Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Published: July 24, 2014 doi: 10.3791/51519

Introduction

De capaciteit van hPSCs om onderscheid te maken in de richting van multilineage volwassen weefsels heeft nieuwe wegen geopend voor de behandeling van patiënten die lijden aan ernstige ziekten die hart-, lever-, pancreas-, en neurologische systemen 1-4 betrekken. Diverse soorten cellen afgeleid van hPSCs zou ook robuuste mobiele platforms voor ziektemodel, genetische manipulatie, drug discovery, en toxicologische testen 1,4. Het belangrijkste punt dat hun toekomstige klinische en farmacologische toepassingen zorgt is het genereren van grote aantallen klinische-grade hPSCs via in vitro celkweek. Echter, de huidige cultuur systemen zijn onvoldoende of inherent variabel, waarbij verschillende feeder en-feeder vrij culturen van hPSCs als kolonies 5,6.

Kolonie-achtige groei van hPSCs aandelen veel constructie-eigenschappen van de binnenste celmassa (ICM) van de vroege embryo's van zoogdieren. De ICM is gevoelig om te differentiëren tot drie kiem-lagenin een meercellige milieu vanwege het bestaan ​​van heterogene signalering gradiënten. Aldus wordt de verwerving van heterogeniteit in de vroege embryonale ontwikkeling als een vereiste werkwijze voor differentiatie, maar een ongewenste eigenschap van HPSC cultuur. De heterogeniteit in HPSC cultuur wordt vaak veroorzaakt door overmatige apoptotische signalen en spontane differentiatie als gevolg van suboptimale groeiomstandigheden. Dus in kolonie-typen cultuur, de heterogene cellen worden vaak waargenomen in de periferie van de kolonies 7,8. Het is ook aangetoond dat de cellen in menselijke embryonale stamcellen (hESC) kolonies vertonen differentiële reacties op signaalstoffen zoals BMP-4 9. Bovendien kolonie cultuur methoden produceren een laag cel opbrengst evenals zeer lage cel herstel tarieven van cryopreservatie te wijten aan oncontroleerbare groei en apoptotische signaalwegen 6,9. De laatste jaren zijn er verschillende suspensiekweken ontwikkeld voor kweken hPSCs, particularly voor uitbreiding van grote hoeveelheden hPSCs in feeder-en matrix-vrije omstandigheden 6,10-13. Uiteraard, andere cultuur systemen hebben hun eigen voordelen en nadelen. In het algemeen, de heterogeniteit van hPSCs is een van de belangrijkste nadelen van de methoden kolonie-type en geaggregeerde cultuur, die optimaal voor het leveren van DNA en RNA materialen in hPSCs voor gentechnologie 6 zijn.

Het is duidelijk dat er een dwingende noodzaak om nieuwe systemen die een aantal tekortkomingen van de huidige kweekmethoden omzeilen ontwikkelen. De ontdekkingen van kleine molecule inhibitoren (zoals de ROTS remmer Y-27632 en JAK remmer 1) dat eencellige verbeteren overleven de weg vrijmaken voor gedissocieerde-HPSC cultuur 14,15. Met het gebruik van deze kleine moleculen, hebben we onlangs een kweekmethode ontwikkeld op basis van niet-kolonie soort (NCM) groei van gedissocieerd-hPSCs 9. Deze nieuwe kweekmethode combineert zowel eencellige passage en high-densityplating methoden, waardoor we grote hoeveelheden homogene hPSCs produceren onder consistente groei cycli zonder grote chromosomale afwijkingen 9. Alternatief kan NCM cultuur met verschillende kleine moleculen en gedefinieerde matrices (bijvoorbeeld laminins) worden uitgevoerd om de kweekmethode voor brede toepassingen te optimaliseren. Hier presenteren we een aantal gedetailleerde protocollen op basis van NCM cultuur en af ​​te bakenen gedetailleerde procedures voor genetische manipulatie. Om de veelzijdigheid van NCM protocollen tonen we ook getest NCM cultuur met diverse ROCK inhibitoren en met de single laminine isovorm 521 (dwz LN-521).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Single-cell-gebaseerde niet-kolonie soort monolaag (NCM) cultuur van hPSCs.

1. Voorbereidingen

  1. Voeg 500 ml medium voor kweek van muis embryonale fibroblasten (MEF): DMEM medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine en 0,1 mM niet-essentiële aminozuren (NEAA).
  2. Isoleer muis embryonale fibroblasten (MEF) cellen, afkomstig van de CF1 stam na een routine protocol 16 en cultuur MEF op 0,1% gelatine beklede 6-well celkweek plaat in DMEM medium. Als alternatief kopen MEF voorraden bij doorgang 3 van commerciële middelen.
  3. Bereid Matrigel platen.
    1. Verdun 5 ml van hESC-gekwalificeerde Matrigel voorraad met 5 ml DMEM/F12-medium (gekoeld op ~ 4 ° C) en op te slaan als 50% porties in een -20 ° C vriezer. Ontdooi de bevroren Matrigel voorraad in een koelkast (4 ° C ~) O / N en verder verdunnen Matrigel koude DMEM/F12-medium (aanleiding geeft tot een 2,5% werkende concentratie).
    2. Verwijder de Matrigel plaat uit de koelkast, zodat de plaat op te warmen bij RT in de celkweek kap gedurende 10 tot 30 minuten (Noot: niet opwarmen van de plaat in een celkweek incubator), en zuig DMEM medium voorafgaand aan hPSCs plating.
  4. Voeg 500 ml hESC medium: 80% DMEM/F12-medium, 20% KSR, 2 mM L-glutamine, 0,1 mM niet-essentiële aminozuren, 0,1 mM β-mercapto-ethanol, en 4 ng / ml FGF-2.
  5. Bereid 10 ml 2X HPSC invriesmedium: 60% FBS, 20% DMSO en 20 pM Y-27632 in mTeSR1 medium steriliseren door filtratie, en gebruik het medium binnen 1 week.

. 2 Protocol 1 (Basis): Grow HPSC Kolonies op Feeders

  1. Gebruik MEF passage nummers op 5 of 6 (aangeduid als p5 en p6) voor HPSC cultuur om consistente Resul krijgents. Mitotisch inactiveren MEF door behandeling van de cellen met 10 ug / ml mitomycine C gedurende 3 uur bij 37 ° C, was de cellen 3x met 1 x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS) en daarna dissociëren MEFs met 0,05% trypsine in 0,53 mM EDTA. Alternatief bestralen MEFs in een dosis van 8000 rad met een X-ray bestraler.
  2. Tel het aantal cellen met behulp van de trypaanblauw vlek uitsluiting methode onder de microscoop. U kunt ook een automatische cel teller.
  3. Plaat bestraalde MEF on 6-well polystyreen platen bekleed met 0,1% gelatine in een dichtheid van 1,88 x 10 5 cellen per putje (dwz 1,96 x 10 4 cellen / cm 2). Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
  4. Verwijder de MEF kweekmedium door aspiratie met een Pasteur pipet (NB: geen wassen stappen die nodig zijn in deze tijd).
  5. Vermaal HPSC kolonies van vorige cultuur in kleine groepjes, onderzoeken de bosjes onder de microscoop om hun maten variërend fr zorgenOM 50 tot 100 urn in diameter en plaat HPSC klonten bovenop MEF feeder lagen in een putje dat 2 ml HPSC medium.
  6. Wijzig hESC medium per dag gedurende 3 tot 5 dagen, op te nemen kolonie groei door foto, markeert geen morfologisch veranderde of gedifferentieerde kolonies (~ 5%), en handmatig de gemarkeerde kolonies verwijderen door voorzichtig aspiratie met een Pasteur pipet.
  7. Spoel de overblijvende kolonies op MEF tweemaal (2 min elk met D-PBS) en incubeer de kolonies met 2 ml 1 mg / ml collagenase IV HPSC medium voor 10 tot 30 min), en onderzoekt het losmaken van HPSC kolonies van de MEF-gecoate oppervlak (Let op: gebruik een schraper om het detachement proces helpen alleen als de kolonies stevig zijn bevestigd aan de plaat).
  8. Voeg 5 ml HPSC medium aan elk putje om enzymatische reacties, overdracht kolonies een 15 ml buisje minimaliseren, zodat HPSC kolonies sedimenteren gedurende 3 tot 5 minuten bij kamertemperatuur, en zorgen voor de sedimentatie van kolonies door directe visualisatie van de cellen onderin de buis (NB: de slang niet Centrifugeer bij deze stap).
  9. Verwijder de bovenstaande vloeistoffen die resten MEF en gedissocieerde enkele cellen, resuspendeer de kolonies met 5 ml van hESC medium, en twee keer herhaal de sedimentatie stap.
  10. Verwijder het medium, vermaal HPSC kolonies in kleine groepjes, op te slaan in 1X HPSC bevriezing medium (of CryoStore CS10 bevriezing medium) voor cryopreservatie (1 samenvloeiing goed per bevroren flesje) of plaat op een 6-wells plaat voor cel passage.

3 Protocol nr. 2:. Zet HPSC Kolonies van Feeders naar NCM

  1. Spoel HPSC pellets in D-PBS eenmaal incubeer de pellets met 1 ml 1X Accutase gedurende 10 min, en onderzoekt de enzymatische reactie onder een microscoop te eencellige dissociatie waarborgen.
  2. Sluit de enzymatische reacties door voorzichtig resuspenderen van de cellen in 5 ml mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632 gevolgd door centrifugatie bij 200 x g bij kamertemperatuur gedurende 5 min(Let op, geen buitensporige centrifugeren krachten die celschade veroorzaken niet te gebruiken).
  3. Voeg 5 ml mTeSR1 medium om de pellet, resuspendeer de pellet als enkele cellen en filter gedissocieerde cellen door een 40 um cel zeef (om resten cel aggregaten te verwijderen).
  4. Zaad 1.3-2 x 10 6 hPSCs in een goed (1,4-2,1 x 10 5 cellen / cm 2) van een 6-wells plaat bekleed met 2,5% hESC-gekwalificeerde Matrigel, voeg mTeSR1 medium tot 2,5 ml, en omvatten 10 uM Y-27632 op de middellange (tot de eerste 24 uur eencellige plating te vergemakkelijken). Als alternatief gebruik maken van de volgende kleine moleculen tot 10 uM Y-27632 te vervangen voor het verbeteren van eencellige plating: 1 uM Y-39983 (ROCK I-remmer), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II-remmer), 1 uM thiazovivin (een roman ROCK inhibitor) , en 2 uM JAK remmer 1.
  5. Vervang het medium met drugsvrije mTeSR1 medium op de volgende dag (binnen 24 uur), distantiëren cellen van een extragoed, en tel het aantal cellen te eencellige plating efficiëntie te bepalen (Opmerking: ongeveer 50 tot 90% van eencellige plating efficiëntie die in dit stadium kan worden bereikt).
  6. Laat de cellen groeien als een enkele-cel monolaag gevormd voor een paar dagen met 3 ml mTeSR1 medium. Dagelijks veranderen medium.
  7. Empirisch bepalen het schema voor passage van aangepaste NCM afhankelijk van de celdichtheid. Passage wanneer celgroei samenloop op dag 3 of dag 4, of op het tijdstip 4 uur na het verdwijnen van cel-cel grenzen bereikt. Distantiëren de cellen in 1 ml van Accutase, gebruikt een 1 tot 3 splitsverhouding (dwz 1 confluente putje van cellen uitgeplaat in 3 putjes van 6-wells plaat) voor mobiele passage en stabiliseren aangepast NCM door 5 passages.
  8. Cel bevriezing
    1. Gebruik een confluente goed (~ 5-6 x10 6 cellen) gedurende een bevroren flacon: dissociëren cellen ve confluente goed met 1 ml Accutase gedurende 10 minuten.
    2. Verdunnen wi 5 ml mTeSR1 medium en centrifugeer cellen zoals hierboven beschreven.
    3. Resuspendeer de pellet in 500 ui mTeSR1 medium en voeg langzaam 500 ui 2x HPSC invriesmedium (bevattende 20 pM Y-27632) in een cryoconserveringsflesje. Alternatief resuspendeer de cellen in 1X HPSC invriesmedium met 2 uM JAK-remmer 1 of 1X CryoStor CS10 medium in de aanwezigheid van een 10 pM Y-27632 of 2 uM JAK-remmer 1.
    4. Plaats bevroren flacons in een ijs-gekoeld cryocontainer (bottom-gevuld met isopranol) en breng de cryocontainer een -80 ° C vriezer onmiddellijk.
    5. Overdracht cellen van de -80 ° C vriezer een vloeibare stikstof tank (de volgende dag) voor lange termijn cryopreservatie.
  9. Cel ontdooien
    1. Gebruik maken van een cryoconserveringsflesje voor plating 1 putje van een 6-wells plaat.
    2. Voorverwarmen mTeSR1 medium in een 37 ° C waterbad gedurende 10 min, dooi cellen in hetzelfde waterbad gedurende 2 min,druppelsgewijs cellen In 5 ml voorverwarmde mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632 en centrifuge zoals hierboven beschreven.
    3. Voorzichtig resuspendeer de celpellets met 2 ml mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632 en langzaam overbrengen cellen om een ​​goed vooraf bekleed met Matrigel (Opmerking: voorkomen die luchtbellen).
    4. Verander medium dagelijks en verwachten HPSC groei samenvloeiing bereiken op dag 3 of 4.

4 Protocol 3:. Zet HPSC Kolonies op Matrigel om NCM Cultuur

  1. Verwijderen van een Matrigel-gecoate plaat uit de koelkast, plaats de plaat in de weefselkweek kap voor 10 tot 30 minuten, verwijder het medium uit elk putje van de plaat, en voeg 2 ml voorverwarmde mTeSR1 medium aan elk putje.
  2. Transfer aangewreven HPSC klonten van de feeder cultuur (stap 2.10 van de basis-protocol) om de bovenstaande Matrigel plaat. Voeg mTeSR1 medium tot 2,5 ml uiteindelijk volume in elk putje.
  3. Opnieuw medium dagelijks gedurende 3 tot 4 dagens tot kolonies bereiken 80-90% confluentie.
  4. Voor cel passage afspoelen kolonies met D-PBS tweemaal behandelen van de cellen met 1 ml 2 mg / ml dispase bij 37 ° C gedurende 15 tot 20 minuten en sediment en passage cellen bosjes.
  5. Voor NCM cultuur: herhaal stap 3,1-3,9 beschreven in Protocol nr. 2.

5 Protocol 4:. NCM Cultuur van hPSCs op LN-521

  1. Ontdooi de recombinante LN-521 oplossing bij 4 ° C vóór de dag van gebruik en maakt het laminine bekledingsoplossing (LCS) door verdunning van de ontdooide laminine met 1 x D-PBS (met Ca2 + / Mg2 +) tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml.
  2. Voeg 1 ml van de LCS een goed in 6-well plaat (let op: vermijd droog-out tijdens het coating proces).
  3. Dicht de gecoate plaat met Parafilm om verdamping te voorkomen en bewaar de plaat in de koelkast (4 ° C) O / N (let op: gebruik de plaat binnen 1 week).
  4. Verwijder voorzichtig de LCS met een Pasteur pipet zonder teuching het gecoate oppervlak en voeg 2 ml mTeSR1 medium om goed.
  5. Warm alle cultuur-oplossingen (waaronder D-PBS) in een 37 ° C waterbad gedurende 25 minuten.
  6. Converteren HPSC kolonies te NCM
    1. Distantiëren celaggregaten om enkele cellen met Accutase zoals beschreven in Protocol nr. 2.
    2. Zaad 1.3-2 x 10 6 hPSCs tot een goed LN-521-coated (1,4-2,1 x 10 5 cellen / cm 2) zonder de aanwezigheid van ROCK-inhibitoren.
    3. Opnieuw medium per dag gedurende 3 tot 4 dagen.
    4. Distantiëren de cellen in 1 ml Accutase op dag 3 of 4 voor de cel passage met een 1 tot 3 splitsverhouding.

. 6 Protocol 5: NCM Cultuur voor plasmide-DNA transfectie

  1. Passen HPSC koloniën NCM cultuur zoals beschreven in de Protocollen 2-4.
  2. Plaat gedissocieerd hPSCs in 12-wells plaat met een celdichtheid van 7,5 x 10 5 cellen / putje in mTeSR1 medium in de aanwezigheid van 10 uM Y-27632.
  3. Vervang mTeSR1 medium met drugsvrije mTeSR1 medium tussen 4-8 uur na plating de cellen.
  4. Voor elke transfectie Verdun 2,5 ug expressieplasmiden (bijv. pmaxGFP) en 5 pi Lipofectamine 2000 in afzonderlijke Eppendorf buizen in 125 pl elk van Opti-MEM Reduced Serum Medium.
  5. Na 5 min, meng de verdunde reagentia en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (transfectie complexen).
  6. Voeg 250 ul transfectie complexen aan elk putje met hPSCs in 1 ml mTeSR1 en incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 24 uur.
  7. Onderzoek de transfectie-efficiëntie onder een fluorescentiemicroscoop en foto willekeurig voor de berekening van de werkelijke transfectie-efficiëntie.

. 7 Protocol 6: NCM Cultuur voor transfectie van MicroRNA

  1. Distantiëren semi-confluente hPSCs op dag 2 onder NCM omstandigheden door 1 ml van Accutase per putje in 6 -Well plaat.
  2. Voeg 10 ml van mTeSR1 medium om enzymatische reacties en centrifuge verdunnen bij 200 xg gedurende 5 minuten.
  3. Resuspendeer de celpellet met mTeSR1 medium zaad de cellen bij een dichtheid van 7,5 x 10 5 cellen per putje in een 12-wells plaat in mTeSR1 medium dat 10 uM Y-27632, en liet de cellen hechten gedurende 4 uur.
  4. Vervang het medium met Y27632-free mTeSR1 medium.
  5. Gebruik in de handel verkrijgbare microRNA's (bijvoorbeeld een niet-targeting Miridian miRNA transfectiecontrole gelabeld met Dy547). Titreer concentraties variërend 0-160 nM met de meegeleverde reagentia en volg de instructies van de fabrikant.
  6. Optimaliseer transfectie-efficiëntie voor elke concentratie in HPSC lijnen door beeldvorming van de Dy547 fluorescentie van de levende cellen onder een microscoop bij 24 uur na de transfectie.
  7. Bereken de transfectie efficiënties het percentage van positieve cellen Dy547 alle afgebeeld cellen.
. TLE "> 8 Protocol nr. 7: NCM Cultuur voor transductie van Lentiviral Vector

  1. Herhaal de stappen 7,1-7,4 van Protocol nr. 6.
  2. Bereken de hoeveelheid virale partikels worden gebruikt voor transductie: Gebruik de volgende formule: TU = (MOI x CN) / VT, terwijl TU duidt het totale aantal transformeren eenheden MOI gelijk is aan de gewenste multipliciteit van infectie bij de put (MOI of TU / cel), CN geeft het aantal cellen in elk putje, en VT geeft voorraad virale titers (TU / ml). Bijvoorbeeld, aangezien stock virale titers SMART-shRNA vector gelijk aan 1 x 10 9 TU / ml (transformeren eenheden per ml), 7,5 x 10 5 cellen per putje bij de transductie en een verwachte MOI van 20: gebruik 15 ul van de voorraad virale deeltjes voor elk putje (let op: deze toestand wordt aanbevolen voor voorbijgaande lentivirale inductie).
  3. Voorverwarmen 300 ul mTeSR1-medium met 10 mg / ml polybreen gedurende 30 minuten.
  4. Voeg 15 ul van voorraad virale deeltjes inde voorverwarmde mTeSR1 medium dat polybreen en de oplossing meng.
  5. Vervang het celkweekmedium met 300 ul voorverwarmde medium dat de virusdeeltjes.
  6. Na 4 uur incubatie, onderzoeken turboGFP fluorescentie (een maker voor shRNA expressie) aan de transductie efficiëntie te bepalen.
  7. Voeg 300 ul van extra mTeSR1 medium om de transducerende goed wanneer de cellen beginnen te turboGFP drukken.
  8. Na 12-16 uur incubatie, heroverwegen turbo-GFP expressie.
  9. Voer gewenste follow-up experimenten met deze getransduceerde cellen binnen 72 uur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een algemeen schema van NCM cultuur

Figuur 1 toont een typische NCM cultuur schema geeft de dynamische veranderingen van hPSCs na hoge dichtheid eencellige plating in aanwezigheid van de remmer ROCK Y-27632. Deze morfologische veranderingen zijn na plating, cellulaire clusters vorming en exponentiële groei cel gevolgd door cel condensatie (Figuur 1A) intercellulaire verbindingen. Een representatief experiment geeft WA01 (H1) hESCs, uitgeplaat als enkele-cellen bij een dichtheid van 1,9 x 10 5 cellen / cm 2 bij aanwezigheid van 10 uM Y-27632 op dag 1 (Figuur 1B, linkerpaneel) verder gekweekt zonder de vorming van kolonies (figuur 1B, middelste paneel) op dag 2 en gecondenseerd als een homogene monolaag die geschikt is voor de gewenste experimenten of cel passage op dag 3 (Figuur 1B, rechter paneel).

<strong> Diverse ROCK-inhibitoren ondersteunen NCM cultuur

Een 96-well plaat test werd gebruikt voor proof-of-concept van high-throughput screening van geneesmiddelen. Het is ook ontworpen om het gebruik van verschillende ROCK inhibitoren NCM cultuur ondersteunen optimaliseren. Ongeveer 31.000 gedissocieerd SCU-i10 cellen, humane geïnduceerde pluripotente cellen (hiPSCs) 17 werden uitgeplaat op een Matrigel gecoate goed in de aanwezigheid van verschillende concentraties ROCK inhibitoren. Na 24 uur werden de cellen onderworpen aan de CCK-8 overleving gebaseerde test om celoverleving te bepalen onder deze omstandigheden. We hebben eerder aangetoond dat het NCM werkwijze vereist het gebruik van de ROCK remmer, Y-27632, 10 uM tot eencellige plating verbeteren. In dit rapport bevestigden we dat 10 pM Y-27632 aanzienlijk verhogen 24 uur eencellige plating efficiëntie van hiPSCs (P <0,05) (Figuur 2). We vonden ook dat Y-39983 (ROCK I-remmer), phenylbenzodioxane (ROCK II remmingtor) en thiazovivin (a novel ROCK inhibitor) significant moduleren eencellige plating efficiëntie en bevordering NCM groei bij 1 uM vergelijking met de controles (p <0,05) (Figuur 2). Bovendien zijn de gevolgen van de drie ROCK inhibitoren (1 uM) bij eencellige plating efficiëntie was vergelijkbaar met die van Y-27632 op 10 uM (P> 0,05) (Figuur 2). Met name wordt de ROCK-I-remmer (5 uM) tot uitgesproken cytotoxiciteit vertonen in vergelijking met het geneesmiddel bij 1 uM (P <0,05), impliceert een specifieke interactie dan andere moleculen. Aldus kunnen verschillende ROCK remmers worden gebruikt voor het ondersteunen NCM cultuur in de toekomst. Zou echter een volledige karakterisering van zowel hESCs en hiPSCs onder NCM deze nieuwe remmers vereist voor toekomstig gebruik.

LN-521 ondersteunt NCM cultuur zonder het gebruik van ROCK-inhibitoren

Om t te bepalenhij de rol van een specifiek laminine isovorm in de ondersteuning van hESC groei, we gekweekt SCU-i30 hiPSCs op LN-521-gecoate platen in de xeno-vrij medium TeSR2. Interessant, LN-521 alleen, zonder de aanwezigheid van ROCK-inhibitoren, ondersteunt single-cell plating en daaropvolgende NCM groei gedurende 15 doorgangen onder deze voorwaarde (figuur 3). Immunokleuring van SCU-i30 cellen met een anti-NANOG polyklonaal antilichaam aan dat de cellen onder deze voorwaarde had hoge NANOG expressie in de kern (figuur 3A). Flow cytometrische analyse toonde aan dat de hESC marker expressie was vergelijkbaar aan de cellen gekweekt als NCM met de ROCK remmer Y-27632 (Figuur 3B).

Hoog rendement van microRNA levering zonder het gebruik van lentivirale deeltjes

Transfectie met Dy547-gelabelde oligonucleotide microRNAs werd in WA01 (H1) cellen vervoerd onder NCM omstandigheden. WA01 hESCs werden gekweekt als NCM op 2,5% Matrigel in mTeSR1 2 (Figuur 4A) en 18 (figuur 4B) passages respectievelijk. Deze cellen vertoonden hoge transfectie-efficiëntie 24 uur na transfectie (Figuren 4A en 4B). In het algemeen kunnen we transfectie-efficiëntie tot 91% in hESCs verkrijgen tegen 24 uur na de transfectie.

Figuur 1
Figuur 1. (A) Schema van NCM cultuur. De lijn grafiek schetst de dynamische veranderingen van meercellige vereniging in een typische 3-daagse cultuur onder NCM omstandigheden. (B) Vertegenwoordiger fase beelden van WA01 (H1) hESC 'gepropageerd onder een NCM conditie op 2,5% Matrigel in mTeSR1 medium voor 16 passages (aangewezen als WA01, mcp16). De sokkel van het vergrote aanzicht van het bovenste paneel. Schaalbalken dan 100 urn.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Enkele celoverleving assays met behulp van een 96-putjes. Ongeveer 31.000 SCU-i10 hiPSCs 17 werden uitgeplaat op 2,5% Matrigel in aanwezigheid van diverse kleine molecule inhibitoren over Rho-geassocieerde kinase (ROCK) pathways het aangegeven concentraties . Na 24 uur werden de cellen om de CCK-8 overleving assay onderworpen door meting van de absorptie bij 450 nm (A450). De student t-test werd gebruikt om te bepalen of de verschillen in eencellige plating efficiëntie tussen verschillende ROCK remmers zijn van statistische significantie. Het enkelvoud asterisk teken (*) geeft geen significante verschillen tussen de remmers (P & #62; 0,05), terwijl de twee sterretjes tekenen (**) geeft de waargenomen verschil is statistisch significant (p <0,05). Kolommen in de histogrammen wijzen de gemiddelde waarden van de viervoudige determinanten en balken geven de standaard afwijkingen.

Figuur 3
Figuur 3. NCM cultuur van hiPSCs op laminine-521 (LN-521) zonder de aanwezigheid van ROCK-inhibitoren. De SCU-i30 hiPSC lijn werd vastgesteld op de NIH Stem Cell Unit. SCU-i30 cellen werden gekweekt op LN-521-coated 6-well platen in de xeno-vrij medium TeSR2 15 passages zonder gebruik van kleine molecule inhibitoren zoals ROCK remmers. (A) Immunokleuring van SCU-i30 cellen met anti -NANOG polyklonaal antilichaam en tegengekleurd met Hoechst 33342 (Hoechst). Met name sommige cellen die een negatieve NANOG vlekken hebben zijn the cellen onder mitose. (B) Flow cytometrische analyse van HPSC marker expressie in SCU-i30 cellen gekweekt als NCM op 2,5% Matrigel met gebruik van 10 pM Y-27632 (bovenste paneel) of NCM op LN-521 zonder Y-27632 (onderste paneel). De procedures voor beide immunostaining en flowcytometrische analyse werden eerder 5 beschreven. Schaalbalken verbeelden 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. NCM cultuur hPSCs voor microRNA transfectie. WA01 hESCs werden gekweekt als NCM op 2,5% Matrigel in mTeSR1 2 (A) en 18 (B) passages respectievelijk. Vertegenwoordiger fase en fluorescentie beelden van WA01-cellen die met Dy547-gelabelde controle microRNAs toezicht transfectie efficiëntie op 24 uur na de transfectie. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 micrometer. klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Er zijn twee belangrijke manieren om cultuur hPSCs in vitro: conventionele kolonie type cultuur (van cellen op feeders of extracellulaire matrices) en ophanging cultuur van hPSCs als aggregaten zonder feeders 6. De beperkingen van kweekmethoden zowel kolonie-type en ophanging omvatten geaccumuleerde heterogeniteit en overerfbare epigenetische veranderingen. NCM cultuur, gebaseerd op zowel single-cell passage en high-density cel plating, vertegenwoordigt een nieuwe kweekmethode voor HPSC groei 6,18. Hoewel diverse eencellige passage werkwijzen zijn beschreven in de literatuur, maar geen van hen worden gebruikt voor normale voortplanting. Bijvoorbeeld, Wu en collega's gebruik van een eencellige passage methode om de effecten van verschillende kleine moleculen cocktails HPSC groei 19 bestuderen. Echter, hun laatste cultuur producten zijn kolonies. Dus, lage-dichtheid gebaseerde single-cell passage methoden nog steeds behoren tot kolonie-achtige cultuur. Met betrekking tot de NCM cultuur, de high-holenheid plating transformeert deze cultuur een nieuwe methode, aangezien de uiteindelijke cel product een homogene monolaag. Onlangs, Dvorak en collega's gebruikten soortgelijke methode om volledig kunnen onderzoeken HPSC eigenschappen onder deze groei voorwaarde 18. Hun resultaten ondersteunen ook onze belangrijkste conclusies. Het is nu duidelijk dat NCM cultuur is een nieuwe methode die een aantal nieuwe eigenschappen bezit en kunnen verder worden aangepast voor veel potentiële toepassingen in pluripotente stamcel biologie.

Basiseigenschappen van hPSCs van NCM cultuur

Het is denkbaar dat onder hPSCs NCM cultuur delen veel kenmerken met dezelfde soorten cellen gekweekt als kolonies 9,18. De expressie niveaus van hESC markers in hPSCs, die oktober-4, NANOG, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81, en SSEA-1 omvatten, zijn zowel bij NCM en kolonie-achtige cultuur . NCM-aangepaste cellen ook soortgelijke globale mRNA expressie patronen behouden om HPSC kolonies gegroeid op MEF feeder lagen 9. Duidelijk, NCM-aangepaste cellen ondersteunen de pluripotent staat zoals bepaald door teratoma assay 9,18. In tegenstelling HPSC kolonies, NCM cellen onder omstandigheden een voorspelbare groeisnelheid die wordt gekenmerkt door consistente groeicurves celcycli en celaantallen 9. Vanwege de hoge dichtheid eencellige plating, hPSCs onder NCM omstandigheden vertonen exponentiële groei tussen dag 2 en 4 (figuur 1B), waardoor het aantal cellen stijgt met 4-maal ten opzichte van HPSC kolonies gegroeid op MEFs. Langdurige cultuur niet toeneemt cel productie, maar verhoogt apoptotische en differentiatie van stress 9. NCM maakt ook optimaal cryopreservatie, waardoor snelle cel herstel na plating ontdooide cellen (protocol 1). Bovendien NCM vergemakkelijkt de aanpassing van HPSC cultuur om met diverse xeno gratis protocollen 9. In het algemeen, NCM ondersteunt de groei van hPSCs, handhaaft de pluripotent staat, en onderhoudt de potentieel van hPSCs te differentiëren in volwassen weefsels van de drie kiembladen.

Chromosomale stabiliteit in hPSCs onder NCM

In termen van stabiliteit van het chromosoom, er geen directe vergelijking tussen de cellen van verschillende kweekmethoden. De meeste hPSCs onder onze NCM kweekomstandigheden hebben normaal karyotype en genkopieën zoals bepaald met G-banding,-array gebaseerde vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH) en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) 9. Twee lijnen (~ 13%) vertoonden abnormale karyotypes, waarbij een lijn (dwz WA09) vertoonden verhoogde polyploïdie en een andere (ES01) had 14% van de cellen met trisomie 20 9. Het is onduidelijk of deze abnormale karyotypen werden afgeleid uit de selectie van reeds bestaande gemuteerde cellen voorafgaand aan NCM cultuur of geïnduceerd tijdens NCM aanpassing. Het is belangrijk dat het uitgangsmateriaal HPSC kolonies of subset van kolonies voor NCM cultuur should zijn goed gekarakteriseerd in termen van hun homogeniteit en stabiliteit van het chromosoom in de tijd voor NCM aanpassing. Met name de snelheid van abnormale karyotypes onder NCM omstandigheden veel lager dan die vermeld in een recente cohortanalyse, waarin de auteurs blijkt 34% abnormale karyotypes onder dominante kolonie-typen kweekomstandigheden 20. Vandaar onze studie blijkt dat we gedissocieerde single-cellen kunnen groeien en hun chromosomale stabiliteit onder NCM omstandigheden te handhaven. Toch moeten we ook gevoeliger methoden te gebruiken om chromosomale afwijkingen van hPSCs onderzoeken in de komende jaren. In het bijzonder, moeten we chromosomen 1, 12, 17 en 20 scannen met hogere resolutie probes (dat wil zeggen <50 kb), zoals enkele kleine veranderingen (bijvoorbeeld de 20q11.21 amplicon) en deze vaak veranderd chromosomen niet kan worden gedetecteerd door conventionele karyotypering en FISH 20-22. Bovendien zou de ontwikkeling van diverse NCM protocollen ons in staat Robu identificerenst en veilige methoden voor toekomstige toepassingen.

NCM cultuur onder diverse modificaties

Het gebruik van de ROCK inhibitor, Y-27632, heeft de deur geopend voor een-cel-gebaseerde testen. De beschikbaarheid van verschillende ROCK-inhibitoren zouden extra keuzemogelijkheden voor NCM-gebaseerde uitbreiding en cryopreservatie van hPSCs (figuur 2) te verstrekken. In theorie, waarbij kleine molecule, die aanzienlijk kunnen verhogen eencellige plating efficiëntie, kan worden gebruikt om NCM cultuur vergemakkelijken. JAK remmer 1, die anders werkt dan die ROCK-inhibitoren, vertegenwoordigt zo'n voorbeeld 9. Het gebruik van enkele moleculen of combinatorische benaderingen kunnen ons zorgen voor een optimale celgroei, cellulaire assays en cryopreservatie van hPSCs. Echter kunnen alternatieve NCM cultuur hPSCs op bepaalde extracellulaire matrixeiwitten, zoals laminine isovorm LN-521, gewoonlijk uitgedrukt in hESCs 23-25, de interferentie van kleine eliminerenmoleculen (Figuur 3). LN-521 kunnen gedissocieerd-HPSC overleving verbeteren en ondersteunt pluripotentie door de activering van de α6β1-PI3K/AKT route 24. De eenvoud van de passage hPSCs met LN-521 vermindert de heterogeniteit van de cellen, compatibel met verschillende-feeder-vrij en xeno gratis celkweek systemen met behulp van volledig beschreven medium (Protocol nr. 4). Het biedt ook een extra module voor high-throughput testen zonder de invloed van kleine moleculen. Hoewel de iPSCs onder NCM cultuur op LN-521 behouden de expressie van een groep HPSC markers verdere karakterisatie van deze cellen met teratoom test en embryoid body gemedieerde multilineage differentiatie kan nodig zijn de pluripotente toestanden in deze cellen bevestigen. Van de nota, hiPSCs gekweekt op de laminin isovorm LN-521 zijn naar verluidt cytogenetisch stabiel (http://biolamina.com/). We moeten echter ook werkwijzen hogere resolutie en gevoelig toepassen (zoals hierboven besproken) tot examine de chromosomale stabiliteit in deze cellen.

Veelzijdigheid van NCM cultuur voor genetische manipulatie

NCM-gebaseerde werkwijzen vormen een eenvoudige, robuuste en voordelige systeem dat bijzonder nuttig kan zijn voor genetische manipulatie van hPSCs (protocollen 5-7). Het is bekend dat hESC kolonies moeilijk te transfecteren of transduceren, met grote variabiliteit in transfectie / transductie efficiënties tussen verschillende laboratoria 26-28. Bijvoorbeeld, transfectie efficiëntie in hESCs varieert van 3 tot 35% onder colony kweekomstandigheden 26. Lentivirale transductie signalen in BG01 cellen onder kolonie voorwaarden bleken te extreem laag 9 zijn. De transfectie-efficiëntie gemedieerd door NCM was groter dan 75% en 9 modificatie van transductie methoden lentivirus gemedieerde transductie efficiëntie te verhogen tot 90% 28. Een strakke vergelijkende studie is gebleken dat het ee meercellige verenigingen in hESC kolonies die bijdragen aan de lage transfectie-efficiëntie 9. Verder hebben we recent gewijzigde een microRNA transfectie protocol en kunnen hoge transfectie-efficiëntie (~ 91%) te bereiken zonder het gebruik van lentivirussen (Protocol 6 en figuur 4). Dit protocol is eenvoudig te gebruiken en bijzonder nuttig voor transiënte transfectie-experimenten bij een 3 - tot 5-dagen termijn. Zoals we afgebakend in bovenstaande protocollen, moeten meerdere factoren in overweging worden genomen bij het optimaliseren we transfectie / transductie-efficiëntie in hPSCs. Deze factoren omvatten celdichtheid plasmide concentraties lentivirale titers, multipliciteit van infectie (MOI), duur van de transfectie / transductie, cytotoxiciteit van de reagentia en methoden voor de controle transfectie / transductie efficiëntie.

We werken en uit te breiden NCM methoden om cultuur hPSCs op Matrigel en gedefinieerd extracellulaire matrices. Deze kweekmethodeis een efficiënte manier om de heterogeniteit vaak gevonden in HPSC kolonie en geaggregeerd culturen te elimineren. Menselijke pluripotente stamcellen onder NCM groeiomstandigheden zijn pluripotent en chromosomaal stabiel. Deze roman cultuur systeem is eenvoudig en veelzijdig voor HPSC onderhoud, grootschalige uitbreiding, en genetische manipulaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL  Model RX-650 X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates Becton Dickinson Labware 353046 Polystyrene plates
DMEM Invitrogen Inc. 11965–092 For MEF medium
Mitomycin C Roche 107409 Mitotic inhibitor
Trypsin Invitrogen Inc. 25300-054 For MEF dissociation
DMEM/F12 Invitrogen Inc. 11330–032 For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium  Invitrogen Inc. 31985-062 For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS Invitrogen Inc. 16000–044 Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement Invitrogen Inc. 10828–028 KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids Invitrogen 11140–050 NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine Invitrogen  25030–081 Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements StemCell Technologies 5850 Animal protein-free
TeSR2 & Supplements StemCell Technologies 5860 Xeno-free medium
β-mercaptoethanol Sigma  M7522 Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC
American Type Culture Collection (ATCC)  SCRC-1040 For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel BD Bioscience 354277 For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521 BioLamina LN521-02 Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic) R&D Systems, MN 223-FB Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I EMD4 Biosciences 420099 An inhibitor of Janus kinase
Y-27632 EMD4 Biosciences 688000 ROCK inhibitor
Y-27632 Stemgent 04-0012 ROCK inhibitor
Y-39983 Stemgent 04-0029 ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane Stemgent 04-0030 ROCK II inhibitor
Thiazovivin Stemgent 04-0017 A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer BD Bioscience 352340 40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C Thermo Scientific  C6516F-1 “Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000 Invitrogen Inc. 11668-027 Transfection reagents
DharmaFECT Duo Thermo Scientific T-2010-02 Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control Thermo Scientific IP-004500-01-05 Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNA Thermo Scientific  To be determined Lentiviral vector
pmaxGFP amaxa Inc (Lonza) Included in every transfection kit Expression plasmid for transfection control
Oct-4 Santa Cruz Biotechnology sc-5279 Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1 Santa Cruz Biotechnology sc-21702 Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4 Santa Cruz Biotechnology sc-21704 Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60 Santa Cruz Biotechnology sc-21705  Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81 Santa Cruz Biotechnology sc-21706 Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51) Santa Cruz Biotechnology sc-8020 Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein Santa Cruz Biotechnology sc-8399 AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19) Santa Cruz Biotechnology sc-9187 FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1) Thermo Scientific MS-295-P0 Mouse IgG1
Desmin Thermo Scientific RB-9014-P1 Rabbit IgG
Anti-NANOG ReproCELL Inc, Japan RCAB0004P-F Polyclonal antibody 
Rat anti-GFAP Zymed 13-0300 Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3) Cedarlane Laboratories Ltd. CL2513A Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4) DakoCytomation Inc IR611/IS611 Mouse IgG2a
Nestin Chemicon International MAB5326 Rabbit polyclonal antibody
TUBB3 Convance Inc MMS-435P Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12) Cell Signaling Technologies 3113 Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution) Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in D-PBS

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  4. Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  5. Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
  6. Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  7. Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
  8. Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
  9. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
  10. Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
  11. Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
  12. Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
  13. Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
  14. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  15. Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
  16. Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  17. Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
  18. Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
  19. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
  20. Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
  21. Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
  22. Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  23. Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
  24. Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
  25. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
  26. Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
  27. Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
  28. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).

Tags

Stem Cell Biology pluripotente stamcellen menselijke embryonale stamcellen geïnduceerde pluripotente stamcellen celkweek niet-kolonie soort monolaag enkele cel plating efficiëntie Rho-geassocieerde kinase Y-27632 transfectie transductie
Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, More

Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, P. G., Mallon, B. S. Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51519, doi:10.3791/51519 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter