Introduction
Kapaciteten i hPSCs att differentiera mot multilineage vuxna vävnader har öppnat nya möjligheter att behandla patienter som lider av svåra sjukdomar som involverar hjärt-, lever, bukspottkörtel, och neurologiska system 1-4. Olika celltyper härrör från hPSCs skulle också ge robusta cellulära plattformar för sjukdomsmodellering, genteknik, drog screening och toxikologiska tester 1,4. Den viktigaste frågan som garanterar deras framtida kliniska och farmakologiska tillämpningar är generering av ett stort antal kliniska kvalitet hPSCs genom cellodling in vitro. Men de nuvarande kultursystem är antingen otillräckliga eller inneboende variabel, olika feeder-och feeder-fria kulturer av hPSCs som kolonier 5,6.
Colony typ tillväxt av hPSCs delar många strukturella drag den inre cellmassan (ICM) i däggdjursembryon tidigt. ICM är benägen att differentiera till de tre bakterie-lageri en flercellig miljö på grund av förekomsten av heterogena signalering gradienter. Således är förvärv av heterogenitet i tidig embryonal utveckling betraktas som en erforderlig process för differentiering, men en oönskad egenskap hos HPSC kultur. Den heterogenitet i HPSC kulturen ofta induceras av alltför apoptotiska signaler och spontan differentiering på grund av suboptimala tillväxtbetingelser. Således, i koloni-typ kultur, de heterogena celler observeras ofta i periferin av kolonierna 7,8. Det har också visat att cellerna i mänskliga embryonala stamceller (hESC) kolonier uppvisar differential svar på signalmolekyler som BMP-4 9. Dessutom koloniodlingsmetoder producerar låga cellutbyten samt mycket låga cell återvinningen från frysförvaring på grund av okontrollerbara tillväxt och apoptotiska signalvägar 6,9. Under senare år har olika suspensionskulturer har utvecklats för odling hPSCs, particularly för expansion av stora mängder hPSCs i feeder-och matrisfria betingelser 6,10-13. Uppenbarligen olika kultursystem har sina egna fördelar och nackdelar. I allmänhet representerar den heterogena karaktären hos hPSCs en av de stora nackdelarna i koloni-typ och aggregerade odlingsmetoder som är suboptimal för att leverera DNA-och RNA-material till hPSCs för genteknik 6.
Uppenbarligen finns det ett tvingande behov av att utveckla nya system som kringgår vissa brister i nuvarande odlingsmetoder. Upptäckterna av småmolekylära hämmare (t.ex. ROCK hämmare Y-27632 och JAK-hämmare 1) som förbättrar encelliga överlevnad bana väg för dissocierade-HPSC kultur 14,15. Med hjälp av dessa små molekyler, har vi nyligen utvecklat en odlingsmetod som bygger på icke-koloni typ (NCM) tillväxt av dissocierade-hPSCs 9. Denna nya kultur-metoden kombinerar både encelliga aging och hög densitetplätering metoder, vilket gör att vi kan producera stora mängder av homogena hPSCs enligt konsekventa tillväxtcykler utan större kromosomavvikelser 9. Alternativt kan NCM kultur implementeras med olika små molekyler och definierade matriser (såsom lamininer) i syfte att optimera odlingsmetoden för breda tillämpningar. Här presenterar vi flera detaljerade protokoll som bygger på NCM kultur och avgränsa detaljerade förfaranden för genteknik. För att visa mångsidigheten hos NCM protokoll, testade vi också NCM företagskultur där mångfald ROCK-hämmare och med den enda laminin isoform 521 (dvs., LN-521).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Encelliga Baserade icke-koloni typ monolager (NCM) kultur hPSCs.
1. Förberedelser
- Gör 500 ml medium för odling av mus embryonala fibroblaster (MEFs): DMEM-medium kompletterat med 10% FBS, 2 mM L-glutamin och 0,1 mM icke-essentiella aminosyror (NEAA).
- Isolera möss embryonala fibroblaster (MEFs) celler härledda från CF1-stammen efter en rutin protokoll 16 och kultur MEFs på 0,1% gelatin-belagd 6-brunnars cellodlingsplatta i DMEM-medium. Alternativt köper MEF lager vid passage 3 från kommersiella resurser.
- Förbered Matrigel plattor.
- Späd 5 ml hESC kvalificerade Matrigel lager med 5 ml DMEM/F12 medium (kyld vid cirka 4 ° C) och lagrar som 50% alikvoter i en -20 ° C frys. Tina frysta Matrigel lager i kylskåp (~ 4 ° C) O / N och ytterligare späda Matrigel i kallt DMEM/F12-medium (för att ge upphov till en 2,5% arbetskoncentration).
- Avlägsna Matrigel plåten ur kylskåpet, låt plåten värmas vid RT i cellkultur huva för 10 till 30 minuter (OBS: inte värma plattan i en cellkultur inkubator), och aspirera DMEM medium innan plätering hPSCs.
- Gör 500 ml hESC medium: 80% DMEM/F12 medium, 20% KSR, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 0,1 mM β-merkaptoetanol, och 4 ng / ml av FGF-2.
- Bered 10 ml av 2X HPSC frysmedium: 60% FBS, 20% DMSO, och 20 | iM Y-27632 i mTeSR1 medium, sterilisera genom filtrering och använda mediet inom en vecka.
. 2 Protokoll 1 (Grundläggande): Odla HPSC kolonier på matare
- Använd MEF passagenummer på 5 eller 6 (betecknad P5 och P6) för HPSC kultur för att få konsekvent Results. Mitotiskt inaktivera MEFs genom behandling av cellerna med 10 | ig / ml mitomycin C i 3 h vid 37 ° C, tvätta cellerna 3 gånger med 1X Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (D-PBS), och därefter dissociera MEFs med 0,05% trypsin i 0,53 mM EDTA. Alternativt, bestråla MEF vid en dos på 8000 rads med röntgenbestrålare.
- Räkna cell nummer med hjälp av trypanblått fläcken uteslutningsmetoden under mikroskop. Alternativt kan du använda en automatisk cellräknare.
- Tallrik bestrålat MEFs på 6-brunnars plattor av polystyren belades med 0,1% gelatin vid en täthet av 1,88 x 10 5 celler per brunn (dvs. 1,96 x 10 4 celler / cm 2). Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 timmar.
- Avlägsna MEF odlingsmedium genom aspiration med en Pasteur-pipett (OBS: ingen tvätt steg som behövs vid denna tid).
- Finfördela HPSC kolonier från tidigare kultur i små klumpar, undersöka klumpar under mikroskop för att se till sina storlekar from-50 till 100 um i diameter, och plattan HPSC klumpar på ovansidan av MEF matarskikt i en brunn innehållande 2 ml av HPSC medium.
- Byt hESC medel dagligen i 3 till 5 dagar, rekord kolonitillväxt genom fotografi, markera eventuella morfologiskt förändrade eller differentierade kolonier (~ 5%), och manuellt ta bort de markerade kolonierna genom att försiktigt aspiration med en Pasteur-pipett.
- Skölj återstående kolonier på MEF två gånger (2 min vardera med D-PBS), och inkubera kolonierna med 2 ml av 1 mg / ml kollagenas IV i HPSC medium under 10 till 30 minuter), och undersöka avskiljandet av HPSC kolonier från MEF-belagda ytan (OBS: använd en skrapa för att hjälpa den lossnar processen endast om kolonierna är tätt knutna till plattan).
- Tillsätt 5 ml HPSC medium till varje brunn för att minimera enzymatiska reaktioner, överföra kolonier till en 15 ml tub, tillåta HPSC kolonier sedimentera under 3-5 min vid RT, och säkerställa sedimentering av kolonierna genom direkt visualisering av calnar på botten av röret (Obs: centrifugera inte röret vid denna punkt).
- Avlägsna supernatanten som innehåller rest MEF och dissocierade enskilda celler, suspendera kolonierna med 5 ml hESC medium och upprepa sedimenteringssteg två gånger.
- Ta bort de medel, Finfördela HPSC kolonier i små klumpar, lagra i 1X HPSC frysning medium (eller CryoStore CS10 frysning medium) för frysförvaring (1 konfluenta väl per fryst ampull) eller plattan på en 6-brunnar för cell passage.
3 Protokoll 2:. Konvertera HPSC Kolonier från matare till NCM
- Skölj HPSC pellets i D-PBS en gång, inkubera pellets med 1 ml 1X Accutase för 10 minuter, och granska den enzymatiska reaktionen i mikroskop för att säkerställa encelliga dissociation.
- Terminate de enzymatiska reaktionerna genom att försiktigt återsuspendera cellerna i 5 ml av mTeSR1 medium innehållande 10 | iM Y-27632, följt av centrifugering vid 200 x g vid rumstemperatur under 5 min(Observera, använd inte alltför centrifugalkraft som orsakar cellskador).
- Tillsätt 5 ml mTeSR1 medium till pelleten, suspendera pelleten som enskilda celler, och filter dissocieras celler genom ett 40 | im cellfilter (för att avlägsna eventuella kvarvarande cellaggregat).
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs i en brunn (1,4 till 2,1 x 10 5 celler / cm 2) hos en 6-brunnars platta belagd med 2,5% hESC kvalificerade Matrigel, till mTeSR1 mediet upp till 2,5 ml och innehålla 10 | iM Y-27632 i medium (för att underlätta den initiala 24 h encelliga plating). Alternativt använda följande små molekyler för att ersätta 10 ^ M Y-27.632 för att öka encelliga plätering: 1 ^ M Y-39983 (ROCK I hämmare), 1 ^ M phenylbenzodioxane (ROCK II-hämmare), 1 ^ M thiazovivin (en roman ROCK-hämmare) , och 2 ^ M JAK-hämmare 1.
- Byt medium med drogfritt mTeSR1 medium på den nästa dag (inom 24 tim), skilja celler från en extrabrunn, och räkna antalet celler för att bestämma encelliga utstrykningseffektivitet (Obs: ungefär 50 till 90% av encelliga plätering effektivitet som kan uppnås i detta skede).
- Låt cellerna att växa som en enda cell-formade monolager för ett par dagar med 3 ml mTeSR1 medium. Ändra medel dagligen.
- Empiriskt bestämma schemat för passaging anpassad NCM beroende på celltätheten. Passage när celltillväxten når sammanflödet på dag 3 eller dag 4, eller vid 4 tim tidpunkt efter försvinnandet av cell-till-cell gränser. Dissociera cellerna i 1 ml av Accutase, använd en 1 till 3 delningsförhållande (det vill säga en sammanflytande brunn av celler utstrukna i tre brunnar i 6-brunnsplatta) för cell passaging, och stabilisera anpassad NCM efter fem passager.
- Cell frysning
- Utnyttja en konfluent brunn (~ 5-6 x 10 6 celler) för en fryst ampull: dissociera cellerna från en konfluent väl med 1 ml Accutase under 10 min.
- Späd wed 5 ml mTeSR1 medium och centrifugera celler såsom beskrivits ovan.
- Återsuspendera pelleten i 500 | il av mTeSR1 medium och sedan långsamt tillsätt 500 | il 2X HPSC frysmedium (innehållande 20 pM Y-27632) i ett kryokonserveringsflaskan. Alternativt resuspendera cellerna i 1X HPSC frysmedium innehållande 2 pM JAK inhibitor 1 eller 1X CryoStor CS10-medium i närvaro av antingen 10 pM Y-27632 eller 2 | iM JAK inhibitor 1.
- Placera frysta ampuller i en is-kyld cryocontainer (botten-fylld med isopranol) och överför cryocontainer till en -80 ° C frysanordning omedelbart.
- Överför celler från -80 ° C frys till en vätsketank kväve (nästa dag) för långsiktig frysförvaring.
- Cell tining
- Utnyttja en kryokonserveringsflaskan för plätering 1 brunn i en 6-brunnar.
- Pre-varm mTeSR1 medium i ett 37 ° C vattenbad i 10 min, tö-celler i samma vattenbad under 2 min,droppvis lägga till celler till 5 ml av förvärmd mTeSR1 medium innehållande 10 | iM Y-27632, och centrifug såsom beskrivits ovan.
- Försiktigt resuspendera cellen pellets med 2 ml mTeSR1-medium innehållande 10 ^ M Y-27632 och långsamt överföra celler till ett väl förväg belagd med Matrigel (Obs! undvika producera luftbubblor).
- Ändra medel dagligen och förväntar HPSC tillväxten når sammanflödet på dag 3 eller 4.
4 Protokoll 3:. Konvertera HPSC kolonier på Matrigel till NCM Kultur
- Ta bort en Matrigel belagd plåt från kylskåpet, placera plattan i vävnadsodling huva för 10 till 30 minuter, ta bort mediet från varje brunn i plattan och tillsätt 2 ml förvärmda mTeSR1 medium till varje brunn.
- Överföring revs HPSC klumpar från matar kultur (steg 2.10 i grundprotokollet) till ovanstående Matrigel plattan. Lägg mTeSR1 medel upp till 2,5 ml slutlig volym i varje brunn.
- Ändra medel dagligen i 3-4 dagars tills kolonier når 80 till 90% sammanflödet.
- För cell passage: Skölj kolonierna med D-PBS två gånger, behandla cellerna med 1 ml 2 mg / ml dispas vid 37 ° C under 15 till 20 minuter, och sediment och passageceller som klumpar.
- För NCM kultur: Upprepa steg 3,1-3,9 beskrivs i protokoll 2.
5 Protokoll 4:. NCM Kultur av hPSCs på LN-521
- Tina upp den rekombinanta LN-521 lösning vid 4 ° C före användningsdagen och gör laminin beläggningslösning (LCS) genom att späda den tinade laminin med 1X D-PBS (innehållande Ca 2 + / Mg 2 +) till en slutlig koncentration av 10 pg / ml.
- Tillsätt 1 ml LCS till en brunn på 6-brunnar (notera: att undvika uttorkning under beläggningsprocessen).
- Täta belagda plattan med Parafilm för att förhindra avdunstning och förvara plattan i kylskåp (4 ° C) O / N (obs: använd plattan inom 1 vecka).
- Försiktigt bort LCS med en Pasteur pipett utan attuching den belagda ytan och tillsätt 2 ml av mTeSR1 medium till en väl.
- Värm alla odlings lösningar (inklusive D-PBS) i ett 37 ° C vattenbad i 25 min.
- Konvertera HPSC kolonier till NCM
- Dissociera cellaggregat till enstaka celler med Accutase som beskrivs i protokoll 2.
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs i en LN-521 belagd väl (från 1,4 till 2,1 x 10 5 celler / cm 2) utan närvaro av ROCK-hämmare.
- Ändra medel dagligen i 3 till 4 dagar.
- Dissociera cellerna i 1 ml av Accutase vid dag 3 eller 4 för nästa cell passage med användning av en 1 till 3 delningsförhållande.
. 6 Protokoll 5: NCM Kultur för plasmid DNA-transfektion
- Adapt HPSC kolonier till NCM kultur såsom beskrivs i protokollen 2-4.
- Plansch dissocieras hPSCs i 12-brunnar med en celltäthet av 7,5 x 10 5 celler / brunn i mTeSR1 medium i närvaro av 10 | iM Y-27632.
- Byt mTeSR1 medium med drogfritt mTeSR1 mediet mellan 4-8 timmar efter plätering cellerna.
- För varje transfektion, späd 2,5 pg av expressionsplasmider (t.ex. pmaxGFP) och 5 pl av Lipofectamine 2000 i separata Eppendorf-rör i 125 pl vardera av Opti-MEM Reducerat Serum Medium.
- Efter 5 min, blanda de utspädda reagenser och inkubera under 20 min vid rumstemperatur (för att bilda transfektion komplex).
- Tillsätt 250 | il transfektion komplex till varje brunn innehållande hPSCs i 1 ml mTeSR1 medium och inkubera cellerna vid 37 ° C i en CO2-inkubator under 24 timmar.
- Undersök transfektionseffektivitet under ett fluorescensmikroskop och fotograferar slumpmässigt för beräkning av den faktiska transfektionseffektivitet.
. 7 Protokoll 6: NCM Kultur för transfektion av MikroRNA
- Dissociera semi-konfluenta hPSCs på dag 2 i NCM betingelser genom att tillsätta 1 ml av Accutase per brunn i 6 -Brunnar.
- Tillsätt 10 ml mTeSR1 medium för att späda enzymatiska reaktioner och centrifugera vid 200 xg under 5 min.
- Resuspendera cellpelleten med mTeSR1 medium, ympa cellerna vid en densitet av 7,5 x 10 5 celler per brunn i en 12-brunnsplatta i mTeSR1 medium innehållande 10 | iM Y-27632, och låta cellerna fästa under 4 timmar.
- Byt medium med Y27632 fritt mTeSR1 medium.
- Använd kommersiellt tillgängliga mikroRNA (t.ex. en icke-inriktning miRIDIAN miRNA transfektionskontroll märkt med Dy547). Titrera koncentrationer som sträcker sig från 0 till 160 nM med de medföljande reagenser och följa tillverkarens instruktioner.
- Optimera transfektionseffektivitet för varje koncentration i HPSC linjer genom avbildning av Dy547 fluorescensen hos levande celler under ett mikroskop vid 24 h efter transfektion.
- Beräkna transfektionseffektiviteter baserat på den procentandel av Dy547 positiva celler över alla bildförsedda celler.
- Upprepa steg från 7,1 till 7,4 i protokoll 6.
- Beräkna mängden av viruspartiklar som ska användas för transduktion: Använd följande formel: TU = (MOI x CN) / VT, medan TU betecknar det totala antalet omvandla enheter, MOI motsvarar önskad mångfald av infektion i brunnen (MOI eller TU / cell), anger CN antalet celler i varje brunn, och VT visar lager virustitrar (TU / ml). Till exempel, med tanke på att lager virustitrar för SMART-shRNA vektor lika med 1 x 10 9 TU / ml (transformerande enheter per ml), 7,5 x 10 5 celler per brunn vid tiden för transduktion och en förväntad MOI på 20: använd 15 l av aktieviruspartiklar för varje brunn (notera: detta villkor rekommenderas för övergående lentiviral induktion).
- Pre-varma 300 pl mTeSR1 medium med 10 mg / ml polybren för 30 min.
- Tillsätt 15 | il av stock virala partiklar iden förvärmda mTeSR1 medium innehållande polybren och försiktigt blanda lösningen.
- Ersätt cellodlingsmediet med 300 | il av förvärmt medium som innehåller de virala partiklarna.
- Efter 4 timmars inkubering, undersöka turboGFP fluorescens (en maker för shRNA expression) för att bestämma transduktionseffektiviteten.
- Addera 300 pl av ytterligare mTeSR1 medium till transducerande väl när cellerna börjar uttrycka turboGFP.
- Efter 12-16 h inkubation, ompröva turbo-GFP uttryck.
- Utför önskade uppföljande experiment med dessa transducerade cellerna inom 72 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett generellt schema NCM kultur
Figur 1 representerar en typisk NCM kultur schema som visar de dynamiska förändringar av hPSCs efter hög densitet encelliga plätering i närvaro av ROCK-inhibitor-Y-27632. Dessa morfologiska förändringar innefattar intercellulära kontakter efter plätering, cellulär kluster bildas, och exponentiell celltillväxt följt av cell kondens (Figur 1A). Ett representativt experiment indikerar WA01 (H1) hESCs, pläteras som singelceller vid en densitet av 1,9 x 10 5 celler / cm 2 i närvaro av 10 | iM Y-27632 vid dag 1 (Figur 1B, vänstra panelen), vidare förökas utan bildandet av kolonier (Figur 1B, mellersta panelen) vid dag 2, och kondenseras som en homogen monoskikt som är lämplig för önskade experiment eller för cell passage vid dag 3 (Figur 1B, höger panel).
<strong> Olika ROCK-hämmare stödjer NCM kultur
En 96-brunnsplattanalys användes för proof-of-concept för high-throughput drug screening. Den var också utformad för att optimera användningen av olika ROCK-hämmare för att stödja NCM kultur. Ungefär 31000 dissocierade SCU-i10-celler, humana inducerade pluripotenta celler (hiPSCs) 17, ströks ut på en Matrigel-belagd brunn i närvaro av olika koncentrationer av ROCK-hämmare. Efter 24 timmar, cellerna utsattes för CCK-8 baserad överlevnadsanalys för att bestämma cellöverlevnad under dessa betingelser. Vi har tidigare visat att NCM metoden kräver användning av ROCK-hämmare, Y-27.632, vid 10 ^ M för att öka encelliga plätering. I denna rapport, bekräftade vi att 10 pM Y-27632 signifikant öka 24 hr encelliga plätering effektivitet hiPSCs (P <0,05) (Figur 2). Vi fann också att Y-39983 (ROCK I hämmare), phenylbenzodioxane (ROCK II hämningstor) och thiazovivin (en roman ROCK-hämmare) signifikant modulera encelliga utstrykningseffektivitet och främja NCM tillväxt vid 1 | iM jämfört med deras kontroller (p <0,05) (Figur 2). Dessutom är effekterna av de tre ROCK-hämmare (vid 1 | iM) på encelliga utstrykningseffektivitet var jämförbar med den för Y-27632 vid 10 ^ M (P> 0,05) (figur 2). Notably ROCK I-inhibitor (vid 5 pM) verkar visa uttalad cytotoxicitet jämfört med läkemedlet vid ett ^ M (p <0,05), som blandar in en mer specifik interaktion än andra molekyler. Sålunda kan olika berg inhibitorer användas för uppbär NCM kultur i framtiden. Dock skulle det krävas en fullständig karakterisering av både hESCs och hiPSCs enligt NCM med dessa nya hämmare för framtida bruk.
LN-521 har stöd för NCM kultur utan användning av ROCK-hämmare
För att bestämma than rollen som en specifik laminin isoform stödja hESC tillväxt, odlade vi SCU-i30 hiPSCs på LN-521-belagda plattor i xeno-fritt medium TeSR2. Intressant, LN-521 ensamt, utan närvaro av ROCK-hämmare, stödjer encelliga plätering och efterföljande NCM tillväxt för 15 passager under detta förhållande (Figur 3). Immunfärgning av SCU-i30 celler med en anti-NANOG polyklonala antikroppen visade att cellerna under detta tillstånd hade höga NANOG uttryck i kärnorna (figur 3A). Flödescytometrisk analys visade att hESC marköruttrycksprofilen var liknande de celler som odlats såsom Ncm med ROCK-inhibitor-Y-27632 (figur 3B).
Hög effektivitet av mikroRNA leverans utan användning av lentivirala partiklar
Transfektion med Dy547-märkt oligonukleotid microRNAsna utfördes i WA01 (H1) celler under NCM betingelser. WA01 hESCs odlades som NCM på 2,5% Matrigel i mTeSR1 för två (figur 4A) och 18 (figur 4B) passagerna respektive. Dessa celler visade hög transfektionseffektivitet 24 h efter transfektion (fig 4A och 4B). Generellt kan vi erhålla transfektionseffektivitet upp till 91% i hESCs vid 24 h efter transfektion.
Figur 1. (A) Schema för NCM kultur. Linjediagrammet skisserar de dynamiska förändringarna av flercelliga förening i en typisk 3-dagars kultur under NCM förhållanden. (B) Representativa fas bilder av WA01 (H1) hESCs förökade under en NCM villkor på 2,5% Matrigel i mTeSR1 medium för 16 passager (utsedda som WA01, mcp16). Den nedre panelen är den förstorade vyn av den övre panelen. Skalstrecken anger 100 nm.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Encelliga överlevnadsanalyser med användning av en 96-brunnsformat. Ungefär var 31.000 SCU-i10 hiPSCs 17 ströks ut på 2,5% Matrigel i närvaro av olika små molekylhämmare relaterade till Rho-associerad kinas (rock) banor vid angivna koncentrationerna . Efter 24 timmar, cellerna utsattes för CCK-8-överlevnadsanalys, genom att mäta absorbansen vid 450 nm (A450). Studentens t-test användes för att bestämma om skillnaderna i encelliga utstrykningseffektivitet mellan olika berg inhibitorer är av statistisk signifikans. Den singulära asterisk tecken (*) indikerar inga signifikanta skillnader mellan de hämmare (P & #62; 0,05), medan de dubbla asterisk tecken (**) betecknar den observerade skillnaden är av statistisk signifikans (P <0,05). Kolumner i histogrammen utse de medelvärden av de fyrfaldiga bestämningsfaktorer och barer representerar standardavvikelser.
Figur 3. NCM kultur hiPSCs på laminin-521 (LN-521) utan närvaro av ROCK-hämmare. SCU-i30 hiPSC linje inrättades vid NIH Stamcells Unit. SCU-i30-celler odlades på LN-521-belagda 6-brunnars plattor i xeno fritt medium TeSR2 för 15 passager utan användning av små molekylhämmare såsom ROCK-hämmare. (A) Immunfärgning av SCU-i30-celler med en anti -NANOG polyklonala antikroppen och counterstained med Hoechst 33342 (Hoechst). Noterbart är vissa celler som har en negativ NANOG färgning är the celler under mitos. (B) Flödescytometrisk analys av HPSC markör uttryck i SCU-i30 celler odlas som NCM på 2,5% Matrigel med användning av 10 ^ M Y-27632 (övre panelen) eller NCM på LN-521 utan Y-27632 (nedre panelen). Förfarandena för både immunfärgning och flödescytometrisk analys beskrevs tidigare 5. Skala barer skildra 100 nm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. NCM kultur hPSCs för mikro-RNA-transfektion. WA01 hESCs odlades som NCM på 2,5% Matrigel i mTeSR1 för 2 (A) och 18 (B) passager, respektive. Representativa fas och fluorescens bilder av WA01 celler transfekterade med Dy547-märkt kontroll mikroRNA för övervakning av transfektion effektivitet på 24 timmar efter transfektion. Skala barer representerar 100 ìm. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två huvudsakliga sätt att kultur hPSCs in vitro: konventionell koloni-typ kultur (av celler på matare eller extracellulära matriser) och fjädring kultur av hPSCs som aggregat utan matare 6. Begränsningarna av både koloni-typ och hängodlingsmetoder inkluderar ackumulerade heterogenitet och ärftliga epigenetiska förändringar. NCM kultur, baserad på både encelliga aging och hög densitet cell plätering, representerar en ny kultur metod för HPSC tillväxt 6,18. Fastän olika encelliga aging metoder har dokumenterats i litteraturen, men inget av dem används för rutinmässig fortplantning. Till exempel, Wu och kollegor använde en encelliga aging metod för att studera effekterna av olika små molekyler drinkar på HPSC tillväxt 19. Men deras slutbruksprodukter är kolonier. Så låg densitet baserade encelliga aging metoder hör fortfarande till koloni-typ kultur. Med avseende på NCM kultur, high-hålortets plating omvandlar denna kultur till en ny metod, eftersom den slutliga cellprodukten är en homogen monolager. Nyligen, Dvorak och kollegor använde samma metod för att grundligt analysera HPSC egenskaper under denna tillväxt villkor 18. Deras resultat stödjer också våra stora slutsatser. Det är tydligt nu att NCM kulturen är en växande metod som äger flera nya egenskaper och kan modifieras ytterligare för många potentiella tillämpningar i pluripotenta stamcellsbiologi.
Grundläggande egenskaper hos hPSCs från NCM kultur
Det är tänkbart att hPSCs enligt NCM kultur delar många egenskaper med samma typ av celler som odlas som kolonier 9,18. De uttrycksnivåer av hESC markörer i hPSCs, som omfattar oktober-4, NANOG, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81 och SSEA-1, är liknande i både NCM och koloni-typ kultur . NCM-anpassade celler behåller även liknande globala mRNA-uttrycksmönster till HPSC kolonier odlade på MEF matarskikt 9. Tydligt, NCM-anpassade celler upprätthålla den pluripotenta staten som bestäms av teratom analys 9,18. Men till skillnad från HPSC kolonier, celler under NCM förhållanden har en förutsägbar tillväxt som kännetecknas av konsekvent tillväxtkurvor, cellcykler och cell nummer 9. På grund av hög densitet encelliga plätering, hPSCs enligt NCM förhållanden uppvisar exponentiell tillväxt mellan dag 2 och 4 (Figur 1B), vilket ökar antalet celler med 4-faldig jämfört med HPSC kolonier odlade på MEF. Långvarig kultur ökar inte cellproduktion, utan snarare ökar apoptotiska och differentiering stressen 9. NCM ger också optimal frysförvaring, vilket möjliggör snabb cell återhämtning efter plätering tinade celler (protokoll 1). Dessutom underlättar NCM anpassning av HPSC kultur till olika xeno-fria protokoll 9. I allmänhet stöder NCM tillväxten av hPSCs, bibehåller pluripotenta staten, och upprätthåller den potenTiAl enligt hPSCs att differentiera till vuxna vävnader hos de tre germinallager.
Kromosomal stabilitet i hPSCs i NCM
I termer av kromosomalt stabilitet, finns det ingen direkt jämförelse mellan celler från olika odlingsmetoder. Majoriteten av hPSCs enligt våra NCM odlingsbetingelser har normala karyotypes och gen kopiera nummer som bestäms av G-bandning, array-baserade jämförande genomisk hybridisering (aCGH), och fluorescens in situ hybridisering (FISH) 9. Två linjer (~ 13%) uppvisade onormala karyotyper, i vilken en linje (dvs WA09) uppvisade förhöjd polyploidi och en annan en (ES01) hade 14% av cellerna med trisomi 20 9. Det är oklart huruvida dessa onormala karyotyper var härledda från urval av redan existerande muterade celler före NCM kultur eller inducerade under NCM anpassning. Det är viktigt att utgångs HPSC kolonier eller delmängd av kolonier används för NCM kultur should vara väl karakteriserad i termer av deras homogenitet och kromosomala stabilitet vid tidpunkten för NCM anpassning. Noterbart är att andelen onormala karyotypes enligt NCM förhållanden mycket lägre än vad som rapporterats i en nyligen kohort analys, där författarna visar 34% onormala karyotypes enligt dominerande koloni-typ odlingsbetingelser 20. Därför visar vår studie att vi kan växa dissocierade singel-celler och bibehålla deras kromosomala stabilitet under NCM förhållanden. Ändå måste vi också använda mer känsliga metoder för att undersöka kromosomavvikelser av hPSCs under de kommande åren. I synnerhet måste vi scanna kromosomerna 1, 12, 17 och 20 med hjälp av högre upplösning sonder (dvs <50 kb), som en del mindre skador (t.ex. den 20q11.21 amplikonet) vid dessa ofta förändrade kromosomer inte kan upptäckas med konventionell karyotypning och FISH 20-22. Dessutom skulle utvecklingen av olika NCM-protokoll gör det möjligt för oss att identifiera Robust och säkra metoder för framtida applikationer.
NCM kultur under olika modifikationer
Användningen av ROCK-hämmare, Y-27.632, har öppnat dörren för encelliga baserade analyser. Tillgången till olika ROCK inhibitorer skulle erbjuda ytterligare val för NCM baserade expansion och kryokonservering av hPSCs (Figur 2). I teorin någon liten molekyl, som avsevärt kan öka encelliga plätering effektivitet, kan användas för att underlätta NCM kultur. JAK-hämmare 1, som fungerar på samma sätt som dessa ROCK-hämmare, är ett sådant exempel 9. Användningen av enkla molekyler eller kombinatoriska metoder kan ge oss optimal celltillväxt, cellanalyser och kryokonservering av hPSCs. Emellertid kan alternativa NCM kultur hPSCs på definierade extracellulära matrisproteiner, såsom laminin-isoform LN-521, som normalt uttrycks i hESCs 23-25, eliminera interferensen av småmolekyler (Figur 3). LN-521 kan förbättra dissocierade-HPSC överlevnad och upprätt pluripotencyen genom aktivering av α6β1-PI3K/AKT vägen 24. Enkelheten i passaging hPSCs med LN-521 minskar heterogeniteten av celler, som är kompatibla med olika matarfria och xeno-fria cellodlingssystem som använder helt definierat medium (protokoll 4). Det ger också en tilläggsmodul för high-throughput analyser utan påverkan av små molekyler. Fastän iPSCs enligt NCM kultur på LN-521 bibehöll expression av en panel av HPSC markörer, ytterligare karakterisering av dessa celler med användning av teratom analysen och embryoid kropp medierad multilineage differentiering kan vara nödvändigt att bekräfta de pluripotenta stater i dessa celler. Notera hiPSCs odlats på laminin isoform LN-521 är enligt uppgift cytogenetiskt stabila (http://biolamina.com/). Men vi måste också tillämpa högre upplösning och känsliga metoder (som diskuterats ovan) till eXamine den kromosomala stabiliteten i dessa celler.
Mångsidighet av NCM kultur för genteknik
NCM-baserade metoder representerar en enkel, robust och ekonomiskt system som kan vara särskilt användbar för genetisk manipulation av hPSCs (protokoll 5-7). Det är känt att hESC kolonier är svåra att transfektera eller transducera, med stor variabilitet i transfektion / transduktion effektivitet bland olika laboratorier 26-28. Exempelvis varierar transfektionseffektiviteten i hESCs 3-35% enligt koloniodlingsbetingelser 26. Lentivirala transduktion signaler i BG01 celler under koloniförhållanden befanns vara extremt låg 9. Emellertid transfektionseffektiviteten medierad av NCM var större än 75% 9 och modifiering av överföringsmetoder kan öka lentivirus-förmedlad transduktion verkningsgrad upp till 90% 28. En stram jämförande studie har visat att det är the flercelliga föreningar i hESC kolonier som bidrar till den låga transfektionseffektiviteten 9. Dessutom har vi nyligen ändrat en mikroRNA transfektion protokoll och kan uppnå hög transfektionseffektivitet (~ 91%) utan användning av lentivirus (Protokoll 6 och Figur 4). Detta protokoll är lätt att använda och särskilt användbar för transient transfektion experiment inom en 3 - till 5-dagars tidsram. Som vi avgränsas i ovannämnda protokoll, bör flera faktorer tas med i överväganden när vi optimerar transfektion / transduktion effektivitet i hPSCs. Dessa faktorer inkluderar celltäthet, plasmid koncentrationer, Lentiviral titrar, mångfald av infektion (MOI), längd transfektion / transduktion, cytotoxicitet av reagens och metoder som används för att övervaka transfektion / transduktion effektivitet.
Vi utveckla och utvidga NCM metoder för kultur hPSCs på Matrigel och på definierade extracellulära matriser. Denna odlingsmetodär ett effektivt sätt att eliminera heterogeniteten vanliga i HPSC koloni och aggregerade kulturer. Mänskliga pluripotenta stamceller enligt NCM tillväxtförhållanden är pluripotenta och chromosomally stabil. Denna nya kultursystem är enkel och mångsidig för HPSC underhåll storskalig expansion, och genetiska manipulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
- Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
- Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
- Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
- Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
- Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
- Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
- Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
- Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
- Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
- Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
- Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
- Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
- Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
