Introduction
Kapaciteten af hPSCs at differentiere mod multilineage voksent væv har åbnet nye veje til behandling af patienter, der lider af alvorlige sygdomme, som medfører hjerte-kar-, lever-, pancreas, og neurologiske systemer 1-4. Forskellige celletyper afledt fra hPSCs ville også give robuste cellulære platforme for sygdom modellering, genteknologi, narkotika screening, og toksikologisk testning 1,4. Det centrale spørgsmål, der sikrer deres fremtidige kliniske og farmakologiske applikationer er dannelsen af et stort antal kliniske kvalitet hPSCs gennem in vitro cellekultur. De nuværende dyrkningssystemer er enten utilstrækkelige eller iboende variabel: forskellige feeder og feeder-fri kulturer af hPSCs som kolonier 5,6.
Vækst koloni-type hPSCs deler mange strukturelle træk ved den indre cellemasse (ICM) af tidlige pattedyr embryoner. ICM er tilbøjelig til at differentiere til de tre kim lagi en flercellede miljø på grund af eksistensen af heterogene signalsystemer gradienter. Således er købet af heterogenitet i den tidlige fosterudvikling betragtes som en nødvendig proces for differentiering, men et uønsket element i hPSC kultur. Den heterogenitet i hPSC kultur er ofte fremkaldt af overdreven apoptotiske signaler og spontan differentiering på grund af suboptimale vækstbetingelser. Således i koloni-typen kultur, heterogene celler ofte observeret i periferien af kolonierne 7,8. Det er også blevet påvist, at cellerne i humane embryonale stamceller (embryonale) kolonier udstille differentierede svar på signalmolekyler såsom BMP-4 9. Desuden koloni dyrkningsmetoder producere lave celleudbytter såvel som meget lav celle genanvendelsesprocenter fra kryopræservering grund af ukontrollable vækstrater og apoptotiske signalveje 6,9. I de seneste år er der blevet udviklet forskellige suspensionskulturer til dyrkning hPSCs, particulArly for udvidelse af store mængder hPSCs i feeder-og matrix-fri betingelser 6,10-13. Naturligvis forskellige dyrkningssystemer har deres egne fordele og ulemper. Generelt er den heterogene karakter hPSCs repræsenterer en af de store ulemper i koloni-type og aggregerede dyrkningsmetoder, som er suboptimale for at levere DNA og RNA materialer i hPSCs for genteknologi 6.
Der er tydeligvis et presserende behov for at udvikle nye systemer, der omgår nogle mangler ved de nuværende dyrkningsmetoder. Opdagelser småmolekyleinhibitorer (såsom ROCK inhibitor Y-27632 og JAK-hæmmer 1), som forbedrer encellede overlevelse bane vejen for dissocierede-hPSC kultur 14,15. Med brugen af disse små molekyler, har vi for nylig udviklet en kultur der er baseret på ikke-koloni type (NCM) vækst dissocierede-hPSCs 9. Denne hidtil ukendte kultur metode kombinerer både encellede passage og høj massefyldeplating metoder, der giver os mulighed for at producere store mængder af homogene hPSCs under konstant vækst cyklusser uden større kromosomafvigelser 9. Alternativt kan NMR kultur gennemføres med andre små molekyler og definerede matricer (f.eks lamininer) for at optimere dyrkningsmetode til brede anvendelser. Her præsenterer vi en række detaljerede protokoller baseret på NCM kultur og afgrænse detaljerede procedurer for genteknologi. For at demonstrere den alsidighed af Nordisk Ministerråds protokoller, vi også testet NCM kultur med diverse ROCK-hæmmere og med en enkelt laminin isoform 521 (dvs. LN-521).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Single-celle baseret non-koloni typen monolag (NCM) kultur af hPSCs.
1. Forberedelser
- Lav 500 ml medium til dyrkning af muse embryonale fibroblaster (MEF): DMEM-medium suppleret med 10% FBS, 2 mM L-glutamin og 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer (NEAA).
- Isoler muse embryonale fibroblaster (MEF) celler afledt fra CF1-stammen efter en rutinemæssig protokol 16 og kultur MEF på 0,1% gelatine-coatede 6-brønds celledyrkningsplade i DMEM-medium. Alternativt, køb MEF lagrene på passage 3 fra kommercielle ressourcer.
- Forbered Matrigel plader.
- Fortynd 5 ml embryonale-kvalificerede Matrigel lager med 5 ml DMEM/F12-medium (kølet ved ~ 4 ° C) og gemmes som 50% portioner i en -20 ° C fryser. Optø frosne Matrigel bestand i køleskab (~ 4 ° C) O / N og yderligere fortyndes Matrigel i koldt DMEM/F12-medium (for at give anledning til en 2,5% arbejder koncentration).
- Fjern Matrigel plade fra køleskabet, så pladen til varme ved RT i cellekultur hætte i 10 til 30 min (Bemærk: ikke opvarme pladen i en cellekultur inkubator), og aspireres DMEM medium før plating hPSCs.
- Gør 500 ml embryonale medium: 80% DMEM/F12 medium, 20% KSR, 2 mM L-glutamin, 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer, 0,1 mM β-mercaptoethanol og 4 ng / ml FGF-2.
- Forbered 10 ml 2X hPSC frysemedium: 60% FBS, 20% DMSO og 20 uM Y-27632 i mTeSR1 medium, steriliseres ved filtrering, og bruge mediet inden for 1 uge.
. 2. Protokol 1 (Basic): Grow hPSC kolonier på Feeders
- Brug MEF passage numre på 5 eller 6 (betegnet som P5 og P6) for hPSC kultur med henblik på at få ensartet results. Mitotisk inaktivere MEF ved behandling af cellerne med 10 pg / ml mitomycin C i 3 timer ved 37 ° C vaskes cellerne 3x med 1X Dulbeccos phosphatbufret saltvand (D-PBS) og derefter adskille MEF'er med 0,05% trypsin i 0,53 mM EDTA. Alternativt bestråles MEF'er ved en dosis på 8000 rad med en X-ray strålerøret.
- Tæl celle numre ved hjælp af trypanblåt pletten udelukkelse metode under mikroskop. Alternativt kan du bruge en automatisk celle tæller.
- Plate bestrålede MEF på 6-brønds polystyrenplader coatet med 0,1% gelatine ved en densitet på 1,88 x 10 5 celler per brønd (dvs. 1,96 x 10 4 celler / cm 2). Inkuberes cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
- Fjern MEF dyrkningsmedium ved aspiration med en Pasteur-pipette (Bemærk: ingen vask nødvendige skridt på dette tidspunkt).
- Triturat hPSC kolonier fra tidligere kultur i små klumper, undersøger de klumper under mikroskop for at sikre, at deres størrelser lige frabout 50 til 100 um i diameter, og pladen hPSC klumper på toppen af MEF fødelag i en brønd, der indeholder 2 ml hPSC medium.
- Skift hESC medium dagligt i 3 til 5 dage, rekord kolonivækst af fotografi, markerer ingen morfologisk ændrede eller differentierede kolonier (~ 5%), og manuelt fjerne de markerede kolonier ved forsigtigt aspiration med en Pasteur-pipette.
- Skyl de resterende kolonier på MEFs to gange (2 min hver med D-PBS), og inkuberes kolonierne med 2 ml 1 mg / ml collagenase IV i hPSC medium for 10 til 30 min), og undersøge detachement af hPSC kolonier fra MEF-overflade (Bemærk: Brug en skraber til at hjælpe frigørelsen processen, hvis kolonierne er stramt fastgjort til plade).
- Der tilsættes 5 ml hPSC medium til hver brønd for at minimere enzymatiske reaktioner, kolonier overførsel til et 15 ml rør, tillade hPSC kolonier til sediment i 3 til 5 minutter ved RT, og sikre sedimentering af kolonier ved direkte visualisering af calen på bunden af røret (Bemærk: ikke centrifugeres røret ved dette trin).
- Fjern supernatanterne indeholder restmængder MEF'er og dissocierede enkelte celler, resuspenderes kolonierne med 5 ml embryonale medium, og gentag sedimentering trin to gange.
- Fjern medium, udriv hPSC kolonier de i små klumper, opbevares i 1X hPSC frysning medium (eller CryoStore CS10 frysning medium) for kryopræservering (1 sammenflydende godt pr frossen hætteglas) eller plade på en 6-brønds plade for celle passage.
3. Protokol 2:. Konverter hPSC Kolonier fra Feeders til NCM
- Skyl hPSC pellets i D-PBS engang inkuberes pillerne med 1 ml 1X Accutase i 10 min, og undersøge den enzymatiske reaktion under et mikroskop for at sikre encellede dissociation.
- Afslut de enzymatiske reaktioner ved forsigtigt at resuspendere cellerne i 5 ml mTeSR1 medium indeholdende 10 uM Y-27632 efterfulgt af centrifugering ved 200 x g ved stuetemperatur i 5 min(Bemærk, ikke bruge store centrifugalkraft, som forårsager celleskader).
- Der tilsættes 5 ml mTeSR1 medium til pelleten resuspenderes pelleten som enkelte celler og filter dissocierede celler gennem et 40 um cellefilter (for at fjerne eventuelle rester celleaggregater).
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs i en brønd (1,4-2,1 x 10 5 celler / cm 2) af en 6-brønds plade belagt med 2,5% embryonale kvalificerede Matrigel, tilføje mTeSR1 medium op til 2,5 ml, og omfatter 10 uM Y-27632 i mediet (for at lette den indledende 24 timers enkelt celleudpladning). Alternativt benytte følgende små molekyler til at erstatte 10 uM Y-27632 til at øge encellede plating: 1 uM Y-39983 (ROCK I inhibitor), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II-hæmmer), 1 uM thiazovivin (en roman ROCK-hæmmer) , og 2 uM JAK-hæmmer 1..
- Udskift mediet med stoffri mTeSR1 medium på den næste dag (inden for 24 timer), dissociere celler fra en ekstragodt, og tælle celle nummer til at bestemme encellede udpladningseffektivitet (Bemærk: ca, 50 til 90% af encellede udpladningseffektivitet, der kan opnås på dette stadium).
- Lade cellerne vokse som en enkelt celle dannede monolag for et par dage med 3 ml mTeSR1 medium. Skift medium dagligt.
- Empirisk bestemme tidsplanen for passage tilpasset NCM afhængigt af celletætheden. Passage når cellevækst når sammenløb på dag 3 eller dag 4 eller på 4 timer tidspunkt efter forsvinden af celle-til-celle grænser. Dissociere cellerne i 1 ml Accutase bruge en 1 til 3 spaltningsforhold (dvs. 1 sammenflydende brønd af celler udpladet i 3 brønde i 6-brønds plade) til celle passage og stabilisere tilpasset NCM med 5 passager.
- Cell frysning
- Udnyt en sammenflydende godt (~ 5-6 x10 6 celler) i et frosset hætteglas: dissociere celler fra et sammenflydende godt med 1 ml Accutase i 10 min.
- Fortynd wed 5 ml mTeSR1 medium og centrifuge-celler som beskrevet ovenfor.
- Pellet resuspenderes i 500 pi mTeSR1 medium og derefter langsomt tilsættes 500 ul 2X hPSC frysemedium (indeholdende 20 uM Y-27632) i en cryokonserveringshætteglassets. Alternativt resuspender cellerne i 1X hPSC frysning medium indeholdende 2 uM JAK inhibitor 1 eller 1X CryoStor CS10 medium i nærvær af enten 10 uM Y-27632 eller 2 uM JAK inhibitor 1.
- Frysevarer hætteglas i en is-kølet cryocontainer (bund fyldt med isopranol) og overføre cryocontainer til en -80 ° C fryser straks.
- Overfør celler fra -80 ° C fryser til en flydende nitrogen tanken (den næste dag) for langvarig nedfrysning.
- Cell optøning
- Udnytte en Cryokonserveringshætteglasset til udpladning 1 brønd i en 6-brønds plade.
- Forvarm mTeSR1 medium i et 37 ° C vandbad i 10 min, tø celler i samme vandbad i 2 minutterdråbevis tilføje celler til 5 ml forvarmet mTeSR1 medium indeholdende 10 uM Y-27632, og centrifugeres som beskrevet ovenfor.
- Forsigtigt resuspenderes cellepellets med 2 ml mTeSR1 medium indeholdende 10 uM Y-27632 og langsomt overføre cellerne til et godt præ-coatet med Matrigel (Bemærk: undgå at producere luftbobler).
- Skift medium daglig og forventer hPSC vækst at nå sammenløb på dag 3 eller 4..
4. Protokol 3:. Konverter hPSC kolonier på Matrigel til NCM Kultur
- Fjern en Matrigel-coated pladen fra køleskabet, anbringes pladen i vævskultur hætte i 10 til 30 min, fjernes mediet fra hver brønd af pladen, og der tilsættes 2 ml forvarmet mTeSR1 medium til hver brønd.
- Overførsel findelt hPSC klumper fra feeder kultur (trin 2.10 i grundlæggende protokol) til ovenstående Matrigel pladen. Tilføj mTeSR1 medium op til 2,5 ml slutvolumen i hver brønd.
- Skift medium dagligt i 3 til 4 dages, indtil kolonier nå 80 til 90% konfluens.
- For celle passaging: Skyl kolonierne med D-PBS to gange, behandle cellerne med 1 ml 2 mg / ml dispase ved 37 ° C i 15 til 20 min, og sediment og passage celler som klumper.
- For NCM kultur: Gentag trin 3.1 3.9 beskrevet i protokol 2.
5. Protokol 4:. NCM Kultur hPSCs på LN-521
- Optø rekombinante LN-521-opløsning ved 4 ° C før dagen for brugen og gør laminin coatingopløsning (LCS) ved fortynding af den optøede laminin med 1X D-PBS (indeholdende Ca2 + / Mg2 +) til en slutkoncentration på 10 ug / ml.
- Tilsæt 1 ml af LCS til én brønd i 6-brønds plade (Bemærk: Undgå tørre ud under belægningsprocessen).
- Forsegl belagt plade med Parafilm at forhindre fordampning og opbevare pladen i køleskab (4 ° C) O / N (Bemærk: Brug pladen inden for 1 uge).
- Forsigtigt fjerne LCS med en Pasteur-pipette uden atuching den coatede overflade, og der tilsættes 2 ml mTeSR1 medium til et godt.
- Varm alle kultur opløsninger (herunder D-PBS) i et 37 ° C vandbad i 25 min.
- Konverter hPSC kolonier til NCM
- Adskille celleaggregater til enkelte celler med Accutase som beskrevet i protokol nr. 2.
- Seed 1,3-2 x 10 6 hPSCs i ét LN-521-belagt godt (1,4-2,1 x 10 5 celler / cm 2) uden tilstedeværelse af ROCK-hæmmere.
- Skift medium dagligt i 3 til 4 dage.
- Dissociere cellerne i 1 ml Accutase på dag 3 eller 4 for den næste celle passage ved anvendelse af en 1 til 3 spaltningsforhold.
. 6 Protokol 5: NCM Culture for plasmid DNA-transfektion
- Adapt hPSC kolonier til NCM kultur som beskrevet i protokol 2 til 4.
- Plate dissocierede hPSCs i 12-brønds plade med en celletæthed på 7,5 x 10 5 celler / brønd i mTeSR1 medium i nærvær af 10 uM Y 27632.
- Erstat mTeSR1 medium med stoffri mTeSR1 medium mellem 4-8 timer efter plettering cellerne.
- For hver transfektion fortyndet 2,5 ug af ekspressionsplasmider (f.eks pmaxGFP), og 5 pi Lipofectamine 2000 i separate Eppendorf-rør i 125 pi af hver af Opti-MEM Reduced Serum Medium.
- Efter 5 minutter, blandes den fortyndede reagenser og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur (for at danne transfektionskomplekser).
- Tilsæt 250 pi transfektionskomplekser til hver brønd indeholdende hPSCs i 1 ml mTeSR1 medium og inkubere cellerne ved 37 ° C i en CO2-inkubator i 24 timer.
- Undersøg transfektionseffektiviteten under et fluorescensmikroskop og fotografere tilfældigt til beregning af den faktiske transfektionseffektivitet.
. 7. Protokol 6: NCM Culture til transfektion af MicroRNA
- Dissociér semi-sammenflydende hPSCs på dag 2 under NCM betingelser ved at tilsætte 1 ml Accutase per brønd i 6 Brønde.
- Der tilsættes 10 ml mTeSR1 medium til udvande enzymatiske reaktioner og centrifugeres ved 200 xg i 5 min.
- Resuspender cellepelleten med mTeSR1 medium, frø cellerne ved en tæthed på 7,5 x 10 5 celler pr brønd i en 12-brønds plade i mTeSR1 medium indeholdende 10 uM Y-27632, og lad cellerne vedhæfte i 4 timer.
- Udskift mediet med Y27632-frit mTeSR1 medium.
- Brug kommercielt tilgængeligt microRNA (fx en ikke-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Kontrol mærket med Dy547). Titrer koncentrationer 0-160 nM med de medfølgende reagenser og følg producentens anvisninger.
- Optimere transfektionseffektiviteten for hver koncentration i hPSC linier ved billeddannelse Dy547 fluorescens af levende celler under et mikroskop ved 24 timer efter transfektion.
- Beregn transfektionseffektiviteter baseret på procentdelen af Dy547 positive celler i alle afbildet celler.
- Gentag trin 7,1-7,4 protokol 6.
- Beregn mængden af virale partikler, der skal anvendes til transduktion: Brug følgende formel: TU = (MOI x CN) / VT, mens TU betegner det samlede antal omdanne enheder MOI er lig den ønskede mangfoldighed af infektion i brønden (MOI eller TU / celle), CN angiver antallet af celler i hver brønd, og VT angiver stock virale titere (TU / ml). For eksempel, eftersom stock virale titere for SMART-shRNA vektor lig med 1 x 10 9 TU / ml (transformerende enheder pr ml), 7,5 x 10 5-celler per brønd på tidspunktet for transduktion og en forventet MOI på 20: bruge 15 pi af lager viruspartikler for hver brønd (bemærk: denne tilstand anbefales til forbigående lentiviral induktion).
- Pre-varme 300 pi mTeSR1 medium med 10 mg / ml polybren i 30 minutter.
- Tilføj 15 pi lager viruspartikler indden foropvarmede mTeSR1 medium indeholdende polybren og forsigtigt blande opløsningen.
- Udskift cellekulturmedium med 300 pi forvarmet medium indeholdende de virale partikler.
- Efter 4 timers inkubation, undersøge turboGFP fluorescens (en maker for shRNA udtryk) til at bestemme transduktionseffektiviteten.
- Tilføj 300 pi ekstra mTeSR1 medium til transduktionsvektor godt, når cellerne begynder at udtrykke turboGFP.
- Efter 12-16 timers inkubation, revurderer turbo-GFP udtryk.
- Udfør de ønskede opfølgning eksperimenter med disse transducerede celler inden for 72 timer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En generel skema af NCM kultur
Figur 1 viser et typisk NMR kultur skema, der viser de dynamiske ændringer i hPSCs efter high-density single-celleudpladning i nærvær af ROCK inhibitor Y-27632. Disse morfologiske ændringer omfatter intercellulære forbindelser efter plating, cellulære klynger dannelse, og eksponentiel cellevækst efterfulgt af celle kondens (figur 1A). Et repræsentativt eksperiment indikerer WA01 (H1) hESCs, belagte som enkelt-celler ved en densitet på 1,9 x 10 5 celler / cm 2 i nærvær af 10 uM Y-27632 på dag 1 (figur 1B, venstre panel), formeres yderligere uden dannelse af kolonier (figur 1B, midterste panel) på dag 2, og kondenseres som en homogen monolag, der er egnet for ønskede eksperimenter eller for celle passaging på dag 3 (figur 1B, højre panel).
<strong> Forskellige ROCK hæmmere understøtter NCM kultur
En 96-brønds plade-assay blev anvendt til proof-of-concept for high-throughput lægemiddel-screening. Det blev også designet til at optimere brugen af forskellige ROCK inhibitorer til støtte NCM kultur. Cirka 31.000 dissocierede SCU-i10 celler, humane inducerede pluripotente celler (hiPSCs) 17, blev belagt på den ene Matrigelcoatede godt i nærværelse af forskellige koncentrationer af ROCK-hæmmere. Efter 24 timer blev cellerne udsat for CCK-8 baseret overlevelse assay for at bestemme celleoverlevelse under disse betingelser. Vi har tidligere vist, at NCM metode kræver anvendelse af ROCK-hæmmer, Y-27632, på 10 pM at øge encellede plating. I denne rapport, bekræftede vi, at 10 pM Y-27632 øge 24 hr encellede udpladningseffektivitet af hiPSCs (P <0,05) (Figur 2). Vi fandt også, at Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II hæmningtor), og thiazovivin (en roman ROCK inhibitor) modulere betydeligt encellede plating effektiviteten og fremme NCM vækst på 1 uM sammenlignet med deres kontrol (p <0,05) (figur 2). Desuden er virkningerne af de tre ROCK-inhibitorer (ved 1 uM) på encellede udpladningseffektiviteten var sammenlignelig med Y-27632 ved 10 uM (P> 0,05) (Figur 2). Især ROCK I inhibitor (ved 5 uM) synes at vise udtalt cytotoksicitet sammenlignet med lægemidlet ved 1 uM (p <0,05), implicerer en mere specifik interaktion end andre molekyler. Således kan forskellige ROCK-inhibitorer anvendes til at understøtte NCM kultur i fremtiden. Imidlertid ville en fuldstændig karakterisering af både hESCs og hiPSCs under NCM med disse nye hæmmere være behov for fremtidig brug.
LN-521 understøtter NCM kultur uden brug af ROCK-hæmmere
For at bestemme than rollen som en specifik laminin isoform støtte embryonale vækst, vi dyrket SCU-i30 hiPSCs på LN-521-belagte plader i xeno-frit medium TeSR2. Interessant, LN-521 alene, uden tilstedeværelse af ROCK-hæmmere, understøtter encellede plating og efterfølgende NCM vækst for 15 passager under denne betingelse (Figur 3). Immunfarvning af SCU-i30 celler med et anti-NANOG polyklonale antistof viste, at celler under denne betingelse havde høj NANOG udtryk i kerner (figur 3A). Flowcytometrisk analyse viste, at embryonale markørekspression profil svarer til cellerne dyrket som NCM hjælp af ROCK inhibitor Y-27632 (figur 3B).
Høj effektivitet af microRNA levering uden brug af lentivirale partikler
Transfektion med Dy547-mærkede oligonukleotid microRNA blev udført i WA01 (H1) celler under NCM betingelser. WA01 hESCs blev dyrket som NCM om 2,5% Matrigel i mTeSR1 for 2 (figur 4A) og 18 (figur 4B) passager henholdsvis. Disse celler viste høj transfektionseffektivitet 24 timer efter transfektion (figur 4A og 4B). Generelt kan vi opnå transfektionseffektiviteten op til 91% i hESCs ved 24 timer efter transfektion.
Figur 1.. (A) Skematik NCM kultur. Linjen graf skildrer de dynamiske ændringer i flercellede forening i en typisk 3-dages kultur under NCM forhold. (B) Repræsentative fase billeder af WA01 (H1) hESCs opformeret under en NCM tilstand på 2,5% Matrigel i mTeSR1 medium til 16 passager (betegnet som WA01, mcp16). Den nederste er forstørret billede af det øverste panel. Skalapanelerne indikerer 100 um.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Enkelt-celle overlevelse assays under anvendelse af en 96-brønds format. Ca. 31.000 SCU-i10 hiPSCs 17 blev udpladet på 2,5% Matrigel i nærvær af forskellige små molekyle inhibitorer i forbindelse med Rho-kinase (ROCK) baner ved angivne koncentrationer . Efter 24 timer blev cellerne udsat for CCK-8 overlevelse assay ved at måle absorbansen ved 450 nm (A450). Den studerende t-test blev anvendt til at bestemme, om forskellene i encellede udpladningseffektivitet mellem de forskellige ROCK-hæmmere er af statistisk signifikans. Ental stjerne tegn (*) angiver ingen signifikante forskelle mellem hæmmere (P & #62; 0,05), mens de to stjerner skilte (**) angiver den observerede forskel er statistisk signifikans (P <0,05). Kolonner i histogrammer udpege de gennemsnitlige værdier af de firedobbelte determinanter og barer repræsenterer standardafvigelser.
Figur 3.. NCM kultur hiPSCs på laminin-521 (LN-521) uden tilstedeværelse af ROCK-hæmmere. SCU-i30 hiPSC linje blev etableret på NIH Stem Cell Unit. SCU-i30 celler blev dyrket på LN-521-coatede plader med 6 brønde i xeno medium TeSR2 til 15 passager uden brug af små molekyle inhibitorer, såsom ROCK inhibitorer. (A) Immunfarvning af SCU-i30 celler med et anti -NANOG polyklonalt antistof og modfarvet med Hoechst 33342 (Hoechst). Især nogle celler, der har en negativ NANOG farvning er the celler under mitose. (B) Flowcytometrisk analyse af hPSC markør ekspression i SCU-i30 celler dyrket som NCM på 2,5% Matrigel med anvendelse af 10 uM Y-27632 (øverste panel) eller NCM på LN-521 uden Y-27632 (nederste del). Procedurerne for både immunfarvning og flowcytometrisk analyse blev beskrevet tidligere 5. Skalapanelerne skildrer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. NCM kultur hPSCs for microRNA transfektion. WA01 hESCs blev dyrket som NCM på 2,5% Matrigel i mTeSR1 for 2 (A) og 18 (B) passager, hhv. Repræsentative fase og fluorescens billeder af WA01 celler transficeret med Dy547-mærkede microRNA til overvågning transfektion effektivitet på 24 timer efter transfektion kontrol. Skala søjler repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to vigtige måder til kultur hPSCs in vitro: konventionel koloni-typen kultur (af celler på foderautomater eller ekstracellulære matricer) og hjulophæng kultur hPSCs som aggregater uden foderautomater 6. Begrænsningerne i både koloni-type og affjedring kultur metoder omfatter akkumulerede heterogenitet og arvelige epigenetiske ændringer. NCM kultur, er baseret på både enkelt-celle-passage og high-density celleudpladning repræsenterer en ny kultur fremgangsmåde til hPSC vækst 6,18. Selvom forskellige encellede passaging metoder er blevet dokumenteret i litteraturen, men ingen af dem er brugt til rutinemæssig formering. For eksempel Wu og kolleger ansat en enkelt celle passaging metode til at studere effekterne af forskellige små molekyler cocktails på hPSC vækst 19. Men deres endelige kultur produkter er kolonier. Så lav massefylde-baserede encellede passaging metoder tilhører stadig koloni-typen kultur. Med hensyn til NCM kultur, de høje-hulerity plating omdanner denne kultur til en ny metode, idet den endelige celle produkt er et homogent monolag. For nylig, Dvorak og kolleger brugte lignende metode til omfattende analysere hPSC egenskaber under denne betingelse vækst 18. Deres resultater understøtter også vores vigtigste konklusioner. Det er klart nu, at NCM kultur er en spirende metode, der har flere nye egenskaber og kan tilpasses yderligere til mange potentielle anvendelser i pluripotente stamceller biologi.
Grundlæggende egenskaber hPSCs fra NCM kultur
Det er tænkeligt, at hPSCs under NCM kultur deler mange karakteristika med de samme typer af celler dyrket som kolonier 9,18. Ekspressionsniveauerne af hESC markører i hPSCs, som omfatter Oct-4, NANOG, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81, og i SSEA-1, er ens i både NCM og koloni-typen kultur . NCM-tilpassede celler bevarer også lignende global mRNA udtryk mønstre til hPSC kolonier dyrket på MEFs feeder lag 9. Det er klart, NCM-tilpassede celler opretholde den pluripotente tilstand som bestemt ved teratom assay 9,18. Men i modsætning til hPSC kolonier, celler under NCM forhold har en forudsigelig vækstrate, der er karakteriseret ved konsekvente vækstkurver, cellecykler og celletal 9. Grund af den høje massefylde encellede plating, hPSCs under NCM betingelser udviser eksponentiel vækst mellem dag 2 og 4 (figur 1B), og derved øge celle nummer ved 4 gange sammenlignet med hPSC kolonier dyrket på MEF. Langvarig kultur ikke øger celle produktion, men tværtimod forøger apoptotisk og differentiering stress 9. NCM giver også optimal nedfrysning, således at en hurtig celle opsving på plating optøede celler (Protokol 1). Desuden NMR letter tilpasningen af hPSC kultur til forskellige xeno-fri protokoller 9. Generelt NCM understøtter væksten af hPSCs, opretholder den pluripotente tilstand og opretholder potentielle af hPSCs at differentiere til voksne væv af de tre kim lag.
Kromosomal stabilitet i hPSCs under NCM
I form af kromosomale stabilitet, er der ingen direkte sammenligning mellem cellerne fra forskellige dyrkningsmetoder. Størstedelen af hPSCs under vores NCM dyrkningsbetingelser har normale karyotyper og gen kopiantal som bestemt ved G-banding, array-baserede komparativ genomisk hybridisering (aCGH), og fluorescens in situ-hybridisering (FISH) 9. To linier (~ 13%) viste unormale karyotyper, hvor en linie (dvs. WA09) udviste forhøjet ploiditetsgraden og en anden (ES01) havde 14% af celler med trisomi 20 9. Det er uklart, om disse unormale karyotypes blev afledt fra udvælgelse af allerede eksisterende muterede celler før NCM kultur eller induceret under NCM tilpasning. Det er vigtigt, at de startende hPSC kolonier eller delmængde af kolonier, der anvendes til NCM kultur should være godt karakteriseret med hensyn til deres homogenitet og kromosomale stabilitet på tidspunktet for NMR tilpasning. Især antallet af unormale karyotyper under NCM betingelser er meget lavere end det rapporterede for nylig i en kohorte analyse, hvor forfatterne afslører 34% unormale karyotyper under fremherskende dyrkningsbetingelser 20 koloni-typen. Derfor vores undersøgelse tyder på, at vi kan vokse dissocierede single-celler og vedligeholde deres kromosom stabilitet under NCM forhold. Men vi skal også bruge mere følsomme metoder til at undersøge kromosomafvigelser af hPSCs i de kommende år. Især er vi nødt til at scanne kromosom 1, 12, 17 og 20 ved hjælp af en højere sonder opløsning (dvs. <50 kb), som nogle mindre læsioner (f.eks den 20q11.21 amplikon) på disse ofte ændrede kromosomer ikke kan påvises ved konventionel karyotyping og FISH 20-22. Desuden vil udviklingen af diverse NCM protokoller gør det muligt for os at identificere Robust og sikre metoder til fremtidige ansøgninger.
NCM kultur under forskellige modifikationer
Brugen af ROCK-hæmmer, Y-27632, har åbnet døren for en enkelt celle baserede assays. Tilgængeligheden af forskellige ROCK-hæmmere vil give yderligere muligheder for NCM-baserede ekspansion og nedfrysning af hPSCs (figur 2). I teorien enhver lille molekyle, der i væsentlig grad kan øge encellede udpladningseffektivitet, kan anvendes til at lette NCM kultur. JAK inhibitor 1, som fungerer forskelligt fra disse ROCK-inhibitorer, repræsenterer et sådant eksempel 9. Brugen af enkelte molekyler eller kombinatoriske metoder kan give os optimal cellevækst, cellulære assays og nedfrysning af hPSCs. Alternativ NCM kultur hPSCs på definerede ekstracellulære matrixproteiner, såsom laminin isoform LN-521, normalt udtrykkes i hESCs 23-25, kan imidlertid forhindre interferens af småmolekyler (figur 3). LN-521 kunne forbedre dissocierede-hPSC overlevelse og opretholder pluripotency gennem aktivering af α6β1-PI3K/AKT vej 24. Enkeltheden i passaging hPSCs med LN-521 reducerer forskelligheden af celler, der er kompatible med forskellige feeder-fri og xeno-fri cellekultur systemer, der anvender fuldstændig defineret medium (Protokol 4). Det giver også et ekstra modul til high-throughput assays uden indflydelse af små molekyler. Selvom iPSCs under NCM kultur på LN-521 bibeholdt ekspressionen af et panel af hPSC markører, yderligere karakterisering af disse celler under anvendelse teratom assay og embryoid body-medieret multilineage differentiering kan være nødvendigt at bekræfte pluripotente stater i disse celler. Notatet, hiPSCs dyrket på laminin isoform LN-521 er efter sigende cytogenetisk stabile (http://biolamina.com/). Men vi er også nødt til at anvende højere opløsning og følsomme metoder (som omtalt ovenfor) til examine det kromosomale stabilitet i disse celler.
Alsidighed af NCM kultur for genteknologi
NCM-baserede metoder udgør en enkel, robust og økonomisk system, der kan være særligt nyttige til genetisk manipulation af hPSCs (Protokol 5-7). Det vides, at hESC kolonier er vanskelige at transficere eller transducere, med stor variation i transfektion / transduktion effektivitet mellem forskellige laboratorier 26-28. For eksempel transfektion effektivitet i hESCs ligger på 3 til 35% under koloni dyrkningsbetingelser 26. Lentivirale transduktion signaler i BG01 celler under koloni betingelser blev anset for at være ekstremt lav 9. , Transfektionseffektiviteten medieret af NCM var imidlertid større end 75% 9 og ændring af transduktion metoder kan øge lentivirus-medieret transduktion effektivitet på op til 90% 28. En stram sammenlignende undersøgelse har vist, at det er the flercellede foreninger i hESC kolonier, der bidrager til den lave transfektionseffektivitet 9. Desuden har vi for nylig ændret en microRNA transfektionsprotokol og er i stand til at opnå en høj transfektionseffektivitet (~ 91%) uden brug af lentivira (protokol 6 og figur 4). Denne protokol er let at bruge og særligt anvendelige til eksperimenter med transient transfektion i en 3 - til 5 dages tidsramme. Som vi afgrænset i ovenstående protokoller, bør flere faktorer tages i overvejelser, når vi optimerer transfektion / transduktion effektivitet i hPSCs. Disse faktorer omfatter celletæthed plasmid koncentrationer lentivirale titre multiplicitet af infektion (MOI), varighed af transfektion / transduktion, cytotoksicitet af reagenser og metoder, der anvendes til overvågning af transfektion / transduktion effektivitet.
Vi uddybe og udvide NCM metoder til kultur hPSCs på Matrigel og på definerede ekstracellulære matricer. Denne dyrkningsmetodeer en effektiv måde at fjerne heterogenitet almindeligvis findes i hPSC koloni og aggregerede kulturer. Humane pluripotente stamceller under NCM vækstbetingelser er pluripotente og kromosomalt stabil. Denne roman kultur systemet er enkel og alsidig for hPSC vedligeholdelse, storstilet ekspansion, og genetiske manipulationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Countess automated cell counter | Invitrogen Inc. | C10227 | Automatic cell counting |
| Faxitron Cabinet X-ray System | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | Model RX-650 | X-ray irradiation of MEFs |
| MULTIWELL 6-well plates | Becton Dickinson Labware | 353046 | Polystyrene plates |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965–092 | For MEF medium |
| Mitomycin C | Roche | 107409 | Mitotic inhibitor |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | For MEF dissociation |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330–032 | For hPSC medium |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Invitrogen Inc. | 31985-062 | For hPSC transfection |
| Heat-inactivated FBS | Invitrogen Inc. | 16000–044 | Component of MEF medium |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen Inc. | 10828–028 | KSR, Component of hPSC medium |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140–050 | NEAA, component of hPSC medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030–081 | Component of hPSC medium |
| mTeSR1 & Supplements | StemCell Technologies | 5850 | Animal protein-free |
| TeSR2 & Supplements | StemCell Technologies | 5860 | Xeno-free medium |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of hPSC medium |
MEF (CF-1) ATCC |
American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | For feeder culture of hPSCs |
| hESC-qualified Matrigel | BD Bioscience | 354277 | For feeder-free culture of hPSCs |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | Human recombinant protein |
| FGF-2 (recombinant FGF, basic) | R&D Systems, MN | 223-FB | Growth factor in hPSC medium |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X mixed enzymatic solution |
| JAK inhibitor I | EMD4 Biosciences | 420099 | An inhibitor of Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK inhibitor |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK inhibitor |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I inhibitor |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II inhibitor |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | A novel ROCK inhibitor |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µm cell strainer |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C | Thermo Scientific | C6516F-1 | “Mr. Frosty” Freezing Container |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | Transfection reagents |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | Transfection reagent |
| Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs |
| SMART-shRNA | Thermo Scientific | To be determined | Lentiviral vector |
| pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | Included in every transfection kit | Expression plasmid for transfection control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21704 | Mouse IgG3, pluripotent marker |
| Tra-1-60 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21705 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | Mouse IgM, pluripotent marker |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | Mouse IgG1, against cytokeratin 8 |
| α-fetoprotein | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, mouse IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, goat polyclonal antibody |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | Mouse IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal antibody |
| Rat anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic protein |
| Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | Mouse IgG1 |
| Smooth muscle actin (clone 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611/IS611 | Mouse IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | Rabbit polyclonal antibody |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, mouse IgG2a |
| HNF4α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| Paraformaldehyde (solution) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in D-PBS |
References
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Burridge, P. W., et al. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mallon, B. S., et al. StemCellDB: The Human Pluripotent Stem Cell Database at the National Institutes of Health. Stem Cell Res. 10, 57-66 (2012).
- Chen, K. G., et al. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
- Bendall, S. C., et al. IGF and FGF cooperatively establish the regulatory stem cell niche of pluripotent human cells in vitro. Nature. 448, 1015-1021 (2007).
- Moogk, D., et al. Human ESC colony formation is dependent on interplay between self-renewing hESCs and unique precursors responsible for niche generation. Cytometry A. 77, 321-327 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 9, 237-248 (2012).
- Amit, M., et al. Suspension culture of undifferentiated human embryonic and induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 6, 248-259 (2010).
- Dang, S. M., et al. scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22, 275-282 (2004).
- Serra, M., et al. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends Biotechnol. 30, 350-359 (2012).
- Steiner, D., et al. propagation and controlled differentiation of human embryonic stem cells in suspension. Nat Biotechnol. 28, 361-364 (2010).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Androutsellis-Theotokis, A., et al. Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo. Nature. 442, 823-826 (2006).
- Jozefczuk, J., et al. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Kozhich, O. A., et al. Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2012).
- Kunova, M., et al. Adaptation to robust monolayer expansion produces human pluripotent stem cells with improved viability. Stem Cells Transl Med. 2, 246-254 (2013).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nat Commun. 2, 167 (2011).
- Amps, K., et al. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nat Biotechnol. 29, 1132-1144 (2011).
- Baker, D. E., et al. Adaptation to culture of human embryonic stem cells and oncogenesis in vivo. Nat Biotechnol. 25, 207-215 (2007).
- Lee, A. S., et al. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Domogatskaya, A., et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells. 26, 2800-2809 (2008).
- Domogatskaya, A., et al. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28, 611-615 (2010).
- Liew, C. G., et al. Transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25, 1521-1528 (2007).
- Braam, S. R., et al. Genetic manipulation of human embryonic stem cells in serum and feeder-free media. Methods Mol Biol. 584, 413-423 (2010).
- Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5, 389-392 (2008).
