Introduction
Kapasiteten på hPSCs å skille mot multilineage voksen vev har åpnet nye veier for å behandle pasienter som lider av alvorlige sykdommer som involverer hjerte, lever, bukspyttkjertel, og nevrologiske systemer 1-4. Ulike celletyper som stammer fra hPSCs ville også gi robuste mobilplattformer for sykdom modellering, genteknologi, narkotika screening, og toksikologiske tester 1,4. Det sentrale spørsmålet som sikrer deres fremtidige kliniske og farmakologiske applikasjoner er generering av et stort antall klinisk-grade hPSCs gjennom in vitro cellekultur. Men dagens kultur-systemer er enten utilstrekkelig eller iboende variable, som involverer ulike mater og mater frie kulturer av hPSCs som kolonier 5,6.
Koloni-type vekst av hPSCs aksjer mange strukturelle trekk ved den indre cellemasse (ICM) av tidlige pattedyr embryoer. ICM er tilbøyelige til å skille ut de tre bakterie-lagi et flercellet miljøet på grunn av eksistensen av heterogene signaloverganger. Dermed er oppkjøpet av heterogenitet i tidlig embryoutvikling anses som en nødvendig prosess for differensiering, men en uønsket funksjon i hPSC kultur. Heterogenitet i hPSC kultur er ofte forårsaket av overdreven apoptotiske signaler og spontan differensiering på grunn av suboptimale vekstforhold. Således, i koloni-type kultur, de heterogene celler er ofte observert i periferien av koloniene 7,8. Det er også vist at cellene i humane embryonale stamceller (hESC) kolonier oppviser differensielle responser til signalmolekyler som BMP-4 9. Videre koloni kultur metoder produsere lave celleutbytte samt svært lav celle utvinning fra nedfrysing skyldes ukontrollerbare vekstrater og apoptotisk signalveier 6,9. I de senere årene har ulike suspensjonskulturer er utviklet for dyrking hPSCs, spesielarly for utvidelse av store mengder hPSCs i mater-og matrisefrie forhold 6,10-13. Tydeligvis, ulike kultur-systemer har sine egne fordeler og ulemper. Generelt er den heterogene karakter av hPSCs representerer en av de store ulemper i koloni-type og aggregert kultur metoder, som er suboptimal for å levere DNA-og RNA-materiale inn hPSCs for genteknologi 6..
Klart, det er en viktig grunn til å utvikle nye systemer som omgår noen svakheter i dagens kultur metoder. Funn av små molekyl-hemmere (for eksempel ROCK inhibitor Y-27632 og JAK inhibitor 1) som forbedrer encellede overlevelse bane vei for skilt-hPSC kultur 14,15. Med bruk av disse små molekylene, har vi nylig utviklet en dyrkningsmetode basert på ikke-kolonitype (NCM) vekst av dissosierte-hPSCs 9. Denne romanen kultur metoden kombinerer både encellede aging og høy tetthetplating metoder, slik at vi kan produsere store mengder homogene hPSCs etter jevn vekst sykluser uten store kromosomavvik ni. Alternativt kan NMR kultur gjennomføres med forskjellige små molekyler og definerte matriser (f.eks laminins) for å optimalisere den dyrkningsmetode for store applikasjoner. Her presenterer vi flere detaljerte protokoller basert på NCM kultur og avgrense detaljerte prosedyrer for genteknologi. For å demonstrere allsidigheten NCM protokoller, vi også testet NCM kultur med diverse ROCK hemmere og med singelen laminin isoformen 521 (dvs., LN-521).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Encellede baserte ikke-koloni typen monolayer (NCM) kultur hPSCs.
En. Forberedelser
- Lag 500 ml medium for kultur av mus embryonale fibroblaster (MEFs): DMEM medium supplert med 10% FBS, 2 mM L-glutamin, og 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer (NEAA).
- Isoler mus embryonale fibroblaster (MEFs) celler avledet fra CF1 belastning etter en rutine protokoll 16 og kultur MEFs på 0,1% gelatin-belagt 6-brønn cellekultur plate i DMEM medium. Alternativt kjøpe MEF aksjer ved passering 3 fra kommersielle ressurser.
- Forbered matrigel plater.
- Fortynn 5 ml hESC kvalifisert Matrigel lager med 5 ml medium DMEM/F12 (kjølt til ~ 4 ° C) og lagre som 50% alikvoter i en -20 ° C fryser. Tine den frosne Matrigel lager i kjøleskap (~ 4 ° C) O / N og ytterligere fortynnes Matrigel i kaldt DMEM/F12 medium (for å gi opphav til en 2,5% arbeider konsentrasjon).
- Fjern Matrigel plate fra kjøleskapet, la maskinen varmes opp ved RT i cellekultur hette for 10 til 30 minutter (NB: ikke varme platen i en cellekultur inkubator), og aspirer DMEM medium før plating hPSCs.
- Lag 500 ml hESC medium: 80% DMEM/F12 medium, 20% KSR, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 0,1 mM β-mercaptoethanol, og 4 ng / ml FGF-2.
- Forbered 10 ml 2X hPSC iskaldt medium: 60% FBS, 20% DMSO og 20 pM Y-27632 i mTeSR1 medium, steriliser ved filtrering og bruker medium i løpet av 1 uke.
. 2 Protokoll 1 (Grunnleggende): Grow hPSC koloniene på Matere
- Bruk MEF passage tall på 5 eller 6 (utpekt som p5 og P6) for hPSC kultur for å få konsistente results. Mitotisk inaktivere MEFs ved behandling av cellene med 10 pg / ml mitomycin C i 3 timer ved 37 ° C vaskes cellene 3x med 1X Dulbeccos fosfatbuffret saltoppløsning (D-PBS), og deretter dissosiere MEFs med 0,05% Trypsin i 0,53 mM EDTA. Alternativt kan bestråle MEFs i en dose på 8000 rads med et røntgen irradiator.
- Telle celle tall ved hjelp av Trypan blå flekken utelukkelse metoden under mikroskop. Alternativt kan du bruke en automatisk celleteller.
- Plate bestrålte MEFs på 6-brønners polystyren-plater belagt med 0,1% gelatin i en tetthet på 1,88 x 10 5 celler per brønn (det vil si 1,96 x 10 4 celler / cm 2). Inkuber cellene ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
- Fjern MEF kulturmedium ved aspirasjon med en Pasteur pipette (Merk: ingen vask skritt som trengs på dette tidspunktet).
- Triturate hPSC kolonier fra forrige kultur i små klumper, undersøke klumper henhold mikroskop for å sikre sine størrelser frOM 50 til 100 mikrometer i diameter, og plate hPSC klumper på toppen av MEF næringslag i en brønn inneholdende 2 ml av hPSC medium.
- Endre hESC medium daglig i 3 til 5 dager, rekord kolonivekst av fotografi, markerer ingen morfologisk endrede eller differensierte kolonier (~ 5%), og manuelt fjerne de merkede kolonier ved forsiktig aspirasjon med en Pasteur pipette.
- Skyll de resterende kolonier på MEFs to ganger (2 min hver med D-PBS), og inkuber koloniene med 2 ml av 1 mg / ml collagenase IV i hPSC medium i 10 til 30 min), og undersøke løsgjøring av hPSC kolonier fra MEF-belagt overflate (Merk: bruke en skraper for å hjelpe til løsgjøring prosessen hvis koloniene er tett festet til platen).
- Tilsett 5 ml av hPSC medium til hver brønn for å minimalisere enzymatiske reaksjoner, overføre kolonier til et 15 ml rør, tillate hPSC kolonier å sedimentere i 3 til 5 min ved RT, og sørge for sedimentering av kolonier ved direkte visualisering av calen i bunnen av røret (Merk: ikke sentrifuger røret på dette trinn).
- Fjern supernatanten inneholdende rest MEFs og dissosiert enkeltceller, resuspender kolonier med 5 ml hESC medium og gjenta sedimente trinn to ganger.
- Fjern mediet, Triturer hPSC kolonier i små klumper, butikken i 1X hPSC frysing medium (eller CryoStore CS10 frysing medium) for nedfrysing (1 konfluent vel per frossen hetteglass) eller plate på en seks-brønns plate for celle aging.
3 Protokoll 2:. Konverter hPSC Colonies fra matere til NCM
- Skyll hPSC pellets i D-PBS en gang, inkuber pelletene med 1 ml av 1X Accutase for 10 min, og undersøke den enzymatiske reaksjon under et mikroskop for å sikre encellet dissosiasjon.
- Terminer enzymatiske reaksjoner ved forsiktig risting av cellene i 5 ml mTeSR1 medium inneholdende 10 uM Y-27632, etterfulgt av sentrifugering ved 200 x g ved RT i 5 min(Merk, ikke bruk store sentrifuge krefter som forårsaker celleskade).
- Tilsett 5 ml av mTeSR1 medium til pelleten, resuspender pelleten som enkeltceller, og filter dissosierte cellene gjennom et 40 pm celle sil (for å fjerne eventuelle gjenværende celleaggregater).
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs i en brønn (1.4 til 2.1 x 10 5 celler / cm 2) av en 6-brønns plate belagt med 2,5% hESC-kvalifisert Matrigel, legge mTeSR1 medium opp til 2,5 ml, og inkluderer 10 mikrometer Y-27632 i mediet (for å lette den innledende 24 timers encellede plating). Alternativt benytte følgende små molekyler for å erstatte 10 mikrometer Y-27632 for å styrke encellede plating: 1 mikrometer Y-39983 (ROCK jeg hemmer), 1 mikrometer phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), 1 mikrometer thiazovivin (en roman ROCK hemmer) , og to mikrometer JAK hemmer en.
- Sett på medium med stoff-fri mTeSR1 medium på neste dag (innen 24 timer), distansere celler fra ett ekstravel, og telle cellenummer for å bestemme encellede plating efficiency (Bemerk: ca, 50 til 90% av encellede pletteeffektivitet som kan oppnås ved dette stadium).
- Tillate cellene å vokse som en enkelt-celle-monosjikt dannes i noen dager med 3 ml mTeSR1 medium. Endre medium daglig.
- Empirisk bestemme tidsplan for passering innrettet NCM, avhengig av celletetthet. Passasje når cellevekst når samløpet på dag 3 eller dag 4, eller på 4 hr tidspunkt etter forsvinningen av celle-til-celle grenser. Dissosiere til cellene i 1 ml Accutase bruke en 1-3 spalteforhold (det vil si en konfluent brønn av celler belagt i tre brønner i seks-brønns plate) for celleaging, og stabilisere innrettet NCM ved 5 passeringer.
- Cell frysing
- Utnytte en konfluent brønn (~ 5-6 x10 6-celler) i en frossen ampulle: dissosiere celler fra en sammenflytende godt med 1 ml Accutase i 10 min.
- Fortynne wed 5 ml mTeSR1 medium og sentrifuge celler som beskrevet ovenfor.
- Resuspender pellet i 500 mL av mTeSR1 medium og deretter sakte legge 500 mL av 2X hPSC frysemedium (som inneholder 20 mM Y-27632) i en nedfrysing hetteglass. Alternativt, resuspender cellene i 1X hPSC iskaldt medium inneholdende 2 mM JAK-inhibitor 1 eller 1X CryoStor CS10 medium i nærvær av enten 10 mM Y-27632 eller 2 uM JAK inhibitor 1..
- Plasser frosne ampuller i en is-kjølt cryocontainer (bottom-fylt med isopranol) og overføre cryocontainer til en -80 ° C fryser umiddelbart.
- Overfør cellene fra -80 ° C fryseren til en flytende nitrogen-tank (neste dag) for langtids kryopreservering.
- Cell tining
- Utnytte en nedfrysing ampulle for plating en brønn i en 6-brønns plate.
- Forvarm mTeSR1 medium i et 37 ° C vannbad i 10 min, tine celler i det samme vann-bad i 2 min,dråpevis legge celler til 5 ml av forvarmet mTeSR1 medium inneholdende 10 uM Y-27632, og sentrifuger som beskrevet ovenfor.
- Forsiktig resuspender cellepellets med 2 ml mTeSR1 medium inneholdende 10 uM Y-27632 og langsomt overføre celler til en godt forhåndsbelagt med Matrigel (Merk: unngå å produsere luftbobler).
- Endre medium daglig og forventer hPSC vekst for å nå samløpet på dag tre eller fire.
4 Protokoll 3:. Konverter hPSC Colonies på Matrigel til NCM Kultur
- Fjerne en Matrigel-belagte plate fra kjøleskapet, plasseres platen i vevskultur hette i 10 til 30 minutter, fjernes mediet fra hver brønn i platen, og tilsett 2 ml forvarmet mTeSR1 medium til hver brønn.
- Overføring triturert hPSC klumper fra dyrknings materen (trinn 2.10 av basisprotokoll) til den ovenfor Matrigel plate. Legg mTeSR1 medium opp til 2,5 ml sluttvolum i hver brønn.
- Endre medium daglig i 3 til 4 dagerss inntil koloniene nå 80 til 90% samløpet.
- For celleaging: skyll kolonier med D-PBS to ganger, behandling av cellene med 1 ml av 2 mg / ml dispase ved 37 ° C i 15 til 20 min, og sediment og passasje-celler som klumper.
- For NCM kultur: gjenta trinn 3.1 til 3.9 som er beskrevet i protokoll 2.
5 protokoll 4:. NCM Culture of hPSCs på LN-521
- Tin det rekombinante LN-521-løsning ved 4 ° C før den dag i bruk og gjør laminin overtrekksoppløsning (LCS) ved fortynning av den tinte laminin med 1X D-PBS (inneholdende Ca2 + / Mg 2 +) til en endelig konsentrasjon på 10 ug / ml.
- Tilsett 1 ml av LCS til en brønn i 6-brønns plate (merk: unngå uttørking under belegningsprosessen).
- Tett belagt plate med Parafilm for å hindre fordamping og lagre platen i kjøleskap (4 ° C) O / N (merk: bruk plate innen 1 uke).
- Forsiktig fjerne LCS med en Pasteur pipette uten åuching den belagte overflate og tilsett 2 ml mTeSR1 medium til en brønn.
- Varm alle løsninger kultur (inkludert D-PBS) i et 37 ° C vannbad i 25 min.
- Konverter hPSC kolonier til NCM
- Distansere cellleaggregater til enkeltceller med Accutase som beskrevet i protokoll 2.
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs i én LN-521-belagt godt (1.4 til 2.1 x 10 5 celler / cm 2) uten tilstedeværelse av ROCK hemmere.
- Endre medium daglig i 3 til 4 dager.
- Dissosiere til cellene i 1 ml Accutase på dag 3 eller 4 for den neste celle aging ved hjelp av en 1 til 3 spalteforhold.
. 6 Protokoll 5: NCM Kultur for plasmid DNA Transfection
- Adapt hPSC kolonier til NCM kultur som beskrevet i protokoll 2 til 4.
- Plate dissosiert hPSCs i 12-brønns plate med en celletetthet på 7,5 x 10 5 celler / brønn i mTeSR1 medium i nærvær av 10 uM Y-27632.
- Bytt mTeSR1 medium med stoff-fri mTeSR1 medium mellom 4-8 timer etter plating cellene.
- For hver transfeksjon, fortynne 2,5 mikrogram av ekspresjonsplasmider (f.eks pmaxGFP) og 5 mL av Lipofectamine 2000 i separate Eppendorfrør i 125 mL hver av Opti-MEM Redusert Serum Medium.
- Etter 5 min, blande de fortynnede reagenser og inkuberes i 20 min ved romtemperatur (for å danne komplekser transfeksjon).
- Tilsett 250 ul transfeksjon komplekser til hver brønn inneholdende hPSCs i 1 ml mTeSR1 medium og inkuberes cellene ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 24 timer.
- Undersøk transfeksjon effektivitet under et fluorescensmikroskop og fotografere tilfeldig for beregning av den aktuelle transfeksjon effektivitet.
. 7 Protokoll 6: NCM Kultur for Transfection av MicroRNAs
- Distansere semi-konfluente hPSCs på dag 2 under NCM forhold ved å legge til en ml Accutase per brønn i 6 -Brønns plate.
- Tilsett 10 ml mTeSR1 medium for å utvanne enzymatiske reaksjoner og sentrifuger ved 200 xg i 5 min.
- Resuspender cellepelleten med mTeSR1 medium, seede celler ved en tetthet på 7,5 x 10 5 celler per brønn i en 12-brønns plate i mTeSR1 medium inneholdende 10 uM Y-27632, og la cellene feste i 4 timer.
- Sett på medium med Y27632 fritt mTeSR1 medium.
- Bruk kommersielt tilgjengelig microRNAs (f.eks, en non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Kontroll merket med DY547). Titrer konsentrasjoner varierende 0-160 nM ved å bruke tilgjengelige reagenser og følg produsentens instruksjoner.
- Optimal transfeksjon effektivitet for hver konsentrasjon i hPSC linjer ved bildedannelse av DY547 fluorescens av de levende celler under et mikroskop ved 24 timer etter transfeksjon.
- Beregn transfeksjon effektivitet basert på prosentandelen av DY547 positive celler over alle fotografert celler.
- Gjenta trinn 07.01 til 07.04 i protokoll 6.
- Beregn mengder viruspartikler som skal brukes for transduksjon: Bruk følgende formel: TU = (MOI x CN) / VT, mens TU betegner det totale antallet transformere enheter, lik MOI ønsket mangfold av infeksjon i brønnen (MOI eller TU / celle), angir CN antallet celler i hver brønn, og VT viser arkiv virale titere (TU / ml). For eksempel, gitt at aksje viral titere for SMART-shRNA vektor tilsvarer 1 x 10 9 TU / ml (transformere enheter per ml), 7,5 x 10 5 celler per brønn på tidspunktet for transduksjon, og en forventet MOI av 20: bruke 15 mL av aksjeviruspartikler for hver brønn (merk: denne tilstanden er anbefalt for forbigående lentiviral induksjon).
- Pre-varme 300 ul mTeSR1 medium med 10 mg / ml polybren i 30 minutter.
- Legg 15 mL av aksjeviruspartikler innden forvarmede mTeSR1 medium som inneholder polybren og forsiktig blande oppløsningen.
- Sett på cellekulturmedium med 300 mL av forvarmet medium inneholdende de virale partikler.
- Etter 4 timers inkubering, undersøke turboGFP fluorescens (et Maskin for shRNA ekspresjon) for å bestemme transduksjon effektivitet.
- Tilsett 300 ul av ytterligere mTeSR1 medium til transduse godt når cellene begynner å uttrykke turboGFP.
- Etter 12-16 timers inkubasjon reexamine turbo-GFP uttrykk.
- Utfør ønskede oppfølging eksperimenter med disse transduserte celler i løpet av 72 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generell skjema av NCM kultur
Fig. 1 representerer en typisk NCM kultur skjema som viser de dynamiske endringer av hPSCs etter høy tetthet encellede plating i nærvær av ROCK inhibitor Y-27632. Disse morfologiske endringer inkluderer inter forbindelser etter plating, cellulære klynger formasjon, og eksponentiell cellevekst etterfulgt av celle kondens (figur 1A). Et representativt forsøk indikerer WA01 (H1) hESCs, belagt som enkelt-celler ved en tetthet på 1,9 x 10 5 celler / cm 2 i nærvær av 10 uM Y-27632 ved dag 1 (figur 1B, venstre panel), videre formeres uten dannelsen av kolonier (Figur 1B, midtre panel) på dag 2, og kondensert som en homogen monolayer som er egnet for ønskede eksperimenter eller for celleaging på dag 3 (Figur 1B, høyre panel).
<strong> Ulike ROCK hemmere støtte NCM kultur
En 96-brønns plate assay ble brukt for proof-of-concept of high-throughput screening medikament. Det ble også utviklet for å optimalisere bruken av forskjellige ROCK-inhibitorer for å støtte NMR kultur. Omtrent 31 000 dissosiert SCU-i10 celler, menneskeskapte pluripotent celler (hiPSCs) 17, ble belagt på den ene Matrigel-belagt godt i nærvær av ulike konsentrasjoner av ROCK hemmere. Etter 24 timer ble cellene utsatt for CCK-8 basert overlevelsesanalyse for å bestemme celleoverlevelse under disse betingelser. Vi har tidligere vist at NMR-metoden krever bruk av ROCK-inhibitor, Y-27632, ved 10 uM for å forbedre enkeltcellekledning. I denne rapporten bekreftet vi at 10 uM Y-27632 i betydelig grad øke 24 hr encellede Plating effektiviteten av hiPSCs (P <0,05) (figur 2). Vi fant også at Y-39983 (ROCK jeg hemmer), phenylbenzodioxane (ROCK II hemmendetor), og thiazovivin (en roman ROCK inhibitor) signifikant modulere encellede pletteeffektiviteten og fremmer NMR vekst ved 1 pM sammenlignet med deres kontroller (p <0,05) (figur 2). Videre effekten av de tre ROCK hemmere (på en mikrometer) på encellede plating effektivitet sammenlignes med resultatene av Y-27632 på 10 mikrometer (P> 0,05) (figur 2). Spesielt, ROCK I-inhibitor (ved 5 mM) synes å vise markert cytotoksisitet sammenliknet med medikament ved en uM (p <0,05), impliserer en mer spesifikk interaksjon enn andre molekyler. Således kan forskjellige ROCK-inhibitorer anvendes for å understøtte NCM kultur i fremtiden. Imidlertid vil en fullstendig karakterisering av begge hESCs og hiPSCs henhold NCM med disse nye inhibitorer være nødvendig for fremtidig bruk.
LN-521 støtter NCM kultur uten bruk av ROCK hemmere
For å bestemme than rollen som en bestemt laminin isoformen i støtte hESC vekst, vi dyrket SCU-i30 hiPSCs på LN-521-belagte plater i xeno fritt medium TeSR2. Interessant, LN-521 alene, uten tilstedeværelse av ROCK hemmere, støtter encellede plating og påfølgende NCM vekst for 15 passasjer under denne tilstanden (figur 3). Farging av SCU-i30-celler med et anti-NANOG polyklonalt antistoff indikerte at cellene under denne tilstand hadde høyt NANOG ekspresjon i kjernen (figur 3A). Flowcytometrisk analyse viste at hESC markør ekspresjonsprofilen var tilsvarende de celler dyrket som NCM hjelp av ROCK inhibitor Y-27 632 (figur 3B).
Høy effektivitet av mikroRNA levering uten bruk av lentiviral partikler
Transfeksjon med DY547-merket oligonukleotid microRNAs ble gjennomført i WA01 (H1) celler under NCM forhold. WA01 hESCs ble dyrket som NCM på 2,5% Matrigel i mTeSR1 for 2 (figur 4A) og 18 (fig. 4B) passasjer hhv. Disse celler viste høy virkningsgrad transfeksjon 24 timer post-transfeksjon (figurene 4A og 4B). Generelt kan vi oppnå transfeksjon virkningsgrad på opptil 91% i hESCs ved 24 timer etter transfeksjon.
Figur 1. (A) Skjema NMR kultur. Linjen grafen markerer den dynamiske endringer av flercellet foreningen i en typisk tre-dagers kultur henhold NCM forhold. (B) Representative fase bilder av WA01 (H1) hESCs spredd under en NCM tilstand på 2,5% Matrigel i mTeSR1 medium for 16 passeringer (utpekt som WA01, mcp16). Den nedre platen er forstørret riss av det øvre panel. Scale barer indikerer 100 mikrometer.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Encellet overlevelsesanalyser ved bruk av en 96-brønns format. Omtrent 31.000 SCU-i10 hiPSCs 17 ble sådd ut på 2,5% Matrigel i nærvær av forskjellige små molekyl-inhibitorer i forbindelse med Rho-assosiert kinase (skjær) trasé ved indikerte konsentrasjoner . Etter 24 timer ble cellene utsatt for CCK-8 overlevelse assay ved å måle absorbansen ved 450 nm (A450). Studenten t-test ble brukt til å avgjøre om forskjellene i encellede plating effektivitet mellom ulike ROCK hemmere er av statistisk signifikans. Den entall stjerne tegn (*) viser ingen signifikante forskjeller mellom de hemmere (P & #62; 0,05), mens de doble stjerne tegn (**) betegner den observerte forskjellen er statistisk signifikant (p <0,05). Kolonner i histogrammene utpeke middelverdiene av de kvadruplikat determinanter og barer representerer standardavvik.
Figur 3. NCM kultur hiPSCs på laminin-521 (LN-521) uten tilstedeværelse av ROCK hemmere. Den SCU-i30 hiPSC linjen ble etablert ved NIH Stem Cell Unit. SCU-i30-celler ble dyrket på LN-521-belagt til 6-brønns plater i xeno-fritt medium TeSR2 for 15 passeringer uten bruk av små molekyl-inhibitorer slik som ROCK-inhibitorer. (B) Farging av SCU-i30-celler med et anti -NANOG polyclonal antistoff og kontra med Hoechst 33342 (Hoechst). Spesielt, noen celler som har en negativ NANOG flekker er the cellene under mitose. (B) flowcytometrisk analyse av hPSC markør ekspresjon i SCU-i30 celler dyrket som NCM på 2,5% Matrigel med bruk av 10 uM Y-27632 (øvre panel) eller NCM på LN-521 uten at Y-27632 (Nedre panel). Prosedyrene for både farging og flowcytometrisk analyse ble beskrevet tidligere fem. Scale barer skildre 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. NCM kultur hPSCs for mikroRNA transfeksjon. WA01 hESCs ble dyrket som NCM på 2,5% Matrigel i mTeSR1 for 2 (A) og 18 (B) passasjer, henholdsvis. Representative fase og fluorescens bilder av WA01 celler transfektert med Dy547-merket kontroll microRNAs for overvåking transfeksjon effektivitet på 24 timer etter transfeksjon. Scale barer representerer 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to viktige måter til kultur hPSCs in vitro: konvensjonell koloni-type kultur (av celler på brett eller ekstracellulære matriser) og suspensjon kultur av hPSCs som tilslag uten matere seks. Begrensningene av både koloni-type og fjæring kultur metoder inkluderer akkumulert heterogenitet og arvbare epigenetiske endringer. NCM kultur, basert på både encellede aging og høy tetthet celle plating, representerer en ny kultur metode for hPSC vekst 6,18. Selv om forskjellige encellede aging metoder er blitt dokumentert i litteraturen, men ingen av dem benyttes for rutinemessig forplantning. For eksempel, Wu og medarbeidere ansatt en encellet aging metode for å studere effekter av ulike små molekyler cocktails på hPSC vekst 19. Men deres endelige kulturprodukter er kolonier. Så, low-density-baserte encellede aging metoder fortsatt tilhører koloni-type kultur. Med hensyn til NCM kultur, høy-hiligheten plette forvandler denne kultur til en ny fremgangsmåte, siden den endelige celle produktet er en ensartet monolag. Nylig, Dvorak og kolleger brukte lignende metode til omfattende analysere hPSC egenskaper under denne veksten tilstand 18. Deres resultater støtter også våre store konklusjoner. Det er klart nå at NCM kultur er en ny metode som besitter flere nye egenskaper og kan endres ytterligere for mange potensielle anvendelser i pluripotent stamcellebiologi.
Grunnleggende egenskapene til hPSCs fra NCM kultur
Det kan tenkes at hPSCs henhold NCM kultur deler mange egenskaper med de samme typer celler dyrket som kolonier 9,18. Uttrykket nivåer av hESC markører i hPSCs, som inkluderer Oct-4, NANOG, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81, og SSEA-en, er lik i både NCM og koloni-type kultur . NCM-tilpasset celler også beholde lignende global mRNA uttrykk mønstre til hPSC kolonier dyrket på MEF næringslag ni. Åpenbart, NCM-tilpasset celler opprettholde pluripotent tilstand som bestemmes av teratom analysen 9,18. Men i motsetning til hPSC kolonier, cellene under NCM forholdene har en forutsigbar vekst som er preget av jevn vekst kurver, cellesykluser, og celle tall 9. På grunn av høy tetthet encellede plating, hPSCs henhold NCM forhold utviser eksponensiell vekst mellom dager 2 og 4 (Figur 1B), og dermed øke celle nummer av fire ganger sammenlignet med hPSC kolonier dyrket på MEFs. Langvarig kulturen ikke øker celleproduksjon, men snarere øker apoptotiske og differensiering belastning 9.. NCM gjør det også mulig optimal nedfrysing, og dermed gir rask celle utvinning på plating tinte celler (protokoll 1). Dessuten letter NCM tilpasning av hPSC kultur til ulike Xeno frie protokoller ni. Generelt støtter NCM veksten av hPSCs, opprettholder pluripotent tilstand, og opprettholder den potenlige av hPSCs til å differensiere i voksen vev av de tre bakterie lag.
Kromosom stabilitet i hPSCs henhold NCM
I form av kromosomal stabilitet, er det ingen direkte sammenligning mellom cellene fra forskjellige kulturmetoder. Flertallet av hPSCs henhold våre NCM kultur forhold har normale Karyotyper og genet kopiere numre som bestemmes av G-banding, array-basert komparativ genomisk hybridisering (aCGH), og fluorescens in situ hybridisering (FISH) 9. To linjer (~ 13%) viste unormale Karyotyper, der én linje (dvs. WA09) viste forhøyet polyploidi og en annen (ES01) hadde 14% av celler med trisomi 20 9. Det er uklart om disse unormale Karyotyper ble avledet fra utvalg av preexisting muterte celler før NCM kultur eller indusert under NCM tilpasning. Det er viktig at start hPSC kolonier eller undergruppe av kolonier brukt til NCM kultur should være godt karakterisert med hensyn til deres homogenitet og kromosomal stabilitet ved tidspunktet for NCM tilpasning. Spesielt, frekvensen av unormale Karyotyper henhold NCM forholdene er mye lavere enn det som er rapportert i en fersk kohort analyse, der forfatterne avslører 34% unormale Karyotyper henhold dominerende koloni-type kultur forhold 20. Derfor viser vår studie at vi kan vokse dissosiert enkelt-celler og opprettholde sin kromosom stabilitet under NCM forhold. Likevel må vi også bruke mer følsomme metoder for å undersøke kromosomavvik av hPSCs i de kommende årene. Spesielt, må vi skanne kromosomene 1, 12, 17 og 20 ved hjelp av høyere oppløsning prober (dvs. <50 kb), som noen mindre lesjoner (f.eks 20q11.21 fragment) ved disse ofte endrede kromosomer ikke kan oppdages ved konvensjonell karyotyping og FISH 20-22. Videre vil utviklingen av ulike NCM protokoller gjøre oss i stand til å identifisere Robust og trygge metoder for fremtidige søknader.
NCM kultur under forskjellige modifikasjoner
Bruken av ROCK-inhibitor, Y-27632, har åpnet døren til encellede baserte analyser. Tilgjengeligheten av ulike ROCK hemmere ville gi ytterligere valg for NCM-basert utvidelse og nedfrysing av hPSCs (figur 2). I teorien ethvert lite molekyl, som i betydelig grad kan øke encellede pletteringseffektiviteten kan bli brukt for å lette NMR kultur. JAK inhibitor 1, som fungerer forskjellig fra de ROCK-inhibitorer, representerer et slikt eksempel 9.. Bruken av enkle molekyler eller kombinatoriske metoder kan gi oss optimal cellevekst, cellulære analyser, og nedfrysing av hPSCs. Imidlertid kan alternative NMR kultur hPSCs på ytelses ekstracellulære matriks-proteiner, slik som laminin isoform LN-521, som normalt uttrykkes i hESCs 23-25, eliminere interferens av småmolekyler (figur 3). LN-521 kan forbedre dissosiert-hPSC overlevelse og opprett pluripotency gjennom aktivering av α6β1-PI3K/AKT veien 24. Enkelheten aging hPSCs med LN-521 reduserer heterogenitet av cellene, kompatible med ulike mater-fri og xeno frie systemer cellekultur ved hjelp av fullstendig definert medium (protokoll 4). Det gir også en ekstra modul for high-throughput-analyser uten påvirkning av små molekyler. Selv om iPSCs henhold NCM kultur på LN-521 beholdt uttrykk for et panel av hPSC markører, ytterligere karakterisering av disse cellene ved hjelp av teratom analysen og embryoid kropp-mediert multilineage differensiering kan være nødvendig for å bekrefte pluripotent stater i disse cellene. Av notatet, hiPSCs dyrket på laminin isoform LN-521 er angivelig cytogenetisk stabil (http://biolamina.com/). Men vi trenger også å gjelde høyere oppløsning og sensitive metoder (som omtalt ovenfor) til eXamine kromosomal stabilitet i disse cellene.
Allsidighet av NCM kultur for genteknologi
NMR-baserte fremgangsmåter representerer en enkel, robust og økonomisk system som kan være spesielt nyttig for genetisk manipulering av hPSCs (Protokoller 5-7). Det er kjent at hESC kolonier er vanskelig å transfektere eller transduce, med stor variasjon i transfeksjon / transduksjon effektivitet mellom ulike laboratorier 26-28. For eksempel, transfeksjon effektivitet hESCs varierer fra 3 til 35% i henhold til kolonidyrkningsbetingelser 26. Lentiviral transduksjon signaler i BG01 cellene under koloniforhold ble funnet å være ekstremt lavt ni. Imidlertid transfeksjon effektivitet mediert av NMR var større enn 75% 9 og modifikasjon av transduksjon metoder kan øke lentivirus-mediert transduksjon effektivitet opp til 90% 28. En stram komparativ studie har avdekket at det er the flercellede foreninger i hESC kolonier som bidrar til lav transfeksjon effektivitet ni. Videre har vi nylig modifiserte en mikroRNA transfeksjon protokoll og er i stand til å oppnå høy virkningsgrad transfeksjon (~ 91%), uten bruk av lentiviruses (Protokoll 6 og figur 4). Denne protokollen er lett å bruke og er spesielt nyttig for transient transfeksjon eksperimenter i løpet av en 3 - til 5-dagers tidsrom. Som vi avgrenset i ovennevnte protokoller, bør flere faktorer tas i hensyn når vi optimalisere transfeksjon / transduksjon effektivitet i hPSCs. Disse faktorene inkluderer celletetthet, plasmid konsentrasjoner, lentiviral titere, multiplisitet for infeksjon (MOI), varighet av transfeksjon / transduksjon, cytotoksisitet av de anvendte reagenser og fremgangsmåter som benyttes for overvåking transfeksjon / transduksjon effektivitet.
Vi utdype og utvide NCM metoder til kultur hPSCs på Matrigel og på ytelses ekstracellulære matriser. Denne dyrkningsmetodeer en effektiv måte å eliminere den heterogenitet som vanligvis finnes i hPSC koloni og aggregerte kulturer. Menneske pluripotente stamceller henhold NCM vekstvilkår er pluripotent og chromosomally stabil. Denne romanen kultur systemet er enkelt og allsidig for hPSC vedlikehold, storstilt utvidelse, og genetiske manipulasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
- Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
- Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
- Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
- Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
- Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
- Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
- Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
- Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
- Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
- Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
- Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
- Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
- Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
