Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l'analyse génétique

Introduction

La capacité de hPSCs de différencier vers les tissus adultes multilignée a ouvert de nouvelles voies pour le traitement des patients qui souffrent de maladies graves qui impliquent cardiovasculaires, hépatiques, pancréatiques, et les systèmes neurologiques ^1-4. Différents types de cellules dérivées de hPSCs seraient également fournir des plates-formes cellulaires robustes pour la modélisation de la maladie, le génie génétique, le dépistage des drogues et de tests toxicologiques ^1,4. La question clé qui assure leurs applications cliniques et pharmacologiques futures est la génération d'un grand nombre de hPSCs clinique de qualité à travers la culture de cellules in vitro. Cependant, les systèmes de culture actuels sont insuffisants ou de nature variable, impliquant diverses cultures nourricières et sans alimentation-de hPSCs les colonies ^5,6.

croissance de type colonie d'actions hPSCs de nombreuses caractéristiques structurelles de la masse cellulaire interne (ICM) d'embryons de mammifères début. L'ICM est sujette à se différencier en trois feuillets germinatifsdans un environnement multicellulaire du fait de l'existence de gradients de signalisation hétérogènes. Ainsi, l'acquisition de l'hétérogénéité dans le développement précoce de l'embryon est considéré comme un processus nécessaire à la différenciation, mais une caractéristique non désirée de la culture HPSC. L'hétérogénéité de la culture HPSC est souvent induite par des signaux apoptotiques excessives et différenciation spontanée en raison des conditions de croissance sous-optimales. Ainsi, dans le type de colonies de culture, les cellules hétérogènes sont souvent observés dans la périphérie des colonies ^7,8. Il a également été montré que les cellules dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) colonies réponses différentielles d'exposition à des molécules telles que BMP-4 ⁹ signalisation. En outre, les méthodes de culture des colonies produisent des rendements de cellules faibles ainsi que les taux de cryoconservation de récupération très faible de cellules en raison de taux de croissance et signalisation apoptotique incontrôlables cheminements de ^6,9. Ces dernières années, diverses cultures en suspension ont été développés pour hPSCs de culture, particulArly pour l'expansion de grandes quantités de hPSCs en alimentation-et les conditions sans matrice ^6,10-13. Il est évident que différents systèmes de culture ont leurs propres avantages et inconvénients. En général, la nature hétérogène de hPSCs représente l'un des principaux inconvénients des méthodes colonie de type et de la culture agrégées, qui sont sous-optimal pour la livraison des matériaux d'ADN et d'ARN dans hPSCs pour le génie génétique ^6.

De toute évidence, il est impératif de développer de nouveaux systèmes qui contournent certaines lacunes des méthodes de culture actuelles. Les découvertes d'inhibiteurs de petites molécules (comme l'inhibiteur de ROCK Y-27632 et JAK inhibiteur 1) qui améliorent la survie de cellule unique ouvrent la voie à dissociée-HPSC culture ^14,15. Avec l'utilisation de ces petites molécules, nous avons récemment développé un procédé de culture en fonction du type non-colonie (MR) de la croissance dissociées ^hPSCs-9. Cette nouvelle méthode de culture combine à la fois des passages à cellule unique et de haute densitéplacage méthodes, ce qui nous permet de produire de grandes quantités de hPSCs homogènes sous des cycles de croissance cohérentes sans grandes anomalies chromosomiques ^9. En variante, la culture peut être mise en œuvre NCM avec différentes petites molécules et des matrices telles que définies (laminines) afin d'optimiser le procédé de culture pour les applications de large. Ici, nous présentons plusieurs protocoles détaillés sur la base de la culture NCM et délimiter des procédures détaillées pour l'ingénierie génétique. Pour démontrer la polyvalence de protocoles MR, nous avons également testé la culture NCM avec des inhibiteurs de ROCK diverses et avec la seule isoforme de laminine 521 (c.-à-LN-521).

Protocol

Base unique cellule non-colonie de type monocouche (NCM) culture de hPSCs.

1. Préparatifs

1. Ajoutez 500 ml de milieu de culture de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF): milieu DMEM supplémenté avec 10% de FBS, 2 mM de L-glutamine et 0,1 mM d'acides aminés non essentiels (NEAA).
2. Isoler les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) des cellules dérivées de la souche CF1 suivant un protocole de routine ¹⁶ et MEF culture sur 0,1% de gélatine revêtues plaque à 6 puits de culture de cellules dans du milieu DMEM. Sinon, acheter des actions du MEF au passage 3 de ressources commerciales.
3. Préparer plaques Matrigel.
   1. Diluer 5 ml de CSEh qualifié Matrigel actions avec 5 ml de milieu DMEM/F12 (refroidi à ~ 4 ° C) et l'enregistrer comme 50% des aliquotes dans un congélateur à -20 ° C. Décongeler le stock congelé Matrigel dans un réfrigérateur (4 ° C ~) O / N et diluer encore le Matrigel dans du milieu DMEM/F12 froid (pour donner lieu à une concentration de travail de 2,5%).
   2. Retirer la plaque Matrigel du réfrigérateur, laisser la plaque se réchauffer à la température ambiante dans la hotte de culture cellulaire pour 10 à 30 min (Note: ne pas chauffer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire), et aspirer milieu DMEM avant le placage hPSCs.
4. Ajoutez 500 ml de milieu de hESC: moyenne de 80% de DMEM/F12, 20% KSR, 2 mM de L-glutamine, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 0,1 mM de β-mercaptoéthanol, et 4 ng / ml de FGF-2.
5. Préparer 10 ml de 2X HPSC milieu de congélation: 60% de FBS, 20% de DMSO et 20 uM Y-27632 dans un milieu mTeSR1, stériliser par filtration, et utiliser le support dans 1 semaine.

. 2 Protocole 1 (de base): Cultivez HPSC colonies en distribution

1. Utilisez des numéros de passage du MEF à 5 ou 6 (désigné comme P5 et P6) pour la culture HPSC afin d'obtenir résul cohérentets. Inactiver mitotique MEF en traitant les cellules avec 10 pg / ml C mitomycine pendant 3 heures à 37 ° C, laver les cellules 3 fois avec du tampon phosphate salin de 1X Dulbecco (D-PBS), puis se dissocient MEF avec 0,05% de trypsine dans 0,53 mM EDTA. Sinon, irradier MEF à une dose de 8000 rads avec un irradiateur X-ray.
2. Compter le nombre de cellules en utilisant la méthode d'exclusion du colorant bleu Trypan sous microscope. Vous pouvez également utiliser un compteur de cellules automatique.
3. Plate MEF irradiés sur des plaques de polystyrène à 6 puits revêtus avec 0,1% de gélatine à une densité de 1,88 x 10 ⁵ cellules par puits (par exemple, 1,96 x 10 ⁴ cellules / cm ^2). Incuber les cellules à 37 ° C et 5% _de CO2 pendant 24 heures.
4. Retirez le milieu de culture MEF par aspiration avec une pipette Pasteur (Remarque: aucun des étapes de lavage nécessaires à ce moment).
5. Colonies triturer HPSC de la culture précédente en petits bouquets, examinent les touffes sous microscope pour s'assurer que leurs tailles allant from 50 à 100 um de diamètre, et de la plaque touffes HPSC sur le dessus de couches nourricières du MEF dans un puits contenant 2 ml de milieu HPSC.
6. Changer CSEh moyen quotidien de 3 à 5 jours, une croissance record de la colonie par la photo, marquer les colonies morphologiquement modifiés ou différenciées (~ 5%), et supprimer manuellement les colonies marquées par aspiration doucement avec une pipette Pasteur.
7. Rincer les colonies restantes sur les MEF deux fois (2 min chacun avec du D-PBS) et incuber les colonies avec 2 ml de 1 mg / ml de collagénase IV en milieu HPSC pendant 10 à 30 min), et examiner le détachement des colonies HPSC de l' MEF surface revêtue (Remarque: Utilisez un grattoir pour aider le processus de détachement que si les colonies sont étroitement attachés à la plaque).
8. Ajouter 5 ml de milieu HPSC à chaque puits pour minimiser les réactions enzymatiques, les colonies de transfert à un tube de 15 ml, permet colonies HPSC dans les sédiments de 3 à 5 min à température ambiante, et de veiller à la sédimentation des colonies par la visualisation directe de la caunes au fond du tube (Note: ne pas centrifuger le tube à cette étape).
9. Retirez les surnageants contenant MEF résiduelles et dissocié des cellules individuelles, remettre en suspension les colonies avec 5 ml de milieu de CSEh, et répéter deux fois l'étape de sédimentation.
10. Retirez les moyennes, les colonies triturer HPSC en petits bouquets, magasin en 1X HPSC milieu de congélation (ou CryoStore CS10 milieu de congélation) pour la cryoconservation (1 confluent bien par flacon congelé) ou une plaque sur une plaque à 6 puits pour des passages de cellule.

3 protocole n ° 2:. Autre HPSC colonies de mangeoires pour NCM

1. Rincer pastilles HPSC par D-PBS une fois, incuber les boulettes avec 1 ml d'Accutase 1X pendant 10 min, et la réaction enzymatique examiner au microscope pour assurer la dissociation de cellule unique.
2. Terminer les réactions enzymatiques en remettant en suspension les cellules doucement dans 5 ml de milieu contenant 10 uM mTeSR1 Y-27632 suivie d'une centrifugation à 200 x g à température ambiante pendant 5 min(Note, ne pas utiliser les forces de centrifugation excessives qui causent des dommages aux cellules).
3. Ajouter 5 ml de milieu mTeSR1 au culot, remettre le culot de cellules individuelles, et filtre dissocié cellules à travers un tamis cellulaire de 40 pm (pour éviter les agrégats de cellules résiduelles).
4. Semences 1.3-2 x 10 ⁶ hPSCs dans un puits (1.4 à 2.1 x 10 ⁵ cellules / cm ²⁾ d'une plaque à 6 puits revêtu de 2,5% CSEh qualifié Matrigel, ajoutent moyen mTeSR1 jusqu'à 2,5 ml, et comprennent 10 uM Y-27632 dans le milieu (pour faciliter le départ de 24 h à cellule unique placage). Sinon, utiliser les petites molécules suivantes pour remplacer 10 uM Y-27632 pour l'amélioration de placage seule cellule: 1 uM Y-39983 (ROCK je inhibiteur), 1 uM phenylbenzodioxane (inhibiteur ROCK II), 1 uM thiazovivin (un inhibiteur de ROCK roman) , et l'inhibiteur de JAK 2 pM 1.
5. Remplacez le support avec un milieu de mTeSR1 sans drogue le jour suivant (à moins de 24 h), dissocier les cellules d'un supplémentbien, et compter le nombre de cellules pour déterminer l'efficacité de placage seule cellule (Note: environ 50 à 90% de mono-cellulaire efficacité de placage qui peut être atteint à ce stade).
6. Permettent aux cellules de se développer comme un seul formé de cellules monocouche pour quelques jours avec 3 ml de milieu mTeSR1. Changer le milieu tous les jours.
7. Empiriquement déterminer le calendrier pour repiquer adapté MR en fonction de la densité cellulaire. Passage lorsque la croissance cellulaire atteint confluence à jour 3 ou 4 jours, ou au point de temps de 4 heures après la disparition des frontières de cellule à cellule. Dissocier les cellules dans 1 ml d'Accutase, utiliser un rapport de 1 à 3 de fendage (c.-à-confluente bien une des cellules étalées dans 3 puits de plaque à 6 puits) de passages des cellules, et de stabiliser adapté NCM par cinq passages.
8. Cellule de congélation
   1. Utiliser un puits de confluence (5-6 ~ x10 ⁶ cellules) pour un flacon congelé: dissocier les cellules d'un puits confluentes avec 1 ml d'Accutase pendant 10 min.
   2. Diluer with 5 ml de mTeSR1 cellules moyen et centrifugation comme décrit ci-dessus.
   3. Reprendre le culot dans 500 ul de milieu mTeSR1 puis ajouter lentement 500 pi de 2X HPSC milieu de congélation (contenant 20 uM Y-27632) dans un flacon de cryoconservation. En variante, remettre en suspension les cellules dans 1X HPSC milieu de congélation contenant un inhibiteur de JAK 2 uM 1 ou 1X milieu CryoStor CS10 en présence de 10 pM soit Y-27632 ou 2, l'inhibiteur de JAK de 1 uM.
   4. Placez les flacons congelés dans un réservoir cryogénique de glace réfrigéré (en bas-rempli avec isopranol) et transférer immédiatement le cryogénique à -80 ° C congélateur.
   5. les cellules de transfert à partir de la congélation de -80 ° C à un réservoir d'azote liquide (le jour suivant) pour la cryoconservation à long terme.
9. Cellule dégel
   1. Utiliser un flacon de cryoconservation pour le placage 1 puits d'une plaque à 6 puits.
   2. Préchauffer mTeSR1 milieu dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 10 min, les cellules de dégel dans le même bain d'eau pendant 2 min,goutte à goutte ajouter des cellules à 5 ml de milieu mTeSR1 préchauffé contenant 10 uM Y-27632, et centrifuger comme décrit ci-dessus.
   3. Resuspendre doucement les boulettes de cellules avec 2 ml de milieu mTeSR1 contenant 10 uM Y-27632 et transférer progressivement les cellules à un bien pré-enduit de Matrigel (Remarque: éviter de produire des bulles d'air).
   4. Changer moyen quotidien et s'attendent à une croissance HPSC pour atteindre la confluence à jour 3 ou 4.

4 Protocole 3:. Autre HPSC colonies sur Matrigel à NCM Culture

1. Retirer une plaque revêtue de Matrigel réfrigérateur, placez la plaque dans la culture de tissus capot pour 10 à 30 min, retirez le support de chaque puits de la plaque, et ajouter 2 ml de milieu mTeSR1 préchauffé à chaque puits.
2. Transfert des touffes HPSC trituré à partir de la culture d'alimentation (étape 2.10 du protocole de base) à la plaque de Matrigel ci-dessus. Ajouter à moyen mTeSR1 jusqu'à 2,5 ml volume final dans chaque puits.
3. Changer le milieu tous les jours pendant 3 à 4 jourss jusqu'à ce que les colonies atteignent 80 à 90% de confluence.
4. Pour des passages de cellule: rincer les colonies avec D-PBS deux fois, traiter les cellules avec 1 ml de 2 mg / ml dispase à 37 ° C pendant 15 à 20 minutes, et les cellules de sédiments et de passage comme les grumeaux.
5. Pour la culture NCM: répétez les étapes 3.1 à 3.9 décrites dans le protocole 2.

5 Protocole 4:. NCM Culture de hPSCs sur LN-521

1. Décongeler la solution recombinant LN-521 à 4 ° C avant le jour de l'utilisation et de préparer la solution de revêtement de la laminine (LCS) en diluant la laminine décongelé avec 1X D-PBS (contenant du Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +)} à une concentration finale de 10 pg / ml.
2. Ajouter 1 ml de la LCS à un puits dans une plaque à 6 puits (note: éviter à sec pendant le processus de revêtement).
3. Sceller la plaque enduite avec du Parafilm pour éviter l'évaporation et stocker la plaque au réfrigérateur (4 ° C) O / N (note: utiliser la plaque dans 1 semaine).
4. Retirez délicatement les LCS avec une pipette Pasteur sans pouruching la surface revêtue et ajouter 2 ml de milieu mTeSR1 pour un bien.
5. Réchauffer toutes les solutions de culture (y compris D-PBS) dans un bain à 37 ° C de l'eau pendant 25 min.
6. Convertir colonies HPSC à NCM
   1. Dissocier les agrégats de cellules à cellules individuelles avec Accutase comme décrit dans le protocole 2.
   2. Semences 1.3-2 x 10 ⁶ hPSCs dans un puits LN-521-enduit (1.4 à 2.1 x 10 ⁵ cellules / cm ²⁾ sans la présence d'inhibiteurs de ROCK.
   3. Changer le milieu tous les jours pendant 3 à 4 jours.
   4. Dissocier les cellules dans 1 ml d'Accutase au jour 3 ou 4, pour le repiquage de la cellule suivante en utilisant un rapport de 1 à 3 de fendage.

. 6 Protocole 5: NCM Culture pour l'ADN plasmidique transfection

1. Adapter colonies HPSC à la culture NCM comme décrit dans les protocoles de 2 à 4.
2. Plate dissocié hPSCs en plaque de 12 puits avec une densité de cellules de 7,5 x 10 ⁵ cellules / puits dans du milieu mTeSR1 en présence de 10 pM de Y-27632.
3. Remplacer moyen mTeSR1 avec le milieu mTeSR1 sans drogue entre 4-8 heures après l'étalement des cellules.
4. Pour chaque transfection, diluer 2,5 pg de plasmides d'expression (par exemple, pmaxGFP) et 5 ul de Lipofectamine 2000 dans des tubes Eppendorf séparées dans 125 pi de chacun d'Opti-MEM Reduced Serum Medium.
5. Après 5 min, mélanger les réactifs dilués et incuber pendant 20 min à température ambiante (pour former des complexes de transfection).
6. Ajouter les complexes de transfection de 250 ul à chaque puits contenant 1 ml hPSCs en milieu mTeSR1 et incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à CO ₂ pendant 24 heures.
7. Examiner l'efficacité de la transfection sous un microscope à fluorescence et la photographie de manière aléatoire pour le calcul de l'efficacité de transfection réelle.

. 7 Protocole 6: NCM Culture pour la transfection de microARN

1. Dissocier hPSCs semi-confluentes à jour 2 dans des conditions NCM en ajoutant 1 ml de Accutase par puits dans 6 Puits plaque.
2. Ajouter 10 ml de milieu mTeSR1 pour diluer les réactions enzymatiques et centrifuger à 200 g pendant 5 min.
3. Reprendre le culot cellulaire avec du milieu mTeSR1, ensemencer les cellules à une densité de 7,5 x 10 ⁵ cellules par puits dans une plaque de 12 puits dans un milieu contenant 10 uM mTeSR1 Y-27632, et que les cellules se fixent pendant 4 heures.
4. Remplacez le support avec le milieu Y27632 sans mTeSR1.
5. Utilisez disponible dans le commerce microARN (par exemple, un miRIDIAN miRNA contrôle de transfection non-ciblage marqué avec Dy547). Titrer des concentrations allant de 0 à 160 nm en utilisant les réactifs fournis et suivez les instructions du fabricant.
6. Optimiser l'efficacité de la transfection pour chaque concentration en traits HPSC par imagerie de la fluorescence Dy547 des cellules vivantes sous un microscope à 24 h après la transfection.
7. Calculer les efficacités de transfection en fonction du pourcentage de cellules positives Dy547 sur toutes les cellules imagées.

. tle "> 8 Protocole 7: NCM Culture pour la transduction du vecteur lentiviral

1. Répétez les étapes 7.1 à 7.4 du Protocole 6.
2. Calculer les quantités de particules virales à être utilisés pour la transduction: Utilisez la formule suivante: TU = (MOI x CN) / VT, alors TU représente le nombre total d'unités de transformation, MOI est égale à la multiplicité souhaitée de l'infection dans le puits (MOI ou TU / cellule), le CN indique le nombre de cellules dans chaque puits, et VT indique d'titres viraux (TU / ml). Par exemple, étant donné que les actions des titres viraux pour SMART-shRNA vecteur est égal à 1 x 10 ⁹ TU / ml (unités de transformation par ml), 7,5 x 10 ⁵ cellules par puits au moment de la transduction, et une MOI attendue de 20: 15 utilisent pl des actions particules virales pour chaque bien (à noter: cette condition est recommandé pour l'induction transitoire lentivirus).
3. Préchauffage 300 ul de milieu mTeSR1 avec 10 mg / ml de polybrène pendant 30 min.
4. Ajouter 15 ul de particules virales dans d'le milieu mTeSR1 préchauffé contenant polybrene et mélanger doucement la solution.
5. Remplacer le milieu de culture de cellules avec 300 pi de milieu préchauffé contenant les particules virales.
6. Après 4 heures d'incubation, examiner turboGFP fluorescence (un fabricant d'expression shRNA) pour déterminer l'efficacité de transduction.
7. Ajouter 300 ul de milieu mTeSR1 supplémentaire pour la transduction bien lorsque les cellules commencent à exprimer turboGFP.
8. Après 12-16 heures d'incubation, réexaminer expression turbo-GFP.
9. Réaliser des expériences de suivi souhaités avec ces cellules transduites dans les 72 heures.

Representative Results

Un schéma général de la culture NCM

La figure 1 représente un schéma typique de culture NCM montrant les changements dynamiques de hPSCs après placage à forte densité de cellule unique en présence de l'inhibiteur de ROCK Y-27632. Ces changements morphologiques comprennent des connexions intercellulaires après placage, la formation de grappes cellulaires, et la croissance cellulaire exponentielle suivie d'une condensation de cellules (Figure 1A). Une expérience représentative indique WA01 (H1) CSEh, plaqué comme cellules individuelles à une densité de 1,9 x 10 ⁵ cellules / cm ² en présence de 10 pM de Y-27632 au jour 1 (figure 1B, panneau de gauche), à la suite propagé sans la formation de colonies (figure 1B, panneau du milieu) au jour 2, et condensé en monocouche homogène qui est approprié pour les expériences souhaitées ou pour repiquage des cellules au jour 3 (figure 1B, panneau de droite).

<> Divers inhibiteurs de ROCK fortes soutenir la culture NCM

Un essai de plaque de 96 puits a été utilisé pour la preuve de concept de dépistage de drogues à haut débit. Il a également été conçu pour optimiser l'utilisation de différents inhibiteurs de ROCK pour soutenir la culture NCM. Environ 31 000 cellules dissociées SCU-i10, des cellules pluripotentes humaines induites (hiPSCs) ^17, ont été étalées sur un Matrigel revêtu bien en présence de différentes concentrations d'inhibiteurs de ROCK. Après 24 h, les cellules ont été soumises à l'essai de survie basé CCK-8 pour déterminer la survie des cellules dans ces conditions. Nous avons précédemment montré que la méthode NCM requiert l'utilisation de l'inhibiteur de ROCK, le Y-27632, à 10 uM pour améliorer le placage à cellule unique. Dans ce rapport, nous avons confirmé que 10 uM Y-27632 augmenter de manière significative 24 h unicellulaire efficacité d'étalement de hiPSCs (P <0,05) (figure 2). Nous avons également constaté que Y-39983 (ROCK je inhibiteur), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitionteur), et thiazovivin (un inhibiteur de ROCK roman) moduler significativement unicellulaire efficacité de placage et de promouvoir la croissance NCM à 1 uM par rapport à leurs témoins (p <0,05) (figure 2). En outre, les effets des trois inhibiteurs de ROCK (à 1 uM) sur une seule cellule efficacité d'étalement étaient comparables à celle de Y-27632 à 10 uM (P> 0,05) (figure 2). Notamment, le ROCK je inhibiteur (à 5 uM) semble montrer cytotoxicité marquée par rapport à la drogue à 1 uM (P <0,05), impliquant une interaction plus spécifique que les autres molécules. Ainsi, différents inhibiteurs de ROCK peuvent être utilisés pour soutenir la culture NCM à l'avenir. Cependant, une caractérisation complète des deux CSEh et hiPSCs sous NCM avec ces nouveaux inhibiteurs serait nécessaire pour une utilisation future.

LN-521 soutient la culture NCM sans l'utilisation d'inhibiteurs de ROCK

Pour déterminer til le rôle d'une isoforme spécifique laminine pour soutenir la croissance des CSEh, nous cultivée hiPSCs SCU-i30 sur des plaques LN-521-enduits dans le milieu sans xéno-TeSR2. Fait intéressant, LN-521 seul, sans la présence d'inhibiteurs de ROCK, soutient le placage unique et la croissance cellulaire NCM ultérieure pour 15 passages dans ces conditions (figure 3). Immunomarquage de cellules SCU-i30 avec un anticorps polyclonaux anti-NANOG indiqué que les cellules sous cette condition avaient expression NANOG élevé dans les noyaux (figure 3A). Analyse par cytométrie de flux a montré que le profil d'expression de marqueur de CSEh était similaire aux cellules cultivées comme MR en utilisant l'inhibiteur de ROCK Y-27632 (figure 3B).

Haute efficacité de la prestation des microARN sans l'utilisation de particules lentiviraux

Transfection avec des microARN oligonucléotidiques marquées Dy547 a été réalisée en WA01 (H1), les cellules dans des conditions MR. CSEh WA01 ont été cultivées sur des MR 2,5% de Matrigel dans mTeSR1 pour 2 (figure 4A) et 18 (figure 4B) passages, respectivement. Ces cellules ont montré une grande h post-transfection efficacité de transfection 24 (figures 4A et 4B). En général, nous pouvons obtenir l'efficacité de transfection jusqu'à 91% dans les CSEh à 24 h après la transfection.

Figure 1. (A) Schéma de la culture NCM. Le graphique de la ligne délimite les changements dynamiques de l'association multicellulaire dans une culture typique de 3 jours dans des conditions NCM. (B) images de phase représentatifs de WA01 (H1) CSEh reproduits sous une condition NCM de 2,5% Matrigel en milieu mTeSR1 pour 16 passages (désignés comme WA01, mcp16). Le panneau inférieur est la vue agrandie du panneau supérieur. Barres d'échelle indiquent 100 um.ef = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/51519/51519fig1highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. Des dosages de survie de cellules uniques en utilisant un format 96 puits. Environ 31.000 hiPSCs SCU-i10 ¹⁷ ont été étalées sur 2,5% de Matrigel en présence de divers inhibiteurs de petites molécules liées à la kinase Rho-associés (ROCHE) les parcours à des concentrations indiquées . Après 24 h, les cellules ont été soumises à l'essai de survie CCK-8 par mesure de l'absorbance à 450 nm (A450). Le test t de Student a été utilisé pour déterminer si les différences dans une seule cellule efficacité de placage entre les différents inhibiteurs de ROCK sont de signification statistique. Le signe astérisque singulier (*) indique qu'il n'ya pas de différences significatives entre les inhibiteurs (P & #62; 0,05), alors que les doubles des signes d'astérisque (**) désigne la différence observée est de la signification statistique (P <0,05). Colonnes dans les histogrammes désignent les valeurs moyennes des déterminants et des bars quadruple représentent les écarts types.

Figure 3. Culture NCM de hiPSCs sur la laminine-521 (LN-521) sans la présence d'inhibiteurs de ROCK. L'ligne hiPSC SCU-i30 a été établi à la NIH Stem Cell Unit. Cellules SCU-i30 ont été cultivées sur LN-521 revêtues des plaques 6 puits à la libre xéno-moyen TeSR2 pour 15 passages sans l'utilisation d'inhibiteurs de petites molécules comme les inhibiteurs de ROCK. (A) Immunomarquage de cellules SCU-i30 avec un anti -NANOG anticorps polyclonaux et contre-avec Hoechst 33342 (Hoechst). Notamment, certaines cellules qui ont une coloration négative NANOG sont ecellules de e sous la mitose. (B) Débit d'analyse par cytométrie de HPSC expression du marqueur dans les cellules SCU-i30 cultivées comme NCM de 2,5% Matrigel avec l'utilisation de 10 uM Y-27632 (panneau supérieur) ou NCM sur LN-521 sans Y-27632 (panneau inférieur). Les procédures pour la coloration immunologique et l'analyse par cytométrie en flux ont été décrites précédemment ^5. Barres d'échelle représentent 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. NCM culture de hPSCs pour microARN transfection. WA01 CSEh ont été cultivées comme NCM de 2,5% Matrigel dans mTeSR1 pour 2 (A) et 18 (B) passages, respectivement. Images de phase et de fluorescence représentatifs de cellules transfectées avec WA01 Dy547 marqué au micro-ARN de contrôle pour la surveillance de l'efficacité de transfection 24 h après la transfection. Barres d'échelle représentent 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Il ya deux façons principales de hPSCs de culture in vitro: culture classique de type colonie (des cellules sur des mangeoires ou des matrices extracellulaires) et de la culture de suspension de hPSCs que les agrégats sans mangeoires ^6. Les limites de ces deux type de colonie et de la suspension des méthodes de culture comprennent hétérogénéité accumulé et les changements épigénétiques héritables. NCM culture, sur la base à la fois des passages à cellule unique et à haute densité cellulaire plaquage, constitue une nouvelle méthode de culture de ^6,18 HPSC de croissance. Bien que diverses méthodes de passages à cellule unique ont été documentés dans la littérature, mais aucun d'entre eux sont utilisés pour la propagation de routine. Par exemple, Wu et ses collègues ont utilisé une méthode de passages à cellule unique pour étudier les effets de différentes petites molécules cocktails sur la croissance HPSC ^19. Toutefois, leurs produits de la culture sont finales colonies. Ainsi, les méthodes de passages seule cellule faibles fondé sur la densité appartiennent encore au type de colonie culture. En ce qui concerne la culture NCM, les hauts-tanièreslité placage transforme cette culture à une nouvelle méthode, étant donné que le produit final de cellules est une monocouche homogène. Récemment, Dvorak et ses collègues ont utilisé la méthode similaire à analyser de manière approfondie les propriétés HPSC sous cette condition de croissance ^18. Leurs résultats soutiennent également nos principales conclusions. Il est maintenant clair que la culture NCM est une nouvelle méthode qui possède plusieurs nouvelles propriétés et peut en outre être modifié pour de nombreuses applications potentielles dans pluripotentes biologie des cellules souches.

Les propriétés de base de hPSCs de culture NCM

Il est concevable que hPSCs sous NCM part de la culture de nombreuses caractéristiques avec les mêmes types de cellules cultivées comme des colonies ^9,18. Les taux des marqueurs de CSEh dans hPSCs, qui comprennent Oct-4, NANOG, AESS-3/4, Tra-1-60, Tra-1-81 et l'AESS-1, expression sont similaires dans les deux MR et de type colonie culture . NCM cellules adaptées conservent également des tendances similaires d'expression d'ARNm mondiale de colonies HPSC cultivés sur MEF couches d'alimentation ^9. De toute évidence, les cellules NCM adaptées maintenir l'état pluripotent tel que déterminé par dosage tératome ^9,18. Cependant, contrairement à HPSC colonies, les cellules dans des conditions MR ont un taux de croissance prévisible qui est caractérisé par des courbes de croissance, cohérentes cycles cellulaires, et le nombre de cellules ^9. En raison de la haute densité à cellule unique placage, hPSCs dans des conditions NCM affichent une croissance exponentielle entre les jours 2 et 4 (figure 1B), ce qui augmente le nombre de cellules de 4 fois par rapport aux colonies cultivées sur HPSC MEF. Culture prolongée n'augmente pas la production de cellules, mais augmente l'apoptose et la différenciation de stress ^9. NCM permet également cryoconservation optimale, permettant ainsi la récupération rapide des cellules sur placage cellules décongelées (Protocole 1). De plus, NCM facilite l'adaptation de la culture HPSC différents protocoles sans ^xéno-9. En général, MR soutient la croissance de hPSCs, maintient l'état pluripotent, et soutient le potentieltiel de hPSCs à se différencier en tissus adultes des trois feuillets embryonnaires.

stabilité chromosomique dans hPSCs sous NCM

En termes de stabilité chromosomique, il n'y a aucune comparaison directe entre les cellules provenant de différents procédés de culture. La majorité des hPSCs dans nos conditions de culture NCM ont caryotypes normaux et le nombre de copies du gène tel que déterminé par G-banding, l'hybridation génomique comparative basée sur la baie (aCGH), et l'hybridation fluorescente in situ (FISH) ^9. Deux lignes (~ 13%) ont montré caryotype anormal, dans lequel une ligne (c.-à-WA09) exposé polyploïdie élevée et un autre (ES01) avaient 14% de cellules ayant la trisomie 20 ^9. On ne sait pas si ces caryotypes anormaux ont été tirées de la sélection de cellules préexistantes mutés avant la culture NCM ou induits lors NCM adaptation. Il est important que les colonies ou sous-ensemble de colonies HPSC départ utilisés pour la culture sh NCMould être bien caractérisé en termes de leur homogénéité et de la stabilité chromosomique à l'époque pour NCM adaptation. Notamment, le taux de caryotypes anormaux dans des conditions NCM est beaucoup plus faible que celui rapporté dans une analyse de cohorte récente, dans laquelle les auteurs révèlent 34% caryotype anormal sous prédominantes conditions de culture de type colonie ^20. Par conséquent, notre étude indique que nous pouvons cultiver des cellules simples-dissociées et maintenir leur stabilité chromosomique dans des conditions NCM. Néanmoins, nous avons besoin aussi d'utiliser des méthodes plus sensibles pour examiner les anomalies chromosomiques de hPSCs dans les années à venir. En particulier, nous devons analyser les chromosomes 1, 12, 17, et 20 à l'aide de sondes plus élevés de résolution (c'est à dire, <50 ko), comme certaines lésions mineures (par exemple, l'amplicon 20q11.21) à ces chromosomes fréquemment modifiées ne peuvent pas être détectés par classique caryotype et FISH ^20-22. En outre, l'élaboration de protocoles divers NCM nous permettra d'identifier Robust et des méthodes sûres pour des applications futures.

Culture NCM sous diverses modifications

L'utilisation de l'inhibiteur de ROCK, Y-27632, a ouvert la porte à des analyses basées seule cellule. La disponibilité des inhibiteurs de ROCK diverses donnerait plus de choix pour l'expansion à base de NCM et la cryoconservation de hPSCs (Figure 2). En théorie, toute petite molécule, qui peut augmenter considérablement l'efficacité de cellule unique de placage, peut être utilisé pour faciliter la culture des MR. JAK inhibiteur 1, qui fonctionne différemment de ces inhibiteurs de ROCK, représente un exemple ^9. L'utilisation de molécules simples ou des approches combinatoires peut nous assurer une croissance optimale des cellules, des tests cellulaires, et la cryoconservation de hPSCs. Cependant, la culture NCM variante de hPSCs sur les protéines de la matrice extracellulaire, tels que définis la laminine isoforme LN-521, normalement exprimée dans les cellules hES ^23-25, peut éliminer l'interférence de petitesmolécules (figure 3). LN-521 pourrait améliorer la survie dissociée-HPSC et soutient la pluripotence par l'activation de la voie α6β1-PI3K/AKT ^24. La simplicité de hPSCs de passages avec LN-521 réduit l'hétérogénéité des cellules, compatibles avec les différents systèmes de culture cellulaire et d'une connexion xéno-gratuit-alimentation en utilisant un milieu complètement défini (protocole n ° 4). Il fournit également un module supplémentaire pour tests à haut débit sans l'influence de petites molécules. Bien que les CSPi sous culture NCM sur LN-521 retenus l'expression d'un panel de marqueurs HPSC, outre la caractérisation de ces cellules à l'aide de test de tératome et la différenciation de multilignée corps médiation embryoïde peut être nécessaire pour confirmer les Etats pluripotentes dans ces cellules. Fait à noter, hiPSCs cultivées sur la laminine isoforme LN-521 seraient cytogénétique stable (http://biolamina.com/). Cependant, nous avons également besoin d'appliquer à plus haute résolution et sensibles méthodes (voir ci-dessus) à eXamine la stabilité chromosomique dans ces cellules.

Polyvalence de la culture NCM pour le génie génétique

Méthodes basées sur la NCM représentent un système simple, robuste et économique qui peut être particulièrement utile pour la manipulation génétique de hPSCs (Protocoles 5-7). On sait que les colonies hESC sont difficiles à transfecter ou transduire, avec une grande variabilité dans l'efficacité de transfection / transduction entre les différents laboratoires ^26-28. Par exemple, l'efficacité de transfection dans les cellules hES varie de 3 à 35% des colonies sous des conditions de culture ^26. Des signaux de transduction lentiviraux dans des cellules dans des conditions BG01 de colonies se sont révélées être extrêmement bas ^9. Cependant, l'efficacité de la transfection médiée par NCM a été supérieure à 75% et ⁹ modification des méthodes de transduction peut augmenter l'efficacité de la transduction médiée par un lentivirus jusqu'à 90% ^28. Une étude comparative serré a révélé qu'il est ee associations de colonies multicellulaires hESC qui contribuent à la faible efficacité de transfection ^9. En outre, nous avons récemment modifié d'un protocole de transfection de microARN et sont capables d'atteindre une efficacité de transfection élevée (~ 91%), sans l'utilisation de lentivirus (Protocole 6 et figure 4). Ce protocole est facile à utiliser et particulièrement utile pour les expériences de transfection transitoire au sein d'un 3 - au laps de temps de 5 jours. Comme nous l'avons délimité dans les protocoles ci-dessus, plusieurs facteurs doivent être pris en considérations lorsque nous optimisons l'efficacité de transfection / transduction dans hPSCs. Ces facteurs comprennent la densité cellulaire, la concentration de plasmide, les titres lentiviraux, multiplicité d'infection (MOI), la durée de transfection / transduction, la cytotoxicité des réactifs et des procédés utilisés pour l'efficacité de transfection de surveillance / transduction.

Nous élaborons et étendre les méthodes MR à hPSCs de culture sur Matrigel et sur les matrices extracellulaires définies. Cette méthode de cultureest un moyen efficace pour éliminer l'hétérogénéité trouve couramment dans les colonies HPSC et cultures agrégées. Cellules souches pluripotentes humaines dans des conditions de croissance MR sont pluripotentes et chromosomique stable. Ce nouveau système de culture est simple et polyvalent pour HPSC entretien, expansion à grande échelle, et les manipulations génétiques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System	Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL	Model RX-650	X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates	Becton Dickinson Labware	353046	Polystyrene plates
DMEM	Invitrogen Inc.	11965–092	For MEF medium
Mitomycin C	Roche	107409	Mitotic inhibitor
Trypsin	Invitrogen Inc.	25300-054	For MEF dissociation
DMEM/F12	Invitrogen Inc.	11330–032	For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Invitrogen Inc.	31985-062	For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS	Invitrogen Inc.	16000–044	Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement	Invitrogen Inc.	10828–028	KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144	D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140–050	NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030–081	Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements	StemCell Technologies	5850	Animal protein-free
TeSR2 & Supplements	StemCell Technologies	5860	Xeno-free medium
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	Component of hPSC medium
MEF (CF-1) ATCC	American Type Culture Collection (ATCC)	SCRC-1040	For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel	BD Bioscience	354277	For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521	BioLamina	LN521-02	Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)	R&D Systems, MN	223-FB	Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104	1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I	EMD4 Biosciences	420099	An inhibitor of Janus kinase
Y-27632	EMD4 Biosciences	688000	ROCK inhibitor
Y-27632	Stemgent	04-0012	ROCK inhibitor
Y-39983	Stemgent	04-0029	ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane	Stemgent	04-0030	ROCK II inhibitor
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer	BD Bioscience	352340	40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C	Thermo Scientific	C6516F-1	“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000	Invitrogen Inc.	11668-027	Transfection reagents
DharmaFECT Duo	Thermo Scientific	T-2010-02	Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control	Thermo Scientific	IP-004500-01-05	Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs
SMART-shRNA	Thermo Scientific	To be determined	Lentiviral vector
pmaxGFP	amaxa Inc (Lonza)	Included in every transfection kit	Expression plasmid for transfection control
Oct-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279	Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1	Santa Cruz Biotechnology	sc-21702	Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-21704	Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60	Santa Cruz Biotechnology	sc-21705	Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81	Santa Cruz Biotechnology	sc-21706	Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8020	Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein	Santa Cruz Biotechnology	sc-8399	AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9187	FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)	Thermo Scientific	MS-295-P0	Mouse IgG1
Desmin	Thermo Scientific	RB-9014-P1	Rabbit IgG
Anti-NANOG	ReproCELL Inc, Japan	RCAB0004P-F	Polyclonal antibody
Rat anti-GFAP	Zymed	13-0300	Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)	Cedarlane Laboratories Ltd.	CL2513A	Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)	DakoCytomation Inc	IR611/IS611	Mouse IgG2a
Nestin	Chemicon International	MAB5326	Rabbit polyclonal antibody
TUBB3	Convance Inc	MMS-435P	Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)	Cell Signaling Technologies	3113	Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	PFA, fixative, diluted in D-PBS