أو بفعل خلال NCM التكيف. من المهم أن تبدأ المستعمرات hPSC أو فرعية من المستعمرات تستخدم لNCM الثقافة SHولد تكون تتميز جيدا من حيث التجانس والاستقرار الكروموسومات في الوقت للتكيف NCM. ومن الجدير بالذكر أن معدل كروتب] غير طبيعية في ظل ظروف NCM هو أقل بكثير من تلك التي ذكرت في تحليل الفوج الأخيرة، والتي تكشف عن الكتاب: 34٪ [كروتب غير طبيعية تحت الغالبة مستعمرة من نوع الظروف الثقافة 20. وبالتالي، تشير دراستنا أننا يمكن أن تنمو الخلايا وحيدة فصلها والحفاظ على الاستقرار الكروموسومات في ظل ظروف NCM. ومع ذلك، فإننا بحاجة أيضا إلى استخدام أساليب أكثر حساسية لفحص شذوذ الكروموسومات من hPSCs في السنوات المقبلة. ولا سيما، ونحن بحاجة لمسح الكروموسومات 1، 12، 17، و 20 باستخدام تحقيقات دقة أعلى (أي <50 كيلو بايت)، وبعض الآفات الطفيفة (على سبيل المثال، AMPLICON 20q11.21) في هذه الكروموسومات غيرت في كثير من الأحيان لا يمكن الكشف عنها بواسطة التقليدية تنميط نووي وFISH 20-22. وعلاوة على ذلك، فإن تطوير بروتوكولات متنوعة NCM تمكننا من تحديد روبوالحادي وطرق آمنة لتطبيقات المستقبل.

ثقافة NCM تحت التعديلات المتنوعة

استخدام مثبط ROCK، Y-27632، فتحت الباب لفحوصات وحيدة الخلية القائمة. سوف توفر مثبطات ROCK متنوعة توفر خيارات إضافية للتوسع تقوم NCM والحفظ بالتبريد من hPSCs (الشكل 2). من الناحية النظرية، أي جزيء صغير، التي يمكن أن تزيد بشكل كبير وحيدة الخلية كفاءة الطلاء، ويمكن استخدامها لتسهيل الثقافة NCM. JAK المانع 1، التي تعمل بشكل مختلف عن تلك المثبطات ROCK، يمثل هذا المثال 9. استخدام جزيئات واحدة أو نهج اندماجي قد توفر لنا النمو الأمثل الخلية، المقايسات الخلوية، والحفظ بالتبريد من hPSCs. ومع ذلك، والثقافة NCM بديلة للhPSCs على تعريف البروتينات المصفوفة خارج الخلية، مثل laminin الإسوي LN-521، أعرب عادة في hESCs 23-25، قد تدخل القضاء الصغيرةجزيئات (الشكل 3). LN-521 قد تعزز بقاء فصلها-hPSC ويديم تعدد القدرات من خلال تفعيل المسار α6β1-PI3K/AKT 24. بساطة hPSCs الركض مع LN-521 يقلل من التجانس من الخلايا، متوافقة مع مختلف نظم زراعة الخلايا وخالية من XENO خالية من التغذية باستخدام المتوسطة محددة تماما (البروتوكول 4). كما يوفر وحدة إضافية لفحوصات عالية الإنتاجية دون تأثير جزيئات صغيرة. على الرغم من أن iPSCs تحت ثقافة NCM على LN-521 الإبقاء على التعبير عن لجنة من علامات hPSC، مزيد من توصيف هذه الخلايا باستخدام مقايسة مسخي ومضغي الشكل بوساطة الجسم multilineage التمايز قد يكون من الضروري تأكيد الدول المحفزة في هذه الخلايا. من المذكرة، مثقف hiPSCs على laminin الإسوي LN-521 ويقال مستقرة cytogenetically (http://biolamina.com/). ومع ذلك، فإننا بحاجة أيضا إلى تطبيق دقة عالية وحساسة طرق (كما نوقش أعلاه) لمراسلتيxamine استقرار الكروموسومات في هذه الخلايا.

براعة الثقافة NCM عن الهندسة الوراثية

أساليب تستند NCM-تمثل نظام بسيط وقوية، والاقتصادية التي قد تكون مفيدة بشكل خاص للتلاعب الجيني للhPSCs (بروتوكولات 5-7). فمن المعروف أن المستعمرات HESC يصعب بالنقل أو تنبيغ، مع تفاوت كبير في الكفاءة ترنسفكأيشن / تنبيغ بين المختبرات المختلفة 26-28. على سبيل المثال، الكفاءة ترنسفكأيشن في hESCs يتراوح 3-35٪ في ظل ظروف ثقافة مستعمرة 26. تم العثور على إشارات تنبيغ Lentiviral في الخلايا BG01 في ظل ظروف مستعمرة لتكون منخفضة للغاية 9. ومع ذلك، كان كفاءة ترنسفكأيشن بوساطة NCM أكبر من 75٪ 9 وتعديل أساليب تنبيغ يمكن أن تزيد بوساطة تنبيغ الفيروسة البطيئة كفاءة تصل إلى 90٪ 28. وكشفت دراسة مقارنة ضيق أنه هو اله جمعيات متعددة الخلايا في مستعمرات HESC التي تساهم في انخفاض كفاءة ترنسفكأيشن 9. وعلاوة على ذلك، ونحن قد عدلت مؤخرا بروتوكول ترنسفكأيشن الرنا الميكروي وقادرون على تحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن عالية (~ 91٪) من دون استخدام lentiviruses (البروتوكول 6 والشكل 4). هذا البروتوكول هو سهلة الاستخدام ومفيدة بشكل خاص للتجارب ترنسفكأيشن عابرة ضمن 3 - الإطار الزمني لمدة 5 أيام. ونحن المحددة في البروتوكولات أعلاه، ينبغي أن تؤخذ عوامل متعددة في الاعتبارات عندما كنا تحسين كفاءة ترنسفكأيشن / تنبيغ في hPSCs. وتشمل هذه العوامل كثافة الخلايا، وتركيزات البلازميد، lentiviral التتر، تعدد العدوى (وزارة الداخلية)، ومدة ترنسفكأيشن / تنبيغ، السمسة من الكواشف، والأساليب المستخدمة لرصد كفاءة ترنسفكأيشن / تنبيغ.

نحن إعداد وتقديم أساليب NCM لhPSCs الثقافة على Matrigel ومصفوفات خارج الخلية على المعرفة. هذا الأسلوب الثقافةهو وسيلة فعالة للقضاء على عدم التجانس التي توجد عادة في hPSC مستعمرة والثقافات تجميعها. الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان في ظل ظروف النمو NCM هي المحفزة ومستقرة صبغويا. هذا النظام الثقافة رواية بسيطة وتنوعا للصيانة hPSC، وتوسيع نطاق واسع، والتلاعب الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL  Model RX-650 X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates Becton Dickinson Labware 353046 Polystyrene plates
DMEM Invitrogen Inc. 11965–092 For MEF medium
Mitomycin C Roche 107409 Mitotic inhibitor
Trypsin Invitrogen Inc. 25300-054 For MEF dissociation
DMEM/F12 Invitrogen Inc. 11330–032 For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium  Invitrogen Inc. 31985-062 For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS Invitrogen Inc. 16000–044 Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement Invitrogen Inc. 10828–028 KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids Invitrogen 11140–050 NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine Invitrogen  25030–081 Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements StemCell Technologies 5850 Animal protein-free
TeSR2 & Supplements StemCell Technologies 5860 Xeno-free medium
β-mercaptoethanol Sigma  M7522 Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		 American Type Culture Collection (ATCC)  SCRC-1040 For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel BD Bioscience 354277 For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521 BioLamina LN521-02 Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic) R&D Systems, MN 223-FB Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I EMD4 Biosciences 420099 An inhibitor of Janus kinase
Y-27632 EMD4 Biosciences 688000 ROCK inhibitor
Y-27632 Stemgent 04-0012 ROCK inhibitor
Y-39983 Stemgent 04-0029 ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane Stemgent 04-0030 ROCK II inhibitor
Thiazovivin Stemgent 04-0017 A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer BD Bioscience 352340 40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C Thermo Scientific  C6516F-1 “Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000 Invitrogen Inc. 11668-027 Transfection reagents
DharmaFECT Duo Thermo Scientific T-2010-02 Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control Thermo Scientific IP-004500-01-05 Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNA Thermo Scientific  To be determined Lentiviral vector
pmaxGFP amaxa Inc (Lonza) Included in every transfection kit Expression plasmid for transfection control
Oct-4 Santa Cruz Biotechnology sc-5279 Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1 Santa Cruz Biotechnology sc-21702 Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4 Santa Cruz Biotechnology sc-21704 Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60 Santa Cruz Biotechnology sc-21705  Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81 Santa Cruz Biotechnology sc-21706 Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51) Santa Cruz Biotechnology sc-8020 Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein Santa Cruz Biotechnology sc-8399 AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19) Santa Cruz Biotechnology sc-9187 FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1) Thermo Scientific MS-295-P0 Mouse IgG1
Desmin Thermo Scientific RB-9014-P1 Rabbit IgG
Anti-NANOG ReproCELL Inc, Japan RCAB0004P-F Polyclonal antibody 
Rat anti-GFAP Zymed 13-0300 Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3) Cedarlane Laboratories Ltd. CL2513A Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4) DakoCytomation Inc IR611/IS611 Mouse IgG2a
Nestin Chemicon International MAB5326 Rabbit polyclonal antibody
TUBB3 Convance Inc MMS-435P Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12) Cell Signaling Technologies 3113 Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution) Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in D-PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Tags

بيولوجيا الخلايا الجذعية، العدد 89، والخلايا الجذعية المحفزة، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية، والخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها، زراعة الخلايا، غير مستعمرة من نوع أحادي الطبقة، وحيدة الخلية، والطلاء الكفاءة، كيناز رو المصاحب، Y-27632، ترنسفكأيشن، تنبيغ
الثقافات البديلة لافرة القوة البشرية الجذعية إنتاج الخلية، الصيانة، والتحليل الوراثي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, … More

Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, P. G., Mallon, B. S. Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51519, doi:10.3791/51519 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter