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Biology

Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética

Published: July 24, 2014 doi: 10.3791/51519

Introduction

A capacidade de se diferenciar em direção hPSCs tecidos adultos multilinhagem abriu novos caminhos para o tratamento de pacientes que sofrem de doenças graves que envolvem cardiovascular, hepática, pâncreas, e sistemas neurológicos 1-4. Vários tipos de células derivadas de hPSCs também fornecem plataformas celulares robustos para modelagem de doenças, a engenharia genética, a seleção da droga, e 1,4 testes toxicológicos. A questão-chave que garante suas aplicações clínicas e farmacológicas futuras é a geração de um grande número de hPSCs clínica de grau através de cultura in vitro de células. No entanto, sistemas de cultivo atuais são insuficientes ou inerentemente variável, envolvendo várias culturas alimentadoras e sem alimentador de hPSCs como colônias 5,6.

Crescimento do tipo colônia de ações hPSCs muitas características estruturais da massa celular interna (ICM) de embriões de mamíferos adiantados. A ICM é propenso a diferenciar-se em três camadas germinativasnum ambiente multicelular, devido à existência de gradientes de sinalização heterogéneos. Assim, a aquisição de heterogeneidade no desenvolvimento embrionário precoce é considerado como um processo necessário para a diferenciação, mas uma característica indesejável de cultura HPSC. A heterogeneidade na cultura HPSC é muitas vezes induzida por sinais apoptóticos excessivas e diferenciação espontânea devido a condições de crescimento abaixo do ideal. Assim, no tipo de colónia de cultura, as células heterogéneas são frequentemente observados na periferia das colónias 7,8. Foi também mostrado que as células em células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) colónias respostas diferenciais exposição a moléculas de sinalização, tais como BMP-4 9. Além disso, métodos de cultura colônia produzir colheitas de células baixas, bem como as taxas de recuperação muito baixo de células de criopreservação, devido às taxas de crescimento incontrolável e sinalização apoptótica vias 6,9. Nos últimos anos, várias culturas de suspensão têm sido desenvolvidos para hPSCs de cultura, particulArly para a expansão de grandes quantidades de hPSCs dentro e alimentadoras condições livres de matriz 6,10-13. Obviamente, os diferentes sistemas de cultura tem as suas próprias vantagens e desvantagens. Em geral, a natureza heterogénea de hPSCs representa um dos principais inconvenientes da colónia de tipo e de cultura de agregados, que são métodos para a entrega de materiais de sub-óptima de DNA e de RNA em hPSCs por engenharia genética 6.

Claramente, há uma necessidade imperiosa de desenvolver novos sistemas que evitam algumas deficiências dos métodos de cultura atual. As descobertas de inibidores de pequenas moléculas (como o inibidor ROCHA Y-27632 e JAK inibidor 1) que melhoram a sobrevivência de uma única célula pavimentar o caminho para a cultura dissociada-HPSC 14,15. Com a utilização destas moléculas pequenas, que desenvolveram recentemente um método de cultura de tipo não-colónia (NCM) crescimento de dissociar-hPSCs 9. Este método de cultura novela combina passaging de uma única célula e de alta densidadechapeamento de métodos, o que nos permite produzir grandes quantidades de hPSCs homogêneas sob ciclos de crescimento consistente, sem grandes anormalidades cromossômicas 9. Alternativamente, a cultura NCM pode ser implementado com diferentes moléculas pequenas e matrizes definidas (como as lamininas), a fim de optimizar o processo de cultura de amplas aplicações. Aqui, apresentamos vários protocolos detalhados com base na cultura NCM e delinear procedimentos detalhados para a engenharia genética. Para demonstrar a versatilidade de protocolos NCM, também testamos cultura NCM com inibidores ROCHA diversas e com a única isoforma laminina 521 (ou seja, LN-521).

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Protocol

Base de uma única célula não-colônia tipo monocamada (NCM) cultura de hPSCs.

1. Preparações

  1. Adicione 500 ml de meio de cultura de fibroblastos de rato embrionários (MEFs): meio DMEM suplementado com 10% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 0,1 e aminoácidos não essenciais (NEAA) mM.
  2. Isolar fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) derivadas a partir da estirpe CF1, seguindo um protocolo de rotina 16 e MEFs cultura em 0,1% de 6 cavidades da placa de cultura de células revestidas com gelatina, em meio DMEM. Como alternativa, comprar ações do MEF na passagem 3 a partir de recursos comerciais.
  3. Prepare placas Matrigel.
    1. Dilui-se 5 ml de estoque de Matrigel hESC qualificado com 5 ml de meio DMEM/F12 (arrefecida a ~ 4 ° C) e armazenar até 50% em alíquotas de um congelador de -20 ° C. Descongelar o estoque de Matrigel congelado no frigorífico (~ 4 ° C) O / N e dilui-se ainda mais o Matrigel em meio DMEM/F12 fria (para dar origem a uma concentração de trabalho de 2,5%).
    2. Remova a placa de Matrigel da geladeira, deixe a placa para aquecer à temperatura ambiente na capa de cultura de células de 10 a 30 min (Nota: não aquecer a placa em uma incubadora de cultura de células) e aspirado DMEM meio antes de chapeamento hPSCs.
  4. Adicione 500 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas: 80% de meio de DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 0,1 mM β-mercaptoetanol, e 4 ng / ml de FGF-2.
  5. Preparar 10 ml de meio de congelação 2x HPSC: 60% de FBS, 20% de DMSO, e 20 uM Y-27632 em meio mTeSR1, esterilizar por filtração, e de usar o meio dentro de 1 semana.

2. Protocolo 1 (Básico): Crescer HPSC colônias em Alimentadores

  1. Use números de passagem MEF a 5 ou 6 (designado como p5 e p6) para cultura HPSC, a fim de obter resul consistentets. Mitoticamente inactivar MEFs por tratamento das células com 10 ug / ml de mitomicina C, durante 3 horas a 37 ° C, lavar as células 3x com fosfato tamponado salino da 1X Dulbecco (STP-D), e, em seguida, se dissociam MEFs com 0,05% de tripsina em 0,53 mM EDTA. Alternativamente, irradiar MEFs a uma dose de 8000 rads com um irradiador de raios-X.
  2. Conte o número de células utilizando o método de exclusão com Trypan Blue mancha sob microscópio. Como alternativa, use um contador automático de células.
  3. Placa MEFs irradiados em placas de poliestireno de 6 poços revestidos com gelatina a 0,1% a uma densidade de 1,88 x 10 5 células por poço (ou seja, 1,96 x 10 4 células / cm 2). Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.
  4. Remova o meio de cultura MEF por aspiração com uma pipeta de Pasteur (Nota: não as etapas de lavagem necessárias neste momento).
  5. Colônias Triturar HPSC da cultura anterior em pequenos pedaços, examinar os aglomerados sob microscópio para garantir que seus tamanhos que variam from 50 a 100 mM, em diâmetros, e placa aglomerados HPSC sobre o topo das camadas alimentadoras MEF num poço contendo 2 ml de meio HPSC.
  6. Mude hESC média diária de 3 a 5 dias, a registro o crescimento da colônia por fotografia, marque qualquer colônias morfologicamente alterados ou diferenciadas (~ 5%), e remover manualmente as colônias marcadas pela suavemente aspiração com uma pipeta Pasteur.
  7. Lavar as colónias remanescentes no MEFs duas vezes (2 min cada com D-PBS), e incuba-se as colónias, com 2 ml de 1 mg / ml de colagenase IV em meio HPSC por 10 a 30 min), e analisar o desprendimento de colónias do HPSC superfície MEF-revestido (Nota: use um raspador para ajudar o processo de desapego somente se as colônias são fortemente ligado à placa).
  8. Adicionar 5 ml de meio HPSC a cada poço para minimizar reações enzimáticas, colônias de transferência para um tubo de 15 ml, permitir colônias HPSC para sedimentar por 3 a 5 minutos à temperatura ambiente, e garantir a sedimentação de colônias por visualização direta do cells na parte inferior do tubo (Nota: não se centrifugar o tubo nesta fase).
  9. Retire os sobrenadantes contendo MEFs residuais e dissociado células individuais, voltar a suspender as colônias com 5 ml de meio de células estaminais embrionárias humanas, e repita o passo sedimentação duas vezes.
  10. Retire as médias, colônias HPSC triturar em pequenos pedaços, loja em 1X HPSC congelamento médio (ou CryoStore CS10 meio de congelamento) para criopreservação (1 confluente bem por frasco congelado) ou placa em uma placa de 6 poços para passaging celular.

3 Protocolo 2:. Converter HPSC Colônias de Alimentadores para NCM

  1. Lavar peletes HPSC em D-PBS, uma vez, incuba-se as peletes com 1 ml de 1X Accutase durante 10 min, e examinar a reacção enzimática sob um microscópio para assegurar a dissociação de uma única célula.
  2. Encerrar as reacções enzimáticas por ressuspensão suave das células em 5 ml de meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632, seguido por centrifugação a 200 xg à temperatura ambiente durante 5 min(Nota, não use força excessiva de centrifugação, que causam danos às células).
  3. Adicionar 5 ml de meio mTeSR1 ao sedimento, ressuspender o sedimento de células individuais, e filtro de células dissociadas através de um filtro de células de 40 mM (para remover quaisquer agregados celulares residuais).
  4. Semente 1,3-2 x 10 6 para um poço hPSCs (1,4-2,1 x 10 5 células / cm 2) de uma placa de 6 poços revestidas com 2,5% de células estaminais embrionárias humanas qualificado Matrigel, adicionar meio mTeSR1 até 2,5 ml, e incluem 10 uM Y-27632 no meio (para facilitar o plaqueamento inicial de 24 horas de uma única célula). Em alternativa, utilizar os seguintes pequenas moléculas para substituir 10 mM Y-27632 para melhorar chapeamento de uma única célula: 1 PM Y-39983 (ROCK I inibidor), 1 phenylbenzodioxane mM (inibidor ROCHA II), 1 PM thiazovivin (um novo inibidor ROCK) , e 2 uM inibidor de JAK 1.
  5. Substitua o meio com meio mTeSR1 livre de drogas no dia seguinte (dentro de 24 horas), dissociar as células de um adicionalbem, e contagem do número de células para determinar a eficiência de uma única célula de revestimento (Nota: aproximadamente, 50 a 90% de uma única célula plaqueamento eficiência que podem ser alcançados nesta fase).
  6. Permitir que as células a crescer como uma única formada de células em monocamada durante alguns dias com 3 ml de meio mTeSR1. Mude média diária.
  7. Empiricamente determina o ritmo de passaging adaptado NCM, dependendo da densidade celular. Passagem, quando o crescimento celular atinge confluência no dia 3 ou dia 4, ou no ponto de tempo de 4 horas após o desaparecimento das fronteiras da célula-a-célula. Dissociar as células em 1 ml de Accutase, utilizar uma proporção de 1 a 3 desdobramento (isto é, uma bem confluente de células plaqueadas em 3 cavidades de placa de 6 poços) para passagens em células e estabilizar adaptado NCM por 5 passagens.
  8. Congelamento celular
    1. Utilizar um bem confluentes (5-6 x 10 ~ 6 células) para um frasco congelado: dissociar as células confluentes de uma bem com 1 mL de Accutase durante 10 min.
    2. Diluir wom 5 ml de células em meio de centrifugação e mTeSR1 como descritos acima.
    3. Ressuspender o sedimento em 500 ul de meio mTeSR1 e, em seguida, adiciona-se lentamente 500 ul de 2X HPSC meio de congelação (contendo 20 ^ M Y-27632) em um frasco de criopreservação. Alternativamente, ressuspender as células em 1X HPSC meio de congelamento contendo inibidor 2 uM JAK 1 ou meio 1X CryoStor CS10, na presença de 10 uM ou Y-27632 ou 2 fiM inibidor de JAK 1.
    4. Colocar os frascos congelados em um cryocontainer gelo-refrigeradas (inferior preenchido com isopranol) e transferir o cryocontainer para um congelador de -80 ° C imediatamente.
    5. Transferência de células do freezer -80 ° C para um tanque de nitrogênio líquido (no dia seguinte) para a criopreservação de longo prazo.
  9. Descongelamento celular
    1. Utilize um frasco de criopreservação para chapeamento um poço de uma placa de 6 poços.
    2. Meio de pré-aquecer mTeSR1 em um banho de água a 37 ° C durante 10 min, as células descongelamento no mesmo banho de água durante 2 minutos,gota a gota para adicionar as células 5 ml de meio mTeSR1 pré-aquecido contendo 10 uM Y-27632, e centrifuga-se como descrito acima.
    3. Suavemente ressuspender as pelotas de células com 2 ml de meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632 e lentamente transferir células de um poço de pré-revestidas com Matrigel (Nota: evitar a produção de bolhas de ar).
    4. Mude médio diário e esperam que o crescimento HPSC para alcançar confluência no dia 3 ou 4.

4 Protocolo 3:. Converter HPSC colônias em Matrigel a NCM Cultura

  1. Retirar uma placa revestida de Matrigel do frigorífico, colocar a placa na cultura capa de tecido, durante 10 a 30 minutos, remover o meio de cada poço da placa, e adicionar 2 ml de meio mTeSR1 pré-aquecido a cada poço.
  2. Transferência triturado aglomerados HPSC da cultura alimentador (Passo 2.10 do protocolo de base) para a placa de Matrigel acima. Adicionar meio mTeSR1 até 2,5 ml de volume final em cada poço.
  3. Alterar média diária durante 3 a 4 diass até colónias atingir 80 a 90% de confluência.
  4. Para passagens em células: enxaguar as colónias com D-PBS, duas vezes, o tratamento de células com 1 ml de 2 mg / ml de dispase a 37 ° C durante 15 a 20 min, e de sedimento e de passagem de células como aglomerados.
  5. Para a cultura NCM: repita os passos 3,1-3,9 definido no protocolo 2.

5 Protocolo 4:. NCM Cultura da hPSCs no LN-521

  1. Descongelar o recombinante LN-521 solução, a 4 ° C, antes do dia da utilização e fazer a solução de revestimento de laminina (LCS), diluindo a laminina descongelado com 1X D-PBS (contendo Ca 2 + / Mg 2 +) para uma concentração final de 10 ug / ml.
  2. Adicionar 1 ml da LCS a um bem em 6 bem-placa (nota: evitar a seco durante o processo de revestimento).
  3. Selar a placa revestida com Parafilm para evitar a evaporação e armazenar o prato na geladeira (4 ° C) O / N (nota: use a placa dentro de 1 semana).
  4. Remova cuidadosamente os LCS com uma pipeta de Pasteur, sem auching a superfície revestida e adicionar 2 ml de meio mTeSR1 para um poço.
  5. Aquecer todas as soluções de cultura (incluindo D-PBS) em um banho de água a 37 ° C durante 25 min.
  6. Converta colônias HPSC para NCM
    1. Dissociar agregados celulares de células individuais com Accutase conforme descrito no protocolo 2.
    2. Semente 1,3-2 x 10 6 hPSCs em um LN-521-revestido bem (1,4-2,1 x 10 5 células / cm 2), sem a presença de inibidores de rock.
    3. Alterar média diária durante 3 a 4 dias.
    4. Dissociar as células em 1 ml de Accutase no dia 3 ou 4 para a próxima passagem em células usando um 1 a 3 razão de divisão.

. 6 Protocolo 5: NCM Cultura para plasmídeo DNA transfecção

  1. Adaptar colónias HPSC a cultura NCM tal como descrito em Protocolos 2 e 4.
  2. Placa dissociado hPSCs em 12 poços da placa com uma densidade de células de 7,5 x 10 5 células / poço em meio mTeSR1 na presença de 10 uM Y-27632.
  3. Substituir médio mTeSR1 com meio mTeSR1 livre de drogas entre 4-8 horas após o plaqueamento das células.
  4. Para cada transfecção, diluir 2,5 ug de plasmídeos de expressão (por exemplo, pmaxGFP) e 5 ul de Lipofectamina 2000 em tubos Eppendorf separados em 125 ul de cada um de Opti-MEM.
  5. Após 5 min, misturar os reagentes e incubar diluídos durante 20 min a temperatura ambiente (de modo a formar complexos de transfecção).
  6. Adicionar os complexos de transfecção 250 ul a cada poço contendo hPSCs em 1 ml de meio mTeSR1 e incuba-se as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 24 horas.
  7. Examinar a eficácia de transfecção com um microscópio de fluorescência e fotografia aleatoriamente para o cálculo da eficiência de transfecção real.

. 7 Protocolo 6: NCM Cultura para transfecção de MicroRNAs

  1. Dissociar hPSCs semi-confluentes no dia 2, em condições NCM, adicionando 1 ml de Accutase por poço em 6 Bem-placa.
  2. Adicionar 10 ml de meio mTeSR1 para diluir as reacções enzimáticas e centrifugar a 200 xg durante 5 min.
  3. Ressuspender o sedimento de células com meio mTeSR1, semear as células a uma densidade de 7,5 x 10 5 células por poço numa placa de 12 poços em meio contendo 10 uM mTeSR1 Y-27632, e permitir que as células aderir durante 4 h.
  4. Substitua o meio com meio Y27632-livre mTeSR1.
  5. Use comercialmente disponível microRNAs (por exemplo, um miRIDIAN miRNA transfecção de controle não-alvo marcado com Dy547). Titula-se concentrações na gama 0-160 nM usando os reagentes fornecidos e seguir as instruções dos fabricantes.
  6. Optimizar a eficiência de transfecção para cada concentração em linhas HPSC pela imagem da fluorescência Dy547 das células vivas em um microscópio às 24 h após a transfecção.
  7. Calcular as eficiências de transfecção com base no percentual de células positivas Dy547 sobre todas as células com imagens.
. tle "> 8 Protocolo 7: Cultura NCM para a transdução de Lentivirus Vector

  1. Repita os passos 7.1 a 7.4 do Protocolo 6.
  2. Calcular as quantidades de partículas virais a serem utilizadas para a transdução de: usar o seguinte fórmula: TU = (MOI x CN) / VT, enquanto TU indica o número total de unidades de transformação, MOI é igual à multiplicidade desejada de infecção no poço (ou MOI TU / célula), CN especifica o número de células em cada poço, e VT indica os títulos virais de estoque (TU / mL). Por exemplo, uma vez que os títulos virais de imagens SMART-shRNA vector é igual a 1 x 10 9 TU / ml (unidades de transformação por ml), 7,5 x 10 5 células por poço, no tempo de transdução, e esperada uma MOI de 20: 15 de usar mL das partículas virais de ações para cada poço (nota: esta condição é recomendado para indução lentiviral transitória).
  3. Pré-quentes de 300 ul de meio mTeSR1 com 10 mg / ml de polibreno durante 30 min.
  4. Adicionar 15 mL de partículas virais de ações emo meio mTeSR1 pré-aquecido contendo polibrene e misture delicadamente a solução.
  5. Substituir o meio de cultura de células com 300 ul de meio pré-aquecido contendo as partículas virais.
  6. Após 4 horas de incubação, examinar turboGFP fluorescência (um fabricante de expressão shRNA) para determinar a eficiência de transdução.
  7. Adicionar 300 mL de meio mTeSR1 adicional para a transdução bem quando as células começam a expressar turboGFP.
  8. Após 12-16 horas de incubação, reexaminar expressão turbo-GFP.
  9. Realizar experimentos de acompanhamento desejados com essas células transduzidas dentro de 72 horas.

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Representative Results

Um esquema geral da cultura NCM

A Figura 1 representa um esquema de cultura NCM típico mostrando as alterações dinâmicas de hPSCs depois de alta densidade de revestimento de uma única célula, na presença do inibidor ROCHA Y-27632. Estas alterações morfológicas incluem ligações intercelulares após o plaqueamento, a formação de agregados celulares e crescimento celular exponencial, seguido por condensação de células (Figura 1A). Uma experiência representativa indica WA01 (H1) hESCs, chapeado como células individuais a uma densidade de 1,9 x 10 5 células / cm 2, na presença de 10 uM Y-27632 no dia 1 (Figura 1B, painel esquerdo), ainda mais propagadas sem a formação de colónias (Figura 1B, painel do meio) no dia 2, e condensado como uma monocamada homogénea que é adequado para experiências desejados ou por passagem em células no dia 3 (Figura 1B, painel da direita).

<> Vários inibidores ROCHA fortes apoiar a cultura NCM

Um ensaio de placa de 96 poços foi utilizada para prova de conceito de despistagem de drogas de alto rendimento. Ele também foi projetado para otimizar o uso de vários inibidores ROCHA para apoiar a cultura NCM. Aproximadamente, 31.000 células dissociadas SCU-i10, células pluripotentes humanas induzida (hiPSCs 17), foram semeadas em uma cavidade na presença de diferentes concentrações de inibidores ROCHA revestidos com Matrigel. Após 24 horas, as células foram submetidas a ensaio de sobrevivência base de CCK-8 para determinar a sobrevivência de células sob estas condições. Nós já demonstrado que o método de NCM requer o uso do inibidor de ROCK, Y-27632, de 10 uM para melhorar o chapeamento de uma única célula. Neste relatório, confirmou que 10 mM Y-27632 aumentar significativamente de uma única célula 24 hr chapeamento eficiência de hiPSCs (P <0,05) (Figura 2). Descobrimos também que Y-39983 (ROCK I inibidor), phenylbenzodioxane (ROCK II inibiçãotor) e thiazovivin (um novo inibidor ROCK) modular significativamente a eficiência do chapeamento de uma única célula e promover o crescimento NCM em 1 M, quando comparados com seus controles (P <0,05) (Figura 2). Além disso, os efeitos dos três inibidores ROCHA (a 1 uM) na eficiência de plaqueamento de uma única célula foram comparáveis ​​ao do Y-27632 a 10 uM (P> 0,05) (Figura 2). Notavelmente, a pedra de inibidor (a 5 mM) parece mostrar citotoxicidade pronunciada em comparação com a droga a 1 uM (P <0,05), implicando uma interacção mais específicos do que outras moléculas. Assim, vários inibidores da rocha pode ser usado para apoiar a cultura MNC no futuro. No entanto, uma caracterização completa de ambos os hESCs e hiPSCs sob NCM com estes novos inibidores seriam necessários para uso futuro.

LN-521 suporta cultura MNC, sem o uso de inibidores da ROCHA

Para determinar tele o papel de uma isoforma laminina específico no apoio ao crescimento hESC, nós cultivadas hiPSCs SCU-i30 em placas LN-521-revestidos no meio livre de xeno TeSR2. Curiosamente, LN-521 sozinho, sem a presença de inibidores da Rocha, suporta chapeamento de uma única célula e posterior crescimento NCM por 15 passagens sob esta condição (Figura 3). A imunocoloração de células SCU-i30 com um anticorpo policlonal anti-NANOG indicaram que as células sob esta condição apresentaram expressão elevada NANOG nos núcleos (Figura 3A). A análise de citometria de fluxo mostrou que o perfil de expressão de células estaminais embrionárias humanas marcador foi semelhante para as células cultivadas como NCM utilizando o inibidor ROCHA Y-27632 (Figura 3B).

Alta eficiência de entrega microRNA sem o uso de partículas lentivirais

A transfecção com microRNAs Dy547 oligonucleotídicas marcadas foi realizada em células WA01 (H1) sob condições NCM. HESCs WA01 foram cultivadas como no NCM 2,5% de Matrigel em mTeSR1 para 2 (Figura 4A) e 18 (Figura 4B), respectivamente, as passagens. Estas células apresentaram uma alta eficiência de transfecção de 24 horas após a transfecção (Figuras 4A e 4B). Geralmente, pode-se obter a eficiência de transfecção superior a 91% em hESCs às 24 h após a transfecção.

Figura 1
(A) Esquema Figura 1. Da cultura NCM. O gráfico de linha delineia as mudanças dinâmicas da associação multicelular em uma cultura típica de 3 dias em condições NCM. (B) imagens de fase representativas de WA01 (H1) hESCs propagadas sob uma condição NCM em 2,5% Matrigel em meio mTeSR1 por 16 passagens (designado como WA01, mcp16). O painel inferior é a vista ampliada do painel superior. As barras de escala indicam 100 um.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Uma única célula ensaios de sobrevivência, utilizando um formato de 96 poços. Aproximadamente, 31.000 hiPSCs SCU-i10 17 foram semeadas em 2,5% de Matrigel na presença de vários inibidores de moléculas pequenas relacionados com (ROCK) vias da Rho cinase associada a concentrações indicadas . Após 24 horas, as células foram submetidas a ensaio de sobrevivência de CCK-8 através da medição da absorvância a 450 nm (A450). O teste t de Student foi utilizado para determinar se as diferenças na eficiência de plaqueamento de uma única célula entre vários inibidores Rock são de significância estatística. O sinal de asterisco singular (*) indica que não há diferenças significativas entre os inibidores (P & #62; 0,05), enquanto os sinais duplo asterisco (**) denota a diferença observada é de significância estatística (P <0,05). Colunas em histogramas designar os valores médios dos determinantes e bares quadruplicadas representam desvios-padrão.

Figura 3
Cultura Figura 3. NCM de hiPSCs sobre laminina-521 (LN-521), sem a presença de inibidores de rock. A linha hiPSC SCU-i30 foi estabelecida no NIH-tronco unidade celular. Células SCU-i30 foram cultivadas em LN-521-revestidos placas de 6 poços no free-xeno médio TeSR2 por 15 passagens sem o uso de inibidores de pequenas moléculas, tais como inibidores de rock. (A) Imunocoloração de células SCU-i30 com um anti -NANOG anticorpo policlonal e contrastadas com Hoechst 33342 (Hoechst). Notavelmente, algumas células que têm uma coloração NANOG negativo são thcélulas e sob mitose. (B) Análise por citometria de fluxo da expressão do marcador em HPSC células SCU-i30 cultivadas como NCM em 2,5% de Matrigel com o uso de 10 uM Y-27632 (painel superior) ou MCN no LN-521 sem Y-27632 (Baixa painel). Os procedimentos para ambos imunocoloração e análise de citometria de fluxo foram descritos anteriormente 5. Barras de escala representam 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Cultura de MNC hPSCs para microRNA transfecção. WA01 hESCs foram cultivadas como NCM em 2,5% de Matrigel em mTeSR1 para 2 (A) e 18 (B) passagens, respectivamente. De fase e de fluorescência de imagens representativas de células transfectadas com WA01 Dy547-marcado microRNAs controlo para monitorizar a eficiência da transfecção de 24 horas após a transfecção. Barras de escala representam 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Há duas formas principais de se hPSCs cultura in vitro: cultura convencional do tipo colônia (de células em alimentadores ou matrizes extracelulares) e cultura de suspensão de hPSCs como agregados sem alimentadores 6. As limitações de ambos do tipo colônia e suspensão métodos de cultura incluem heterogeneidade acumulada e mudanças epigenéticas herdadas. Cultura NCM, com base em ambos passaging de uma única célula e plaqueamento de células de alta densidade, representa um novo método para a cultura HPSC 6,18 crescimento. Embora vários métodos Passaging unicelular têm sido documentados na literatura, mas nenhum deles é usado para a propagação de rotina. Por exemplo, Wu e colegas empregue um método de passagens em células única para estudar os efeitos de várias moléculas pequenas cocktails na HPSC crescimento 19. No entanto, os seus produtos de cultura finais são colónias. Assim, os métodos Passaging de uma única célula de baixa densidade à base de ainda pertencem ao tipo colônia cultura. No que diz respeito à cultura NCM, os altos-tocasdade chapeamento transforma esta cultura para um novo método, uma vez que o produto final de células é uma monocamada homogénea. Recentemente, Dvorak e seus colegas usaram método semelhante para analisar de forma abrangente propriedades HPSC sob esta condição crescimento de 18. Seus resultados também apoiar as nossas principais conclusões. Está claro agora que a cultura NCM é um método emergente que possui diversas novas propriedades e pode ser modificado para muitas aplicações potenciais em biologia de células-tronco pluripotentes.

Propriedades básicas de hPSCs de cultura NCM

É concebível que hPSCs sob NCM partes cultura muitas características com os mesmos tipos de células cultivadas como colônias 9,18. Os níveis de marcadores de células estaminais embrionárias humanas em hPSCs, que incluem Oct-4, NANOG, SSEA-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81, e SSEA-1, de expressão são semelhantes em ambos NCM e tipo de colónias cultura . Células NCM-adaptados também manter padrões semelhantes de expressão de mRNA global para colônias HPSC cultivadas em MCamadas alimentadoras EF 9. Claramente, as células NCM-adaptados sustentar o estado pluripotente, conforme determinado pelo ensaio de teratoma 9,18. No entanto, ao contrário de colónias HPSC, células sob condições NCM têm uma taxa de crescimento previsível que é caracterizado por curvas de crescimento, ciclos consistentes de células, e o número de células 9. Devido à alta densidade de revestimento de uma única célula, hPSCs em condições NCM apresentar crescimento exponencial entre os dias 2 e 4 (Figura 1B), aumentando assim o número de células por 4 vezes em comparação com as colônias HPSC cultivadas em MEFs. Cultura prolongada não aumenta a produção de células, mas sim aumenta a apoptose e diferenciação estresse 9. NCM também permite a criopreservação ideal, permitindo assim a recuperação celular rápida sobre cultivo de células descongeladas (Protocolo 1). Além disso, NCM facilita a adaptação da cultura HPSC para vários protocolos de livre-xeno 9. Em geral, a NCM suporta o crescimento de hPSCs, mantém o estado pluripotente, e mantém o potencialcial de hPSCs para se diferenciar em tecidos adultos das três camadas germinativas.

Estabilidade cromossômica em hPSCs sob NCM

Em termos de estabilidade cromossómico, não há nenhuma relação directa entre as células de diferentes métodos de cultura. A maioria dos hPSCs sob nossas condições de cultura NCM tem cariótipo normal e número de cópias de genes, conforme determinado pelo G-bandas, hibridização genômica comparativa baseada em array (aCGH) e hibridização fluorescente in situ (FISH) 9. Duas linhas (~ 13%) mostrou cariótipos anormais, em que uma linha (ou seja, WA09) exibiu poliploidia elevada e um outro (ES01) teve 14% de células com trissomia 20 9. Não é claro se estes cariótipos anormais foram derivados da seleção de células mutantes preexistentes antes da cultura NCM ou induzidos durante NCM adaptação. É importante que as colónias a partir HPSC ou subconjunto de colónias usadas para NCM cultura should ser bem caracterizados em termos da sua homogeneidade e estabilidade cromossómico no tempo para adaptação NCM. Notavelmente, a taxa de cariótipos anormais em condições NCM é muito menor do que a relatada em uma análise de coorte recente, em que os autores revelam 34% cariótipos anormais sob predominantes do tipo colônia condições de cultura 20. Assim, nosso estudo indica que podemos crescer células individuais dissociadas e manter sua estabilidade cromossômica em condições NCM. No entanto, também precisamos usar métodos mais sensíveis para examinar anormalidades cromossômicas de hPSCs nos próximos anos. Particularmente, precisamos analisar os cromossomos 1, 12, 17 e 20, utilizando sondas de alta resolução (ou seja, <50 kb), como algumas lesões menores (por exemplo, o 20q11.21 amplicon) nesses cromossomos freqüentemente alterados não podem ser detectados por convencional cariótipo e FISH 20-22. Além disso, o desenvolvimento de diversos protocolos NCM nos permitiria identificar Robuº e métodos seguros para aplicações futuras.

Cultura NCM sob diversas modificações

A utilização do inibidor de ROCK, Y-27632, foi aberta a porta para ensaios baseados em células únicas. A disponibilidade de inibidores ROCHA diversas iria proporcionar opções adicionais para a expansão à base de NCM e criopreservação de hPSCs (Figura 2). Em teoria, qualquer molécula pequena, que pode aumentar significativamente a eficiência de revestimento de uma única célula, podem ser utilizados para facilitar a cultura MNC. JAK inibidor 1, que funciona de forma diferente daquelas inibidores da Rocha, representa um exemplo 9. O uso de moléculas individuais ou abordagens combinatórias pode nos fornecer um crescimento ótimo celular, ensaios celulares, e criopreservação de hPSCs. Contudo, alternativa cultura de MNC hPSCs sobre proteínas da matriz extracelular, tais como definidos a laminina isoforma LN-521, normalmente expresso em hESCs 23-25, pode eliminar a interferência de pequenomoléculas (Figura 3). LN-521 pode melhorar dissociada-HPSC sobrevivência e sustenta pluripotência através da ativação da via α6β1-PI3K/AKT 24. A simplicidade de hPSCs Passaging com LN-521 reduz a heterogeneidade das células, compatível com vários sistemas de cultura de células e livre de xeno livre-feeder usando meio completamente definido (Protocolo 4). Ele também proporciona um módulo adicional para ensaios de elevado rendimento, sem a influência de moléculas pequenas. Embora as iPSCs sob cultura MNC no LN-521 manteve a expressão de um painel de marcadores, HPSC posterior caracterização destas células utilizando o ensaio de teratoma e embrióides diferenciação mediada multilinhagens-corpo pode ser necessário confirmar os estados pluripotentes nestas células. Digno de nota, hiPSCs cultivadas na laminina isoforma LN-521 são declaradamente citogeneticamente estável (http://biolamina.com/). No entanto, precisamos também aplicar métodos de maior resolução e sensíveis (como discutido acima) aexamine a estabilidade cromossómica nestas células.

Versatilidade da cultura NCM para a engenharia genética

Métodos baseados em NCM representar um sistema simples, robusto, e económico que pode ser particularmente útil para a manipulação genética de hPSCs (Protocolos 5-7). Sabe-se que as colónias de hES são difíceis de transfectar ou transduzir, com grande variabilidade na eficiência de transfecção / transdução de entre laboratórios diferentes 26-28. Por exemplo, a eficiência de transfecção em hESCs varia de 3 a 35% sob condições de cultura de 26 colónias. Sinais de transdução de lentivírus em células BG01 em condições de colônias foram encontrados para ser extremamente baixo 9. No entanto, a eficiência de transfecção mediada por NCM foi superior a 75% e 9, a modificação dos métodos de transdução pode aumentar mediada por lentivírus eficiência de transdução de até 90% 28. Um estudo comparativo apertado revelou que é the associações em colônias multicelulares hESC que contribuem para a baixa eficiência de transfecção 9. Além disso, foram recentemente modificada de um protocolo de transfecção microRNA e é capaz de alcançar uma alta eficiência de transfecção (~ 91%), sem a utilização de lentivírus (Protocolo 6 e Figura 4). Este protocolo é fácil de usar e particularmente útil para experiências de transfecção transiente dentro de um 3 - a 5 dias de tempo. Como já delineado em protocolos acima, vários fatores devem ser levados em considerações quando otimizar a eficiência de transfecção / transdução em hPSCs. Estes factores incluem a densidade de células, as concentrações de plasmídeos, os títulos de lentivírus, multiplicidade de infecção (MOI), duração de transfecção / transdução, a citotoxicidade dos reagentes, e os métodos utilizados para a monitorização da eficiência de transfecção / transdução.

Elaboramos e estender os métodos NCM para hPSCs cultura em Matrigel e em matrizes extracelulares definidos. Este método de culturaé uma maneira eficiente de eliminar a heterogeneidade comumente encontrados em HPSC colônia e culturas agregadas. Células-tronco pluripotentes humanas, em condições de crescimento NCM são pluripotentes e cromossomicamente estável. Este sistema de cultura romance é simples e versátil para a manutenção HPSC, a expansão em grande escala, e as manipulações genéticas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Countess automated cell counter Invitrogen Inc. C10227 Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL  Model RX-650 X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates Becton Dickinson Labware 353046 Polystyrene plates
DMEM Invitrogen Inc. 11965–092 For MEF medium
Mitomycin C Roche 107409 Mitotic inhibitor
Trypsin Invitrogen Inc. 25300-054 For MEF dissociation
DMEM/F12 Invitrogen Inc. 11330–032 For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium  Invitrogen Inc. 31985-062 For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS Invitrogen Inc. 16000–044 Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement Invitrogen Inc. 10828–028 KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline Invitrogen Inc. 14190-144 D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids Invitrogen 11140–050 NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine Invitrogen  25030–081 Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements StemCell Technologies 5850 Animal protein-free
TeSR2 & Supplements StemCell Technologies 5860 Xeno-free medium
β-mercaptoethanol Sigma  M7522 Component of hPSC medium

MEF (CF-1) ATCC
American Type Culture Collection (ATCC)  SCRC-1040 For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel BD Bioscience 354277 For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521 BioLamina LN521-02 Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic) R&D Systems, MN 223-FB Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10 StemCell Technologies 7930
Accutase Innovative Cell Technologies AT-104 1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I EMD4 Biosciences 420099 An inhibitor of Janus kinase
Y-27632 EMD4 Biosciences 688000 ROCK inhibitor
Y-27632 Stemgent 04-0012 ROCK inhibitor
Y-39983 Stemgent 04-0029 ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane Stemgent 04-0030 ROCK II inhibitor
Thiazovivin Stemgent 04-0017 A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer BD Bioscience 352340 40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C Thermo Scientific  C6516F-1 “Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000 Invitrogen Inc. 11668-027 Transfection reagents
DharmaFECT Duo Thermo Scientific T-2010-02 Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control Thermo Scientific IP-004500-01-05 Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs 
SMART-shRNA Thermo Scientific  To be determined Lentiviral vector
pmaxGFP amaxa Inc (Lonza) Included in every transfection kit Expression plasmid for transfection control
Oct-4 Santa Cruz Biotechnology sc-5279 Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1 Santa Cruz Biotechnology sc-21702 Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4 Santa Cruz Biotechnology sc-21704 Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60 Santa Cruz Biotechnology sc-21705  Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81 Santa Cruz Biotechnology sc-21706 Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51) Santa Cruz Biotechnology sc-8020 Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein Santa Cruz Biotechnology sc-8399 AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19) Santa Cruz Biotechnology sc-9187 FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1) Thermo Scientific MS-295-P0 Mouse IgG1
Desmin Thermo Scientific RB-9014-P1 Rabbit IgG
Anti-NANOG ReproCELL Inc, Japan RCAB0004P-F Polyclonal antibody 
Rat anti-GFAP Zymed 13-0300 Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3) Cedarlane Laboratories Ltd. CL2513A Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4) DakoCytomation Inc IR611/IS611 Mouse IgG2a
Nestin Chemicon International MAB5326 Rabbit polyclonal antibody
TUBB3 Convance Inc MMS-435P Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12) Cell Signaling Technologies 3113 Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution) Electron Microscopy Sciences 15710 PFA, fixative, diluted in D-PBS

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References

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Culturas alternativas para pluripotentes estaminais humanas produção de células, Manutenção e Análise Genética
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Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, More

Chen, K. G., Hamilton, R. S., Robey, P. G., Mallon, B. S. Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis. J. Vis. Exp. (89), e51519, doi:10.3791/51519 (2014).

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