Introduction
Die Kapazität der hPSCs in Richtung multilineage adulten Geweben differenzieren hat neue Wege zur Behandlung von Patienten, die an schweren Krankheiten, Herz-Kreislauf-, Leber-, Pankreas-und neurologischen Systeme beinhalten leiden 1-4 eröffnet. Verschiedene Zelltypen aus hPSCs abgeleitet würde auch robust Mobilfunk-Plattformen für Krankheit Modellierung, Gentechnik, Arzneimittel-Screening, und toxikologische Prüfungen 1,4. Die zentrale Frage, die ihre zukünftigen klinischen und pharmakologischen Anwendungen gewährleistet, ist die Erzeugung einer großen Zahl von klinischem hPSCs durch in-vitro-Zellkultur. Allerdings sind die aktuellen Kultur-Systeme entweder unzureichend oder von Natur aus variabel, die verschiedene Feeder und Feeder-freien Kulturen hPSCs als Kolonien 5,6.
Colony-Typ-Wachstum von hPSCs teilt viele Strukturmerkmale der inneren Zellmasse (ICM) der frühen Säugetierembryos. Das ICM ist anfällig für in die drei Keimblätter zu differenzierenin einem multizellulären Umgebung, weil die Existenz von heterogenen Signalverläufe. So wird die Übernahme von Heterogenität in der frühen embryonalen Entwicklung als eine erforderliche Verfahren zur Differenzierung betrachtet, aber eine unerwünschte Eigenschaft hpSC Kultur. Die Heterogenität in hpSC Kultur wird oft durch übermäßige apoptotische Signale und spontane Differenzierung aufgrund suboptimaler Wachstumsbedingungen induziert. Somit wird in Kolonie-Typ-Kultur, die heterogenen Zellen werden oft in der Peripherie der Kolonien 7,8 beobachtet. Es hat sich auch gezeigt, dass die Zellen in menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Kolonien zeigen Differential Antworten auf Signalmoleküle wie BMP-4-9. Darüber hinaus Kolonie Kulturmethoden produzieren geringe Zellausbeuten als auch sehr niedrige Zellgewinnungsraten von Kryokonservierung aufgrund unkontrollierbarer Wachstumsraten und apoptotische Signalwege 6,9. In den letzten Jahren sind verschiedene Suspensionskulturen zur Züchtung hPSCs entwickelt, particulArly für die Expansion von großen Mengen von hPSCs in Feeder-und Matrix-freien Bedingungen 6,10-13. Offensichtlich haben unterschiedliche Kultursysteme ihre eigenen Vorteile und Nachteile. Im Allgemeinen ist die Heterogenität der hPSCs stellt eine der wichtigsten Nachteile in Kolonie-Typ und aggregierte Kulturverfahren, die optimal für die Bereitstellung von DNA-und RNA-Materialien in hPSCs Gentechnik 6 sind.
Klar, es ist eine zwingende Notwendigkeit, neue Systeme, die einige Mängel der derzeitigen Kulturmethoden zu umgehen, zu entwickeln. Die Entdeckungen der niedermolekularen Inhibitoren (wie der ROCK-Inhibitor Y-27632 und JAK-Inhibitor 1), die Einzelzellüberleben verbessern ebnen den Weg für dissoziiert-hpSC Kultur 14,15. Mit der Verwendung dieser kleinen Moleküle, haben wir vor kurzem ein Kulturverfahren auf der Basis nicht-Kolonietyp (NCM) Wachstum von dissoziierten hPSCs 9. Diese neue Kulturverfahren kombiniert die beiden Single-Cell-Passage und High-Density-Plating Verfahren, so dass wir große Mengen von homogenen hPSCs unter konsistenten Wachstumszyklen ohne große Chromosomenanomalien 9 zu produzieren. Alternativ könnte NCM Kultur mit verschiedenen kleinen Molekülen und definierten Matrizen (wie Laminin), um das Kulturverfahren für breite Anwendungen zu optimieren implementiert werden. Hier auf der Basis NCM Kultur, präsentieren wir mehrere detaillierte Protokolle und abzugrenzen detaillierte Verfahren für die Gentechnik. Um die Vielseitigkeit der NCM-Protokolle zeigen, testeten wir auch NCM Kultur mit vielfältigen ROCK-Hemmer und mit der Single Laminin-Isoform 521 (dh, LN-521).
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Protocol
Einzelzell-basierte nicht-Kolonie Typ Monoschicht (NCM) Kultur der hPSCs.
1. Vorbereitungen
- Machen 500 ml Medium für die Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF): DMEM-Medium mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) ergänzt.
- Isolieren embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF-Zellen) aus dem CF1-Stamm nach einer Routine-Protokoll 16 und Kultur MEFs auf 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Zellkulturplatte in DMEM-Medium abgeleitet. Alternativ kaufen MEF Aktien bei Passage 3 von kommerziellen Ressourcen.
- Bereiten Matrigel Platten.
- Verdünnen Sie 5 ml hESC qualifizierte Matrigel Lager mit 5 ml DMEM/F12-Medium (bei ~ 4 ° C gekühlt) und speichern 50% Aliquots in einem -20 ° C Gefrierschrank. Tauen Sie das gefrorene Matrigel Lager im Kühlschrank (ca. 4 ° C) O / N und weiter zu verdünnen das Matrigel in kaltem DMEM/F12-Medium (bis zu einer Arbeitskonzentration von 2,5% zu geben).
- Entfernen Sie die Matrigel Platte aus dem Kühlschrank, damit die Platte bei RT in der Zellkultur Haube für 10 bis 30 min (Anmerkung: nicht die Platte in einem Zellkulturbrutschrank nicht warm) zu wärmen, und saugen DMEM Medium vor hPSCs Beschichtung.
- Machen 500 ml HES-Medium: 80% DMEM/F12 Medium, 20% KSR, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 mM β-Mercaptoethanol und 4 ng / ml FGF-2.
- Bereiten Sie 10 ml 2X hpSC Gefriermedium: 60% FBS, 20% DMSO und 20 uM Y-27632 in mTeSR1 Medium, durch Filtration sterilisieren und nutzen das Medium innerhalb 1 Woche.
. 2 Protokoll Nr. 1 (Basic): Wachsen hpSC Kolonien auf Feeders
- Verwenden MEF Passage Zahlen bei 5 oder 6 (als P5 und P6 bezeichnet) für hpSC Kultur, um eine einheitliche Resul bekomments. Mitotisch inaktiviert MEFs durch Behandlung der Zellen mit 10 ug / ml Mitomycin C für 3 h bei 37 ° C, wäscht die Zellen 3x mit 1X Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) und dann dissoziieren MEFs mit 0,05% Trypsin in 0,53 mM EDTA. Alternativ bestrahlen MEFs in einer Dosis von 8000 rad mit einer Röntgenbestrahlungsvorrichtung.
- Graf Zellzahlen mit Hilfe der Trypanblau-Ausschlussverfahrens Fleck unter dem Mikroskop. Alternativ können Sie eine automatische Zellzähler.
- Platte bestrahlten MEFs auf 6-Well-Polystyrol-Platten mit 0,1% Gelatine in einer Dichte von 1,88 x 10 5 Zellen pro Vertiefung (dh 1,96 × 10 4 Zellen / cm 2) beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 24 Stunden.
- Entfernen Sie die MEF Kulturmedium durch Aspiration mit einer Pasteur-Pipette (Hinweis: keine Waschschritte in dieser Zeit nötig).
- Man reibt hpSC Kolonien aus früheren Kultur in kleine Klumpen, untersuchen Sie die Klumpen unter dem Mikroskop auf ihre Größen, die fr gewährleistenom 50 bis 100 &mgr; m Durchmesser, und die Platte hpSC Klumpen auf der Oberseite der MEF-Feeder-Schichten in einem Well mit 2 ml hpSC Medium.
- Ändern hESC Medium täglich für 3 bis 5 Tage, Koloniewachstumsrekord von Fotografie, markieren Sie alle morphologisch veränderten oder differenzierte Kolonien (~ 5%), und von Hand mit einer Pasteurpipette entfernen Sie die markierten Kolonien durch vorsichtiges Absaugen.
- Spülen der verbleibenden Kolonien auf MEFs zweimal (jeweils mit D-PBS 2 min), und Inkubieren der Kolonien mit 2 ml 1 mg / ml Collagenase IV in hpSC Medium für 10 bis 30 min), und prüft die Ablösung hpSC Kolonien aus der MEF-beschichteten Oberfläche (Hinweis: Verwenden Sie einen Schaber, um die Ablöseprozess helfen nur dann, wenn die Kolonien dicht an der Platte befestigt).
- 5 ml hpSC Medium zu jeder Vertiefung zur enzymatischen Reaktionen Übertragungs Kolonien auf 15 ml-Röhrchen zu minimieren, damit hpSC Kolonien für 3 bis 5 min bei RT sedimentiert und stellen die Sedimentation von Kolonien durch direkte Visualisierung des cEllen an der Unterseite des Rohres (Anmerkung: nicht die Rohrzentrifuge bei diesem Schritt).
- Entfernen Sie die Überstände, Rest MEFs und Einzelzellen dissoziiert, suspendieren die Kolonien mit 5 ml Medium hESC und zweimal wiederholen Sie den Schritt Sedimentation.
- Entfernen Sie die mittlere, verreiben hpSC Kolonien in kleine Klumpen, lagern in 1X hpSC Gefriermedium (oder CryoStore CS10 Einfrieren mittel) für die Kryokonservierung (1 konfluenten gut gefroren pro Flasche) oder Platte auf einem 6-Well-Platte für Zell Passagieren.
3 Protokoll Nr. 2:. Konvertieren hpSC Kolonien von Futtertröge zu NCM
- Spülen hpSC Pellets in D-PBS einmal brüten die Pellets mit 1 ml 1X Accutase für 10 min, und untersuchen die enzymatische Reaktion unter einem Mikroskop auf Einzelzell Dissoziation zu gewährleisten.
- Enden die enzymatischen Reaktionen durch vorsichtiges Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium mit 10 mTeSR1 uM Y-27632, gefolgt von Zentrifugation bei 200 · g bei RT für 5 min(Beachten Sie, verwenden Sie keine übermäßige Zentrifugation Kräfte, die Zellschäden verursachen.)
- 5 ml mTeSR1 Medium zu dem Pellet, das Pellet als Einzelzellen und Filter dissoziierten Zellen durch ein 40 &mgr; m Zellsieb (um restliche Zellaggregate zu entfernen).
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs in ein gut (1,4 bis 2,1 x 10 5 Zellen / cm 2) einer 6-well-Platte mit 2,5% hESC qualifizierte Matrigel beschichtet, fügen mTeSR1 Medium bis zu 2,5 ml, und beinhalten 10 uM Y-27632 im Medium (die ersten 24 h Einzelzell-Beschichtung zu erleichtern). Alternativ nutzen Sie die folgenden kleinen Molekülen bis 10 uM Y-27632 für die Verbesserung Single-Cell-Beschichtung ersetzen: 1 uM Y-39983 (ROCK I-Inhibitor), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II-Inhibitor), 1 uM thiazovivin (ein Roman ROCK-Inhibitor) und 2 uM JAK-Inhibitor ein.
- Ersetzen Sie das Medium mit drogenfreie mTeSR1 Medium am nächsten Tag (innerhalb von 24 Stunden), distanzieren Zellen von einem zusätzlichengut, und zählen die Zellzahl auf Einzelzell Plattierungseffizienz bestimmen (Anmerkung: etwa 50 bis 90% der Single-Cell-Beschichtung Effizienz, die in dieser Phase erzielt werden kann).
- Lassen Sie die Zellen als Einzelzellen-Monoschicht gebildet wird für ein paar Tage mit 3 ml mTeSR1 Medium wachsen. Ändern Medium täglich.
- Empirisch bestimmen den Zeitpunkt einer Passage angepasst NCM in Abhängigkeit von der Zelldichte. Passage, wenn das Zellwachstum erreicht Zusammenfluss am Tag 3 oder Tag 4 oder im 4 h Zeitpunkt nach dem Verschwinden der Zell-zu-Zell-Grenzen. Distanzieren, die Zellen in 1 ml Accutase, verwenden Sie einen 1 bis 3 Teilungsverhältnis (dh 1 konfluenten gut von Zellen in drei Vertiefungen der 6-Well-Platte plattiert) für Passagieren von Zellen und stabilisieren angepasst NCM von 5 Passagen.
- Handy Einfrieren
- Nutzen Sie ein gut zusammenfließenden (~ 6.5 x10 6 Zellen) für einen Tiefkühlflasche: distanzieren Zellen von einem konfluenten gut mit 1 ml Accutase für 10 min.
- Verdünnen Sie with 5 ml Medium und mTeSR1 Zentrifuge Zellen wie oben beschrieben.
- Resuspendieren des Pellets in 500 ul Medium mTeSR1 und dann langsam in einem Kryokonservierungsfläschchen fügen 500 ul 2X hpSC Gefriermedium (enthaltend 20 &mgr; M Y-27632). Alternativ Resuspendieren der Zellen in 1X hpSC Gefriermedium, das 2 &mgr; M JAK-Inhibitor 1 oder 1X CryoStor CS10 Medium in Gegenwart von entweder 10 &mgr; M oder Y-27632 2 uM JAK-Inhibitor 1.
- Zeigen Fläschchen eingefroren in einem Eis-gekühltes Kryobehälter (mit isopranol Bottom-gefüllt) und übertragen die Kryobehälter zu einer -80 ° C-Gefrierschrank sofort.
- Übertragungszellen von dem -80 ° C Gefrierschrank in einem Flüssigstickstofftank (am nächsten Tag) für die Langzeit Kryokonservierung.
- Handy Auftauen
- Nutzen Sie ein Kryokonservierungsfläschchen für die Beschichtung ein Well einer 6-Well-Platte.
- Vorwärmen mTeSR1 Medium in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten auftauen Zellen in der gleichen Wasserbad für 2 min,tropfenweise in den Zellen 5 ml vorgewärmten mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632 und Zentrifuge wie oben beschrieben.
- Vorsichtig resuspendieren Zellpellets mit 2 ml mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632 und langsam Zellen übertragen, um mit einem gut vorge Matrigel-beschichtete (Hinweis: die Herstellung von Luftblasen zu vermeiden).
- Ändern Medium täglich und erwarten hpSC Wachstum Zusammenfluss am Tag 3 oder 4 erreichen.
4 des Protokolls Nr. 3:. Konvertieren hpSC Kolonien auf Matrigel zu NCM Kultur
- Entfernen einer Matrigel-beschichtete Platte aus dem Kühlschrank wird die Platte in der Gewebekultur Haube für 10 bis 30 Minuten, entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung der Platte, und 2 ml vorgewärmten Medium mTeSR1 in jede Vertiefung.
- Über verrieben hpSC Klumpen aus dem Einzug Kultur (Schritt 2.10 der Grund-Protokoll) zu dem oben Matrigel Platte. In mTeSR1 Medium bis zu 2,5 ml Endvolumen in jeder Vertiefung.
- Medium täglich ändern TAG 3 BIS 4s bis Kolonien erreichen 80 bis 90% Konfluenz.
- Für Passagieren von Zellen: zweimal spülen Sie die Kolonien mit D-PBS, Behandlung der Zellen mit 1 ml 2 mg / ml Dispase bei 37 ° C für 15 bis 20 min und Sediment-und Durchgangszellen als Klumpen.
- Für NCM Kultur: wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,9 in Protokoll Nr. 2 beschrieben.
5 Protokoll Nr. 4:. NCM Kultur hPSCs auf LN-521
- Auftauen des rekombinanten LN-521-Lösung bei 4 ° C vor dem Tag der Anwendung und machen die Laminin-Beschichtungslösung (LCS) durch Verdünnen der aufgetauten Laminin mit 1X D-PBS (das Ca 2 + / Mg 2 +), um eine Endkonzentration von 10 ug / ml.
- 1 ml der LCS einer Mulde in 6-Well-Platte (Anmerkung: ein Austrocknen während der Beschichtung zu vermeiden).
- Verschließen Sie die Platte mit Parafilm überzogen, um Verdunstung zu vermeiden, und die Platte im Kühlschrank (4 ° C) O / N (Anmerkung: Verwenden Sie die Platte innerhalb von 1 Woche).
- Die LCS mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig entfernen, ohne zuuching der beschichteten Oberfläche und 2 ml mTeSR1 mittel-bis gut ein.
- Warm alle Kulturlösungen (einschließlich D-PBS) in einem 37 ° C Wasserbad für 25 min.
- Konvertieren hpSC Kolonien NCM
- Distanzieren Zellaggregate auf einzelne Zellen mit Accutase in Protokoll 2 beschrieben.
- Samen 1.3-2 x 10 6 hPSCs in einem gut LN-521 beschichtete (1,4-2,1 × 10 5 Zellen / cm 2) ohne die Anwesenheit von ROCK-Inhibitoren.
- Änderungsmedium täglich für 3 bis 4 Tage.
- Dissoziation der Zellen in 1 ml Accutase am Tag 3 oder 4 für die nächste Zelle Passagierung mit einem 1 bis 3 Teilungsverhältnis.
. 6 Protokoll 5: NCM Kultur für Plasmid-DNA Transfektion
- Passen hpSC Kolonien NCM Kultur als in den Protokollen 2 bis 4 beschrieben.
- Platte dissoziiert hPSCs in 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 7,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in mTeSR1 Medium in Gegenwart von 10 &mgr; M Y-27632.
- Ersetzen mTeSR1 Medium mit drogenfreie mTeSR1 Medium zwischen 4-8 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen.
- Für jede Transfektion verdünnen 2,5 ug Expressionsplasmide (zB pmaxGFP) und 5 ul Lipofectamine 2000 in getrennten Eppendorf-Röhrchen in jedem Opti-MEM 125 ul Reduzierte Serum Medium.
- Nach 5 min, mischen Sie die Reagenzien verdünnt und Inkubation für 20 min bei RT (der Transfektion Komplexe zu bilden).
- Fügen 250 ul Transfektion Komplexe jede Vertiefung hPSCs in 1 ml mTeSR1 Medium und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem CO 2-Inkubator für 24 Stunden.
- Prüft die Transfektionseffizienz unter einem Fluoreszenzmikroskop und fotografieren zufällig für die Berechnung der tatsächlichen Transfektionseffizienz.
. 7 des Protokolls Nr. 6: NCM für Kultur Transfektion von MicroRNAs
- Distanzieren halbkonfluente hPSCs am Tag 2 unter NCM Bedingungen durch Zugabe von 1 ml pro Vertiefung in Accutase 6 -Well-Platte.
- 10 ml mTeSR1 mittel-bis enzymatischen Reaktionen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min zu verdünnen.
- Zellpellet mit mTeSR1 Medium, Samen, die Zellen in einer Dichte von 7,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte in mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632, und lassen die Zellen legen für 4 Stunden.
- Ersetzen Sie das Medium mit Y27632 frei mTeSR1 Medium.
- Verwenden Sie handelsübliche Micro-RNAs (zB eine nicht-Targeting miRIDIAN miRNA-Transfektion Control mit Dy547 beschriftet). Titriert Konzentrationen im Bereich von 0 bis 160 nM mit den mitgelieferten Reagenzien und folgen Sie den Anweisungen der Hersteller.
- Optimieren Transfektionseffizienz für jede Konzentration in hpSC Linien durch Abbildung der Dy547 Fluoreszenz der lebenden Zellen unter dem Mikroskop bei 24 Stunden nach der Transfektion.
- Berechnen Sie die Transfektionseffizienzen basiert auf dem Prozentsatz der positiven Zellen Dy547 über alle Zellen abgebildet.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.4 des Protokolls Nr. 6.
- Berechnen Sie die Mengen an Viruspartikeln für Übertragung verwendet werden: Verwenden Sie die folgende Formel ein: = TU (MOI x CN) / VT, während TU bezeichnet die Gesamtzahl der Umwandlung Einheiten entspricht MOI die gewünschte Vielfalt der Infektion in der gut (MOI oder TU / Zelle), CN gibt die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung und VT-Lager zeigt virale Titer (TU / ml). Zum Beispiel gegeben, dass die Aktien virale Titer für SMART-shRNA Vektors gleich 1 x 10 9 TU / ml (Umwandlung Einheiten pro ml), 7,5 x 10 5 Zellen pro Vertiefung bei der Transduktion, und einer erwarteten MOI von 20: 15 zu verwenden ul der Aktienviruspartikel für jeden gut (Anmerkung: Diese Bedingung ist für transiente lentiviralen Induktion empfohlen).
- Vorwärmen mTeSR1 300 ul Medium mit 10 mg / ml Polybrene für 30 min.
- In 15 ul Lager Viruspartikel indie vorgewärmten Medium mit mTeSR1 Polybren und vorsichtig die Lösung.
- Ersetzen des Zellkulturmedium mit 300 &mgr; l vorgewärmtem Medium, das die Viruspartikel enthält.
- Nach 4 Stunden Inkubation untersuchen turboGFP Fluoreszenz (ein Hersteller für shRNA-Expression) um die Übertragungseffizienz zu bestimmen.
- In 300 ul zusätzlicher mTeSR1 Medium auf die Wandler gut, wenn die Zellen beginnen, turboGFP auszudrücken.
- Nach 12-16 h Inkubation denken Turbo-GFP-Expression.
- Führen gewünschten Follow-up-Experimente mit diesen transduzierten Zellen innerhalb von 72 Stunden.
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Representative Results
Ein allgemeines Schema der NCM Kultur
Abbildung 1 zeigt eine typische NCM Kultur-Schema, das die dynamischen Änderungen der hPSCs nach der High-Density-Single-Cell-Beschichtung in der Gegenwart des ROCK-Inhibitor Y-27632. Diese morphologischen Änderungen sind interzellulären Verbindungen nach der Plattierung, Zellcluster Bildung und exponentiellen Zellwachstums, gefolgt von Kondensation Zelle (1A). Ein repräsentatives Experiment zeigt WA01 (H1) hESCs, als Einzelzellen in einer Dichte von 1,9 x 10 5 Zellen / cm 2 in Gegenwart von 10 &mgr; M Y-27632 am Tag 1 beschichtet (Fig. 1B linken Seite), ohne weiteres ausgebreitet die Bildung von Kolonien (1B, mittleres Feld) an Tag 2 und als homogene Monoschicht, die sich zur gewünschten Experimente oder Passagieren von Zellen am Tag 3 (1B, rechte Tafel) kondensiert.
<strong> Verschiedene ROCK-Inhibitoren unterstützt NCM Kultur
Ein 96-Well-Platten-Assay wurde für Proof-of-Konzept der Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening verwendet. Es wurde auch entwickelt, um die Verwendung verschiedener Inhibitoren ROCK NCM Kultur unterstützen optimieren. Etwa, dissoziiert 31.000 SCU-i10-Zellen, humane induzierte pluripotente Zellen (hiPSCs) 17, wurden auf einem plattierten Matrigel-beschichteten auch in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen von ROCK-Inhibitoren. Nach 24 Stunden wurden die Zellen auf die CCK-8-basierte Überlebens-Assay unterzogen, um das Überleben der Zellen unter diesen Bedingungen zu bestimmen. Wir haben zuvor gezeigt, dass die NCM Verfahren erfordert die Verwendung des ROCK-Inhibitor, Y-27632, bei 10 &mgr; M zu Einzelzell-Plattierung zu verbessern. In diesem Bericht bestätigt, dass wir 10 uM Y-27632 24-Stunden-Einzelzellen-Beschichtung Effizienz hiPSCs (P <0,05) (Abbildung 2) deutlich zu erhöhen. Wir fanden auch, dass Y-39983 (ROCK I-Inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II Inhibitorentor) und thiazovivin (ein Roman ROCK-Inhibitor) deutlich modulieren Einzelzell Plattierungseffizienz und zu fördern NCM Wachstum bei 1 uM wenn sie mit ihren Kontrollen (P <0,05) (Abbildung 2) verglichen. Darüber hinaus wurden die Auswirkungen der drei ROCK-Inhibitoren (1 &mgr; M) auf Einzelzell Plattierungseffizienz bei 10 &mgr; M (P> 0,05) (Fig. 2) vergleichbar mit der von Y-27632. Bemerkenswert ist, das ROCK I-Inhibitor (bei 5 uM) scheint ausgesprochen Zytotoxizität im Vergleich mit dem Medikament bei 1 uM (P <0,05) zeigen, implizieren eine spezifische Wechselwirkung als andere Moleküle. Somit können verschiedene ROCK-Inhibitoren für die Unterstützung NCM Kultur in der Zukunft genutzt werden. Jedoch würde eine vollständige Charakterisierung von HES und hiPSCs unter NCM mit diesen neuen Inhibitoren für die zukünftige Verwendung erforderlich.
LN-521 unterstützt NCM Kultur ohne die Verwendung von ROCK-Inhibitoren
Um festzustellen, ter Rolle eines spezifischen Laminin-Isoform in der Unterstützung hESC Wachstum, kultiviert wir SCU-i30 hiPSCs auf LN-521-beschichteten Platten in der Xeno-freien Medium TeSR2. Interessanterweise allein LN-521, ohne die Anwesenheit von ROCK-Inhibitoren, unterstützt Einzelzell Beschichtung und anschließende NCM Wachstum für 15 Passagen in diesem Zustand (Fig. 3). Immunfärbung von SCU-i30-Zellen mit einem anti-NANOG polyklonalen Antikörpers zeigte, daß die Zellen unter diesen Bedingungen hatte hohe NANOG Expression in den Zellkernen (Fig. 3A). Durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die HES-Marker-Expressionsprofil war ähnlich den Zellen als NCM mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 (3B) gewachsen.
Hoher Wirkungsgrad von microRNA Lieferung ohne die Verwendung von lentiviralen Partikel
Transfektion mit Dy547-markierten Oligonukleotid microRNAs wurde in WA01 (H1)-Zellen unter NCM Bedingungen durchgeführt. WA01 hESCs wurden als NCM auf gewachsen 2,5% Matrigel in mTeSR1 2 (Fig. 4A) und 18 (Fig. 4B) Durchgänge sind. Diese Zellen zeigten eine hohe Transfektionseffizienz zu 24 Stunden nach der Transfektion (4A und 4B). Im Allgemeinen können wir Transfektionseffizienz bis zu 91% in hESCs bei 24 Stunden nach der Transfektion zu erhalten.
Abbildung 1. (A) Schema der NCM Kultur. Das Liniendiagramm umreißt die dynamischen Änderungen der vielzelligen Verband in einer typischen 3-Tages-Kultur unter NCM Bedingungen. (B) Repräsentative Phasenbilder der WA01 (H1) hESCs unter einer Bedingung NCM auf 2,5% Matrigel in mTeSR1 Medium für 16 Passagen propagiert (bezeichnet als WA01, mcp16). Die untere Platte ist die vergrßerte Ansicht der oberen Platte. Maßstabsbalken zeigen 100 um.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Einzel-Zell-Überlebenstests unter Verwendung einer 96-Well-Format. Ungefähr 31.000 SCU-i10 hiPSCs 17 wurden auf 2,5% Matrigel in Gegenwart von verschiedenen niedermolekularen Inhibitoren Rho-assoziierten Kinase (ROCK) Wege zum angegebenen Konzentrationen bezogen vernickelt . Nach 24 Stunden wurden die Zellen auf die CCK-8-Überlebens-Assay durch Messung der Absorption bei 450 nm (A450) unterzogen. Der Student t-Test wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die Unterschiede in der Einzelzelle Platierungseffizienz zwischen verschiedenen ROCK-Inhibitoren der statistischen Signifikanz. Die einzigartige Stern-Zeichen (*) zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Inhibitoren (P & #62; 0,05), wohingegen die Doppelsternchenzeichen (**) den beobachteten Unterschied ist statistisch signifikant (P <0,05). Spalten der Histogramme bezeichnen die Mittelwerte der vier Determinanten und Balken stellen Standardabweichungen.
Abbildung 3. NCM Kultur der hiPSCs auf Laminin-521 (LN-521), ohne die Anwesenheit von ROCK-Inhibitoren. Die SCU-i30 hiPSC Linie wurde am NIH etablierten Stammzelleinheit. SCU-i30 Zellen wurden auf LN-521-beschichteten 6-Well-Platten im Xeno-freies Medium TeSR2 15 Passagen ohne den Einsatz von niedermolekularen Inhibitoren wie Steininhibitoren geworden. (A) Immunfärbung von SCU-i30-Zellen mit einem Anti -NANOG polyklonalen Antikörper und mit Hoechst 33342 (Hoechst) gegengefärbt. Bemerkenswert ist, sind einige Zellen, die eine negative Färbung NANOG the-Zellen unter Mitose. (B) Durchflusszytometrische Analyse von hpSC Markerexpression in SCU-i30-Zellen als NCM auf 2,5% gewachsen Matrigel mit dem Einsatz von 10 uM Y-27632 (Oberplatte) oder NCM auf LN-521 ohne Y-27632 (unteres Bild). Die Verfahren für die beiden Immunfärbung und Durchflusszytometrie wurden bisher 5 beschrieben. Maßstabsbalken zeigen 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. NCM Kultur hPSCs für microRNA Transfektion. WA01 HES als NCM auf 2,5% Matrigel mTeSR1 in 2 (A) gezüchtet und 18 (B) Durchgänge sind. Repräsentative Phase und Fluoreszenzbilder von Zellen mit WA01 Dy transfiziert547-markierten Kontroll microRNAs für die Überwachung der Transfektionseffizienz bei 24 Stunden nach der Transfektion. Maßstabsbalken repräsentieren 100 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Es gibt zwei große Möglichkeiten, um in vitro Kultur hPSCs: konventionelle Kolonie-Art-Kultur (von Zellen auf Feeder oder extrazelluläre Matrix) und Suspensionskultur von hPSCs als Aggregate ohne Zubringer 6. Die Grenzen der beiden Kolonie-Typ-und Suspensionskultur Methoden gehören sammelt Heterogenität und vererbbaren epigenetischen Veränderungen. NCM Kultur, basierend sowohl auf Einzelzell Passagieren und High-Density-Zelle Überzug, stellt eine neue Methode zur Kultur hpSC Wachstum 6,18. Obwohl verschiedene Einzelzell Passagierung Methoden sind in der Literatur dokumentiert worden, aber keiner von ihnen sind für die routinemäßige Ausbreitung verwendet. Zum Beispiel, Wu und Kollegen verwendeten ein Single-Cell-Passage Methode, um die Auswirkungen von verschiedenen kleinen Molekülen Cocktails auf hpSC Wachstum 19 studieren. Aber ihre endgültige Kulturprodukte sind Kolonien. Also, Low-Density-basierte Single-Cell-Passage Methoden noch Kolonie-Typ-Kultur gehören. In Bezug auf NCM Kultur, High-Denskeit Beschichtung wandelt diese Kultur auf eine neue Methode, da die endgültige Zellprodukt eine homogene Monoschicht. Kürzlich, Dvorak und Kollegen verwendeten ähnliches Verfahren zu hpSC Eigenschaften im Rahmen dieses Wachstumsbedingung 18 umfassend zu analysieren. Ihre Ergebnisse unterstützen unsere wichtigsten Schlussfolgerungen. Es ist nun klar, dass NCM Kultur ist eine aufstrebende Methode, die einige neue Eigenschaften besitzt und kann weiter für viele potentielle Anwendungen in pluripotenten Stammzellbiologie geändert werden.
Grundlegende Eigenschaften von hPSCs von NCM Kultur
Es ist denkbar, dass hPSCs unter NCM Kultur teilen viele Eigenschaften mit den gleichen Arten von Zellen als Kolonien 9,18 gewachsen. Die Expression von hES-Marker in hPSCs, die Oct-4, Nanog, SSEA-3/4, TRA-1-60 Tra-1-81, und SSEA-1, sind in beiden NCM und Kolonie-Typ-Kultur . NCM-adaptierten Zellen ähnliche globale mRNA-Expressionsmuster zu hpSC Kolonien auf M gewachsen behalten auchEF Feeder-Schichten 9. Klar, NCM-adaptierten Zellen nachhaltig die pluripotenten Zustand, wie durch Teratom Assay 9,18 bestimmt. Doch im Gegensatz zu hpSC Kolonien, NCM-Zellen unter Bedingungen einen vorhersagbaren Wachstumsrate, die durch eine konsequente Wachstumskurven, Zellzyklus und Zellzahlen 9 gekennzeichnet ist. Aufgrund der Einzelzell-Plattierung mit hoher Dichte, hPSCs unter Bedingungen NCM zeigen exponentielles Wachstum zwischen den Tagen 2 und 4 (Fig. 1B), wodurch die Zellzahl um 4-fach verglichen mit hpSC Kolonien auf MEFs gewachsen. Längerer Kultur nicht erhöht, die Zellproduktion, sondern erhöht die Apoptose und Differenzierung Stress 9. NCM ermöglicht auch optimale Kryokonservierung, so dass eine schnelle Erholung der Zellen auf Beschichtung aufgetauten Zellen (Protokoll 1). Darüber hinaus NCM erleichtert die Anpassung an verschiedene hpSC Kultur Xeno-kostenlos-Protokolle 9. Im Allgemeinen unterstützt das Wachstum von NCM hPSCs, hält den pluripotenten Zustand, und erhält die potenTiAl von hPSCs in adulten Geweben der drei Keimblätter zu differenzieren.
Chromosomale Stabilität in hPSCs unter NCM
Hinsichtlich der Chromosomenstabilität, kein direkter Vergleich zwischen den Zellen von verschiedenen Kulturverfahren. Die Mehrheit der hPSCs unter unserem NCM Kulturbedingungen haben normale Karyotypen und Gen-Kopienzahlen wie von G-Banding, Array-basierte komparative genomische Hybridisierung (aCGH) und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) 9 bestimmt. Zwei Leitungen (~ 13%) zeigten abnormale Karyotypen, in dem eine Leitung (dh, WA09) zeigten erhöhte Polyploidie und eine weitere (ES01) hatten 14% der Zellen mit Trisomie 20 9. Es ist unklar, ob diese abnormalen Karyotypen wurden aus der abgeleiteten Auswahl der bereits vorhandenen mutierten Zellen vor der NCM Kultur oder während NCM Anpassung induziert. Es ist wichtig, daß die Ausgangsmenge hpSC Kolonien oder von Kolonien für NCM Kultur verwendet shOuld an der Zeit für die Anpassung NCM sein gut charakterisiert in ihrer Homogenität und chromosomale Stabilität. Bemerkenswert ist, ist die Rate der abnormen Karyotyp unter NCM Bedingungen viel geringer als die in einer aktuellen Kohortenanalyse, in der die Autoren zeigen, 34% abnorme Karyotypen unter vorherrschenden Kolonie-Typ-Kulturbedingungen 20 berichtet. Daher unsere Studie zeigt, dass wir dissoziierte Einzelzellen wachsen und pflegen ihre chromosomale Stabilität unter NCM Bedingungen. Dennoch müssen wir auch empfindlicher Methoden verwenden, um Chromosomenanomalien von hPSCs in den kommenden Jahren zu untersuchen. Insbesondere müssen wir die Chromosomen 1, 12, 17 und 20 mit einer höheren Auflösung zu scannen Sonden (dh <50 kb), wie einige kleinere Läsionen (zB die 20q11.21 Amplikon) bei diesen häufig geändert Chromosomen können durch herkömmliche erkannt werden Karyotypisierung und FISH 20-22. Darüber hinaus würde die Entwicklung diverser Protokolle NCM uns ermöglichen, robu identifizierenst und sichere Methoden für zukünftige Anwendungen.
NCM Kultur unter verschiedenen Modifikationen
Die Verwendung des ROCK-Inhibitor, Y-27632, hat die Tür für Einzelzellen-basierte Assays eröffnet. Die Verfügbarkeit der verschiedenen ROCK-Inhibitoren würde zusätzliche Möglichkeiten für NCM-basierte Erweiterung und Kryokonservierung von hPSCs (Abbildung 2) zu liefern. In der Theorie, jede kleine Molekül, das Single-Cell-Beschichtung die Effizienz deutlich zu erhöhen, können verwendet werden, um NCM Kultur zu erleichtern. JAK-Inhibitor 1, die Funktionen unterschiedlich von jenen ROCK-Hemmer, stellt ein solches Beispiel 9. Die Verwendung von einzelnen Molekülen oder kombinatorische Ansätze können uns eine optimale Zellwachstum, Zellassays und Kryokonservierung von hPSCs. Jedoch können alternative NCM Kultur hPSCs auf definierten extrazellulären Matrixproteine wie Laminin Isoform LN-521, die normalerweise in hESCs 23-25 ausgedrückt, die Störungen der kleinen beseitigenMoleküle (Abbildung 3). LN-521 könnte dissoziierten hpSC Überleben zu verbessern und erhält Pluripotenz durch die Aktivierung des α6β1-PI3K/AKT Wegs 24. Die Einfachheit der Passage hPSCs mit LN-521 reduziert die Heterogenität der Zellen mit verschiedenen Feeder-frei und Xeno-freien Zellkultursystemen mit vollständig definierten Mediums (Protokoll Nr. 4) kompatibel. Es bietet auch ein Zusatzmodul für Hochdurchsatz-Assays ohne den Einfluss von kleinen Molekülen. Obwohl die iPS-Zellen unter NCM Kultur auf LN-521 behielt die Expression einer Reihe von hpSC Marker, die weitere Charakterisierung dieser Zellen mit Teratom Assay und Embryoidkörper-vermittelte multilineage Differenzierung kann notwendig sein, um die pluripotenten Zustände in diesen Zellen zu bestätigen. Zu beachten ist, kultiviert hiPSCs auf der Laminin-Isoform LN-521 sind angeblich zytogenetisch stabil (http://biolamina.com/). Allerdings müssen wir auch mit höherer Auflösung und empfindliche Methoden anwenden (wie oben erörtert) bis eXamine die chromosomale Stabilität in diesen Zellen.
Vielseitigkeit von NCM Kultur für Gentechnik
NCM-basierte Verfahren stellen eine einfache, robuste und wirtschaftliche System, das besonders nützlich zur genetischen Manipulation von hPSCs (Protokolle 5-7) sein kann. Es ist bekannt, dass hES-Kolonien sind schwer zu transfizieren oder transduzieren, mit großer Variabilität bei der Transfektion / Transduktionseffizienzen zwischen verschiedenen Laboratorien 26-28. Zum Beispiel Transfektionseffizienz in hESCs Bereich von 3 bis unter Kolonie Kulturbedingungen 26 35%. Lentiviralen Transduktion Signale in BG01 Zellen unter Bedingungen Kolonie gefunden wurden extrem niedrige 9 sein. Allerdings war die Transfektionseffizienz durch NCM vermittelt mehr als 75% 9 und Änderung der Übertragungsmethoden können Lentiviren-vermittelte Transduktion Wirkungsgrad bis 90% 28 zu erhöhen. Eine enge Vergleichsstudie hat gezeigt, dass es thE vielzelligen Verbänden in hESC Kolonien, die der geringen Transfektionseffizienz 9 bei. Darüber hinaus haben wir kürzlich eine microRNA Transfektion Protokolls modifiziert und in der Lage, hohe Transfektionseffizienz (~ 91%) ohne die Verwendung von Lentiviren (Protokoll Nr. 6 und 4) zu erreichen. Dieses Protokoll ist einfach zu bedienen und besonders nützlich für die transiente Transfektion in einem 3 - bis 5-Tage-Zeitraums. Wie wir im oben genannten Protokolle abgegrenzt, sollten mehrere Faktoren in die Überlegungen getroffen werden, wenn wir optimieren Transfektion / Transduktion in hPSCs. Diese Faktoren schließen Zelldichte Plasmid Konzentrationen lentiviralen Titer, Multiplizität der Infektion (MOI), Dauer der Transfektion / Transduktion Zytotoxizität der Reagenzien und für die Überwachung der Transfektion / Transduktion verwendeten Methoden.
Wir erarbeiten und erweitern NCM Methoden zur Kultur hPSCs auf Matrigel und auf definierten extrazellulären Matrix. Diese Kultur-Methodeist eine effiziente Möglichkeit, die Heterogenität häufig in hpSC Kolonie und aggregiert Kulturen zu beseitigen. Menschen pluripotenten Stammzellen unter NCM Wachstumsbedingungen sind pluripotent und chromosomal stabil. Diese neue Kultursystem ist einfach und vielseitig für hpSC Wartung, große Expansion und genetische Manipulationen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
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