Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ثنائي الفوتون Published: May 12, 2014 doi: 10.3791/51520
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

Abstract

في القشرة الثدييات، الخلايا العصبية تشكيل شبكات معقدة للغاية، وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي. التغيرات في قوة متشابك، فضلا عن إضافة / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، تحدث بطريقة تعتمد على الخبرة، وتوفير الأساس الهيكلي للاللدونة العصبية. كمكونات بعد المشبكي من نقاط الاشتباك العصبي معظم مثير في القشرة، وتعتبر العمود الفقري شجيري أن يكون وكيل جيدة من نقاط الاشتباك العصبي. الاستفادة من مزايا وتقنيات الوراثة الماوس وضع العلامات الفلورسنت، والخلايا العصبية الفردية وهياكلها متشابك يمكن أن توصف في الدماغ سليمة. ونحن هنا نقدم بروتوكول التصوير عبر الجمجمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر لمتابعة fluorescently المسمى العمود الفقري شجيري بعد المشبكي على مر الزمن في الجسم الحي. هذا البروتوكول يستخدم إعداد ضعفت الجمجمة، والتي تحافظ على الجمجمة سليمة ويتجنب الآثار الناجمة عن التعرض للالتهابات السحايا والقشرة. لذلك، يمكن الحصول على الصور مباشرة بعد سويتم تنفيذ rgery. لا يمكن أن يؤديها إجراء التجارب بشكل متكرر على مدى فترات زمنية مختلفة تتراوح من ساعات إلى سنوات. يمكن أيضا استخدام هذا المستحضر يتم توسيع التحقيق في مختلف المناطق القشرية وطبقات، وكذلك أنواع الخلايا الأخرى، في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية.

Introduction

تشارك القشرة الثدييات في العديد من وظائف الدماغ، من الحسي الإدراك والحركة التحكم لمعالجة المعلومات المجردة والإدراك. وظائف القشرية المختلفة بناء على الدوائر العصبية المختلفة، والتي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا العصبية التواصل وتبادل المعلومات في نقاط الاشتباك العصبي الفردية. وباستمرار يتم تعديل هيكل وظيفة نقاط الاشتباك العصبي ردا على الخبرات والأمراض. في الدماغ ناضجة، اللدونة متشابك يأخذ شكل كلا من التغيرات قوة وبالإضافة إلى ذلك / إزالة نقاط الاشتباك العصبي، ولعب أدوارا مهمة في تشكيل والحفاظ على الدوائر العصبية الوظيفية. العمود الفقري شجيري هي المكونات بعد المشبكي الأغلبية من نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ مثير الثدييات. ويعتقد أن دوران مستمر وتغيرات شكلية في العمود الفقري لتكون بمثابة مؤشر جيد من التعديلات في الاتصالات متشابك 1-7.

ثنائي الفوتون المسح الضوئي ليزر الصغيرةيقدم SCOPY الاختراق العميق في السراء، والأعمال التحضيرية مبهمة والضيائية منخفضة، مما يجعلها مناسبة للتصوير الحية في الدماغ سليمة 8. في تركيبة مع وضع العلامات الفلورسنت، ويوفر اثنين من الفوتون التصوير أداة قوية لنظرة خاطفة إلى الدماغ يعيشون واتبع إعادة التنظيم الهيكلي في نقاط الاشتباك العصبي الفردية مع مكانية عالية والقرار الزماني. وقد استخدمت أساليب مختلفة لإعداد الفئران لتصوير حي 9-13. هنا، نحن تصف إعداد ضعفت الجمجمة من الجسم الحي في اثنين من الفوتون التصوير للتحقيق في اللدونة الهيكلية في العمود الفقري شجيري بعد المشبكي في القشرة الماوس. باستخدام هذا النهج، وقد صورت دراساتنا الأخيرة صورة ديناميكية التغيرات العمود الفقري شجيري ردا على تعلم المهارات الحركية مع زيادة توافر الحيوانات المعدلة وراثيا مع fluorescently المسمى فرعية العصبية والتطور السريع للتقنيات وضع العلامات في الجسم الحي، وإجراءات مماثلة وصفها هنا يمكن أن تطبق أيضا لinvestigaالشركة المصرية للاتصالات أنواع أخرى الخلية والمناطق القشرية، جنبا إلى جنب مع معالجات أخرى، فضلا عن استخدامها في نماذج المرض 16-23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يحتاج الى موافقة التي يمكن الحصول عليها من المؤسسات المنزل قبل بدء الجراحة ودراسة التصوير. وأجريت التجارب الموضحة في هذه المخطوطة وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح من جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة.

1. جراحة

  1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية وتعقيم مساحة العمل مع 70٪ كحول جيدا قبل الجراحة.
  2. تخدير الماوس عن طريق داخل الصفاق (IP) حقن KX حل مخدر (200 ملغ / كغ الكيتامين و 20 مغ / كغ زيلازين) وفقا لوزن الجسم الماوس، ملاحظة: KX الجرعة يمكن تعديلها وفقا للسلالة، والعمر، والحالة الصحية من الفئران. ويوصى أيضا التشاور البيطرية لتحديد الجرعة المثالية.
  3. إجراء اختبار قرصة أخمص القدمين بشكل دوري عن طريق الضغط على أصابع القدم الماوس، والتحقق من وجود استجابة انعكاسية لمراقبة حالة التخدير.تأكد من أن الفأر هو تخدير كامل قبل البدء في الجراحة ملاحظة: خلال جلسات التصوير لفترات طويلة، تحقق من حالة التخدير الماوس، بشكل دوري وإداراتها إضافية KX إذا لزم الأمر.
  4. ضع الماوس على وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم أثناء الجراحة.
  5. حلق الرأس من الفأرة باستخدام شفرة حلاقة لفضح فروة الرأس.
  6. تعقيم منطقة حلق بواسطة المسح الجلد بالتناوب مع منصات الكحول وبتدين. إزالة أي قصاصات الشعر المتبقية.
  7. تطبيق مرهم العين بلطف لتليين كلتا العينين، وبالتالي منع الأضرار الناجمة عن الجفاف دائمة أثناء التجربة.
  8. جعل شق مستقيم على طول خط الوسط من فروة الرأس، ونقل الجلد أفقيا نحو حواف الجمجمة.
  9. إزالة النسيج الضام تعلق على الجمجمة.

2. ضعفت الجمجمة إعداد

  1. تحديد المنطقة على أساس التصوير ستير. الإحداثيات eotaxic ملاحظة: في محاولة لتجنب الأوعية الدموية الكبيرة، والتي تغلغل ضوء كتلة وطمس الهياكل تصويرها. ويلاحظ الأوعية الدموية أفضل عند الجمجمة رطبة مع ملحي معقم.
  2. استخدام الحفر الصغيرة عالية السرعة إلى منطقة دائرية رقيقة من الجمجمة (0.5-1.0 ملم القطر). نقل موازية الحفر إلى السطح الجمجمة، بدلا من عقد ضد الجمجمة والضغط على أسفل. الحفر حتى كل من طبقة العظم المضغوط الخارجي وطبقة العظم الإسفنجي منتصف تتم إزالة ملاحظة: لمنع الأضرار الناجمة عن ارتفاع درجة الحرارة، وتجنب الاتصال المطول بين مثقاب والجمجمة.
  3. تواصل ترقق الطبقة الداخلية العظام التعاقد مع شفرة المجهرية في وسط منطقة الحفر ضعيفة. عقد شفرة المجهرية في زاوية ما يقرب من 45 درجة إلى كشط الجمجمة دون الضغط انخفض مقابل الجمجمة حتى يتم ضعفت بالتساوي منطقة صغيرة (200-300 ميكرون قطر) مع سمك تقريبييتم الحصول لاي 20-30 ميكرومتر. نظرا لصناعة السيارات في مضان من الجمجمة، ويمكن قياس سماكة عن طريق مسح المسافة بين السطح العلوي والسفلي من الجمجمة تحت المجهر ثنائي الفوتون ملاحظة: على الرغم من أن سمك الجمجمة أقل من 20 ميكرون يوفر جودة تصوير جيدة، لا ينصح به لأنه يجعل عملية ترقق في جلسات لاحقة إعادة التصوير صعبا. لتجنب الإفراط رقيق، سمك الجمجمة يحتاج إلى أن يتم التحقق بشكل دوري أثناء الجراحة (انظر مناقشة).

3. تجميد

  1. بعناية إزالة الحطام العظام.
  2. وضع قطرة صغيرة من الغراء cyanoacrylate على كل حافة من افتتاح مركز لوحة الرأس العقيمة، والتي تم تعقيمها (انظر الشكل 1). عقد لوحة الرأس بإحكام ضد الجمجمة مع المنطقة ضعيفة تقع في وسط افتتاح ملاحظة: إذا كان الغراء يلوث ص ضعيفةegion عن طريق الصدفة، إزالته بعناية مع شفرة المجهرية.
  3. برفق الجلد من الجانبين من الجمجمة إلى حواف افتتاح مركز لوحة الرأس.
  4. انتظر حوالي 10 دقيقة حتى يتم إرفاق لوحة رأس البئر في الجمجمة.
  5. وضع لوحة الرأس على اثنين من كتل الجانبية من لوحة بعقد ثم تضييق الخناق على حواف لوحة الرأس لشل حركة الماوس على لوحة عقد (انظر الشكل 1) ملاحظة: تأكد من عدم وجود الجلد أو شعيرات بين لوحة الرأس والكتل قبل تشديد الخناق. A إعداد يجمد جيدة ينبغي أن لا تظهر أي حركة ملحوظة من الجمجمة تحت المجهر تشريح عند الجزء الخلفي من الحيوان يربت بلطف.
  6. . شطف الجمجمة يتعرض بمحلول ملحي لإزالة الغراء unpolymerized ملاحظة: من المهم لإزالة أي الغراء المتبقية، والغراء unpolymerized يطمس الصور والأضرار المجهر أهداف <./ لى>

4. التصوير

  1. التقاط صورة من الأوعية الدموية من الجمجمة يتعرض مع المنطقة ضعفت كما خريطة 1، والذي يستخدم لنقل المنطقة المصورة في جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2).
  2. ضع الماوس تحت المجهر التصوير. تحديد المنطقة ضعيفة تحت الهدف 10X الهواء باستخدام epifluorescence ونقل أنحف المنطقة إلى مركز العرض.
  3. إضافة قطرة من المياه المالحة في الجزء العلوي من الجمجمة والتحول إلى الهدف 60X، والتي تم تشطف بالماء المعقم. تحديد المنطقة التي تصور العمود الفقري شجيري الفردية بوضوح على طول التشعبات. تحديد وتسمية المنطقة المقابلة على خريطة 1 من خلال مقارنة بين الأوعية الدموية وجهة نظر المجهر epifluorescent والصورة الأوعية الدموية.
  4. ضبط الطول الموجي ليزر ثنائي الفوتون وفقا لfluorophores. على سبيل المثال، 920 نانومتر لYFP؛ 890 نانومتر لGFP؛ 1،000 نانومتر لDsRed وtdTomato 24.
  5. الحصول على صورة أكوام مع 2الخطوات ميكرومتر على طول ض محور باستخدام الهدف 60X. هذه الصورة كومة يغطي × 200 ميكرون المنطقة حوالي 200 ميكرون (512 X 512 بيكسل) ويتم استخدام خريطة 2 لنقل خلال جلسات التصوير لاحقة (انظر الشكل 2).
  6. الحصول على تسعة مداخن صورة داخل الخريطة 2 باستخدام تقريب رقمي 3X. كل صورة كومة يغطي مساحة تقارب 70 ميكرومتر × 70 ميكرون (512 X 512 بكسل)، مع 0.7 ميكرومتر الخطوات على طول ض محور ملاحظة: يجب أن تكون كثافة الليزر أقل من 40 ميغاواط عند قياسها على عينات لتقليل الضيائية.

5. استعادة

  1. بعد التصوير، وفصل بلطف لوحة الرأس من الجمجمة.
  2. تماما تنظيف الجمجمة والجلد لإزالة كافة الغراء المتبقية ملاحظة: إن أي الغراء المتبقي على الجلد يسبب تهيج وتبطئ الشفاء الجلد في حين أن أي الغراء المتبقية على الجمجمة ويسبب تآكل الجمجمة وngiogenesis في طبقة العظام نمت حديثا، مما يجعل نقل اللاحقة وإعادة التصوير صعبا.
  3. شطف الجمجمة والجلد بمحلول ملحي عدة مرات.
  4. خياطة فروة الرأس مع خياطة جراحية معقمة.
  5. الحفاظ على الحيوان على وسادة التدفئة في قفص منفصل. إدارة مسكن البوبرينورفين (0.1 ملغ / كلغ) تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. عودة الحيوان إلى قفص المنزل بعد الشفاء التام. مراقبة الحيوانات عن كثب (فحص مرة واحدة يوميا على الأقل) حتى تشفى شق ويتم إزالة الغرز. إدارة الحقن اللاحقة من البوبرينورفين مسكن إذا لزم الأمر.

6. Reimaging

  1. كرر الخطوات من 1،1-1،8.
  2. كرر الخطوات من 3،1-3،6
  3. تحديد موقع المنطقة تصويرها سابقا بمقارنة نمط الأوعية الدموية لخريطة 1 ونمط فرع شجيري إلى خريطة 2.
  4. إذا تم تنفيذ reimaging في حدود 1 في الاسبوع، كرر الخطوة 2.3 لإزالة طبقة رقيقة من العظام نمت حديثا على رأس إعادة ضعيفةجيون باستخدام شفرة المجهرية. إذا تم تنفيذ reimaging بعد أكثر من 1 أسبوع، كرر الخطوات على حد سواء 2.2 و 2.3 ملاحظة: تتكون طبقة العظام نمت حديثا هيكل أقل مكثف مقارنة مع طبقة العظم المضغوط الأصلي، مما يؤدي إلى انخفاض جودة الصورة. لذا، للحصول على نفس النوعية، فمن الضروري رقيقة الجمجمة أكثر قليلا من الدورة السابقة التصوير.
  5. ضبط الموقف والتوجه للحصول على أكوام الصورة التي تطابق المتخذة سابقا مداخن صورة تحت المجهر ثنائي الفوتون.
  6. الحصول على صور كما في الخطوة 4.6.
  7. كرر الخطوات من 5،1-5،5 بعد التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في YFP-H خط الفئران 25، بروتين فلوري الصفراء يعبر في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية الهرمية طبقة V، التي توقع لها قمية التشعبات إلى طبقات سطحية في القشرة. من خلال إعداد ضعفت الجمجمة، وقطاعات شجيري fluorescently المسمى ولا يمكن تصوير تحت المجهر متكررة اثنين من الفوتون على فترات التصوير المختلفة، بدءا من ساعات لأشهر. نحن هنا تظهر مثال على التصوير أربع مرات من نفس التشعبات أكثر من 8 أيام في القشرة الحركية على فأرة الحاسوب 1 الشهر القديمة، حيث العمود الفقري الفردية وكذلك أرجل كاذبة خيطية يمكن تصور بوضوح على طول التغصنات. عادة، وعمق من مداخن صورة ما يقرب من 100-200 ميكرون من سطح حنوني. لا يمكن أن يؤديها التحليلات المختلفة على أساس هذه الصور. على سبيل المثال، وتشكيل العمود الفقري، والقضاء ودوران يمكن قياسها كميا من خلال مقارنة الصور من الدورات المختلفة. ويمكن حساب كثافة العمود الفقري عن طريق قسمة عدد من العمود الفقري من طول dendritالجزء جيم. ويمكن أيضا تحليل التغيرات في العمود الفقري على الحركة والتشكل.

الشكل 1
الشكل 1. وحات تجميد صنعت خصيصا لإعداد ضعفت الجمجمة لاثنين من الفوتون التصوير في الجسم الحي. (A) وهناك صورة من لوحة الرأس، وهو مصنوع من اثنين أو ثلاثة من شفرات الحلاقة لصقها معا، مع حواف حادة من قبل الأشرطة تغطيتها. (ب) صورة من لوحة عقد، الذي يتكون من 1 لوحة الفولاذ المقاوم للصدأ، الفولاذ المقاوم للصدأ 2 كتل، 2 مسامير، و2 الفواصل.

الرقم 2
الشكل 2. عبر الجمجمة التصوير ثنائي الفوتون من خلال إعداد ضعفت الجمجمة في القشرة الحركية الماوس، في الصور المجراة. (ب) إسقاط الحد الأقصى منخفضة التكبير من الفروع الشجيرية في القشرة الحركية على فأرة الحاسوب 1 الشهر القديمة (خريطة 2). (C) الصور المتكررة من نفس الجزء شجيري العمود الفقري تكشف شكلت حديثا (السهام)، العمود الفقري القضاء (الأسهم)، وأرجل كاذبة خيطية (نجوم) في اليوم 0، 2، 4، و 8. لوحة اليسرى نسخة-التكبير أعلى من الجزء شجيري هو مبين في المنطقة محاصر في (B). أشرطة مقياس: 500 ميكرون (A)، و 20 ميكرومتر (B)، و 2 ميكرون (C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

للحصول على نجاح إعداد ضعفت الجمجمة، عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة. 1) سمك الجمجمة. عظم الجمجمة لديها بنية ساندويتش، مع اثنين من طبقات من العظم المضغوط عالي الكثافة وطبقة وسطى من الاسعار المنخفضة للكثافة العظام الاسفنجية. في حين أن الحفر الصغيرة عالية السرعة مناسبة لإزالة الطبقات الخارجية من العظم المضغوط والعظم الإسفنجي، شفرة المجهرية مثالية لترقق الطبقة الداخلية من العظم المضغوط. كما سمك وصلابة من الزيادات الجمجمة خلال التنمية، والتصوير من الفئران الكبار يتطلب المزيد من العظام المراد إزالتها من أجل الحصول على صور ذات نوعية جيدة. منطقة ضعيفة يسلك مظهر صلبة شفافة ويوفر جودة تصوير جيدة عندما سمك الجمجمة حوالي 20-30 ميكرومتر. يجب فحص سماكة الجمجمة بشكل دوري أثناء عملية ترقق كما الإفراط في ترقق يجعل عملية ترقق في جلسات لاحقة reimaging صعبة. 2) وحجم المنطقة ضعيفة.فمن المهم وضع مستقر التكوين ضعفت الجمجمة، حيث يتم التوصل إلى تجويف يشبه المخروط. الهندسة المعمارية للمنطقة ضعيفة مع حجم المناسبة يمنع إلحاق الضرر القشرة ويساعد على منع تجلط في جلسات إعادة التصوير لاحقة. فمن المستحسن لجعل منطقة القاع (حوالي 200-300 ميكرون في القطر) في المنطقة ضعيفة أصغر من أعلى الافتتاح (حوالي 0.5-1.0 ملم في القطر). 3) والاستقرار في الصور. A إعداد يجمد جيدا يساعد على تحسين جودة الصورة من خلال الحد من الآثار الناجمة عن حركة الجهاز التنفسي. فمن المهم للحفاظ على الجمجمة الجافة وخالية من النسيج الضام والعظام الحطام قبل أن يتم إرفاق لوحة وجها لوجه في الجمجمة. يمكن أيضا أن تطبق الغراء اضافية لملء الفجوات المتبقية بين لوحة الرأس والجمجمة. بالإضافة إلى ذلك، استهدفت منطقة بعيدا عن الأوعية الدموية الكبيرة يقلل أيضا الحركات التي تسببها ضخ الدم.

التحقيق في التغييرات في البرازيلفي الحيوانات مع القرار المكانية والزمانية عالية باستخدام اثنين من الفوتون المجهري يعيشون يتطلب جيل من نافذة البصرية. بالإضافة إلى إعداد ضعفت الجمجمة، وهياكل fluorescently المسمى يمكن أيضا تصور عن طريق إزالة الجمجمة واستبدالها مع كوب غطاء (عادة 3-5 مم في القطر) الذي يوفر نافذة التصوير واضح 10 و 13. في حين أن كلا ضعفت الجمجمة وبروتوكولات التصوير الجمجمة مفتوحة يتم تطبيقها على نطاق واسع لفي الدراسات المجراة التصوير، كل أسلوب له مزاياه الخاصة وغير مناسبة لتصاميم تجريبية مختلفة. على سبيل المثال، إعداد الجمجمة المفتوح مفيد للدراسات أن التحقيق في مناطق الدماغ كبيرة نسبيا (على سبيل المثال، 5 مم)، وتتطلب العديد من جلسات التصوير مع فترات قصيرة (أي أيام). مرة واحدة هو مزروع النافذة في الجمجمة بنجاح، لا يحتاج لعملية جراحية إضافية. ومع ذلك، لا بد من فترة ما بعد الجراحة (عادة حوالي 1 شهر) قبل التصوير الأولىدورة لتحسين الاستجابات الالتهابية المحتملة الناجمة عن الجراحة. يصبح من المستحيل إعادة التصوير عندما يتم حظر النافذة في الجمجمة عن طريق إعادة نمو العظام و / أو سماكة في السحايا. في المقابل، الحيوانات مع إعداد ضعفت الجمجمة يمكن تصويرها مباشرة بعد الجراحة الأولية، مما يجعلها أكثر ملاءمة للتصوير المزمن من الحيوانات الأصغر سنا (على سبيل المثال، 2 أسابيع من العمر). وهي مناسبة للتحقيق مع فترات طويلة التصوير (أي أشهر إلى سنوات)، حيث أن إعادة نمو العظام والجافية سماكة ليست مشكلة. ومع ذلك، وعادة ما يتطلب إعادة رقيق من الجمجمة لدورات إعادة التصوير لاحقة (حتى مع فترات اليوم 2) ويرجع ذلك إلى إعادة نمو العظام. علاوة على ذلك، تتكون طبقة العظام نمت حديثا هيكل أقل مكثف مقارنة مع العظم المضغوط الأصلي، الحد بشكل كبير من الشفافية في المنطقة ضعفت الجمجمة. لذا، للحصول على نفس النوعية من الصور، فمن الضروري إزالة طبقة العظام نمت حديثا. ومثل هذاعادة ما يؤدي ttempts لسمك النهائي من الجمجمة في التصوير اللاحقة أرق من إعداد السابقة. منذ سماكة الجمجمة أعدت ل20-30 ميكرومتر في دورة التصوير الأولي، مما يترك مجالا محدودا لإعادة رقيق، مجموع مرات التصوير من إعداد ضعفت الجمجمة هو عادة أقل من 5 مرات. وقد وضعت في الآونة الأخيرة، وهو المنهج التجريبي جديدة باسم مصقول وعززت ضعفت الجمجمة (الموانئ) على الجمع بين كل من ضعفت والاستعدادات الجمجمة مفتوحة-11، 26، 27.

حتى الآن، وقد تم تنفيذ معظم التصوير في الجسم الحي في القشرة باستخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا معربا عن EGFP أو YFP تحت العصبية المروج thy1 محددة. هذه الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن البروتينات الفلورية قليلة في مجموعة فرعية، ولكن يسكنها خليط من الخلايا العصبية القشرية 25. منذ العديد من خطوط الأدلة تشير إلى أن تعتمد على الخبرة اللدونة الهيكلية يحدث في سيليأنواع الخلايا التفاعلية الذي نظمه الدوائر واضحة المعالم، فمن المهم لتسمية والصورة بطريقة محددة خلية من نوع. حتى الآن، تم تطبيق العديد من المقاربات لتحقيق هذا الهدف. على سبيل المثال، الخلايا العصبية الهرمية في الطبقات القشرية المختلفة يمكن أن تكون مستهدفة من خلال إجراء التثقيب الكهربائي في الرحم في المراحل الجنينية محددة 28، 29. وبالمثل، حقن ناقلات فيروسية هندسيا للتعبير عن بروتين فلوري يمكن أيضا أن تستخدم لتسمية الخلايا في مناطق الدماغ المختلفة 30. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء العديد من خطوط الفئران المعدلة وراثيا لدفع التعبير من لجنة المساواة العرقية recombinase تحت نوع من الخلايا المروجين محددة 31، 32. حقن ناقلات فيروسية مثل فيروس الغدة المرتبطة تحمل الجينات مراسل فلوري بعد توقف كودون floxed في هذه الفئران توفر إمكانية لاستهداف فئة محددة من الخلايا العصبية في المنطقة المقيدة 33. من خلال الجمع بين هذه النهج مع وضع العلامات الجديدة لدينا ضعيفة لياليإعداد كول، والتغيرات في الاتصالات متشابك من الخلايا العصبية القشرية يمكن التحقيق من قبل اثنين من الفوتون في الجسم الحي التصوير في نوع الخلية و/ أو بطريقة دائرة محددة.

مع تزايد توافر الحيوانات المعدلة وراثيا مع ويمكن أيضا أن تطبق السكان الخلية fluorescently المسمى والتطور السريع للتقنيات وضع العلامات في الجسم الحي، وإجراءات مماثلة وصفها هنا للتحقيق في أنواع الخلايا الأخرى (الخلايا الدبقية) والأوعية الدموية في الدماغ الحية. جنبا إلى جنب مع التلاعب السلوكية ونماذج المرض، اثنين من الفوتون في الجسم الحي التصوير سوف توسع إلى حد كبير فهمنا للآليات الجزيئية، الخلوية، والدوائر الكامنة وظائف المخ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

نشكر جيمس بيرنا لتوضيح الرسم. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة العقلية لYZ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Bioniche Pharma 67457-034-10 Mixed with xylazine for anesthesia
Xylazine Lloyd laboratories 139-236 Mixed with ketamine for anesthesia
Saline Hospira 0409-7983-09 0.9% NaCl for injection and imaging
Razor blades Electron microscopy sciences 72000 Double-edge stainless steel razor blades
Alcohol pads Fisher Scientific 06-669-62 Sterile alcohol prep pads
Eye ointment Henry Schein 102-9470 Petrolatum ophthalmic ointment sterile ocular lubricant
High-speed micro drill Fine Science Tools 18000-17 The high-speed micro drill is suitable for thinning the outer layer of compact bone and targeting a small area
Micro drill steel burrs Fine Science Tools 19007-14 1.4 mm diameter
Microsurgical blade Surgistar 6961 The microsurgical blade is suitable for thinning the inner layer of compact bone and middler layer of spongy bone
Cyanoacrylate glue Fisher Scientific NC9062131 Fix the head plate onto the skull
Suture Havard Apparatus 510461 Non-absorbale, sterile silk suture, 6-0 monofilament
Dissecting microscope Olympus SZ61
CCD camera Infinity
Two-photon microscope Prairie Technologies Ultima IV
10X objective Olympus NA 0.30, air
60X objective Olympus NA 1.1, IR permeable, water immersion
Ti-sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nature reviews. Neuroscience. 10, 647-658 (2009).
  2. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in neurosciences. 34, 177-187 (2011).
  3. Yu, X., Zuo, Y. Spine plasticity in the motor cortex. Current opinion in neurobiology. 21, 169-174 (2011).
  4. Harms, K. J., Dunaevsky, A. Dendritic spine plasticity: looking beyond development. Brain research. 1184, 65-71 (2007).
  5. Segal, M. Dendritic spines and long-term plasticity. Nature reviews. Neuroscience. 6, 277-284 (2005).
  6. Tada, T., Sheng, M. Molecular mechanisms of dendritic spine morphogenesis. Current opinion in neurobiology. 16, 95-101 (2006).
  7. Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual review of neuroscience. 30, 79-97 (2007).
  8. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  9. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature protocols. 5, 201-208 (2010).
  10. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature protocols. 4, 1128-1144 (2009).
  11. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature methods. 7, 981-984 (2010).
  12. Szu, J. I., et al. Thinned-skull cortical window technique for in vivo optical coherence tomography imaging. J Vis Exp. , (2012).
  13. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J Vis Exp. , (2008).
  14. Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462, 915-919 (2009).
  15. Fu, M., Yu, X., Lu, J., Zuo, Y. Repetitive motor learning induces coordinated formation of clustered dendritic spines in vivo. Nature. 483, 92-95 (2012).
  16. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nature neuroscience. 8, 752-758 (2005).
  17. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature neuroscience. 7, 1181-1183 (2004).
  18. Pan, F., Aldridge, G. M., Greenough, W. T., Gan, W. B. Dendritic spine instability and insensitivity to modulation by sensory experience in a mouse model of fragile X syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 17768-17773 (2010).
  19. Liu, Z., Condello, C., Schain, A., Harb, R., Grutzendler, J. CX3CR1 in microglia regulates brain amyloid deposition through selective protofibrillar amyloid-beta phagocytosis. J Neurosci. 30, 17091-17101 (2010).
  20. Tremblay, M. E., Zettel, M. L., Ison, J. R., Allen, P. D., Majewska, A. K. Effects of aging and sensory loss on glial cells in mouse visual and auditory cortices. Glia. 60, 541-558 (2012).
  21. Lam, C. K., Yoo, T., Hiner, B., Liu, Z., Grutzendler, J. Embolus extravasation is an alternative mechanism for cerebral microvascular recanalization. Nature. 465, 478-482 (2010).
  22. Kelly, E. A., Majewska, A. K. Chronic imaging of mouse visual cortex using a thinned-skull preparation. J Vis Exp. , (2010).
  23. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. J Vis Exp. , (2010).
  24. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  25. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  26. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
  27. Zhang, L., et al. Imaging glioma initiation in vivo through a polished and reinforced thin-skull cranial window. J Vis Exp. , (2012).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation. J Vis Exp. , (2012).
  29. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240, 237-246 (2001).
  30. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J Vis Exp. , (2010).
  31. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  32. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J Neurosci. 32, 3131-3141 (2012).
  33. Kuhlman, S. J., Huang, Z. J. High-resolution labeling and functional manipulation of specific neuron types in mouse brain by Cre-activated viral gene expression. PloS one. 3, (2008).

Tags

علم الأعصاب، العدد 87، العمود الفقري شجيري، والماوس القشرة،
ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in… More

Yu, X., Zuo, Y. Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation. J. Vis. Exp. (87), e51520, doi:10.3791/51520 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter