Introduction
הקיבולת של hPSCs לבדל לכיוון רקמות בוגרות multilineage פתחה אפיקים חדשים לטיפול בחולים הסובלים ממחלות קשות הכרוכים בלב וכלי דם, כבד, לבלב, ומערכות נוירולוגיות 1-4. סוגי תאים שונים הנגזרים מhPSCs היינו גם מספקים פלטפורמות סלולריות חזקות לדוגמנות מחלה, הנדסה גנטית, הקרנת סמים, ו1,4 בדיקה טוקסיקולוגית. הנושא המרכזי המבטיח יישומים הקליניים ותרופתיים עתידם הוא הדור של מספרים גדולים של hPSCs קליני כיתה באמצעות תרבית תאים במבחנה. עם זאת, מערכות התרבות הנוכחיות הם או לא מספיק או מטבעו משתנה, הכוללים תרבויות ומזין ללא מזין שונות של hPSCs כמושבות 5,6.
צמיחת מושבה מסוג מניות hPSCs הרבה תכונות מבניות של מסת התאים הפנימית (ICM) של עוברי יונקים מוקדמים. ICM הוא נוטה להתמיין לשלוש ניבט שכבותבסביבה תאית, בשל קיומה של הדרגתיים איתות הטרוגנית. לכן, הרכישה של ההטרוגניות בהתפתחות עוברית מוקדמת נחשבת כתהליך הנדרש לבידול, אבל תכונה לא רצויה של תרבות hPSC. ההטרוגניות בתרבות hPSC מושרה לעתים קרובות על ידי אותות אפופטוטיים מוגזמים והתמיינות ספונטנית בשל תנאי גידול אופטימליים. כך, בתרבות של מושבה מסוג התאים הטרוגנית הם נצפו לעתים קרובות בפריפריה של המושבות 7,8. זה כבר גם הראה כי התאים בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC) מושבות תגובות ההפרש תערוכה למולקולות איתות כגון BMP-4 9. יתר על כן, שיטות תרבות המושבה לייצר תשואות תא נמוכות, כמו גם שיעורי החלמה תא נמוך מאוד מהקפאה בשל שיעורי צמיחה בלתי נשלטים ואיתות אפופטוטיים מסלולי 6,9. בשנים האחרונות, תרבויות השעיה שונות פותחו עבור hPSCs culturing, particulקארלי להרחבה של כמויות גדולות של hPSCs ובמזין תנאים 6,10-13 ללא מטריצה. ברור שיש להם מערכות תרבות שונות יתרונות משלהם וחסרונות. באופן כללי, הטבע הטרוגנית של hPSCs מייצג את אחד החסרונות העיקריים בשיטות מושבה מסוג והתרבות מצטברת, שהם הכי מוצלח להעברת חומרי DNA ו-RNA לhPSCs להנדסה גנטית 6.
ברור, יש צורך הכרחי כדי לפתח מערכות חדשות הלעקוף כמה חסרונות של שיטות תרבות הנוכחיות. התגליות של מעכבי מולקולה קטנים (כגון מעכב ROCK Y-27632 וJAK מעכב 1) המשפרות את הישרדות תא בודד לסלול את הדרך לתרבות ניתק-hPSC 14,15. עם השימוש במולקולות קטנות אלה, יש לנו לאחרונה פיתחו שיטת תרבות המבוססת על סוג הלא מושבה צמיחה (מלח"י) של ניתק-hPSCs 9. שיטת התרבות החדשנית זו משלבת גם passaging תא בודד וצפיפות גבוההציפוי שיטות, מאפשר לנו לייצר כמויות גדולות של hPSCs הומוגנית תחת מחזורי צמיחה עקביים ללא פגמים בכרומוזומים עיקריים 9. לחלופין, תרבות לח"י עלולה להיות מיושמת עם מולקולות קטנות שונות ומטריצות מוגדרות (כגון laminins) על מנת לייעל את שיטת התרבות עבור יישומים רחבים. כאן, אנו מציגים כמה פרוטוקולים מפורטים המבוססים על תרבות לח"י ולהתוות נהלים מפורטים להנדסה גנטית. כדי להדגים את הרבגוניות של פרוטוקולים מלח"י, אנחנו גם נבדקו תרבות לח"י עם מעכבי ROCK מגוונים ועם איזופורם laminin אחת 521 (כלומר, LN-521).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
תרבות monolayer סוג הלא מושבה תא בודד מבוסס (מלח"י) של hPSCs.
1. הכנות
- הפוך 500 מיליליטר של מדיום לתרבות של fibroblasts העכבר העוברי (MEFs): מדיום DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו0.1 חומצות מ"מ שאינו חיוניים אמינו (NEAA).
- לבודד fibroblasts עכבר העוברי תאים (MEFs) נגזרים מזן CF1 בעקבות פרוטוקול שגרתי 16 והתרבות MEFs על 0.1% צלחת תרבית תאי 6 גם ג'לטין מצופה במדיום DMEM. לחלופין, לרכוש מניות MEF בחלוף 3 ממקורות מסחריים.
- הכן את צלחות Matrigel.
- לדלל 5 מיליליטר של מניית Matrigel hESC מוסמך עם 5 מיליליטר של מדיום DMEM/F12 (המקורר ב ~ 4 ° C) וחנות כaliquots 50% ב-20 ° C במקפיא. להפשיר את מניית Matrigel הקפואה במקרר (~ 4 ° C) O / N ולדלל את Matrigel נוסף במדיום DMEM/F12 קר (כדי להצמיח ריכוז עובד 2.5%).
- הסר את צלחת Matrigel מהמקרר, לאפשר את הצלחת כדי לחמם ב RT במכסת מנוע תרבית תאים ל10-30 דקות (שים לב: לא לחמם את הצלחת בתרבית תאי חממה), ולשאוב DMEM לפני ציפוי בינוני hPSCs.
- הפוך 500 בינוני מיליליטר hESC: 80% בינוניים DMEM/F12, 20% KSR, 2 מ"מ L-גלוטמין, 0.1 חומצות אמינו לא חיוניות מ"מ, 0.1 מ"מ β-mercaptoethanol, ו -4 ng / מיליליטר של FGF-2.
- הכן 10 מיליליטר של מדיום הקפאת 2X hPSC: FBS 60%, DMSO 20%, ו20 מיקרומטר Y-27632 במדיום mTeSR1, לעקר על ידי סינון, ולהשתמש במדיום בתוך השבוע 1.
. 2 פרוטוקול 1 (בסיסי): לגדול hPSC מושבות על האכלה
- השתמש במספרים מעבר MEF ב 5 או 6 (כאזור P5 ו P6) לתרבות hPSC על מנת לקבל resul העקביts. Mitotically להשבית MEFs על ידי טיפול בתאים עם C mitomycin 10 מיקרוגרם / מיליליטר למשך 3 שעות ב 37 ° C, לשטוף את התאים 3x עם פוספט שנאגר מלוח של 1X Dulbecco (D-PBS), ולאחר מכן לנתק את MEFs עם 0.05% טריפסין ב0.53 מ"מ EDTA. לחלופין, להקרין MEFs במינון של 8,000 ראד עם irradiator רנטגן.
- לספור מספרים סלולריים בשיטת הרחקת כתם Trypan הכחולה מתחת למיקרוסקופ. לחלופין, השתמש בדלפק תא אוטומטי.
- MEFs מוקרן צלחת על צלחות קלקר 6 היטב מצופה ג'לטין 0.1% בצפיפות של 1.88 x 10 5 תאים לכל טוב (כלומר, 1.96 x 10 4 תאים / 2 סנטימטר). דגירה התאים ב 37 ° C ו 5% CO 2 למשך 24 שעות.
- הסר את מדיום תרבות MEF על ידי שאיפה עם פיפטה פסטר (שים לב: לא צעדים לשטוף צורך בשלב זה).
- מושבות Triturate hPSC מהתרבות קודמת לגושים קטנים, לבחון את הגושים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח הגדלים שלהם החל frאום 50-100 מיקרומטר בקטרים, וצלחת גושי hPSC בחלק העליון של שכבות מזין MEF בבאר אחת המכיל 2 מיליליטר של מדיום hPSC.
- שינוי hESC בינוני ביום למשך 3 עד 5 ימים, צמיחת מושבה שיא בתמונה, לסמן כל מושבות מורפולוגית שינו או הבדיל (~ 5%), ולהסיר באופן ידני את המושבות המסומנות בעדינות על ידי שאיפה עם פיפטה פסטר.
- יש לשטוף את המושבות שנותרו על MEFs פעמיים (2 דקות כל אחד עם D-PBS), דגירה המושבות עם 2 מיליליטר של 1 מ"ג / IV collagenase מיליליטר במדיום hPSC ל10-30 דקות), ולבחון את הניתוק של מושבות hPSC מ משטח מצופה-MEF (הערה: להשתמש מגרד כדי לסייע בתהליך הניתוק רק אם המושבות הן מחוברים בחוזקה לצלחת).
- הוסף 5 מיליליטר של מדיום hPSC היטב כל אחד כדי למזער תגובות אנזימטיות, מושבות להעביר צינור 15 מיליליטר, לאפשר מושבות hPSC למשקעים במשך 3 עד 5 דקות ב RT, ולהבטיח את שקיעה של מושבות על ידי הדמיה ישירה של גאמות בחלק התחתון של הצינור (הערה: לא צנטריפוגות הצינור בשלב זה).
- הסר את supernatants המכיל MEFs שייר וניתק תאים בודדים, resuspend המושבות עם 5 מיליליטר של מדיום hESC, ולחזור על שלב השיקוע פעמיים.
- הסר את המדיום, מושבות hPSC triturate לתוך גושים קטנים, חנות ב1X hPSC הקפאה בינונית (או בינוני הקפאת CryoStore CS10) לשימור בהקפאה (מחוברות 1 גם לכל בקבוקון קפוא) או צלחת על צלחת 6 היטב לpassaging תא.
3 פרוטוקול 2:. המרת hPSC מושבות מהאכלה ללח"י
- יש לשטוף את כדורי hPSC בD-PBS פעם אחת, דגירה את כדורים עם 1 מיליליטר של 1X Accutase עבור 10 דקות, ולבחון את התגובה האנזימטית תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק מתא בודד.
- לסיים את התגובות אנזימטיות בעדינות על ידי resuspending התאים ב5 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מכיל 10 מיקרומטר Y-27632 ואחריו צנטריפוגה ב XG 200 ב RT למשך 5 דקות(שים לב, לא משתמשים בכוחות צנטריפוגה מוגזמים הגורמים לניזק לתאים).
- הוסף 5 מיליליטר של מדיום mTeSR1 לגלולה, resuspend את הכדור כתאים בודדים, ומסנן ניתק תאים דרך מסננת תא 40 מיקרומטר (כדי להסיר כל אגרגטים תא שיורי).
- הזרעים 1.3-2 x 10 6 hPSCs לאחד היטב (1.4-2.1 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר) של צלחת 6 היטב מצופה Matrigel hESC מוסמך 2.5%, להוסיף בינוני mTeSR1 עד 2.5 מיליליטר, וכולל 10 מיקרומטר Y-27632 במדיום (כדי להקל על ציפוי תא בודד 24 שעות הראשוניות). לחלופין, לנצל את המולקולות קטנות הבאות כדי להחליף 10 מיקרומטר Y-27632 לציפוי תא בודד שיפור: 1 מיקרומטר Y-39983, phenylbenzodioxane 1 מיקרומטר (ROCK השני מעכב), thiazovivin 1 מיקרומטר (מעכב ROCK רומן) (ROCK אני מעכב) , ומעכב JAK 2 1 מיקרומטר.
- החלף את המדיום עם מדיום ללא סמים mTeSR1 ביום שלמחרת (תוך 24 hr), לנתק את תאים מאחד נוסףגם ו, לספור את המספר הסלולרי כדי לקבוע את יעילות ציפוי תא בודד (הערה: כ, 50-90% מיעילות ציפוי תא בודד שניתן להשיג בשלב זה).
- לאפשר לתאים לגדול כ- נוצר תא בודד monolayer לכמה ימים עם 3 מיליליטר של מדיום mTeSR1. שנה בינונית מדי יום.
- באופן אמפירי לקבוע את לוח הזמנים לpassaging לח"י הותאם בהתאם לצפיפות התא. מעבר כאשר צמיחת תאים מגיעה למפגש ביום 3 או יום 4, או בנקודת הזמן 4 שעות לאחר היעלמותם של גבולות תא אל התא. לנתק את התאים ב 1 מיליליטר של Accutase, השתמש 1 עד 3 יחס פיצול (כלומר, מחוברות 1 גם של תאים מצופים ב3 בארות של צלחת 6 היטב) לpassaging תא, ולייצב את מלח"י הותאם על ידי 5 קטעים.
- הקפאת תא
- לנצל היטב אחת מחוברות (~ 5-6 x10 6 תאים) לבקבוקון אחד קפוא: לנתק את התאים ממחוברות אחת גם עם 1 מיליליטר של Accutase 10 דקות.
- לדלל wה-i 5 מיליליטר של תאים בינוניים ו צנטריפוגות mTeSR1 כפי שתואר לעיל.
- Resuspend את הכדור ב500 μl של מדיום mTeSR1 ולאחר מכן להוסיף לאט 500 μl של מדיום הקפאת 2X hPSC (המכיל 20 מיקרומטר Y-27632) בבקבוקון שימור בהקפאה. לחלופין, resuspend התאים במדיום הקפאת 1X hPSC המכילים מעכבי JAK 2 1 מיקרומטר או בינוני 1X CryoStor CS10 בנוכחות שני 10 מיקרומטר Y-27632 או 2 מעכבי JAK 1 מיקרומטר.
- מניחים צלוחיות קפוא לcryocontainer קרח צונן (תחתון מלא בisopranol) ולהעביר את cryocontainer ל-80 ° C במקפיא באופן מיידי.
- העברת תאים מ-80 ° C במקפיא למכל חנקן נוזלי (ביום למחרת) לשימור בהקפאה לטווח ארוך.
- הפשרת תא
- לנצל בקבוקון הקפאה אחד לציפוי גם 1 של צלחת 6 באר.
- בינוני mTeSR1 טרום חמה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, תאי הפשרה באותו אמבט מים במשך 2 דקות,ירידה מבחינת להוסיף תאים ל5 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מראש חימם מכיל 10 מיקרומטר Y-27632, ו צנטריפוגות כמתואר לעיל.
- בעדינות resuspend את כדורי תא עם 2 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מכיל 10 מיקרומטר Y-27632 ולהעביר לאט תאים גם מצופה מראש עם Matrigel (הערה: להימנע מהפקת בועות אוויר).
- שנה בינונית מדי יום וצופה צמיחת hPSC למגיעה למפגש ביום 3 או 4.
4 פרוטוקול 3:. המרת hPSC מושבות על Matrigel ללח"י תרבות
- הסר את צלחת Matrigel מצופה ממקרר, מניח את הצלחת במכסת המנוע בתרבית רקמה ל10-30 דקות, להסיר את המדיום מבאר כל הצלחת, ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום mTeSR1 מראש חימם היטב כל אחד.
- העברת triturated גושי hPSC מתרבות המזין (שלב 2.10 של הפרוטוקול הבסיסי) לצלחת Matrigel לעיל. הוסף בינוני mTeSR1 עד 2.5 נפח סופי מיליליטר בכל טוב.
- שנה בינונית ביום למשך 3 עד 4 ימיםשל עד מושבות מגיעים למפגש 80-90%.
- לpassaging תא: לשטוף את המושבות עם D-PBS פעמיים, טיפול בתאים עם 1 מיליליטר של 2 מ"ג / מיליליטר dispase ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות, ומשקעים והמעבר תאים כגושים.
- לתרבות לח"י: חזור על שלבים 3.1-3.9 מתוארים בפרוטוקול 2.
5 4 פרוטוקול:. לח"י תרבות של hPSCs על LN-521
- להפשיר את פתרון LN-521 רקומביננטי על 4 מעלות צלזיוס לפני יום השימוש ולהפוך את פתרון ציפוי laminin (LCS) על ידי דילול laminin מופשר עם 1X D-PBS (המכיל Ca 2 + / Mg 2 +) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מיליליטר.
- הוסף 1 מיליליטר של LCS לאחד גם בצלחת 6 היטב (הערה: הימנע מיבש במהלך תהליך הציפוי).
- חותם את הצלחת המצופה עם Parafilm כדי למנוע אידוי ולאחסן את הצלחת במקרר (4 מעלות צלזיוס) O / N (הערה: להשתמש בצלחת בתוך השבוע 1).
- בעדינות להסיר את LCS עם פיפטה פסטר ללא לuching המשטח המצופה ולהוסיף 2 מיליליטר של מדיום mTeSR1 לאחד טוב.
- לחמם את כל פתרונות התרבות (כולל D-PBS) באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.
- המרת מושבות hPSC ללח"י
- לנתק אגרגטים תא לתאים בודדים עם Accutase כפי שתואר בפרוטוקול 2.
- הזרעים 1.3-2 x 10 6 hPSCs לאחד LN-521 מצופה היטב (1.4-2.1 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר) ללא הנוכחות של מעכבי ROCK.
- שנה בינונית ביום למשך 3 עד 4 ימים.
- לנתק את התאים ב 1 מיליליטר של Accutase ביום 3 או 4 לpassaging התא הבא באמצעות 1 עד 3 יחס פיצול.
. 6 פרוטוקול 5: לח"י תרבות לפלסמיד דנ"א Transfection
- להתאים מושבות hPSC לתרבות לח"י כמתואר בפרוטוקולים 2 עד 4.
- צלחת ניתקה hPSCs ב12 גם צלחת עם צפיפות תאים של 7.5 x 10 5 תאים / היטב במדיום mTeSR1 בנוכחות 10 מיקרומטר Y-27632.
- החלף בינוני mTeSR1 עם ללא סמים בינוניים mTeSR1 בין 4-8 שעות לאחר ציפוי התאים.
- לכל transfection, לדלל 2.5 מיקרוגרם של פלסמידים ביטוי (למשל, pmaxGFP) ו -5 μl של Lipofectamine 2000 בצינורות Eppendorf נפרדים ב125 μl כל אחד מOpti-ממ מופחת סרום בינוני.
- אחרי 5 דקות, לערבב את חומרים כימיים בדילול מלא ודגירה של 20 דקות ב RT (ליצירת קומפלקסי transfection).
- הוסף את 250 מתחמי transfection μl לכל hPSCs היטב המכיל 1 מיליליטר בינוני mTeSR1 דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור במשך 24 שעות.
- לבחון את יעילות transfection תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולצלם באופן אקראי לחישוב יעילות transfection בפועל.
. 7 6 לפרוטוקול: מלח"י תרבות לTransfection של מיקרו RNA
- לנתק hPSCs למחצה מחוברות ביום 2 בתנאים מלח"י על ידי הוספת 1 מיליליטר של Accutase לכל טוב ב6 היטב צלחת.
- הוסף 10 מיליליטר של מדיום mTeSR1 לדלל תגובות ו צנטריפוגות האנזימטית ב XG 200 למשך 5 דקות.
- Resuspend התא גלולה עם מדיום mTeSR1, זרע התאים בצפיפות של 7.5 x 10 5 תאים לכל היטב צלחת 12 גם במדיום mTeSR1 מכילה 10 מיקרומטר Y-27632, ולתת לתאים לצרף ל4 שעות.
- החלף בינוני עם בינוני mTeSR1 Y27632 חינם.
- השתמש במייקרו RNA זמין באופן מסחרי (למשל, מירנה Transfection בקרת miRIDIAN ללא מיקוד שכותרתו עם Dy547). לכיל ריכוזים הנעים 0-160 ננומטר באמצעות חומרים כימיים הניתנים ולעקוב אחר הוראות היצרנים.
- לייעל את יעילות transfection עבור כל ריכוז בקווי hPSC ידי ההדמיה הקרינה Dy547 של תאי חיים תחת מיקרוסקופ ב24 שעות לאחר transfection.
- לחשב את יעילות transfection מבוססת על אחוז התאים החיוביים Dy547 על כל תאי הדמיה.
- חזור על שלבים 7.1-7.4 של פרוטוקול 6.
- לחשב את הכמויות של חלקיקים נגיפיים שישמשו לתמרה: השתמש בנוסחה הבאה: TU = (משרד הפנים x CN) / VT, ואילו TU מציין את המספר הכולל של הפיכת יחידות, משרד הפנים שווים לריבוי הרצוי של זיהום בבאר (משרד הפנים או TU / תא), CN מציין את מספר התאים בכל טוב, וVT מציין כותרות מניית ויראלי (TU / מיליליטר). לדוגמא, בהתחשב בכך שכותרות נגיפיות המניה לוקטור סמארט shRNA שווה 1 x 10 9 TU / מיליליטר (הפיכת יחידות למ"ל), 7.5 x 10 5 תאים לכל גם בזמן של התמרה, ומשרד הפנים צפויים של 20: להשתמש 15 μl של החלקיקים נגיפיים המניה לכל אחד גם (שים לב: במצב זה מומלץ לזירוז lentiviral חולף).
- 300 μl טרום חם של מדיום mTeSR1 עם 10 מ"ג / מיליליטר של polybrene ל30 דקות.
- הוסף 15 μl של חלקיקים נגיפיים לתוך המניהמדיום mTeSR1 המחומם מראש המכיל polybrene ולערבב בעדינות את הפתרון.
- החלף את מדיום תרבית תאים עם 300 μl של מדיום prewarmed המכיל חלקיקים נגיפיים.
- לאחר 4 שעות דגירה, לבחון את הקרינה turboGFP (יצרנית לביטוי shRNA) כדי לקבוע את יעילות התמרה.
- הוסף 300 μl של מדיום mTeSR1 נוסף לtransducing גם כאשר התאים מתחילים לבטא turboGFP.
- לאחר הדגירה 12-16 שעות, לבחון מחדש את הביטוי הטורבו-GFP.
- לבצע ניסויי מעקב רצויים עם תאי transduced אלה בתוך 72 שעה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סכימה כללית של תרבות לח"י
איור 1 מייצג סכימת תרבות לח"י טיפוסית מראה את השינויים הדינמיים של hPSCs לאחר ציפוי תא בודד בצפיפות גבוהה בנוכחות מעכב ROCK Y-27632. שינויים מורפולוגיים אלה כוללים קשרים אינטר לאחר ציפוי, היווצרות אשכולות סלולריים, וצמיחת תאי מעריכי אחרי עיבוי תא (איור 1 א). ניסוי נציג מציין WA01 hESCs (H1), מצופה בתאים בודדים בצפיפות של 1.9 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר בנוכחות 10 מיקרומטר Y-27632 ביום 1 (איור 1, פנל משמאל), מופצות נוסף ללא היווצרות של מושבות (איור 1, פנל באמצע) ביום 2, ואת תמצית כmonolayer הומוגנית כי הוא מתאים לניסויים רצויים או לpassaging תא ביום 3 (איור 1, פנל מימין).
<מעכבי ROCK strong> שונים תומכים תרבות לח"י
Assay צלחת 96 היטב שימש להוכחה של קונספט של הקרנת סמים תפוקה גבוהה. כמו כן, נועד לייעל את השימוש במעכבי ROCK שונים כדי לתמוך בתרבות לח"י. כ, 31,000 ניתק תאי SCU-i10, תאי pluripotent אדם מושרה (hiPSCs) 17, היו מצופה על אחד גם בנוכחות ריכוזים שונים של מעכבי ROCK מצופה Matrigel. לאחר 24 שעות, התאים היו נתונים assay ההישרדות מבוססת CCK-8 כדי לקבוע הישרדות תא בתנאים אלה. הראינו בעבר כי שיטת לח"י דורשת שימוש במעכב ROCK, Y-27632, ב10 מיקרומטר כדי לשפר את ציפוי מתא בודד. בדו"ח זה, אנו מאשרים כי 10 מיקרומטר Y-27632 להגדיל את התא בודד 24 שעות ציפוי יעילות של hiPSCs (P <0.05) (איור 2) באופן משמעותי. מצאנו גם כי Y-39983 (ROCK אני מעכב), phenylbenzodioxane (inhibi ROCK השניטור), וthiazovivin (מעכב ROCK רומן) לווסת באופן משמעותי את יעילות ציפוי תא בודד ולקדם את צמיחת לח"י ב1 מיקרומטר בהשוואה לקבוצת הביקורת שלהם (P <0.05) (איור 2). יתר על כן, ההשפעות של מעכבי שלושה ROCK (ב1 מיקרומטר) על יעילות ציפוי תא הבודד היו דומות לזה של ה-Y 27632 ב10 מיקרומטר (P> 0.05) (איור 2). יש לציין, ROCK אני מעכב (בשעה 5 מיקרומטר) מופיע כדי להראות cytotoxicity הבולט בהשוואה לתרופה ב1 מיקרומטר (P <0.05), להפליל אינטראקציה ספציפית יותר ממולקולות אחרות. לכן, מעכבי ROCK שונים עשויים לשמש לתמיכה בתרבות לח"י בעתיד. עם זאת, אפיון של שני hESCs וhiPSCs תחת מלח"י עם מעכבים החדשים אלה מלאים היה נדרש לשימוש עתידי.
LN-521 תומכים תרבות לח"י ללא השימוש במעכבי ROCK
כדי לקבוע tהוא תפקידו של איזופורם laminin ספציפי בתמיכה בצמיחת hESC, אנחנו מתורבת hiPSCs SCU-i30 על צלחות מצופות LN-521 במדיום ללא קסנו TeSR2. מעניין, LN-521 לבד, ללא הנוכחות של מעכבי ROCK, תומך ציפוי תא בודד וצמיחה הבאה מלח"י ל15 מעברים בתנאי זה (איור 3). Immunostaining של תאי SCU-i30 עם נוגדן polyclonal אנטי Nanog הצביע על כך שהתאים תחת תנאי זה היה ביטוי Nanog הגבוה בגרעינים (איור 3 א). ניתוח cytometric הזרימה הראה כי פרופיל ביטוי סמן hESC היה דומה לתאים שגודל כלח"י באמצעות מעכב ROCK Y-27632 (איור 3 ב).
יעילות גבוהה של משלוח microRNA ללא השימוש בחלקיקי lentiviral
Transfection עם מיקרו RNA oligonucleotide כותרת Dy547 בוצע בWA01 תאים (H1) בתנאים מלח"י. hESCs WA01 גדל כמלח"י על 2.5% Matrigel בmTeSR1 ל( איור 4 א) 2 ו18 (איור 4) קטעי בהתאמה. תאים אלה הראו יעילות transfection 24 לאחר transfection הגבוה שעה (איורים 4 א ו -4 ב). באופן כללי, אנחנו יכולים להשיג יעילות transfection עד 91% בhESCs ב24 שעות לאחר transfection.
סכימת איור 1. () של תרבות לח"י. גרף הקו משרטט את השינויים הדינמיים של עמותה תאית בתרבות של 3 ימים טיפוסיות בתנאים מלח"י. (ב ') תמונות שלב נציג WA01 hESCs (H1) מופץ תחת תנאי מלח"י על 2.5% Matrigel במדיום mTeSR1 ל16 מעברים (מיועדות כWA01, mcp16). הפנל התחתון הוא התצוגה המוגדלת של הפנל העליון. ברים סולם מצביעים 100 מיקרומטר.EF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מבחני הישרדות תא בודד באמצעות פורמט 96 היטב. כ, 31,000 hiPSCs SCU-i10 17 היו מצופה על 2.5% Matrigel בנוכחות מעכבי מולקולה קטנים שונים הקשורים לקינאז קשור-Rho מסלולים (ROCK) בריכוזים הצביעו . לאחר 24 שעות, התאים היו נתונים assay הישרדות CCK-8 על ידי מדידת הספיגה ב 450 ננומטר (A450). מבחן t התלמיד משמש כדי לקבוע אם ההבדלים ביעילות ציפוי תא בודד בין מעכבי ROCK השונים הם בעלי המשמעות סטטיסטית. הסימן היחיד הכוכבית (*) מציין שאין הבדלים משמעותיים בין מעכבים (P & #62; 0.05), ואילו סימני הכוכבית כפולים (**) מציין את ההבדל הנצפה הוא בעל משמעות סטטיסטית (P <0.05). עמודות בהיסטוגרמות לייעד את הערכים הממוצעים של הגורמים וברי ארבע פעמים מייצגים סטיות תקן.
איור 3. תרבות לח"י של hiPSCs בlaminin-521 (LN-521) ללא הנוכחות של מעכבי ROCK. שורת hiPSC SCU-i30 הוקמה בNIH גזע יחידה נייד. תאי SCU-i30 גדלו על 6 צלחות היטב מצופות LN-521 בTeSR2 ללא בינוני קסנו 15 מעברים ללא השימוש במעכבי מולקולה קטנים כגון מעכבי ROCK. Immunostaining () של תאי SCU-i30 עם אנטי -Nanog נוגדן polyclonal וcounterstained עם Hoechst 33,342 (Hoechst). יש לציין, כמה תאים שיש להם כתמי Nanog שליליים הם התאי דואר במיטוזה. ניתוח cytometric זרימה של ביטוי סמן hPSC בתאי SCU-i30 גדלו כמו מלח"י על 2.5% Matrigel עם השימוש ב10 מיקרומטר Y-27632 (פנל עליון) או מלח"י על LN-521 ללא Y-27632 (ב ') (פנל תחתון). הנהלים לשני immunostaining וניתוח התזרים cytometric תוארו בעבר 5. ברים סולם מתארים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תרבות לח"י של hPSCs עבור transfection microRNA. WA01 hESCs גדלו כמלח"י על 2.5% Matrigel בmTeSR1 ל2 (א) ו 18 קטעים (ב '), בהתאמה. תמונות שלב וקרינת נציג של תאי WA01 transfected עם Dy547 שכותרתו רנ"א שליטה לניטור יעילות transfection ב24 שעות לאחר transfection. ברים סולם מייצגים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנן שתי דרכים עיקריות לhPSCs התרבות במבחנה: תרבות קונבנציונלית מושבה מהסוג (של תאים במתקני האכלה או מטריצות תאיים) ותרבות השעיה של hPSCs כמו אגרגטים ללא ניזונים 6. המגבלות של שיטות תרבות הן המושבה מסוג וההשעיה כוללות הטרוגניות שנצברה ושינויים אפיגנטיים בירושה. תרבות לח"י, המבוססת על שני passaging תא בודד וציפוי תא בצפיפות גבוהה, מייצגת שיטת תרבות חדשה ל6,18 צמיחת hPSC. למרות ששיטות passaging תא בודד שונות תועדו בספרות, אבל אף אחד מהם משמשים להפצה שבשגרה. לדוגמא, וו ועמיתיו השתמשו בשיטת passaging תא בודד כדי לחקור את ההשפעות של קוקטיילים מולקולות קטנות שונים על צמיחת hPSC 19. עם זאת, מוצרי תרבותם הסופיים הם מושבות. אז, מבוסס בצפיפות נמוכה שיטות passaging תא בודד עדיין שייכות לתרבות מושבה מהסוג. בכל קשור לתרבות לח"י, גבוהים מאורותציפוי ity הופך תרבות זו לשיטה חדשה, שכן המוצר הסופי הוא תא monolayer הומוגנית. לאחרונה, דבוז'ק ועמיתיו השתמשו בשיטה דומה כדי לנתח באופן מקיף מאפייני hPSC בתנאי גידול זה 18. התוצאות שלהם גם תומכות במסקנות העיקריות שלנו. ברור כעת שתרבות לח"י היא שיטה המתעוררות שבעל כמה מאפיינים חדשים ויכולה להיות שונה יותר ליישומים פוטנציאליים רבים בביולוגיה של תא גזע pluripotent.
מאפיינים בסיסיים של hPSCs מתרבות לח"י
זה מתקבל על הדעת כי מאפיינים רבים hPSCs תחת לח"י נתח התרבות עם אותם הסוגים של תאים שגודל כמושבות 9,18. רמות הביטוי של סמני hESC בhPSCs, הכוללים אוקטובר -4, Nanog, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81, וSSEA-1, דומות בשני מלח"י ותרבות מושבה מהסוג . תאים מותאמים לח"י גם לשמור על דפוסי ביטוי mRNA הגלובלי דומים למושבות hPSC גדלו על Mשכבות מזין EF 9. ברור, תאים מותאמים לח"י לקיים את מדינת pluripotent כפי שנקבעו על ידי assay תפלצת 9,18. עם זאת, בניגוד למושבות hPSC, יש תאים בתנאי לח"י שיעור צמיחה צפוי שמאופיינת בקימורים עקביים צמיחה, מחזורים סלולריים, ומספרי תא 9. בשל ציפוי התא בודד בצפיפות גבוהה, hPSCs בתנאי לח"י מפגין צמיחה המעריכית בין הימים 2 ו -4 (איור 1), וכך להגדיל את מספר תאים על ידי פי 4 בהשוואה למושבות hPSC גדלו על MEFs. תרבות הממושכת אינה מגבירה את ייצור תאים, אלא מגביר אפופטוטיים ובידול מתח 9. לח"י גם מאפשר הקפאה אופטימלית, ובכך מאפשר התאוששות תאים מהירה על תאי ציפוי מופשרים (1 לפרוטוקול). יתר על כן, מלח"י מקל על ההסתגלות של תרבות hPSC לפרוטוקולים ללא קסנו שונים 9. באופן כללי, מלח"י תומך הצמיחה של hPSCs, שומר על מדינת pluripotent, ומקיים potenTiAl של hPSCs להתמיין לרקמות בוגרות בשלוש השכבות נבט.
יציבות כרומוזומלית בhPSCs תחת לח"י
במונחים של יציבות כרומוזומלית, אין מקום להשוואה ישירה בין התאים משיטות תרבות שונות. רוב hPSCs בתנאי תרבות לח"י יש karyotypes נורמלי ועותק גן מספרים כפי שנקבע על ידי G-banding, הכלאה גנומית השוואתית המבוסס על מערך (aCGH), וקרינת הכלאה באתרו (FISH) 9. שני קווים (~ 13%) הראו karyotypes לא נורמלי, שבו שורה אחת (כלומר, WA09) הציגה polyploidy המוגבה ועוד אחד (ES01) היו 14% מתאים עם טריזומיה 20 9. לא ברור אם karyotypes חריג אלה הופקו מתוך בחירה של preexisting תאים שעברו מוטציה לפני תרבות לח"י או מושרה במהלך הסתגלות מלח"י. חשובה שמושבות hPSC מתחילות או משנה של מושבות משמשות לsh תרבות לח"יולד להיות מאופיין היטב בתנאים של הומוגניות שלהם ויציבות בכרומוזומים בזמן הסתגלות מלח"י. יש לציין, שיעור karyotypes חריג בתנאים מלח"י הוא נמוך בהרבה מזה שדווח בניתוח מחזור האחרון, שבו המחברים לחשוף karyotypes חריג 34% בתנאי תרבות מושבה מסוג דומיננטיים 20. לפיכך, המחקר שלנו מצביע על כך שאנו יכולים לגדול חד תאים ניתק ולשמור על היציבות בכרומוזומים שלהם בתנאים מלח"י. עם זאת, אנחנו גם צריכים להשתמש בשיטות רגישות יותר לבדיקת פגמים בכרומוזומים של hPSCs בשנים הקרובות. במיוחד, אנחנו צריכים לסרוק את כרומוזום 1, 12, 17, ו20 באמצעות בדיקות ברזולוציה גבוהות יותר (כלומר, <50 kb), כפי שכמה נגעי קטין (למשל, amplicon 20q11.21) בכרומוזומים לעתים קרובות שינו אלה לא יכולים להיות מזוהים על ידי קונבנציונליים karyotyping ודגים 20-22. יתר על כן, הפיתוח של פרוטוקולים מלח"י מגוונים יאפשר לנו לזהות Robust ושיטות בטוחות ליישומים עתידיים.
תרבות לח"י תחת שינויים מגוונים
השימוש במעכב ROCK, Y-27632, פתח את הדלת למבחני תא בודד מבוססים. הזמינות של מעכבי ROCK מגוונים תספק אפשרויות נוספות להרחבה מבוססת לח"י ושימור בהקפאה של hPSCs (איור 2). בתאוריה, כל מולקולה קטנה, שיכול להגביר את היעילות של ציפוי תא בודד באופן משמעותי, ניתן להשתמש בם כדי להקל על תרבות לח"י. JAK מעכב 1, אשר מתפקד באופן שונה ממעכבי ROCK אלה, מהווה דוגמא כזו 9. השימוש במולקולות בודדות או גישות קומבינטורית עשויות לספק לנו צמיחה אופטימלית של תאים, מבחני סלולריים, ושימור בהקפאה של hPSCs. עם זאת, תרבות לח"י החלופית של hPSCs על חלבונים מוגדרים תאיים מטריקס, כגון איזופורם laminin LN-521, בדרך כלל באו לידי ביטוי בhESCs 23-25, עשויה למנוע ההתערבות של קטןמולקולות (איור 3). LN-521 עשויים לשפר את ההישרדות ניתק-hPSC ומקיימים pluripotency באמצעות ההפעלה של מסלול α6β1-PI3K/AKT 24. הפשטות של hPSCs passaging עם LN-521 מקטינה את ההטרוגניות של התאים, תואמים עם מערכות תרבית תאים שונות וללא קסנו מזין ללא שימוש במדיום מוגדר לחלוטין (4 לפרוטוקול). הוא גם מספק מודול נוסף עבור מבחני תפוקה גבוהה ללא ההשפעה של מולקולות קטנות. למרות iPSCs תחת תרבות לח"י על LN-521 שמר את הביטוי של פנל של סמני hPSC, אפיון נוסף של תאים אלה באמצעות assay תפלצת ובידול multilineage בתיווך גוף embryoid עשוי להיות נחוץ כדי לאשר את מדינות pluripotent בתאים אלה. ראוי לציין, hiPSCs בתרבית על איזופורם laminin LN-521 דיווחים יציבים cytogenetically (http://biolamina.com/). עם זאת, אנחנו גם צריכים ליישם שיטות רזולוציה גבוהה יותר ורגישה (כפי שפורט לעיל) לדוארxamine היציבות בכרומוזומים בתאים אלה.
רבגוניות של תרבות לח"י להנדסה גנטית
שיטות המבוססות על מלח"י מייצגות מערכת פשוטה, חזקה, וחסכונית שעשויה להיות שימושיים במיוחד למניפולציה גנטית של hPSCs (פרוטוקולי 5-7). זה ידוע כי מושבות hESC קשים transfect או transduce, עם השתנות גדולה ביעילות transfection / התמרה בין מעבדות שונות 26-28. לדוגמא, יעילות transfection בhESCs נעה 3-35% בתנאי תרבות מושבה 26. אותות התמרה lentiviral בתאי BG01 בתנאי מושבה נמצאו להיות נמוכים מאוד 9. עם זאת, את יעילות transfection בתיווכו של מלח"י הייתה גדול יותר מ75% 9 ושינוי של שיטות התמרה יכול להגביר את היעילות של התמרה בתיווך lentivirus עד 90% 28. מחקר השוואתי הדוק גילה שזה הדואר עמותות רב תאיים במושבות hESC שתורמים ליעילות transfection הנמוכה 9. יתר על כן, יש לנו לאחרונה הותאם פרוטוקול transfection microRNA והם מסוגלים להשיג יעילות גבוהה transfection (~ 91%) ללא השימוש בlentiviruses (פרוטוקול 6 ואיור 4). פרוטוקול זה הוא קל לשימוש ושימושי במיוחד עבור ניסויי transfection חולפים בתוך 3 - למסגרת זמן של 5 ימים. כפי שהותווינו בפרוטוקולים לעיל, יש לקחת גורמים רבים בחשבון שיקולים כאשר אנו לייעל את יעילות transfection / התמרה בhPSCs. גורמים אלה כוללים את צפיפות תאים, ריכוזי פלסמיד, כותרות lentiviral, ריבוי של זיהום (משרד הפנים), משך זמן של transfection / התמרה, cytotoxicity של חומרים כימיים, ושיטות המשמשות לניטור יעילות transfection / התמרה.
אנו לפרט ולהרחיב את השיטות מלח"י לhPSCs תרבות על Matrigel ועל מטריצות תאיים מוגדרות. שיטה זו התרבותהוא דרך יעילה לחסל את ההטרוגניות נמצאת בדרך כלל במושבת hPSC ותרבויות מצטברות. תאי גזע pluripotent אדם בתנאי גידול מלח"י הם pluripotent ויציבים chromosomally. מערכת תרבות הרומן הזה היא פשוט ותכליתי לתחזוקת hPSC, התרחבות בקנה מידה גדולה, ומניפולציות גנטיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
- Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
- Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
- Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
- Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
- Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
- Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
- Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
- Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
- Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
- Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
- Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
- Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
- Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
