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Biology

मानव pluripotent के लिए वैकल्पिक संस्कृतियों सेल उत्पादन, रखरखाव, और जेनेटिक विश्लेषण स्टेम

Published: July 24, 2014 doi: 10.3791/51519
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

Introduction

multilineage वयस्क ऊतकों की ओर अंतर करने hPSCs की क्षमता हृदय, यकृत, अग्नाशय, और मस्तिष्क संबंधी प्रणालियों 1-4 शामिल है कि गंभीर बीमारियों से पीड़ित मरीजों के इलाज के लिए नए रास्ते खोल दिया है. HPSCs से निकाली गई विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में भी रोग मॉडलिंग, जेनेटिक इंजीनियरिंग, दवा स्क्रीनिंग, और विषाक्तता परीक्षण 1,4 के लिए मजबूत सेलुलर प्लेटफार्मों प्रदान करेगा. उनके भविष्य के नैदानिक ​​और औषधीय अनुप्रयोगों सुनिश्चित करता है कि प्रमुख मुद्दा इन विट्रो सेल संस्कृति के माध्यम से नैदानिक ​​ग्रेड hPSCs की बड़ी संख्या की पीढ़ी है. हालांकि, मौजूदा संस्कृति प्रणालियों कालोनियों 5,6 के रूप में hPSCs के विभिन्न फीडर और फीडर से मुक्त संस्कृतियों से जुड़े, अपर्याप्त या स्वाभाविक चर या तो कर रहे हैं.

HPSCs के शेयर शुरुआती स्तनधारी भ्रूण की आंतरिक कोशिका द्रव्यमान (आईसीएम) की कई ढांचागत सुविधाओं की कालोनी प्रकार विकास. आईसीएम तीन रोगाणु परतों में अंतर होने का खतरा हैक्योंकि विषम संकेतन ढ़ाल के अस्तित्व की एक बहुकोशिकीय वातावरण में. इस प्रकार, जल्दी भ्रूण के विकास में विविधता के अधिग्रहण के भेदभाव के लिए एक आवश्यक प्रक्रिया के रूप में माना जाता है, लेकिन HPSC संस्कृति की एक अवांछित सुविधा है. HPSC संस्कृति में विविधता के कारण अक्सर suboptimal विकास की स्थिति को अत्यधिक apoptotic संकेतों और सहज भेदभाव से प्रेरित है. इस प्रकार, कॉलोनी प्रकार संस्कृति में, विषम कोशिकाओं अक्सर कालोनियों 7,8 की परिधि में मनाया जाता है. यह भी मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESC) में कोशिकाओं बीएमपी 4 9 के रूप में संकेतन अणुओं को प्रदर्शनी अंतर प्रतिक्रियाओं कालोनियों कि दिखाया गया है. इसके अलावा, कॉलोनी संस्कृति तरीकों के कारण बेकाबू विकास दर और apoptotic संकेतन 6,9 रास्ते के लिए कम सेल पैदावार के साथ ही cryopreservation से बहुत कम सेल वसूली की दरों का उत्पादन. हाल के वर्षों में, विभिन्न निलंबन संस्कृतियों, संवर्धन hPSCs के लिए particul विकसित किया गया हैफीडर और मैट्रिक्स मुक्त परिस्थितियों 6,10-13 में hPSCs की बड़ी मात्रा के विस्तार के लिए Arly. जाहिर है, अलग संस्कृति प्रणालियों के अपने फायदे और नुकसान हैं. सामान्य में, hPSCs की विषम प्रकृति जेनेटिक इंजीनियरिंग 6 hPSCs में डीएनए और आरएनए सामग्री पहुंचाने के लिए suboptimal हैं जो कॉलोनी के प्रकार और एकत्रित संस्कृति तरीकों में प्रमुख कमियां, में से एक का प्रतिनिधित्व करता है.

जाहिर है, वर्तमान संस्कृति तरीकों में से कुछ कमियों को नाकाम कि नई प्रणाली विकसित करने के लिए एक अनिवार्य आवश्यकता है. एकल कोशिका अस्तित्व में सुधार (जैसे रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 और जे ए अवरोध करनेवाला 1) के रूप में छोटे अणु inhibitors की खोजों अलग-HPSC संस्कृति 14,15 के लिए मार्ग प्रशस्त हुआ. इन छोटे अणुओं का उपयोग के साथ, हम हाल ही में गैर कॉलोनी प्रकार अलग-hPSCs 9 की (एनसीएम) के विकास पर आधारित एक संस्कृति विधि विकसित की है. इस उपन्यास संस्कृति विधि एकल कक्ष passaging और उच्च घनत्व दोनों को जोड़ती है, तरीकों चढ़ाना हमें प्रमुख गुणसूत्र असामान्यताओं 9 के बिना लगातार विकास चक्र के तहत सजातीय hPSCs की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने की इजाजत दी. वैकल्पिक रूप से, एनसीएम संस्कृति व्यापक अनुप्रयोगों के लिए संस्कृति विधि का अनुकूलन करने के क्रम में विभिन्न छोटे अणुओं और (जैसे laminins के रूप में) परिभाषित matrices के साथ लागू किया जा सकता है. यहाँ, हम एनसीएम संस्कृति पर आधारित कई विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान और जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को चित्रित. एनसीएम प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन करने के लिए, हम भी विविध रॉक inhibitors के साथ और एकल laminin isoform 521 (यानी, एल एन-521) के साथ एनसीएम संस्कृति का परीक्षण किया.

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Protocol

HPSCs की एकल कोशिका आधारित गैर कॉलोनी प्रकार monolayer (एनसीएम) संस्कृति.

1. तैयारी

  1. 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, और 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA) के साथ पूरक DMEM मध्यम: माउस भ्रूणीय fibroblasts (MEFs) की संस्कृति के लिए माध्यम के 500 मिलीलीटर.
  2. माउस भ्रूणीय fibroblasts DMEM मध्यम में 0.1% जिलेटिन लेपित 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली पर एक नियमित प्रोटोकॉल 16 और संस्कृति MEFs निम्नलिखित CF1 तनाव से व्युत्पन्न (MEFs) कोशिकाओं को अलग. वैकल्पिक रूप से, वाणिज्यिक संसाधनों से पारित होने के 3 में MEF शेयरों की खरीद.
  3. Matrigel प्लेटों की तैयारी.
    1. एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 50% aliquots के रूप में 5 (~ 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा) DMEM/F12 मध्यम मिलीलीटर और दुकान के साथ hESC योग्य Matrigel शेयर के 5 एमएल पतला. एक रेफ्रिजरेटर (~ 4 डिग्री सेल्सियस) ओ / एन में जमी Matrigel शेयर पिघलना और आगे (2.5% काम एकाग्रता को जन्म देने के लिए) ठंड DMEM/F12 मध्यम में Matrigel पतला.
    2. थाली 10 से 30 मिनट के लिए सेल कल्चर हुड (नोट: एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में थाली गर्म नहीं है) में आरटी पर गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं, फ्रिज से Matrigel थाली निकालें, और महाप्राण DMEM मध्यम पूर्व hPSCs चढ़ाना के लिए.
  4. 500 मिलीलीटर hESC मध्यम बनाओ: 80% DMEM/F12 मध्यम, 20% एस आर, 2 मिमी एल glutamine, 0.1 मिमी गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 0.1 मिमी β-mercaptoethanol, और 4 FGF-2 के / एमएल एनजी.
  5. , 60% FBS, 20% DMSO, और mTeSR1 मध्यम में 20 माइक्रोन वाई 27,632 निस्पंदन द्वारा जीवाणुरहित, और 1 सप्ताह के भीतर मध्यम उपयोग करें: 2X HPSC ठंड माध्यम के 10 एमएल तैयार करें.

. 2 प्रोटोकॉल 1 (बेसिक): फीडरों पर HPSC कालोनियों आगे बढ़ें

  1. लगातार resul पाने के लिए HPSC संस्कृति के लिए 5 या 6 (P5 और P6 के रूप में नामित) में MEF बीतने के इस्तेमाल की संख्याटीएस. Mitotically 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए 10 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर mitomycin सी के साथ कोशिकाओं के इलाज से MEFs निष्क्रिय, धोने कोशिकाओं 1X Dulbecco फॉस्फेट-buffered खारा (डी पीबीएस) के साथ 3x, और फिर 0.53 मिमी में 0.05% trypsin के साथ MEFs अलग कर देना EDTA. वैकल्पिक रूप से, एक एक्स - रे irradiator साथ 8,000 RADS की एक खुराक पर MEFs चमकाना.
  2. खुर्दबीन के नीचे Trypan ब्लू दाग बहिष्कार विधि का उपयोग सेल नंबर गणना. वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करें.
  3. 6 अच्छी तरह polystyrene प्लेटों पर प्लेट विकिरणित MEFs अच्छी तरह से प्रति 1.88 x 10 5 कोशिकाओं (यानी, 1.96 x 10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी) के एक घनत्व 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित. 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 5% सीओ 2 के 24 घंटे के लिए.
  4. एक पाश्चर पिपेट (: इस समय की जरूरत नहीं धोने कदम नोट) के साथ आकांक्षा से MEF संस्कृति के माध्यम से निकालें.
  5. छोटे clumps में पिछले संस्कृति से महीन चुर्ण बनाना HPSC कालोनियों, एफआर लेकर उनके आकार सुनिश्चित करने के लिए खुर्दबीन के नीचे झुरमुटों की जांचओम 50 व्यास में माइक्रोन से 100, और अच्छी तरह से HPSC मध्यम 2 मिलीलीटर युक्त एक में MEF फीडर परतों के शीर्ष पर HPSC clumps थाली.
  6. किसी भी आकृति विज्ञान या बदल विभेदित कालोनियों (~ 5%) निशान, फोटोग्राफ द्वारा 3 से 5 दिन, रिकॉर्ड कॉलोनी के विकास के लिए hESC मध्यम प्रतिदिन बदलते हैं और स्वयं एक पाश्चर विंदुक के साथ धीरे आकांक्षा द्वारा चिह्नित कालोनियों को हटा दें.
  7. दो बार MEFs पर शेष कालोनियों (2 मिनट डी पीबीएस के साथ प्रत्येक) कुल्ला, और 2 मिलीलीटर 1 की मिग्रा / 10 से 30 मिनट के लिए HPSC माध्यम में मिलीलीटर collagenase चतुर्थ) के साथ कालोनियों सेते हैं, और से HPSC कालोनियों की टुकड़ी की जांच MEF लेपित सतह (नोट: कालोनियों कसकर थाली से जुड़े होते हैं केवल यदि टुकड़ी प्रक्रिया में मदद करने के लिए एक खुरचनी का उपयोग करें).
  8. , एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को एंजाइमी प्रतिक्रियाओं, स्थानांतरण कालोनियों को कम HPSC कालोनियों आरटी पर 3 से 5 मिनट के लिए तलछट करने की अनुमति, और सी के प्रत्यक्ष दृश्य द्वारा कालोनियों के अवसादन सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से HPSC माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ेंट्यूब के नीचे एल्स (नोट: इस चरण में ट्यूब अपकेंद्रित्र नहीं है).
  9. अवशिष्ट MEFs युक्त supernatants निकालें और एकल कक्षों अलग, hESC माध्यम के 5 मिलीलीटर के साथ कालोनियों resuspend, और दो बार अवसादन कदम दोहराएँ.
  10. सेल passaging के लिए 6 अच्छी तरह से थाली पर (1 अच्छी तरह से जमे हुए शीशी प्रति मिला हुआ) या थाली cryopreservation के लिए मध्यम (या CryoStore CS10 ठंड मध्यम) ठंड 1X HPSC में छोटे clumps, दुकान में मध्यम, महीन चुर्ण बनाना HPSC कालोनियों निकालें.

3 प्रोटोकॉल 2:. एनसीएम को HPSC कालोनियों भक्षण से कन्वर्ट

  1. , एक बार डी पीबीएस में HPSC छर्रों कुल्ला 10 मिनट के लिए 1X Accutase के 1 मिलीलीटर के साथ छर्रों सेते हैं, और एकल कक्ष हदबंदी सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे enzymatic प्रतिक्रिया की जांच.
  2. धीरे वाई 27,632 5 मिनट के लिए आरटी पर 200 XG पर centrifugation द्वारा पीछा किया 10 माइक्रोन से युक्त mTeSR1 माध्यम के 5 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspending द्वारा एंजाइमी प्रतिक्रियाओं बर्खास्त(सेल नुकसान का कारण जो अत्यधिक centrifugation बलों का उपयोग नहीं करते, ध्यान दें).
  3. गोली mTeSR1 माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें, एकल कक्षों के रूप में गोली resuspend, और फिल्टर एक 40 माइक्रोन सेल झरनी (किसी भी अवशिष्ट सेल समुच्चय को दूर करने के लिए) के माध्यम से कोशिकाओं को अलग.
  4. एक कुएं में बीज 1.3-2 एक्स 10 6 hPSCs 2.5% hESC योग्य Matrigel साथ लेपित 6 अच्छी तरह से थाली के (1.4-2.1 x 10 5 कोशिकाओं / 2 सेमी), 2.5 मिलीग्राम तक का mTeSR1 मध्यम जोड़ने, और 10 माइक्रोन शामिल मध्यम में वाई 27,632 (प्रारंभिक 24 घंटा एकल कक्ष चढ़ाना सुविधाजनक बनाने के लिए). 1 माइक्रोन Y-39983 (मैं अवरोध करनेवाला रॉक), 1 माइक्रोन phenylbenzodioxane (रॉक द्वितीय अवरोध करनेवाला), 1 माइक्रोन thiazovivin (एक उपन्यास रॉक अवरोध करनेवाला): वैकल्पिक रूप से, बढ़ाने एकल कक्ष चढ़ाना के लिए 10 माइक्रोन वाई 27,632 बदलने के लिए निम्न छोटे अणुओं का उपयोग , और 2 माइक्रोन जे ए अवरोध करनेवाला 1.
  5. (24 घंटे के भीतर) अगले दिन पर दवा मुक्त mTeSR1 मध्यम से मध्यम बदलें, अतिरिक्त एक से कोशिकाओं को अलग कर देनाखैर, और एकल कक्ष चढ़ाना दक्षता का निर्धारण करने के लिए सेल संख्या की गणना (नोट: लगभग, इस स्तर पर प्राप्त किया जा सकता है कि एकल कक्ष चढ़ाना दक्षता का 50 से 90%).
  6. कोशिकाओं mTeSR1 माध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ कुछ दिनों के लिए एक एकल कोशिका से बनाई monolayer के रूप में विकसित करने की अनुमति. दैनिक मध्यम बदलें.
  7. Empirically सेल घनत्व के आधार पर अनुकूलित एनसीएम passaging के लिए समय निर्धारित करते हैं. सेल के विकास के दिन 3 या 4 दिन में संगम, या सेल करने वाली सेल सीमाओं के लापता होने के बाद 4 घंटा समय बिंदु पर पहुंचता है जब यात्रा. एक 1-3 बंटवारे अनुपात (यानी, अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली के 3 कुओं में चढ़ाया कोशिकाओं के 1 मिला हुआ) सेल passaging के लिए उपयोग, Accutase के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को अलग कर देना, और 5 मार्ग द्वारा रूपांतरित एनसीएम को स्थिर.
  8. सेल ठंड
    1. एक जमे हुए शीशी के लिए एक मिला हुआ अच्छी तरह से (~ 5-6 X10 6 कोशिकाओं) का उपयोग: ठीक 10 मिनट के लिए Accutase के 1 मिलीलीटर के साथ एक मिला हुआ से कोशिकाओं को अलग कर देना.
    2. डब्ल्यू पतलाith 5 ऊपर वर्णित के रूप में mTeSR1 मध्यम और अपकेंद्रित्र कोशिकाओं के मिलीलीटर.
    3. MTeSR1 माध्यम के 500 μl में गोली Resuspend और फिर धीरे धीरे एक cryopreservation शीशी में (20 माइक्रोन वाई 27,632 युक्त) 2X HPSC ठंड मध्यम के 500 μl जोड़ें. वैकल्पिक रूप से, 10 माइक्रोन वाई 27,632 या 2 या तो माइक्रोन जे ए अवरोध करनेवाला 1 की उपस्थिति में 2 माइक्रोन जे ए अवरोध करनेवाला 1 या 1x CryoStor CS10 मध्यम युक्त 1X HPSC ठंड मध्यम में कोशिकाओं resuspend.
    4. एक बर्फ ठंडा cryocontainer (isopranol के साथ नीचे से भरे) में जमे हुए शीशियों प्लेस और तुरंत एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में cryocontainer हस्तांतरण.
    5. लंबी अवधि cryopreservation के लिए (अगले दिन) एक तरल नाइट्रोजन टैंक को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से कोशिकाओं स्थानांतरण.
  9. सेल विगलन
    1. 6 अच्छी तरह से थाली में से 1 अच्छी तरह से चढ़ाना के लिए एक cryopreservation शीशी का उपयोग.
    2. 2 मिनट के लिए एक ही नहाने के पानी में 10 मिनट, पिघलना कोशिकाओं के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूर्व गर्म mTeSR1 मध्यम,ड्रॉप के लिहाज से 10 माइक्रोन वाई 27,632 युक्त पूर्व गर्म mTeSR1 माध्यम के 5 मिलीलीटर कोशिकाओं को जोड़ने, और ऊपर वर्णित के रूप में अपकेंद्रित्र.
    3. धीरे 10 माइक्रोन वाई 27,632 युक्त mTeSR1 मध्यम 2 मिलीलीटर के साथ सेल छर्रों resuspend और धीरे धीरे एक अच्छी तरह से Matrigel के साथ पूर्व में लिपटे कोशिकाओं हस्तांतरण (नोट: हवाई बुलबुले उत्पादन से बचने).
    4. दैनिक मध्यम बदलें और HPSC वृद्धि दिन 3 या 4 साल में संगम तक पहुँचने की उम्मीद है.

4 प्रोटोकॉल 3:. एनसीएम संस्कृति को Matrigel पर HPSC कालोनियों में कनवर्ट

  1. फ्रिज से एक Matrigel लेपित थाली निकालें 10 से 30 मिनट के लिए टिशू कल्चर हुड में थाली प्लेस, थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से मध्यम हटाने, और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पूर्व गर्म mTeSR1 मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. स्थानांतरण ऊपर Matrigel प्लेट के लिए फीडर संस्कृति (बुनियादी प्रोटोकॉल के चरण 2.10) से HPSC clumps triturated. प्रत्येक कुएं में 2.5 मिलीलीटर अंतिम मात्रा पर निर्भर mTeSR1 मध्यम जोड़ें.
  3. 3 से 4 दिन के लिए दैनिक मध्यम बदलेंकालोनियों तक के 80 से 90% संगम तक पहुँचने.
  4. सेल passaging के लिए:, दो बार डी पीबीएस के साथ कालोनियों कुल्ला 15 से 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीग्राम / एमएल dispase के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज, और गुच्छों के रूप में तलछट और पारित होने कोशिकाओं.
  5. एनसीएम संस्कृति के लिए: 3.1-3.9 प्रोटोकॉल 2 में वर्णित चरणों को दोहराएँ.

5 प्रोटोकॉल 4:. पर hPSCs की एनसीएम संस्कृति एलएन-521

  1. प्रयोग के दिन से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर पुनः संयोजक एलएन-521 समाधान पिघलना और एक अंतिम एकाग्रता के लिए (सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + युक्त) 1x डी पीबीएस के साथ thawed laminin गिराए द्वारा laminin कोटिंग समाधान (LCS) बनाने 10 माइक्रोग्राम / एमएल.
  2. (: सूखी बाहर कोटिंग प्रक्रिया के दौरान बचने के नोट) अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली में एक करने के लिए LCS के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. वाष्पीकरण को रोकने और रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) ओ / एन (1 सप्ताह के भीतर प्लेट का उपयोग करें) में थाली स्टोर करने के लिए Parafilm के साथ लेपित प्लेट सील.
  4. धीरे करने के लिए बिना एक पाश्चर विंदुक के साथ LCS हटानेलेपित सतह uching और अच्छी तरह से एक के लिए mTeSR1 मध्यम 2 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. 25 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में (डी पीबीएस सहित) सभी संस्कृति समाधान गर्म.
  6. HPSC कालोनियों एनसीएम के साथ परिवर्तित
    1. प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में Accutase साथ एकल कक्षों के लिए सेल समुच्चय अलग कर देना.
    2. एक में बीज 1.3-2 एक्स 10 6 hPSCs अच्छी तरह एलएन-521-लेपित (1.4-2.1 x 10/2 सेमी 5 कोशिकाओं) रॉक inhibitors की उपस्थिति के बिना.
    3. 3 से 4 दिनों के लिए दैनिक मध्यम बदलें.
    4. एक 1-3 बंटवारे अनुपात का उपयोग अगले सेल passaging के लिए दिन 3 या 4 साल में Accutase के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को अलग कर देना.

. 6 प्रोटोकॉल 5: एनसीएम संस्कृति प्लास्मिड डीएनए अभिकर्मक के लिए

  1. 4 के लिए प्रोटोकॉल 2 में वर्णित के रूप में एनसीएम संस्कृति को HPSC कालोनियों को अपनाना.
  2. प्लेट 10 माइक्रोन Y-2763 की मौजूदगी में mTeSR1 माध्यम में 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से एक्स 10 7.5 की एक सेल घनत्व के साथ 12 अच्छी तरह से थाली में hPSCs अलग2.
  3. कोशिकाओं चढ़ाना के बाद 4-8 घंटे के बीच दवा मुक्त mTeSR1 मध्यम साथ mTeSR1 मध्यम बदलें.
  4. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, (उदाहरण के लिए, pmaxGFP) अभिव्यक्ति plasmids के 2.5 ग्राम पतला और 125 μl Opti-सदस्य में से प्रत्येक में अलग Eppendorf ट्यूबों में 2000 Lipofectamine के 5 μl सीरम मध्यम कम.
  5. 5 मिनट के बाद, पतला अभिकर्मकों मिश्रण और आर टी (अभिकर्मक परिसरों के लिए फार्म) पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  6. 1 मिलीलीटर mTeSR1 माध्यम में प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त hPSCs के लिए 250 μl अभिकर्मक परिसरों में जोड़ें और 24 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं.
  7. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और वास्तविक अभिकर्मक दक्षता की गणना के लिए बेतरतीब ढंग से तस्वीर के नीचे अभिकर्मक दक्षता जांच करते हैं.

. 7 प्रोटोकॉल 6: एनसीएम संस्कृति microRNAs के अभिकर्मक के लिए

  1. 6 में अच्छी तरह से प्रति Accutase के 1 मिलीलीटर जोड़कर एनसीएम परिस्थितियों में दिन 2 पर अर्द्ध मिला हुआ hPSCs अलग कर देना अच्छी तरह से थाली.
  2. 5 मिनट के लिए 200 XG पर एंजाइमी प्रतिक्रियाओं और अपकेंद्रित्र को कमजोर करने mTeSR1 माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. , MTeSR1 माध्यम के साथ सेल गोली Resuspend 10 माइक्रोन वाई 27,632 युक्त mTeSR1 मध्यम में एक 12 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति 7.5 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं के बीज, और कोशिकाओं 4 घंटे के लिए देते हैं.
  4. Y27632 मुक्त mTeSR1 मध्यम से मध्यम बदलें.
  5. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध microRNAs (जैसे, Dy547 साथ लेबल एक गैर लक्षित कर miRIDIAN miRNA अभिकर्मक नियंत्रण) का उपयोग करें. प्रदान की अभिकर्मकों का उपयोग 0-160 एनएम से लेकर सांद्रता टाइट्रेट और 'निर्माताओं के निर्देशों का पालन करें.
  6. अभिकर्मक के बाद 24 घंटे में एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं का जीना Dy547 प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा HPSC लाइनों में प्रत्येक एकाग्रता के लिए अभिकर्मक दक्षता का अनुकूलन.
  7. सभी imaged कोशिकाओं पर Dy547 सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के आधार पर अभिकर्मक क्षमता की गणना.
. TLE "> 8 प्रोटोकॉल 7: lentiviral वेक्टर के पारगमन के लिए एनसीएम संस्कृति

  1. दोहराएँ प्रोटोकॉल 6 की 7.1-7.4 कदम.
  2. पारगमन के लिए प्रयोग की जाने वाली वायरल कणों की मात्रा की गणना: निम्न सूत्र का उपयोग करें: टीयू = टीयू इकाइयों बदलने की कुल संख्या को दर्शाता है, जबकि (MOI सीएन x) / वीटी,, moi अच्छी तरह से (MOI या में संक्रमण के वांछित बहुलता के बराबर होती है टीयू / सेल), सीएन अच्छी तरह से प्रत्येक में कोशिकाओं की संख्या निर्दिष्ट करता है, और VT शेयर वायरल titers (टीयू / एमएल) इंगित करता है. उदाहरण के लिए, स्मार्ट shRNA वेक्टर के लिए शेयर वायरल titers (मिलीग्राम प्रति इकाइयों बदलने) 1 एक्स 10 9 टीयू / मिलीलीटर के बराबर होती है, यह देखते हुए 7.5 x 10 5 पारगमन के समय में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं, और 20 की एक उम्मीद Moi: 15 उपयोग प्रत्येक के लिए अच्छी तरह शेयर वायरल कणों की μl (नोट: इस हालत क्षणिक lentiviral शामिल करने के लिए सिफारिश की है).
  3. 30 मिनट के लिए polybrene की 10 मिलीग्राम / एमएल के साथ mTeSR1 मध्यम से पूर्व गर्म 300 μl.
  4. शेयर वायरल कणों के 15 μl में जोड़ेंपूर्व गर्म mTeSR1 मध्यम polybrene युक्त और धीरे समाधान मिश्रण.
  5. वायरल कणों से युक्त prewarmed माध्यम के 300 μl के साथ सेल संस्कृति के माध्यम से बदलें.
  6. 4 घंटा ऊष्मायन के बाद, पारगमन क्षमता निर्धारित करने के लिए turboGFP प्रतिदीप्ति (shRNA अभिव्यक्ति के लिए एक निर्माता) की जांच.
  7. कोशिकाओं turboGFP व्यक्त करने के लिए शुरू जब अच्छी तरह से transducing करने के लिए अतिरिक्त mTeSR1 माध्यम के 300 μl जोड़ें.
  8. 12-16 घंटे ऊष्मायन के बाद, टर्बो GFP अभिव्यक्ति reexamine.
  9. 72 घंटा के भीतर इन transduced कोशिकाओं के साथ वांछित अनुवर्ती प्रयोगों प्रदर्शन.

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Representative Results

एनसीएम संस्कृति का एक सामान्य स्कीमा

चित्रा 1 रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 की उपस्थिति में उच्च घनत्व एकल कक्ष चढ़ाना के बाद hPSCs के गतिशील परिवर्तन दिखा एक ठेठ एनसीएम संस्कृति स्कीमा का प्रतिनिधित्व करता है. इन morphological परिवर्तन, सेलुलर समूहों के गठन चढ़ाना, और सेल संक्षेपण द्वारा पीछा घातीय सेल के विकास (चित्रा 1 ए) के बाद कहनेवाला कनेक्शन शामिल हैं. एक प्रतिनिधि प्रयोग दिन 1 पर 10 माइक्रोन वाई 27,632 की उपस्थिति में / 2 सेमी 1.9 x 10 5 कोशिकाओं के घनत्व पर एकल कक्षों के रूप में चढ़ाया, WA01 (एच 1) hESCs इंगित करता है (चित्रा 1 बी, बाएं पैनल), आगे के बिना प्रचार किया दिन 2 पर कालोनियों (चित्रा 1 बी, मध्यम पैनल) के गठन, और वांछित प्रयोगों के लिए या दिन 3 (चित्रा 1 बी, सही पैनल) में सेल passaging के लिए उपयुक्त है कि एक सजातीय monolayer के रूप में संघनित.

<मजबूत> विभिन्न रॉक inhibitors एनसीएम संस्कृति का समर्थन

96 अच्छी तरह से थाली परख सबूत की अवधारणा उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था. यह भी एनसीएम संस्कृति का समर्थन करने के लिए विभिन्न रॉक inhibitors के उपयोग का अनुकूलन करने के लिए डिजाइन किया गया था. लगभग 31,000, SCU-आई 10 कोशिकाओं, मानव प्रेरित pluripotent कोशिकाओं (hiPSCs) 17 अलग पर चढ़ाया गया एक Matrigel लेपित रॉक inhibitors के विभिन्न सांद्रता की उपस्थिति में अच्छी तरह से. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं इन परिस्थितियों में सेल अस्तित्व का निर्धारण करने के लिए CCK-8 के आधार अस्तित्व परख के अधीन थे. हम पहले से एनसीएम विधि एकल कक्ष चढ़ाना बढ़ाने के लिए 10 माइक्रोन पर रॉक अवरोध करनेवाला, वाई 27,632, का उपयोग आवश्यक है कि पता चला है. इस रिपोर्ट में, हम 10 माइक्रोन वाई 27,632 काफी hiPSCs की दक्षता चढ़ाना 24 घंटा एकल कोशिका (पी <0.05) (चित्रा 2) में वृद्धि की पुष्टि की. हम यह भी पाया गया है कि वाई-39983 (मैं अवरोध करनेवाला रॉक), phenylbenzodioxane (रॉक द्वितीय inhibiटो), और thiazovivin (एक उपन्यास रॉक अवरोध करनेवाला) काफी एकल कक्ष चढ़ाना दक्षता मिलाना और उनके नियंत्रण (पी <0.05) (चित्रा 2) के साथ तुलना में 1 माइक्रोन पर एनसीएम विकास को बढ़ावा देने. इसके अलावा, एकल कोशिका चढ़ाना दक्षता पर (1 माइक्रोन से कम) तीन रॉक inhibitors के प्रभाव 10 माइक्रोन (पी> 0.05) (चित्रा 2) में वाई 27,632 के बराबर थे. विशेष रूप से, मैं (5 माइक्रोन से कम) अवरोध रॉक अन्य अणुओं की तुलना में एक अधिक विशिष्ट बातचीत implicating, 1 माइक्रोन (पी <0.05) में दवा के साथ तुलना में स्पष्ट cytotoxicity दिखाने के लिए प्रकट होता है. इस प्रकार, विभिन्न रॉक inhibitors भविष्य में एनसीएम संस्कृति समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, इन नए inhibitors के साथ एनसीएम के तहत दोनों hESCs और hiPSCs की एक पूरी लक्षण वर्णन भविष्य में उपयोग के लिए आवश्यक होगा.

एलएन-521 रॉक inhibitors का उपयोग बिना एनसीएम संस्कृति का समर्थन करता है

टी निर्धारित करने के लिएhESC वृद्धि के समर्थन में एक विशिष्ट laminin isoform की वह भूमिका, हम Xeno मुक्त माध्यम TeSR2 में एलएन-521-लेपित प्लेट पर SCU-i30 hiPSCs सुसंस्कृत. दिलचस्प है, अकेले एलएन-521, रॉक inhibitors की उपस्थिति के बिना, एकल कोशिका चढ़ाना और इस शर्त के तहत 15 अंश के लिए बाद में एनसीएम विकास (चित्रा 3) का समर्थन करता है. एक विरोधी Nanog पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के साथ SCU-i30 कोशिकाओं के immunostaining इस शर्त के तहत कोशिकाओं के नाभिक में उच्च Nanog अभिव्यक्ति (चित्रा 3 ए) ने संकेत दिया कि. प्रवाह cytometric विश्लेषण hESC मार्कर अभिव्यक्ति प्रोफाइल रॉक अवरोध करनेवाला वाई 27,632 (3B चित्रा) का उपयोग करते हुए आयोग के रूप में विकसित कोशिकाओं के समान था कि पता चला है.

Lentiviral कणों के उपयोग के बिना microRNA वितरण की उच्च दक्षता

Dy547 लेबल oligonucleotide microRNAs साथ अभिकर्मक एनसीएम परिस्थितियों में WA01 (एच 1) कोशिकाओं में किया गया था. WA01 hESCs पर एनसीएम के रूप में बड़े हो रहे थे 2.5% 2 (चित्रा -4 ए) के लिए mTeSR1 में Matrigel और 18 (चित्रा 4 बी) क्रमशः मार्ग. इन कोशिकाओं को उच्च अभिकर्मक दक्षता 24 घंटा बाद अभिकर्मक (आंकड़े -4 ए और 4 बी) से पता चला है. आम तौर पर, हम अभिकर्मक के बाद 24 घंटे में hESCs में 91% करने के लिए अभिकर्मक दक्षता प्राप्त कर सकते हैं.

चित्रा 1
एनसीएम संस्कृति की चित्रा 1. (ए) स्कीमा. लाइन ग्राफ एनसीएम परिस्थितियों में एक ठेठ 3 दिन संस्कृति में बहुकोशिकीय एसोसिएशन के गतिशील परिवर्तन रूपरेखा बनाती है. (बी) 16 अंश के लिए mTeSR1 माध्यम में 2.5% Matrigel पर एक एनसीएम शर्त के तहत प्रचारित WA01 (एच 1) hESCs के प्रतिनिधि चरण छवियों (नामित WA01, mcp16) के रूप में. कम पैनल ऊपरी पैनल के बढ़े हुए दृश्य है. स्केल सलाखों 100 माइक्रोन से संकेत मिलता है.एफई = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक 96 अच्छी तरह प्रारूप का उपयोग एकल सेल अस्तित्व assays. लगभग 31,000 SCU-आई 10 hiPSCs 17 संकेत सांद्रता में रो जुड़े kinase (रॉक) रास्ते से संबंधित विभिन्न छोटे अणु inhibitors की उपस्थिति में 2.5% Matrigel पर चढ़ाया गया . 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं 450 एनएम (A450) पर absorbance को मापने के द्वारा CCK-8 अस्तित्व परख के अधीन थे. छात्र टी परीक्षण विभिन्न रॉक inhibitors के बीच एकल कक्ष चढ़ाना दक्षता में मतभेद सांख्यिकीय महत्व के हैं यह पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. विलक्षण तारांकन चिह्न (*) अवरोधक (पी एंड # के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद इंगित करता है62; 0.05), (**) मनाया फर्क अर्थ डबल तारांकन संकेत सांख्यिकीय महत्व (पी <0.05) का है जबकि. Histograms में कॉलम चार प्रतियों निर्धारकों और सलाखों के मतलब मूल्यों मानक विचलन का प्रतिनिधित्व नामित.

चित्रा 3
रॉक inhibitors की उपस्थिति के बिना laminin-521 (एलएन-521) पर hiPSCs की चित्रा 3. एनसीएम संस्कृति. SCU-i30 hiPSC लाइन सेल यूनिट स्टेम एनआईएच में स्थापित किया गया था. SCU-i30 कोशिकाओं जैसे रॉक inhibitors के रूप में छोटे अणु inhibitors के उपयोग के बिना 15 अंश के लिए Xeno मुक्त माध्यम TeSR2 में एलएन-521-लेपित 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर बड़े हो रहे थे. एक विरोधी के साथ SCU-i30 कोशिकाओं की (ए) Immunostaining -Nanog पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी और Hoechst 33342 (Hoechst) के साथ counterstained. विशेष रूप से, एक नकारात्मक Nanog धुंधला है कि कुछ कोशिकाओं वें रहे हैंपिंजरे का बँटवारा के तहत ई कोशिकाओं. (बी) वाई 27,632 के बिना एलएन-521 पर 10 माइक्रोन वाई 27,632 (ऊपरी पैनल) या एनसीएम के उपयोग के साथ 2.5% Matrigel पर एनसीएम के रूप में विकसित SCU-i30 कोशिकाओं में HPSC मार्कर अभिव्यक्ति के प्रवाह cytometric विश्लेषण (कम पैनल). immunostaining और प्रवाह cytometric विश्लेषण दोनों के लिए प्रक्रियाओं पहले 5 में वर्णित किया गया. स्केल सलाखों 100 माइक्रोन को दर्शाती है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
क्रमशः, चित्रा 4. MicroRNA अभिकर्मक के लिए hPSCs की एनसीएम संस्कृति. WA01 hESCs 2 (ए) के लिए mTeSR1 में 2.5% Matrigel पर एनसीएम के रूप में बड़े हो रहे थे और 18 (बी) के अंश. उप के साथ ट्रांसफ़ेक्ट WA01 कोशिकाओं के प्रतिनिधि चरण और प्रतिदीप्ति छवियोंअभिकर्मक के बाद 24 घंटे में अभिकर्मक दक्षता की निगरानी के लिए नियंत्रण microRNAs 547 लेबल. स्केल सलाखों 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पारंपरिक (भक्षण या बाह्य matrices पर कोशिकाओं की) कॉलोनी प्रकार संस्कृति और भक्षण 6 बिना समुच्चय रूप hPSCs के निलंबन संस्कृति: इन विट्रो में संस्कृति hPSCs के लिए दो प्रमुख तरीके हैं. कॉलोनी के प्रकार और निलंबन दोनों संस्कृति तरीकों की सीमाओं संचित विविधता और दाय epigenetic परिवर्तन शामिल हैं. एनसीएम संस्कृति, एकल कोशिका Passaging और उच्च घनत्व सेल चढ़ाना दोनों पर आधारित, HPSC विकास 6,18 के लिए एक नई संस्कृति विधि का प्रतिनिधित्व करता है. विभिन्न एकल कक्ष passaging तरीकों साहित्य में प्रलेखित किया गया है, लेकिन उनमें से कोई भी दिनचर्या प्रचार के लिए उपयोग किया जाता है. उदाहरण के लिए, वू और उनके सहयोगियों HPSC विकास पर 19 विभिन्न छोटे अणुओं कॉकटेल के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक एकल कोशिका passaging विधि कार्यरत हैं. हालांकि, उनके अंतिम संस्कृति उत्पादों कालोनियों हैं. तो, कम घनत्व के आधार पर एकल कक्ष passaging तरीकों अभी भी कॉलोनी प्रकार संस्कृति के हैं. एनसीएम संस्कृति, उच्च भट के संबंध मेंअंतिम सेल उत्पाद एक समरूप monolayer है के बाद से अल्पसंख्यक चढ़ाना, एक नई विधि के लिए इस संस्कृति को बदल देती है. हाल ही में, ड्वोरक और उनके सहयोगियों ने व्यापक इस विकास शर्त के तहत 18 HPSC गुणों का विश्लेषण करने के लिए इसी तरह की पद्धति का इस्तेमाल किया. उनके परिणाम भी हमारे प्रमुख निष्कर्ष का समर्थन है. यह एनसीएम संस्कृति कई नए गुणों के पास है कि एक उभरती हुई विधि है और आगे pluripotent स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में कई संभावित अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है कि अब यह स्पष्ट है.

एनसीएम संस्कृति से hPSCs के मूल गुण

यह कोशिकाओं के एक ही प्रकार के साथ hPSCs एनसीएम के तहत संस्कृति शेयर कई विशेषताओं कालोनियों 9,18 के रूप में हो कि बोधगम्य है. Oct-4, Nanog, SSEA-3/4, ट्रा-1-60, ट्रा-1-81, और SSEA -1 में शामिल हैं जो hPSCs में hESC मार्करों,, की अभिव्यक्ति के स्तर एनसीएम और कॉलोनी प्रकार संस्कृति दोनों में समान हैं . एनसीएम अनुकूलित कोशिकाओं को भी एम पर हो HPSC कालोनियों के समान वैश्विक mRNA अभिव्यक्ति पैटर्न को बनाए रखनेएफई फीडर परतों 9. Teratoma परख 9,18 द्वारा निर्धारित रूप में जाहिर है, एनसीएम अनुकूलित कोशिकाओं pluripotent राज्य बनाए. हालांकि, HPSC कालोनियों के विपरीत, एनसीएम परिस्थितियों में कोशिकाओं लगातार वृद्धि घटता, सेल चक्र, और सेल नंबर 9 की विशेषता है कि उम्मीद के मुताबिक वृद्धि दर है. कारण उच्च घनत्व एकल कक्ष चढ़ाना, एनसीएम परिस्थितियों में hPSCs जिससे MEFs पर हो HPSC कालोनियों के साथ तुलना में 4 गुना से सेल संख्या बढ़ रही है, दिन 2 और 4 (चित्रा 1 बी) के बीच घातीय वृद्धि दिखा रहे हैं. लम्बे समय तक संस्कृति कोशिकाओं के उत्पादन में वृद्धि नहीं करता, बल्कि apoptotic और भेदभाव तनाव 9 बढ़ जाती है. एनसीएम भी इस तरह thawed कोशिकाओं (प्रोटोकॉल 1) चढ़ाना पर तेजी से सेल वसूली की अनुमति, इष्टतम cryopreservation के लिए सक्षम बनाता है. इसके अलावा, एनसीएम विभिन्न Xeno मुक्त प्रोटोकॉल 9 को HPSC संस्कृति के अनुकूलन की सुविधा. सामान्य में, एनसीएम, hPSCs के विकास का समर्थन करता है pluripotent राज्य बनाए रखता है, और poten सम्हालतातीन रोगाणु परतों की वयस्क ऊतकों में अंतर करने की hPSCs की tial.

एनसीएम के तहत hPSCs में गुणसूत्र स्थिरता

गुणसूत्र स्थिरता के संदर्भ में, अलग संस्कृति तरीकों से कोशिकाओं के बीच कोई सीधा तुलना नहीं है. जी बैंडिंग, सरणी आधारित तुलनात्मक जीनोमिक संकरण (aCGH), और स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति (मछली) 9 द्वारा निर्धारित रूप में हमारे एनसीएम संस्कृति परिस्थितियों में hPSCs के बहुमत सामान्य karyotypes और जीन की नकल संख्या है. दो लाइनें (~ 13%) एक लाइन (यानी, WA09) त्रिगुणसूत्रता 20 9 के साथ कोशिकाओं के 14% था ऊंचा polyploidy और एक और एक (ES01) का प्रदर्शन किया, जिसमें असामान्य karyotypes दिखाया. यह इन असामान्य karyotypes से प्राप्त किए गए स्पष्ट नहीं है कि पूर्व एनसीएम संस्कृति को या एनसीएम रूपांतरण के दौरान प्रेरित उत्परिवर्तित कोशिकाओं preexisting का चयन. यह शुरू HPSC कालोनियों या कालोनियों के सबसेट एनसीएम संस्कृति श के लिए प्रयोग किया जाता है कि महत्वपूर्ण हैएनसीएम अनुकूलन के लिए समय पर उनकी एकरूपता और गुणसूत्र स्थिरता के संदर्भ में अच्छी तरह से विशेषता हो ould. विशेष रूप से, एनसीएम परिस्थितियों में असामान्य karyotypes की दर लेखकों प्रबल कॉलोनी प्रकार संस्कृति की स्थिति 20 के तहत 34% असामान्य karyotypes प्रकट जिसमें हाल ही में एक पलटन विश्लेषण, में सूचना दी है कि तुलना में बहुत कम है. इसलिए, हमारे अध्ययन से हम अलग एकल कोशिकाओं के विकास और एनसीएम परिस्थितियों में उनके गुणसूत्र स्थिरता बनाए रख सकते हैं कि इंगित करता है. फिर भी, हम भी आने वाले वर्षों में hPSCs के गुणसूत्र असामान्यताओं की जांच करने के लिए अधिक संवेदनशील तरीकों का उपयोग करने की आवश्यकता है. इन अक्सर बदल गुणसूत्रों में कुछ मामूली घावों (जैसे, 20q11.21 amplicon) पारंपरिक से नहीं पाया जा सकता है के रूप में विशेष रूप से, हम, उच्च संकल्प जांच (यानी, <50 केबी) का उपयोग गुणसूत्रों 1, 12, 17, और 20 स्कैन की जरूरत karyotyping और मछली 20-22. इसके अलावा, विविध एनसीएम प्रोटोकॉल के विकास robu की पहचान करने के लिए सक्षम होगाअनुसूचित जनजाति और भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए सुरक्षित तरीके.

विविध संशोधनों के तहत एनसीएम संस्कृति

रॉक अवरोध करनेवाला, वाई 27,632, का उपयोग एकल कोशिका आधारित assays के लिए दरवाजा खोल दिया है. विविध रॉक inhibitors की उपलब्धता hPSCs की एनसीएम आधारित विस्तार और cryopreservation (चित्रा 2) के लिए अतिरिक्त विकल्प प्रदान करेगा. सिद्धांत रूप में, काफी एकल कक्ष चढ़ाना दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं कि किसी भी छोटे अणु, एनसीएम संस्कृति की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अलग तरीके से उन रॉक inhibitors से, इस तरह के एक उदाहरण के 9 प्रतिनिधित्व करता है जो कार्यों जे ए अवरोध करनेवाला 1. एकल अणुओं या मिश्रित दृष्टिकोण का उपयोग हमें इष्टतम सेल के विकास, सेलुलर assays, और hPSCs की cryopreservation प्रदान कर सकता है. हालांकि, इस तरह आम तौर पर hESCs 23-25 ​​में व्यक्त laminin isoform एलएन-521, के रूप में परिभाषित बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन, पर hPSCs के वैकल्पिक एनसीएम संस्कृति छोटे के हस्तक्षेप को समाप्त कर सकते हैंअणु (चित्रा 3). एलएन-521 अलग-HPSC अस्तित्व को बढ़ाने और α6β1-PI3K/AKT मार्ग 24 के सक्रियण के माध्यम से pluripotency को बनाए सकता है. एलएन-521 के साथ passaging hPSCs की सादगी पूरी तरह से परिभाषित मध्यम (प्रोटोकॉल 4) का उपयोग विभिन्न फीडर से मुक्त और Xeno मुक्त सेल संस्कृति सिस्टम के साथ संगत कोशिकाओं की विविधता कम कर देता है. यह भी छोटे अणुओं के प्रभाव के बिना उच्च throughput assays के लिए एक अतिरिक्त मॉड्यूल प्रदान करता है. एलएन-521 पर एनसीएम संस्कृति के तहत iPSCs HPSC मार्कर, teratoma परख और embryoid शरीर की मध्यस्थता multilineage भेदभाव का उपयोग कर इन कोशिकाओं के आगे लक्षण वर्णन के एक पैनल की अभिव्यक्ति को बरकरार रखा हालांकि इन कोशिकाओं में pluripotent राज्यों पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो सकता है. ध्यान से, hiPSCs laminin isoform एलएन-521 कथित cytogenetically स्थिर रहे हैं (http://biolamina.com/) पर सुसंस्कृत. (ऊपर चर्चा के रूप में) हालांकि, हम भी ई के लिए उच्च संकल्प और संवेदनशील तरीके लागू करने की जरूरत हैइन कोशिकाओं में गुणसूत्र स्थिरता xamine.

जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए एनसीएम संस्कृति की चंचलता

एनसीएम आधारित विधियों hPSCs (प्रोटोकॉल 5-7) के आनुवंशिक हेरफेर के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है कि एक सरल, मजबूत, और आर्थिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह hESC कालोनियों transfect या विभिन्न प्रयोगशालाओं 26-28 के बीच अभिकर्मक / पारगमन क्षमता में महान परिवर्तनशीलता के साथ, transduce मुश्किल हो जाता है कि जाना जाता है. उदाहरण के लिए, hESCs में अभिकर्मक दक्षता 3 से कॉलोनी संस्कृति की स्थिति 26 के तहत 35% के बीच है. कॉलोनी परिस्थितियों में BG01 कोशिकाओं में lentiviral पारगमन संकेत 9 बेहद कम होना पाया गया. हालांकि, एनसीएम द्वारा मध्यस्थता अभिकर्मक दक्षता अधिक से अधिक 75% से 9 था और पारगमन तरीकों का संशोधन 90% 28 अप करने के लिए lentivirus की मध्यस्थता पारगमन क्षमता बढ़ा सकते हैं. एक तंग तुलनात्मक अध्ययन यह वें है कि पता चला हैकम अभिकर्मक दक्षता 9 में योगदान देने वाले hESC कालोनियों में ई बहुकोशिकीय संघों. इसके अलावा, हम हाल ही में एक microRNA अभिकर्मक प्रोटोकॉल संशोधित और lentiviruses (प्रोटोकॉल 6 और चित्रा 4) के उपयोग के बिना उच्च अभिकर्मक दक्षता (~ 91%) प्राप्त करने में सफल रहे हैं. 5 दिन की समय सीमा के लिए - इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए आसान और एक 3 भीतर क्षणिक अभिकर्मक प्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. हम ऊपर प्रोटोकॉल में चित्रित के रूप में हम hPSCs में अभिकर्मक / पारगमन क्षमता का अनुकूलन करने, कई कारकों विचार में लिया जाना चाहिए. इन कारकों सेल घनत्व, प्लाज्मिड सांद्रता, lentiviral titers, संक्रमण की बहुलता (MOI), अभिकर्मक / पारगमन की अवधि, अभिकर्मकों के cytotoxicity, और निगरानी अभिकर्मक / पारगमन क्षमता के लिए इस्तेमाल किया तरीकों में शामिल हैं.

हम विस्तृत और Matrigel पर और परिभाषित बाह्य matrices पर संस्कृति hPSCs को एनसीएम तरीकों का विस्तार. इस संस्कृति विधिसामान्यतः HPSC कॉलोनी और एकत्रित संस्कृतियों में पाया विविधता खत्म करने के लिए एक कारगर तरीका है. एनसीएम विकास शर्तों के तहत मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं pluripotent और chromosomally स्थिर रहे हैं. इस उपन्यास संस्कृति प्रणाली HPSC रखरखाव, बड़े पैमाने पर विस्तार, और आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए सरल और बहुमुखी है.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL  Model RX-650 X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates Becton Dickinson Labware 353046 Polystyrene plates
DMEM Invitrogen Inc. 11965–092 For MEF medium
Mitomycin C Roche 107409 Mitotic inhibitor
Trypsin Invitrogen Inc. 25300-054 For MEF dissociation
DMEM/F12 Invitrogen Inc. 11330–032 For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium  Invitrogen Inc. 31985-062 For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS Invitrogen Inc. 16000–044 Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement Invitrogen Inc. 10828–028 KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids Invitrogen 11140–050 NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine Invitrogen  25030–081 Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements StemCell Technologies 5850 Animal protein-free
TeSR2 & Supplements StemCell Technologies 5860 Xeno-free medium
β-mercaptoethanol Sigma  M7522 Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC		 American Type Culture Collection (ATCC)  SCRC-1040 For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel BD Bioscience 354277 For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521 BioLamina LN521-02 Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic) R&D Systems, MN 223-FB Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I EMD4 Biosciences 420099 An inhibitor of Janus kinase
Y-27632 EMD4 Biosciences 688000 ROCK inhibitor
Y-27632 Stemgent 04-0012 ROCK inhibitor
Y-39983 Stemgent 04-0029 ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane Stemgent 04-0030 ROCK II inhibitor
Thiazovivin Stemgent 04-0017 A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer BD Bioscience 352340 40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C Thermo Scientific  C6516F-1 “Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000 Invitrogen Inc. 11668-027 Transfection reagents
DharmaFECT Duo Thermo Scientific T-2010-02 Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control Thermo Scientific IP-004500-01-05 Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNA Thermo Scientific  To be determined Lentiviral vector
pmaxGFP amaxa Inc (Lonza) Included in every transfection kit Expression plasmid for transfection control
Oct-4 Santa Cruz Biotechnology sc-5279 Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1 Santa Cruz Biotechnology sc-21702 Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4 Santa Cruz Biotechnology sc-21704 Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60 Santa Cruz Biotechnology sc-21705  Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81 Santa Cruz Biotechnology sc-21706 Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51) Santa Cruz Biotechnology sc-8020 Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein Santa Cruz Biotechnology sc-8399 AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19) Santa Cruz Biotechnology sc-9187 FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1) Thermo Scientific MS-295-P0 Mouse IgG1
Desmin Thermo Scientific RB-9014-P1 Rabbit IgG
Anti-NANOG ReproCELL Inc, Japan RCAB0004P-F Polyclonal antibody 
Rat anti-GFAP Zymed 13-0300 Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3) Cedarlane Laboratories Ltd. CL2513A Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4) DakoCytomation Inc IR611/IS611 Mouse IgG2a
Nestin Chemicon International MAB5326 Rabbit polyclonal antibody
TUBB3 Convance Inc MMS-435P Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12) Cell Signaling Technologies 3113 Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution) Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in D-PBS

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References

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सेल बायोलॉजी अंक 89 pluripotent स्टेम सेल मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं प्रेरित pluripotent स्टेम सेल सेल संस्कृति गैर कॉलोनी प्रकार monolayer एकल कक्ष चढ़ाना दक्षता रो जुड़े kinase वाई 27,632 अभिकर्मक पारगमन स्टेम
मानव pluripotent के लिए वैकल्पिक संस्कृतियों सेल उत्पादन, रखरखाव, और जेनेटिक विश्लेषण स्टेम
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Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, … More

Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, P. G., Mallon, B. S. Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51519, doi:10.3791/51519 (2014).

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