Introduction
multilineage의 성인 조직으로 분화하는 hPSCs의 용량은 심장, 간, 췌장, 및 신경 시스템 1-4을 포함하는 심각한 질병으로 고통받는 환자를 치료에 새로운 길을 열었습니다. hPSCs에서 파생 된 다양한 종류의 세포는 질병 모델링, 유전 공학, 약물 검사 및 독성 시험 1,4에 대한 강력한 휴대폰 플랫폼을 제공 할 것이다. 미래 임상 약리학 응용 프로그램을 보장하는 중요한 문제는 체외 세포 배양을 통해 임상 수준의 hPSCs 많은 수의 세대입니다. 그러나, 현재의 문화 시스템은 식민지 5,6 등 hPSCs의 다양한 장치와 피더 무료 문화를 포함, 부족하거나 본질적으로 변수 중 하나입니다.
hPSCs 공유 초기 포유류 배아의 내부 세포 덩어리 (ICM)의 많은 구조적 특징의 식민지 형 성장. ICM은 세 가지 세균 층으로 분화하는 경향이있다때문에 이종 신호 그라디언트의 존재 다세포 환경에서. 따라서, 초기 배아 발달에 이성의 인수는 차별화를위한 필수 과정으로 간주하지만, hPSC 문화의 원치 않는 기능입니다. hPSC 문화의 이질성은 종종 인해 차선의 성장 조건에 과도한 세포 사멸 신호와 자발적 분화에 의해 유도된다. 따라서, 콜로니 식 배양에서, 이종 세포는 종종 7,8 콜로니의 주위에서 관찰된다. 또한 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)에서 세포는 BMP-4와 같은 구 신호 분자로 전시 차동 응답 콜로니 것으로 밝혀졌다. 또한, 식민지 배양 방법으로 인해 통제 할 수없는 성장 속도와 세포 사멸 신호가 6,9를 경로에 낮은 세포 수율뿐만 아니라 냉동 보존에서 매우 낮은 세포 회수율을 생산하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다양한 서스펜션 문화, 배양 hPSCs에 particul을 개발 한피더 행렬없는 조건 6,10-13에 hPSCs 많은 양의 확장을위한 아 흘리. 물론, 다른 문화 시스템은 자신의 장점과 단점이있다. 일반적으로, hPSCs의 이질적인 성격은 유전 공학 6에 hPSCs에 DNA와 RNA 자료를 제공하기위한 차선이다 식민지 유형 및 집계 문화 방법의 주요 단점 중 하나를 나타냅니다.
명백하게, 현재의 배양 방법의 몇 가지 단점을 회피 새로운 시스템을 개발하는 필수적인 필요가있다. 단일 세포의 생존을 개선 (예 : ROCK 억제제 Y-27632 및 JAK 억제제 1과) 작은 분자 억제제의 발견은 해리 - hPSC 문화 (14, 15)에 대한 방법을 포장. 이러한 작은 분자의 사용으로, 우리는 최근 비 식민지 유형 해리 - hPSCs 9 (NCM)의 성장에 따라 배양 방법을 개발했습니다. 이 신규 한 배양 방법은 단일 세포 계대 고밀도 모두 결합, 도금 방법을 우리가 주요 염색체 이상 9없이 안정적인 성장주기에 따라 균일 한 hPSCs 많은 양을 생산할 수 있도록. 또한, NCM 문화는 다양한 응용 프로그램에 대한 배양 방법을 최적화하기 위해 다른 작은 분자 (예 : 라미닌 등) 정의 행렬로 구현 될 수 있습니다. 여기, 우리는 NCM 문화를 기반으로 몇 가지 상세한 프로토콜을 제시하고 유전 공학에 대한 자세한 절차를 서술. NCM 프로토콜의 다양성을 설명하기 위해, 우리는 또한 다양한 ROCK 억제제와 하나의 라미닌 이소 521 (즉, LN-521)와 NCM 문화를 테스트했다.
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Protocol
hPSCs의 단일 셀 기반이 아닌 식민지 형 단일 층 (NCM) 문화.
1. 준비
- 10 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA)와 보충 DMEM 매체 : 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 배양 배지 500 ㎖로 만든다.
- 마우스 배아 섬유 아세포를 DMEM 배지에서 0.1 % 젤라틴 코팅 6 - 웰 세포 배양 접시에 일상적인 프로토콜 (16)와 문화 MEFs 다음 CF1 균주에서 유래 (MEFs) 세포를 분리. 또한, 상업 자원의 통로 (3)에 MEF의 주식을 구입할 수 있습니다.
- 리겔 플레이트를 준비합니다.
- -20 ° C의 냉동고에 50 % 씩 분주로 5 (~ 4 ° C에서 냉장) DMEM/F12 배지 ㎖ 및 저장소와 hESC의 자격 리겔 주식의 5 ㎖를 희석. 냉장고 (~ 4 ° C) O / N에서 냉동 마트 리겔 주식을 해동하고 추가 (2.5 % 작업 농도 상승을주는) 차가운 DMEM/F12 배지에서 리겔을 희석.
- 플레이트는 10 ~ 30 분 동안 세포 배양 후드 (참고 : 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 따뜻하게하지 않는다)에 실온에서 따뜻하게 할 수 있도록, 냉장고에서 리겔 플레이트를 제거하고 대기음 DMEM 매체 전에 hPSCs을 도금 할 수 있습니다.
- 500 ㎖의 hESC 매체 만들기 : 80 % DMEM/F12 배지, 20 % KSR 2 ㎜의 L-글루타민, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 0.1 ㎜의 β-메르 캅토 에탄올, 4는 FGF-2 / ㎖를 겨.
- , 60 % FBS, 20 % DMSO 및 mTeSR1 배지에서 20 μM Y-27632 여과 살균, 1 주 안에 매체를 사용 2X hPSC 동결 매체의 10 ㎖를 준비합니다.
. 2 프로토콜 1 (기본) : 공급기에 hPSC 식민지를 성장
- 일관성 resul을 얻기 위해 hPSC 문화에 대해 5 또는 6 (P5 및 P6로 지정)에서 MEF 통로 번호를 사용TS. Mitotically 37 ° C에서 3 시간 동안 10 ㎍ / ㎖의 마이 토마 이신 C와 세포를 치료에 의해 MEFs을 비활성화, 세척 세포는 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)으로 3 배, 다음 0.53 밀리미터에서 0.05 % 트립신 MEFs을 떼어 놓다 EDTA. 대안 적으로, X-선 조사 장치와 8,000 라드의 투여 량으로 MEFs를 조사.
- 현미경 하에서 트립 판 블루 염색 배제 방법을 이용하여 세포 수를 센다. 또한, 자동 세포 계수기를 사용합니다.
- 6 자 폴리스티렌 번호판 플레이트 조사 MEFs 잘 당 1.88 × 10 5 세포 (즉, 1.96 × 10 4 세포 / ㎠)의 밀도로 0.1 % 젤라틴으로 코팅. 37 ° C에서 세포를 품어 5 % CO 2 24 시간 동안.
- 파스퇴르 피펫 (이 시간에 필요로 한 세척 단계를 참고 없음)로 흡인하여 MEF 문화 매체를 제거합니다.
- 작은 덩어리로 이전의 문화에서 씹다 hPSC 식민지, FR에 이르기까지 자신의 크기를 확인하기 위해 현미경으로 수풀을 검사OM (50) 직경의 100 ㎛, 잘 hPSC 2 ㎖를 포함하는 하나의 MEF 피더 레이어의 상단에 hPSC 덩어리를 접시.
- 어떤 형태 학적으로 변형 된 또는 차별화 된 식민지 (~ 5 %)를 마크, 사진 에의 한 5 일 기록 식민지의 성장을위한 hESC의 매체 일상을 변경하고 수동으로 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 흡인에 의해 표시 식민지를 제거합니다.
- 두 번 MEFs에 남아있는 식민지 (2 분 D-PBS로 각을) 씻어, 2 ㎖를 1 ㎎ / 10 ~ 30 분 hPSC 매체 ㎖의 콜라게나 제 IV)에 식민지를 배양하고,에서 hPSC 식민지의 분리를 검토 MEF 도포면 (주 : 콜로니 단단히 플레이트에 부착되는 경우에만 박리 공정을 돕기 위하여 스크레이퍼를 사용).
- , 15 ML 튜브에 효소 반응, 전송 식민지를 최소화 hPSC 식민지는 실온에서 3 ~ 5 분 동안 침전 할 수 있도록, 그리고 C의 직접적인 시각화에 의해 식민지의 침전을 보장하기 위해 각 웰에 hPSC 매체의 5 ML을 추가합니다튜브의 바닥에 ELL 학생 (참고 :이 단계에서 튜브를 원심 분리하지 않음).
- 잔류 MEFs를 함유 상청액을 제거하고 단일 세포를 해리, hESC의 매체 (5 mL)로 콜로니를 재현 탁하고, 두 번 침전 단계를 반복한다.
- 세포의 계대를위한 6 자 접시에 (1 아니라 냉동 바이알 당 합류) 또는 판 냉동 보존을위한 매체 (또는 CryoStore CS10 동결 매체) 냉동 1X hPSC 작은 덩어리, 저장소로 매체, 씹다 hPSC 식민지를 제거합니다.
3 프로토콜 2. NCM에 hPSC 식민지를 공급기로 변환
- 일단 D-PBS에서 hPSC 펠렛을 씻어 10 분 동안 1X Accutase 1 ㎖로 알약을 배양하고, 단일 셀의 분리를 보장하기 위해 현미경으로 효소 반응을 검사합니다.
- 온화 Y-27632은 5 분 동안 RT에서 200 XG에서 원심 분리 한 다음 10 μM을 함유 mTeSR1 배지 5 ㎖에 세포를 재현 탁하여 효소 반응을 종결(세포 손상의 원인이 과도한 원심 분리의 힘을 사용하지 않는 참조).
- 펠렛에 mTeSR1 매체의 5 ML을 추가, 하나의 세포로 펠렛을 재현 탁하고, 필터는 40 μm의 셀 스트레이너 (잔여 세포 집합체를 제거하는)를 통해 세포를 해리.
- 잘 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 2.5 % hESC의 자격 리겔로 코팅 된 6 - 웰 플레이트의 (1.4-2.1 × 10 5 세포 / ㎠), 2.5 mL로 mTeSR1 매체를 추가하고, 10 μM을 포함 배지에서 Y-27632 (초기 24 시간 단세포 도금을 촉진하기 위해). 1 μM Y-39983 (내가 억제제 ROCK), 1 μM의 phenylbenzodioxane (ROCK II 억제제), 1 μM의 thiazovivin (소설 ROCK 억제제) 또는 강화 단일 셀 도금 10 μM Y-27632을 대체하기 위해 다음과 같은 작은 분자를 이용 , 2 μM의 JAK 억제제 1.
- (24 시간 이내) 다음날 약 자유로운 mTeSR1 매체와 매체를 교체, 추가로 하나의 세포를 떼어 놓다또한, 단일 세포 도금의 효율을 결정하는 세포의 수를 계산합니다 (참고 : 대략,이 단계에서 달성 될 수 단일 셀 도금 효율 50-90%).
- 세포가 mTeSR1 매체의 3 ㎖로 몇 일 동안 단일 세포 형성 단층으로 성장 할 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다.
- 경험적으로 세포 밀도에 따라 적응 NCM을 계대 일정을 결정합니다. 세포의 성장은 3 일 또는 4 일에 합류, 또는 세포 간 경계의 소멸 후 4 시간 시점에 도달 통로. 1 ~ 3 분할 비율 (즉, 잘 6 잘 플레이트의 3 우물에서 도금 세포의 1 합류) 세포의 계대 용을 사용 Accutase 1 ㎖의 세포를 떼어 놓다, 5 통로에 적응 NCM을 안정.
- 세포 동결
- 하나의 고정 된 유리 병에 대해 하나의 합류도 (~ 5 ~ 6 배 6 셀) 활용 : 음 10 분 Accutase 1 ㎖로 한 융합 세포를 떼어 놓다.
- w를 희석i 번째 5 전술 한 바와 같이 mTeSR1 매질 및 원심 셀 ML.
- mTeSR1 매체의 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 천천히 냉동 보존 유리 병 (20 μM Y-27632 포함)을 2 배 hPSC 동결 매체 500 μl를 추가합니다. 대안 적으로, 10 μM Y-27632 또는이 어느 μM의 JAK 억제제 1의 존재하에 2 μM의 JAK 억제제 1 또는 1X CryoStor CS10 매체를 함유하는 1X hPSC 동결 배지에서 세포를 재현 탁.
- 얼음 냉각 cryocontainer (isopranol하여 하단 작성)에 냉동 튜브를 삽입하고 즉시 -80 ° C 냉동고에 cryocontainer를 전송합니다.
- 장기간의 냉동 보존에 대한 (다음 날) 액체 질소 탱크에 -80 ° C 냉동고에서 세포를 전송합니다.
- 세포의 해동
- 6 잘 플레이트의 1도를 도금 한 냉동 보존 유리 병을 사용한다.
- 2 분 동안 동일한 물을 욕조에 10 분, 해동 세포에 대한 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 mTeSR1 매체,적가 10 μM Y-27632을 포함하는 미리 예열 mTeSR1 매체의 5 ML에 셀을 추가하고, 상기 한 바와 같이 원심 분리기.
- 조심스럽게 10 μM Y-27632을 포함 mTeSR1 2 ㎖와 세포 펠렛을 재현 탁 천천히 잘 리겔으로 미리 코팅에 세포를 전송 (참고 : 공기 방울을 생성하지 않도록).
- 매일 매체를 변경하고 hPSC 성장은 3 일 또는 4에 합류에 도달 할 전망이다.
4 프로토콜 3. NCM 문화에 리겔에 hPSC 식민지로 변환
- , 냉장고에서 마트 리겔 코팅 된 플레이트를 제거합니다 10 ~ 30 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 배치, 플레이트의 각 우물에서 매체를 제거하고 각 웰에 미리 예열 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다.
- 전송 위의 리겔 플레이트에 피더 문화 (기본 프로토콜의 단계 2.10)에서 hPSC 덩어리를 분쇄. 각 웰에 2.5 ㎖의 최종 부피까지 mTeSR1 매체를 추가합니다.
- 3~4일 매일 매체 변경식민지까지의 80 % 내지 90 %의 합류에 도달합니다.
- 세포의 계대의 경우 : 두 번 D-PBS로 식민지를 씻어 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 2 ㎎ / ㎖ 디스 파제 1 ㎖의 세포를 치료하고, 수풀 등의 침전물과 통로 세포.
- NCM 문화의 경우 : 3.1 ~ 3.9 프로토콜 2에서 설명하는 단계를 반복합니다.
5 프로토콜 4.에 hPSCs의 NCM 문화 LN-521
- 사용 하루 전에 4 ° C에서 재조합 LN-521 솔루션을 해동하고 최종 농도에 (칼슘 2 + / 마그네슘 2 +를 포함) 1X D-PBS와 해동 라미닌을 희석하여 라미닌 코팅 용액 (LCS)을 만들 10 ㎍ / ㎖의.
- (: 드라이 아웃 코팅 과정에서 피할 주)도 6 - 웰 플레이트에 하나에 LCS의 1 ML을 추가합니다.
- 증발을 방지하고 냉장고 (4 ° C) O / N (1 주일 이내에 플레이트를 사용 주)의 플레이트를 저장하는 파라 필름과 코팅 된 플레이트를 밀봉.
- 부드럽게에없이 파스퇴르 피펫 LCS를 제거코팅 된 표면을 uching 잘 하나 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다.
- 25 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 (D-PBS를 포함하여) 모든 문화 솔루션을 따뜻하게.
- hPSC 식민지 NCM로 변환
- 프로토콜 2에 설명 된대로 Accutase으로 하나의 세포에 세포 집합체를 떼어 놓다.
- 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 잘 LN-521-코팅 (1.4-2.1 × 10 / ㎠ 5 셀) ROCK 억제제의 존재없이.
- 3~4일 매일 매체를 변경합니다.
- 1 내지 3 개의 분할 비를 이용하여 다음 세포 계대 1 일 3 또는 4의 Accutase 1 ml의 세포 해리.
. 6 프로토콜 5 : NCM 문화 플라스미드 DNA 형질에 대한
- 4 프로토콜 2에 설명 된대로 NCM 문화에 hPSC 식민지 적응.
- 플레이트는 10 μM Y-2763의 존재에 mTeSR1 매체에 5 세포 / 웰 × 10 7.5 세포 밀도로 12 - 웰 플레이트에 hPSCs 해리2.
- 세포를 도금 후 4-8 시간 사이에 약 자유로운 mTeSR1 매체와 mTeSR1 매체를 교체합니다.
- 각 형질의 경우 (예를 들어, pmaxGFP) 발현 플라스미드의 2.5 μg을 희석하고 125 ㎕의 옵티-MEM 각 별도의 에펜 도르프 튜브에 리포 펙 타민 2000 년 5 μL 세럼 중간을 감소.
- 5 분 후, 희석 시약을 혼합하고 RT (형질 단지를 형성)에서 20 분 동안 품어.
- 1 ㎖ mTeSR1 매체의 각 잘 포함 hPSCs에 250 ㎕의 형질 단지를 추가하고 24 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어.
- 형광 현미경과 실제 형질 전환 효율의 계산을 위해 무작위로 사진에서 형질 전환 효율을 검사합니다.
. 7 프로토콜 6 : NCM 문화 마이크로 RNA의 형질에 대한
- 6에 잘 당 Accutase 1 ㎖를 추가하여 NCM 조건에서 2 일에 반 합류 hPSCs을 떼어 놓다 - 잘 플레이트.
- 5 분 200 XG에서 효소 반응과 원심 분리기를 희석 mTeSR1 매체의 10 ML을 추가합니다.
- , mTeSR1 배지로 세포 펠렛을 재현 탁 10 μM Y-27632를 함유 mTeSR1 배지에서 12 - 웰 플레이트에 웰 당 7.5 × 105 세포의 밀도로 세포를 시드하고, 세포가 4 시간 동안 부착시킨.
- Y27632없는 mTeSR1 매체와 매체를 교체합니다.
- 상업적으로 이용 가능한 마이크로 RNA (예를 들어, Dy547 레이블이 아닌 대상 miRIDIAN miRNA의 형질 컨트롤)를 사용합니다. 제공되는 시약을 사용하여 0-160 nm의에 이르기까지 농도를 적정하고 제조 업체의 지침을 따르십시오.
- 형질 감염 후 24 시간에서 현미경 생균의 Dy547 형광을 영상화함으로써 hPSC 라인의 각 농도에 대한 형질 전환 효율을 최적화.
- 모든 묘화 셀 위에 Dy547 양성 세포의 백분율에 기초하여 형질 전환 효율을 계산한다.
- 반복 프로토콜 6 7.4 7.1 단계를 반복합니다.
- 전달에 사용되는 바이러스 입자의 양을 계산 : 다음 식에 사용 TU를 = TU는 단위 변환의 총 수를 의미하는 반면 (MOI는 CN을 X) / VT, MOI은 잘 (MOI 또는 감염의 원하는 다수의 동일 TU / 셀), CN은 물론 각 세포의 수를 지정하고, VT 재고 바이러스 역가 (TU / ㎖)를 나타냅니다. 예를 들어, SMART-shRNA를 벡터에 대한 스톡 바이러스 역가가 (ML 당 단위 변환) 1 × 10 9 TU / ㎖ 동일 주어진, 7.5 × 10 5 전달시에 웰 당 세포 및 (20)의 예상 MOI는 : 15을 사용 각 웰에 대한 재고 바이러스 입자의 μL가 (주의 :이 조건이 과도 렌티 바이러스 유도하는 것이 좋습니다).
- 30 분 동안 폴리 브렌의 10 ㎎ / ㎖와 mTeSR1 매체의 사전 따뜻한 300 μL.
- 주식 바이러스 입자의 15 μl를 추가로예열 mTeSR1 매체는 폴리 브렌을 함유하는 용액을 부드럽게 혼합한다.
- 바이러스 입자를 포함하는 예비 가온 매체의 300 μL와 세포 배양 배지를 교체합니다.
- 4 시간 배양 한 후, 전달 효율을 결정하는 turboGFP 형광 (shRNA를 발현에 대한 메이커)를 검사합니다.
- 세포가 turboGFP을 표현하기 시작하면 잘 열 변환에 추가 mTeSR1 매체 300 μl를 추가합니다.
- 12 ~ 16 시간 배양 한 후, 터보-GFP 발현을 재검토.
- 72 시간 이내에 형질 세포로 원하는 후속 실험을 수행합니다.
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Representative Results
NCM 문화의 일반적인 스키마
그림 1은 ROCK 억제제 Y-27632의 존재 고밀도 단일 셀 도금 후 hPSCs의 역동적 인 변화를 보여주는 전형적인 NCM 문화 스키마를 나타냅니다. 이러한 형태 변화는 세포의 클러스터 형성을 도금, 세포 응축 다음에 지수 세포 성장 (그림 1A) 후 세포 간 연결이 (가) 있습니다. 대표적인 실험이 1 일에서 10 μM Y-27632의 존재 / ㎠ 1.9 × 10 5 세포의 밀도로 단일 세포로 도금, WA01 (H1) 인간 배아 줄기 세포를 나타냅니다 (그림 1B, 왼쪽 패널), 더없이 전파 하루 2의 식민지 (그림 1B, 가운데 패널)의 형성, 원하는 실험 또는 3 일 (그림 1B, 오른쪽 패널)에서 세포 계대에 적합한 균일 한 단일 층으로 응축.
<강한> 다양한 ROCK 억제제는 NCM 문화 지원
96 - 웰 플레이트 분석은 개념 증명 높은 처리량 약물 검사의 사용되었다. 또한 NCM 배양을 지원하기 위해 다양한 ROCK 억제제의 사용을 최적화하기 위해 설계되었다. 약, 31,000, SCU-I10 세포, 인간 유도 만능 세포 (hiPSCs)를 17 해리은에 도금 된 하나의 리겔 코팅 ROCK 저해제의 서로 다른 농도의 존재에 잘. 24 시간 후, 균체를이 조건 하에서 세포 생존을 결정하기 CCK-8 기반 생존 분석을 실시 하였다. 우리는 이전에 NCM 방법은 단일 셀 도금을 향상시키기 위해 10 μM의 ROCK 억제제, Y-27632의 사용을 필요로하는 것으로 나타났습니다. 이 보고서에서, 우리는 10 μM Y-27632 크게 hiPSCs의 효율성을 도금 24 시간 단일 셀 (P <0.05) (그림 2)를 증가 확인. 우리는 또한 발견 Y-39983 (내가 억제제 ROCK), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibi토르) 및 thiazovivin (신규 ROCK 억제제)는 크게 단일 셀 도금의 효율을 조절하고 자신의 제어 (P <0.05) (도 2)과 비교할 때 1 μM에서 NCM의 성장을 촉진한다. 또한, 단일 셀 도금 효율 (1 μM에서) 세 ROCK 억제제의 효과는 10 μM (P> 0.05) (그림 2)에서 Y-27632의 비교했다. 특히, I (5 μM에서) 억제제 ROCK 다른 분자보다 더 구체적인 상호 작용을 고발, 1 μM (P <0.05)의 약물에 비해 현저한 세포 독성을 보여 나타납니다. 따라서, 다양한 ROCK 억제제는 향후 NCM 배양을 지원하기 위해 사용될 수있다. 그러나, 이러한 새로운 억제제와 NCM에서 모두 인간 배아 줄기 세포와 hiPSCs의 전체 특성은 나중에 사용하기 위해 필요한 것입니다.
LN-521 ROCK 저해제를 사용하지 않고 NCM 문화 지원
T을 확인하려면hESC의 성장을 지원하는 특정 라미닌 이소의 그 역할은 우리가 외부의 배지 TeSR2의 LN-521-코팅 된 플레이트에 SCU-I30 hiPSCs을 배양. 흥미롭게도, 혼자 LN-521, ROCK 억제제의 존재하지 않고, 단일 셀 도금이 상태에서 15 구절에 대한 후속 NCM의 성장 (그림 3)을 지원합니다. 반대로 NANOG 폴리 클로 날 항체와 SCU-I30 세포의 면역 염색은이 조건 하에서 세포가 핵에서 높은 NANOG 식 (도 3A)을 한 것으로 나타났다. 유세포 분석은 hESC의 마커의 발현 양상은 ROCK 억제제 Y-27632 (그림 3B)를 사용하여 NCM로 성장 세포와 유사한 것으로 나타났다.
렌티 바이러스 입자의 사용없이 마이크로 RNA 전달의 고 능률
Dy547 표지 된 올리고 뉴클레오티드 마이크로 RNA와 형질 NCM 조건 WA01 (H1) 세포에서 수행 하였다. WA01의 인간 배아 줄기 세포는에 NCM으로 성장했다 2.5 % 2 (그림 4A)에 대한 mTeSR1의 리겔 (18) (그림 4B)는 각각 통로. 이 세포는 높은 형질 전환 효율을 24 시간 후 형질 (그림 4a 및도 4b)을 보여 주었다. 일반적으로, 우리는 형질 전환 후 24 시간에서 인간 배아 줄기 세포의 91 %에 형질 전환 효율을 최대를 얻을 수 있습니다.
NCM 문화의 그림 1. (A) 스키마. 선 그래프는 NCM 조건에서 전형적인 3 일 문화 다세포 협회의 역동적 인 변화를 묘사한다. (B) 16 구절 mTeSR1 매체에 2.5 % 리겔에 NCM 조건에서 전파 WA01 (H1) 인간 배아 줄기 세포의 대표 상 이미지 (지정 WA01, mcp16) 등. 하판은 상판의 확대도이다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.EF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg"대상 = "_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2. 96 - 웰 포맷을 사용하여 단일 세포 생존 분석법. 약, 31,000 SCU-I10 hiPSCs 17에 나타낸 농도에서 RHO - 관련 키나제 (ROCK) 경로에 관련된 다양한 소분자 억제제의 존재하에 2.5 % 마트 리겔에 도말 . 24 시간 후, 균체를 450 nm의 (A450)에서의 흡광도를 측정하여 CCK-8 생존 분석을 실시 하였다. 학생의 t-시험은 다양한 ROCK 억제제 간의 단일 셀 도금 효율의 차이는 통계적 유의성의 지 여부를 결정하는 데 사용 하였다. 단일 별표 기호 (*)는 억제제 (P & # 사이에 유의 한 차이를 나타냅니다62; 0.05), (**) 관찰 된 차이를 나타낸다 이중 별표 표시가 통계적으로 유의 한 (P <0.05) 반면. 히스토그램의 열은 사통 결정과 바의 평균 값은 표준 편차를 나타내는 지정합니다.
ROCK 저해제의 존재없이 라미닌-521 (LN-521)에 hiPSCs의 그림 3. NCM의 문화. SCU-I30 hiPSC 라인은 셀 단위 줄기 NIH에 설립되었습니다. SCU-I30 셀은 같은 ROCK 저해제와 같은 작은 분자 억제제를 사용하지 않고 15 구절에 대한 외부의 배지 TeSR2의 LN-521-코팅 6 - 잘 접시에 성장했다. 방지와 SCU-I30 셀 (A) 면역 염색 -NANOG 폴리 클로 날 항체 및 훽스트 33342 (훽스트)와 대조. 특히, 음의 NANOG 염색이 일부 세포는 일이다유사 분열에서 전자 셀. (B) Y-27632없이 LN-521에 10 μM Y-27632 (위 패널) 또는 NCM의 사용으로 2.5 % 리겔에 NCM로 성장 SCU-I30 셀에 hPSC 마커 표현의 유세포 분석 (하단 패널). 면역 염색 및 유세포 분석 모두에 대한 절차는 이전 5 기재 하였다. 스케일 바는 100 μm의를 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
각각 그림 4. 마이크로 RNA 형질에 대한 hPSCs의 NCM의 문화. WA01 인간 배아 줄기 세포는 2 (A)에 mTeSR1 2.5 % 리겔에 NCM로 성장하고, 18 (B) 통로. 다이 형질 WA01 세포의 주제 상 및 형광 이미지형질 전환 후 24 시간에서 형질 전환 효율을 모니터링하기위한 제어 마이크로 RNA를 547 표지. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기존의 (피더 또는 세포 외 매트릭스에 세포의) 식민지 형 문화와 지류 6없이 집계로 hPSCs의 현탁 배양 : 체외에서 배양 hPSCs에 두 가지 주요 방법이 있습니다. 식민지 형 서스펜션 모두 배양 방법의 한계는 축적 된 이질성 및 상속 성적인 변경 내용이 포함되어 있습니다. NCM 배양, 단세포 계대 및 고밀도 세포 도금 양에 기초 hPSC 성장 6,18위한 새로운 배양 방법을 나타낸다. 다양한 단일 세포 계대 방법은 문헌에 기록되어있다,하지만 그들 중 누구도 일상적인 전파를 사용하지 않지만. 예를 들어, 우 및 동료 hPSC 성장 19에 다양한 작은 분자 칵테일의 효과를 연구 할 수있는 단일 세포 계대 방법을 채택했다. 그러나, 최종 문화 제품은 식민지입니다. 따라서, 저밀도 기반 단일 셀 계대 방법은 여전히 콜로니 식 배양에 속한다. NCM 문화, 높은 굴과 관련하여최종 셀 제품은 균질 한 단일 층이기 때문에 ITY 도금, 새로운 방법이 문화를 변형시킨다. 최근, 드보르작와 동료 종합적으로 이러한 성장 조건 18 세 이하 hPSC 특성을 분석하기 위해 비슷한 방법을 사용했다. 그들의 결과는 또한 우리의 주요 결론을 지원합니다. 그것은 NCM 문화는 여러 가지 새로운 속성을 가지고 새로운 방법이며 더 다 능성 줄기 세포 생물학에있는 많은 잠재적 인 응용 프로그램에 대한 수정 될 수 있음 이제 분명하다.
NCM 문화에서 hPSCs의 기본 속성
그것은 세포의 동일한 유형의 hPSCs NCM 아래 문화 점유율 많은 특성이 식민지 9,18로 성장 생각할 수있다. 월 04 NANOG, SSEA-3 / 4, 트라-1-60, 트라-1-81, 및 SSEA-1을 포함 hPSCs에서 hESC의 마커의 발현 수준은 NCM 및 콜로니 식 배양 모두 비슷 . NCM 적응 된 세포는 M에 성장 hPSC 콜로니 유사한 도전 mRNA 발현 패턴을 유지EF 피더 층 9. 기형 종 분석 9,18 의해 결정 분명 NCM 적응 된 세포는 다 능성 상태를 유지한다. 그러나 hPSC 식민지와 달리, NCM 조건에서 세포는 안정적인 성장 곡선, 세포주기 및 세포 수 (9)에 의해 특징입니다 예측 성장률이 있습니다. 인해 고밀도 단세포 도금, NCM 조건 하에서 hPSCs함으로써 MEFs 성장 hPSC 콜로니에 비해 4 배에 의해 세포 수를 증가시키는, 일 (2, 4) (도 1b) 간의 급수를 나타낸다. 장기간 배양 세포 생산을 증가시키지 않고, 오히려 세포 사멸과 분화 응력 9는 증가한다. NCM은 따라서 해동 세포 (프로토콜 1) 도금에 빠른 세포 회복을 허용, 최적의 냉동 보존 할 수 있습니다. 또한, NCM은 다양한 이종없는 프로토콜 9 hPSC 문화의 적응을 용이하게한다. 일반적으로, NCM은 hPSCs의 성장을 지원하는 다 능성 상태를 유지하고, poten 지탱세 가지 세균 층의 성인 조직으로 분화 할 수 hPSCs의 자유형.
NCM에서 hPSCs의 염색체 안정성
염색체 안정성의 관점에서, 상이한 배양 방법에서 셀 사이의 직접적인 비교는 없다. G-밴딩, 어레이 기반의 비교 게놈 교잡 (aCGH) 및 형광 제자리 교잡 (FISH) (9)에 의해 결정되는 우리의 NCM 배양 조건에서 hPSCs의 대다수는 정상 핵형 및 유전자 사본 번호가. 두 줄 (~ 13 %)은 하나의 라인 (즉, WA09)는 20 번 삼 염색체 9와 세포의 14 %를 가지고 높은 배수성과 또 다른 하나 (ES01)를 전시하는, 비정상 핵형을 보였다. 그것은 이러한 비정상 핵형이에서 파생되었는지 여부 불분명 이전 NCM 문화 또는 NCM에 적응하는 동안 유도 돌연변이 세포를 기존의 선택. 그것은 시작 hPSC 식민지 또는 식민지의 일부가 NCM 문화 쉬에 사용하는 것이 중요합니다NCM 적응의 시간에 자신의 균일 성 염색체 안정성의 측면에서 잘 특성화 될 울드. 특히, NCM 조건 하에서 비정상 핵형의 비율은 저자가 지배적 콜로니 식 배양 조건 하에서 20 34 % 이상 핵형을 계시하는 최근 코호트 분석에서보고 된 것보다 훨씬 더 낮다. 따라서, 우리의 연구는 우리가 해리 단일 세포 성장 및 NCM의 조건에서 염색체의 안정성을 유지 할 수 있음을 나타냅니다는. 그럼에도 불구하고, 우리는 또한 앞으로 hPSCs의 염색체 이상을 검사하는 더 민감한 방법을 사용합니다. 이러한 자주 변경 염색체에 약간의 병변 (예를 들어, 20q11.21의 증폭이) 기존에 의해 감지 할 수 없으므로 특히, 우리는 높은 해상도의 프로브 (즉, <50 킬로바이트)를 사용하여 염색체 1, 12, 17, 20를 스캔해야 핵형 분석과 FISH 20-22. 또한, 다양한 NCM 프로토콜의 개발은 robu를 식별 할 수있게합니다성 및 미래의 애플리케이션을위한 안전한 방법.
다양한 수정에서 NCM 문화
ROCK 저해제, Y-27632의 사용은 단일 세포 기반 분석을 위해 문을 열었습니다. 다양한 ROCK 억제제의 사용 가능 여부는 hPSCs의 NCM 기반 확장과 냉동 보존 (그림 2)에 대한 추가 선택을 제공 할 것이다. 이론적으로, 현저하게 단세포 도금의 효율을 증가시킬 수있는 작은 분자는 NCM 배양을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 다르게 그 ROCK 억제제에서, 그러한 실시 예 9를 나타내는 함수 JAK 억제제 1. 단일 분자 또는 조합 방식의 사용은 우리에게 최적의 세포 성장, 세포 분석 및 hPSCs의 냉동 보존을 제공 할 수있다. 그러나, 일반적으로 인간 배아 줄기 세포 23 ~ 25에 표현 된 라미닌 이소 LN-521,,로 정의 된 세포 외 기질 단백질에 hPSCs의 대안 NCM 문화는 작은의 간섭을 제거 할 수있다분자 (그림 3). LN-521 해리 - hPSC 생존을 강화하고 α6β1-PI3K/AKT 통로 (24)의 활성화를 통해 능성을 지속 할 수 있습니다. LN-521과 계대의 hPSCs의 단순 완전히 정의 매체 (프로토콜 4)를 사용하여 다양한 피더 - 무료 및 이종없는 세포 배양 시스템과 호환 세포의 이질성을 줄일 수 있습니다. 또한 작은 분자의 영향을받지 않고 높은 처리량 분석을위한 추가 모듈을 제공합니다. LN-521에 NCM 문화에서 유도 만능이 hPSC 마커, 기형 종 분석 및 배아 몸 매개 multilineage의 차별화를 사용하여 이러한 세포의 추가 특성의 패널의 표현을 그대로 유지하지만 이들 세포의 다 능성 상태를 확인해야 할 수 있습니다. 참고로, hiPSCs은 라미닌 이소 LN-521 전하는 바에 의하면 세포 유전 학적 안정 (http://biolamina.com/)에 배양 하였다. (전술 한 바와 같이) 그러나, 우리는 전자에 더 높은 해상도와 민감한 방법을 적용 할 필요가이러한 세포의 염색체 안정성 xamine.
유전 공학에 대한 NCM 문화의 다양성
NCM 기반의 방법은 hPSCs (프로토콜 5-7)의 유전자 조작에 특히 유용 할 수 있습니다, 간단한 강력하고 경제적 인 시스템을 나타냅니다. 그것은 hESC의 식민지가 형질 또는 다른 실험실 26 일부터 28 일 사이에 형질 전환 / 전달의 효율성에 큰 변화와 함께, 형질 도입하기 어려운 것으로 알려져있다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포의 형질 전환 효율은 3 식민지 배양 조건 26에서 35 % 사이입니다. 콜로니 조건 하에서 BG01 세포의 렌티 바이러스 형질 도입 신호가 구 매우 낮은 것으로 밝혀졌다. 그러나 NCM 의해 매개 형질 전환 효율은 75 % 이상으로 15이고 전달 방법의 변형 예는 90 % (28)까지 렌티 바이러스 - 매개 형질 도입 효율을 증가시킬 수있다. 꽉 비교 연구는 일이라고 밝혔다낮은 형질 전환 효율이 9에 기여 hESC의 식민지에서 전자 다세포 협회. 또한, 우리는 최근 마이크로 RNA의 형질 전환 프로토콜을 수정하고 lentiviruses (프로토콜 6과 그림 4)를 사용하지 않고 높은 형질 전환 효율 (~ 91 %)을 달성 할 수있다. 5 일간의 기간에 -이 프로토콜은 사용하기 쉽고 (3) 내의 일시적인 형질 전환 실험에 특히 유용합니다. 우리는 위의 프로토콜에 묘사로 우리가 hPSCs에 형질 전환 / 전달 효율을 최적화 할 때, 여러 요인이 고려 사항에주의해야한다. 이러한 요소는 세포 밀도, 플라스미드 농도, 렌티 바이러스 역가, 감염의 다중성 (MOI), 형질 전환 / 전달의 지속 시간, 시약의 세포 독성 및 모니터링의 형질 전환 / 전달 효율을 위해 사용 방법을 포함한다.
우리는 정교하고 리겔에와 정의 세포 외 매트릭스에 문화 hPSCs에 NCM 방법을 확장 할 수 있습니다. 이 배양 방법일반적으로 hPSC 식민지 및 집계 문화에서 발견되는 이질성을 제거하는 효율적인 방법입니다. NCM 성장 조건에서 인간 다 능성 줄기 세포는 다 능성 및 염색체 안정하다. 이 새로운 문화 시스템은 hPSC 유지 보수, 대규모 확장, 유전자 조작에 대한 간단하고 다재다능하다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
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