Summary
Vi beskriver brugen af en fluorescerende reporter vacciniavirus, der muliggør real-time måling af virusinfektivitet og genekspression igennem etapen-specifikt udtryk for spektralt adskilte reporter fluorophores. Vi detalje en plade-baserede metode til præcist at identificere det stadium, hvor virus replikation påvirkes som reaktion på små molekyle hæmning.
Abstract
Poxviruses er en familie af dobbelt strandede DNA-virus, der indeholder aktive humane patogener såsom monkeypox, molluscum contagiousum og Contagalo virus. Familien omfatter også koppevirus, Variola. På grund af kompleksiteten af poxvirus replikation, mange spørgsmål er stadig om deres genekspression strategi. I denne artikel beskriver vi conceptualization og anvendelse af rekombinante vacciniavira, der muliggør tidstro måling af enkelte og flere stadier af viral genekspression i en high-throughput format. Dette er aktiveret ved anvendelse af spektralt forskellige fluorescerende proteiner som reportere til hver af de tre faser af viral replikation. Disse vira giver en høj signal-til-støj-forhold og samtidig bevare stage specifikke udtryk mønstre, der gør det muligt plade-baserede assays og mikroskopiske observationer af virus formering og replikation. Disse værktøjer har anvendelsesmuligheder for antiviral opdagelse, undersøgelser af interaktionen virus-vært, og evolutionære biologi.
Introduction
Traditionelt er virus udtryk undersøgt ved hjælp af molekylærbiologiske teknikker (fx Northern blotting, Western blotting, microarray hybridisering, osv.) 1. Mens disse metoder er i stand til at give detaljerede oplysninger med hensyn til at kategorisere udtryk ændringer i de enkelte mRNAer eller proteiner, er de typisk ikke modtagelig for real-time og high-throughput processer. Alternative metoder, der anvender fluorescens-baserede journalister er blevet anvendt tidligere, når du arbejder med poxviruses; Imidlertid har deres udvikling og anvendelse er blevet motiveret af forskellige mål. Flere sådanne metoder blev udviklet til udvælgelse af rekombinante vira 2,3. Disse teknikker udtrykker EGFP på korrekt inkorporering og ekspression af exogent DNA fra rekombinante vaccinia kloner. Tilsvarende flere vacciniastammer stabilt udtrykker opløselig EGFP eller GFP-mærkede proteiner udtrykt i en nativ vaccinia-promotor har været meget anvendt. Disse er typtisk bruges til at kvantificere virus indrejse og replikation i løbet af antistofbaserede neutraliseringsassays, kemisk hæmning, eller sammenligning af antiviral effektivitet 4-6. Mens disse vira har vist sig nyttige, er de begrænset i deres evne til at give detaljerede oplysninger om det punkt hæmning på grund af deres brug af et enkelt tvetydig tidlig / sen viral promotor. Tidligere fremgangsmåder har også gjort brug af EGFP protein med suboptimale signal-støj-egenskaber.
På grund af kompleksiteten af poxvirus replikation og manglen på eksisterende værktøjer til rådighed til at analysere real-time ændringer i virusgenekspression, har vi udviklet en suite af single og multi scene reporter vira 7,8. Som beskrevet i tidligere publikationer, disse vira udtrykker et, to eller tre spektralt forskellige fluorescerende proteiner fra native vaccinia promotorer i den tidlige, mellemliggende eller sene stadier i infektion. Disse vira kan være osed som indikatorer for virus replikation fremskridt ved hjælp af en fluorescens mikroskop og de er lige velegnede til high-throughput plade-og-reader assays. Disse vira er let at bruge i stedet for vildtype-virus, der vokser med lignende kinetik for at nå tilsvarende titre 7. Under planlægningen og oprettelsen af disse vira, var meget omhyggelig med at vælge fluorophores der har høje signal-til-baggrund karakteristika med overlegen folde effektivitet til at lette pålidelig kvantificering med hurtig tilbagemelding til ændringer i udtrykket (Venus, mCherry og TagBFP). Derudover blev kombinationer af virale promotorer valgt som producerer high fidelity, entydig trinspecifik udtryk, der giver oplysninger om hele spektret af tidlige (C11R promotor), mellemliggende (G8R promotor) og sene (F17R promotor) genekspression i modsætning til tvetydige tidlig / sen initiativtagere.
Disse vira kan anvendes som et redskab til investigating livscyklus prototypiske poxvirus, vaccinia virus. Meget er stadig ikke kendt om samspillet host-virus på trods af sin lange historie undersøgelsen. Vaccinia er kompleks, der producerer over 200 unikke proteiner, hvoraf mange er immunmodulerende og vært antagonistisk. Efter infektion, vacciniavirus begynder straks tidlig mRNA-transkription. Dette lettes af en RNA-polymerase og transkriptionsfaktorer, der blev indlæst på det virale genom i løbet af virion emballage og holdes i et midlertidigt afbrudt tilstand, indtil efterfølgende infektion. Denne tidlige ekspression producerer proteiner, der kræves til undertrykkelse af værtens immunsystem (mRNA hætteaftagning, dsRNA binding og lokkemad-receptorproteiner samt inhibitorer af apoptose, stress respons, og Toll, IL, og NF-KB-signalering) og genomreplikation. Tidlig udtryk producerer også transkriptionsfaktorer der er nødvendige for mellemliggende udtryk. Intermediate udtryk omfatter ekspression af sene transskription fase faktorer. Detudtryk kaskade fører til produktion af strukturelle og enzymatiske virus proteiner under sene stadier af infektion, som er nødvendige for fuldstændig samling af modne vaccinia virion.
Vores sæt af fluorescerende reporter vira tillader hurtig fremskridt i forståelsen af poxvirus biologi. En af de mest almindelige og tidskrævende metoder inden for virologi er vækstassay. Dette involverer typisk at inficere celler, fastlæggelse af en række behandlinger, høst-virus ved at lysere inficerede celler og kvantificere den resulterende virale titer ved plaque-assay. Brug af reporter virus beskrevet her tillader tidstro måling af virusvækst, der let kan analyseres og sammenlignes mellem mange behandlinger, der udføres parallelt. Vi forudser dette sæt af reagenser vil blive anvendt i forskellige protokoller til at identificere ændringer i viral genekspression som reaktion på lægemiddelbehandling, RNAi knockdown eller værtsspektrum begrænsning.
Denne metode gør det muligt også højt indhold analyse på en større skala end tidligere tilgængelige, giver mulighed for high-throughput antivirale narkotika skærme til specifikt definerede målgrupper stadier af interesse. Mens mange potentielle behandlinger til bekæmpelse af poxvirus-infektion er blevet identificeret, er den eneste FDA-godkendte behandlinger er effektive til behandling af poxvirus-infektion er den acykliske phosphonat nucleosid Cidofovir, og behandling med vaccinia immunglobulin 9,10. På trods af udryddelsen af kopper i 1977 11, koppevira forblive en væsentlig trussel mod menneskers sundhed 12.. Ophør af udbredt vaccination mod Variola virus har ført til øget følsomhed over for andre koppevira 13. For eksempel er områder i Centralafrika tidligere var beskyttet ved vaccination oplever en kraftig stigning i Monkeypox virusinfektioner 14. Betydelig bekymring har også væretfremføres vedrørende latente tilbøjelighed til udsætning af Variola-virus. På grund af de begrænsede behandlinger øjeblikket er til rådighed, er der et presserende behov for udvikling af nye behandlinger. Disse reporter vira tillade hurtig og high-throughput lille molekyle inhibitor screening for hæmning af en bestemt fase af viral replikation. Identifikation af inhibitorer, der er målrettet virusekspressionssystemer etaper i øjeblikket ikke målet for hæmning vil lette udviklingen af kombinationsbehandlinger med øget styrke.
Meget kan udledes om vaccinia cellebiologi ved at observere ændringer i hver etape er genekspression. Dæmpning ved kemisk eller genetisk manipulation af en inficeret værtscelle udtrykkes typisk i form af reducerede virale titere. Men ved at sammenligne ændringer i hver fase af den virale udtryk kaskade, kan man få en mere komplet forståelse af, hvordan virus fitness er virkningened af en bestemt behandling. Disse data har vist sig at korrelere godt med den traditionelle virustiteren output, men give mere detaljerede mekanistisk information samt høj throughput kapaciteter 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Plate Cells
- Dissociér HeLa-celler fra pladen, og fortyndes i vækstmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) til cirka 2,0 x 10 5 celler / ml. Der overføres 100 pi / brønd i en sort-walled, klar fladbundet 96-brønds plade (20.000 celler / brønd).
- Cellerne inkuberes i 24 timer, indtil sammenflydende i en 37 ° C inkubator + 5% CO2.
2.. Infect Cells
- Fortynd virus og inficere celler.
- Thaw TrpV (Triple-virus; Early Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) og PLV (Promotor-mindre Venus) fluorescerende virus og disaggregere bruge sonikering i 5 minutter. Alternativt kan rå virusstammer blandes 1:1 med 0,25 mg / ml trypsin infektion medier og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter.
- Fortyndet rå virusstammer i 37 ° C infektion medier (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Til høje MOI infektioner (10 PFU / celle), fortyndes virus lager til 1,0 x 10 7 PFU / ml antager 5 x 10 4celler / brønd og et inokulum volumen på 50 pi. Planen om at inficere 3 gentagne brønde til hver behandling med TrpV og yderligere 3 replikatbrønde for den samme behandling med PLV at redegøre for baggrunden fluorescens specifikke for hver behandling.
- Infect brønde ved tilsætning af 50 ul / brønd fortyndet virus i infektion medier. Dette er defineret som tiden = 0 timer efter infektion (0 HPI).
- Fortynd ønskede behandling forbindelser til infektion medier. For alle behandlinger en enkelt 2x mester mix fortynding bør gøres og anvendes til at replikere brønde (fx 350 pi samlede volumen for seks 96-brønde med 50 ul hver).
- Fortyndet eksperimentelle forbindelser til infektion medier.
- Køretøj-kontrol opløsningsmiddel (f.eks PBS, DMSO) fortyndes i infektion medier. Bemærk: Der bør bruges Lignende endelige koncentrationer af køretøj-control opløsningsmidler, som anvendes til forsøg forbindelser (fx hvis din HIH bestanden er lavet med DMSO og anvendes på en endelig concentrations af 1 ul / ml, derefter bruge DMSO alene ved 1 ul / ml som vehikelkontrollen).
- Fortyndet kontrol forbindelser til infektion medier. Anbefalede kontrol forbindelser indbefatter: 3.6 uM (1 ug / ml) 1-β-D-arabinofuranosylcytosin (AraC), 50 uM (11,7 ug / ml) isatin β-thiosemicarbazon (HIH), 60 uM (50 ug / ml) Rifampicin, eller 5 m (1,9 mg / ml) ST-246 8,15,16. Se Repræsentative Resultater for forventede effekter. Bemærk: at denne fortynding på to gange (2x) den ønskede slutkoncentration, da dette tilsættes i forholdet 1:1 til den mængde, der allerede i brønden.
- Umiddelbart efter tilsætning af virus, tilsættes 50 pi infektion medier indeholdende de ønskede behandlinger og kontroller, som fortyndet i trin 2.2. Bemærk: For at analysere for hæmning før tidligt tidspunkt udtryk, kan forbindelse (r) enten tilsættes direkte til den fortyndede virusinokulum (trin 2.1.2) eller til at være vært for celler før infektion (før trin 2.1.3).
- Inkuber 6-24 hr i et 37 & #176; C inkubator + 5% CO2.
3.. Fix Cells
- Lave celler ved tilsætning af 100 pi 8% paraformaldehyd infektion medie, der allerede i hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 15 minutter beskyttet mod lys. Bemærk: Det anbefales at tilføje 2x PFA (8%) direkte til infektion medier for at forhindre aerosolisering af smitsom vaccinia, der kan opstå, hvis højtiter-medier er inverteret direkte ind i affald fad før fiksering.
- Fjern fiksativ ved at vende pladen i affaldet fad.
- Tilsæt 100 ul stuetemperatur PBS.
- Seal plade med optisk klar klæbende film. Bemærk: Plader kan lagres ved 4 ° C, hvis ikke læse det samme. Vær sikker på at vende tilbage forseglede plader til stuetemperatur, før du læser for at forhindre kondens fordrejer spektrofotometermålinger.
4.. Kvantificer Virus Vækst
- Mål endpoint fluorescens ved 515:530 til Venus, 587:610 for mCherry og 415:457 feller TagBFP (excitation: Emission bølgelængde i nm). Fire målinger bør gennemsnit per brønd med optimerede gain indstillinger for hver kanal. Bemærk: Den passende emission bølgelængde kan være forskellige, afhængigt af den specifikke model og filter karakteristika pladelæseren. Dette kan bestemmes empirisk ved at udføre en emissionsbølgelængde scanning for at bestemme det punkt, hvor der er den største forskel mellem TrpV og PLV for hver kanal.
- Normalisere rådata at lette sammenligningen mellem forsøgene.
- For hver kanal, bestemme middelværdien af replikat TrpV og PLV brønde.
- Fratræk de gennemsnitlige PLV-inficerede baggrund målinger fra de gennemsnitlige TrpV-inficerede eksperimentelle målinger for hver behandling.
- Normalisering af dataene ved at dividere hver baggrund trukket værdi af det eneste køretøj-værdi godt.
- Når et eksperiment er blevet gentaget flere gange, en envejs variansanalyse (envejs ANOVA) og multipel comparison post-test kan udføres for at bestemme, om nogen af behandlingerne afspejler en statistisk signifikant forskel fra den eneste, behandling for hver kanal.
. 5. Alternativ Protokol: Kinetic pladeassays
- Udfør alle trin ved tilsætning af behandlinger (trin 2.3).
- Seal pladen med den selvklæbende film og sted i pladelæser kammer ækvilibreret til 37 ° C. Bemærk: Der skal udvises særlig omhu for at holde pladerne konsekvent ved 37 ° C for at forhindre unødig celle stress og kondens. Til kinetiske assays, er det særlig vigtigt at anvende en pufret medium (natriumbicarbonat og HEPES) at opretholde en korrekt pH uden tilsætning af 5% CO2.
- Sæt pladelæser opnå manuelt for at forhindre mætning af senere tidspunkter. Bemærk: Nøjagtig gevinst optimering kan opnås ved at udføre et endepunkt analyser på lignende betingelser.
- Anskaf timeaflæse for 8-24 HPI og normalisere bruge simiLAR fremgangsmåde som i endepunkt-assay (trin 4.2).
- Individuel tidspunkter kan analyseres for statistisk signifikans under anvendelse af lignende fremgangsmåder som den tidligere beskrevne endepunkt-assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel på den typiske anvendelse af disse vira blev tredobbelt fluorescens-reporterviruset anvendt til at sammenligne punkt hæmning af adskillige veldefinerede poxvirus-inhibitorer.
HeLa-celler blev udpladet i vævskultur behandlet sort walled klare fladbundede plader med 96 brønde og inkuberet natten over. Sammenflydende monolag blev inficeret ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 under anvendelse af enten tredobbelte reporterviruset (TrpV Tabel 1) eller promotoren mindre Venus (PLV) som angivet på pladen kortet (figur 1). Blev tilsat Infektion medier indeholdende behandlinger til opnåelse af en slutkoncentration på 0,1% DMSO, 3.6 pM (1 ug / ml) AraC, 50 uM (11,7 ug / ml) HIH 5 um (1,9 ug / ml) ST-246 eller 60 uM (50 ug / ml) Rifampicin i tre eksemplarer. 0,1% DMSO blev anvendt som vehikelkontrol da alle inhibitor lagrene blev anvendt ved 1 ul / ml i DMSO. Pladen blev returneret til et 37 ° C incubator, indtil 18 HPI. Celler blev fikseret i 15 minutter ved tilsætning af 100 ul 8% PFA til alle brønde og opbevares i PBS beskyttet mod lys indtil aflæst på en pladelæser. Fluorescensaflæsninger blev udført ved hjælp af et Tecan Infinite M1000 pladelæser og I-control software (v1.5.14.0) ved bottom-læsning 4 point per brønd ved excitation emission bølgelængder på 515:530, 587:610, 415:457 nm til Venus , mCherry og TagBFP fluorophorer, hhv. Forud for de endelige målinger blev gain optimeret til at tillade maksimal signal uden mætning af sensorer (gevinst var typisk 235, 255, 235 for grøn, rød og blå målinger, henholdsvis).
Figur 1. Repræsentant layoutet af infektioner og lægemiddelbehandlinger på 96-brønds plade. Diagram af 96-brønds plade infektion og småmolekyle tilsætning ordningen benyttet til crspise repræsentative resultater. Triple fluorescerende virus (TrpV, lysere grå), der udtrykker tidligt Venus, mellemliggende mCherry og sene TagBFP eller promotor-mindre Venus (PLV, mørkere grå) anvendes i tredobbelte kolonner. 1-β-D-arabinofuranosylcytosin (AraC), isatin β-thiosemicarbazon (HIH), rifampicin, ST-246 og DMSO køretøj kontrol med testede koncentration er angivet til højre. Klik her for at se større billede.
Relative fluorescensenheder (RFU) for hver replikat blev normaliseret for hver kanal. Først blev den gennemsnitlige fluorescens til PLV brønde intensitet trækkes fra middelværdien intensitet TrpV brønde for hver behandling for at redegøre for baggrunden intensitet bidraget med hvert lægemiddel. Dernæst blev denne værdi divideret med baggrunden trækkes gennemsnitlige intensitet af DMSO-behandlede TrpV brønde (vækst vild type). De opnåede resultater efter behandling med kendte poxvirus hæmmere var i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte resultater og deres forstået virkningsmekanisme. Ophøret af transkription og overgangen til mellemliggende genekspression tidlige gen har vist sig at kræve DNA-replikation 17. I overensstemmelse med dette, AraC, en inhibitor af DNA-replikation, udviste en dramatisk stigning i tidlig genekspression (210% DMSO behandles tidligt udtryk, figur 2) og en fuldstændig mangel på mellemprodukt og sene ekspression (0,4% og 0,3% DMSO behandlet mellemliggende og sent-ekspression, figur 2). Mens de nøjagtige virkningsmekanisme ikke er defineret for HIH, menes det at fremme læse-through transkription, hvilket resulterer i øgede mængder af dsRNA, aktivering af RNase L pathway og apoptose 18-20. Som svar på HIH behandling et progressivt alvorlig fænotype blev observeret i hvilken mellemliggende og sent udtryk var betydeligt mindre end DMSO alene (24,7%og 2,9% DMSO behandlet for mellemliggende og sent-ekspression, figur 2). En konsekvent, men ikke statistisk signifikant fald tidligt fluorescens blev også observeret; men dette det sandsynligvis HIH-induceret apoptose på dette senere tidspunkt (74,0% DMSO ved 18 hpi). I modsætning til AraC og HIH, poxvirus narkotika ST-246 og rifampicin begge hæmmer efter sen genekspression under virionsamling og modning 15,16. Ingen ændringer i genekspression sås i alle faser, når cellerne blev behandlet med enten ST-246 (100,9%, 98,5% og 94,5% DMSO behandles tidligt, mellemliggende og sent ekspression henholdsvis figur 2) eller Rifampicin (107,6% 104,2% og 106,5% af DMSO behandles tidligt, mellemliggende og sent udtryk, henholdsvis).
Historisk set en kombination af lav MOI (0,01-0,1 PFU / celle) og høj MOI (5-10 PFU / celle) vækstassays anvendes når udforske den inhibitoriske virkning af en ny lille molekyle eller et virus mutant. Ved en lav MOI er generelt inhiberende virkninger ofte overdrevet af selv mindre hæmning, da kun en delmængde af celler, der oprindeligt er inficeret. Når jeg forsøger at definere det punkt under en infektion cyklus, hvor en virus hæmmes, et højt MOI infektion er sandsynligvis mere passende, da alle celler er smittet med din primære inokulum. Den i figur 3 viste forsøg blev udført som i figur 2 med tilføjelse af en række brønde, der var inficeret ved en lavere MOI = 1. Som en inhibitor, der fungerer post-transkriptionelt bør ST-246 påvirker ikke noget stadium af gen-ekspression ; Det er imidlertid klart, at når kun en delmængde af celler infected (fig. 3, MOI = 1), er der tilsyneladende hæmning af alle stadier af ekspression (38,4%, 48,9% og 52,9% DMSO i forhold til 100,9%, 98,5% og 94,5% for MOI = 1 vs MOI = 10 infektion niveauet i begyndelsen, mellemliggende og sent-ekspression, figur 3). Under forudsætning af 100% inhibering af modne virion-dannelse ved ST-246, betyder det 100% af celler blev inficeret ved MOI = 10 infektioner, og et eller andet sted mellem 50 og 70% af cellerne blev produktivt inficeret under MOI = 1 infektion.
Fig. 3. Effekt af infektion plan om tilsyneladende ST-246 inhibering. HeLa-celler inficeret som i figur 2 med både høj (MOI = 10) og lav (MOI = 1) TrpV behandlet med ST-246. Relative fluorescensenheder (RFU, baggrund fratrukket hver kanal baseret on PLV vækst for hver behandling og normaliseret til TrpV + DMSO) for tidligt (grøn), intermediære (rød), og sent (blå) viral udtryk i celler inficeret enten MOI = 1 eller MOI = 10 og behandlet med 20 pM ST- 246. Klik her for at se større billede.
| Navn | Beskrivelse | Ref. |
| TrpV | Triple virus; C11R (Early) fremmes Venus, G8R (Intermediate) forfremmet mCherry, F17R (sidst) fremmet mTagBFP | 7 |
| PLV | Promotorløse Venus | |
| EV | C11R (tidlig) fremmet Venus | |
| IV | G8R (Intermediate) fremmes Venus | |
| LV | F17R (sidst) fremmet Venus | |
| IREV | G8R (Intermediate) fremmet mCherry og C11R (tidlig) fremmet Venus | |
| LREV | F17R (sen) fremmet mCherry og C11R (tidlig) fremmet Venus | |
| LR | F17R (sidst) fremmet mCherry | |
| mCherry-A4L | N-terminal fusion af VENUS fluoroforen til den sene-udtrykte viruskerne protein A4L |
Tabel 1. Liste over vacciniavirus reporter stammer. Tabel beskriver fluorescens reporter virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet den praktiske anvendelse af en etapevis vaccinia reporter virus (TrpV), som giver reproducerbare, real-time feedback foranstaltninger af virus replikation. Ved hjælp af veldefinerede poxvirus-hæmmere, var vi i stand til at vise, at TrpV reagerer på en måde i overensstemmelse med den forstod virkningsmekanisme for hver inhibitor. Mens TrpV virus giver den mest omfattende information om virus stadie progression, to-trins (IREV, LREV) og single-etape (EV, IV, LV) virus kan også bruges på samme måde, at drage fordel af den optimale protein foldning, stabilitet, og overlegen signal-til-støj-forhold på Venus fluoroforen.
Proof-of-concept-analysen i denne protokol angiver muligheden for at identificere den fase af viral genekspression foretaget af kendte poxvirus-hæmmere i en enkel, high throughput pladeassay. Dette assay kan udvides til at fuldføre hurtig, omfattende screeningaf ukendte kemiske biblioteker samt. Virus kan anvendes til at inficere små molekyler behandlede celler ved lav MOI, giver mulighed for specifik identifikation af forbindelser, der blokerer ethvert stadium af den virale livscyklus. De inhibitorer kan derefter screenes ved hjælp TrpV på flere MOI'er at bestemme den fase af virus livscyklus hæmmes, fra entry (ingen genekspression), til begyndelsen, mellemliggende eller sen genekspression eller samling (fuld genekspression men ingen virus spredes). Vi har brugt denne teknik til at identificere en ny anti-poxviral hæmmer med aktivitet mod adskillige poxvira, herunder Monkeypox 8.
Mens vi har givet detaljerede oplysninger for at bruge disse vira i en plade-reader format, det er lige så velegnet til mikroskopisk undersøgelse. Infektion og observation via fluorescensmikroskop (se figur 2B) giver mulighed for en celle til celle-undersøgelse af viral fase progression, som kan være nyttige iet blandet cellekultur indstilling, såsom infektion i et væv eller i virale eller bakterielle co-infektion forhold. Og mens disse vira blev skabt med henblik på antiviral screening 8, forventer vi dem til at være af samme nytte i grundforskning undersøger livscyklus vacciniavirus. For eksempel kan disse vira let modificeres ved hjælp af traditionelle teknikker til at enten mangler eller overudtrykke virusproteiner; kinetikken af virus-genekspression og spredning kan derefter blive overvåget i realtid for alle stadier af viral transskription.
Undersøgelser af virus-vært-interaktion kan drage fordel af brugen af disse reporter vira samt. Disse journalister mulighed for hurtig identifikation af den fase af viral replikation afsluttet i løbet af infektion af ikke-tolerante celletyper, såsom visse primære cellelinjer, perifere blod leukocytter eller divergerende art 21,22. Oplysninger, der indsamles fra at bruge denneredskab vil fremme vores viden om poxvirus host range restriktions faktorer og funktionen af virale immuno-modulerende proteiner. De vira vil også være nyttige til at identificere scenen af virusreplikation inhiberet af knockdown af værtfaktorer nødvendige for infektion, i enten en hel-genom skala skærmen eller i en rettet lille bibliotek skærmen.
Flere trin i denne protokol bør betragtes som kritisk, når begyndt at bruge disse vira i et nyt system. Forskelle i plade-format, vækstmedier og celletype kan kræve ændringer af MOI, podning tid, eller inkubationstid varighed. Det bliver især vigtigt at optimere endpoint inkubationstid før opskalering til high-throughput format. For at bestemme den ideelle inkubationstid, skal en pilot kinetisk pladeassay udføres (se trin 5). Under en kinetisk assay fluorescens målinger hver time i 12-24 timer og kan bruges til at lokalisere det tidspunkt, hvor GRobserveres spiser forskel mellem kontrol og behandling virus ekspression. Betydningen af dette trin kan ses i behandling med HIH, hvor inhibering skyldes forøgede apoptose fører til en tilsyneladende, men ikke statistisk signifikant fald i begyndelsen af ekspression. Hvis tidligere tidspunkter (4-8 HPI) blev observeret, ville der sandsynligvis være ikke observeret nogen forskel. Derudover skal teste en ny inhiberende forbindelse omfatter flere sammensatte koncentrationer. Mens disse fluorescens reporter vira er i stand til at opdage minimale ændringer i genekspression, kan de supplerende oplysninger, som flere koncentrationer føre til en bedre forståelse af deres samlede virkning.
Under planlægningen og oprettelsen af disse vira, var meget omhyggelig med at vælge fluorophores der har høje signal-til-baggrund 7 karakteristika. Venus protein blev identificeret som væsentligt bedre end nogen anden testet fluorophore, og derfor blev brugt i hele udviklingen af triple-, dobbelt-og enkeltværelser fluorescerende reporter vira. En begrænsning ved at bruge denne fluorofor, er, at det ikke kan anvendes til at inficere enhver cellelinie, der allerede indeholder et grønt fluorescerende reporter fusionsprotein. For at imødegå analyse under disse omstændigheder blev flere alternative vira skabt ved hjælp af rød fluorescerende proteiner (tabel 1). Ved at udtrykke enten opløselig mCherry fra F17R sene promotor eller en mCherry-A4L fusionsprotein fra den naturlige A4L sene promotor vi er i stand til at udrette tilsvarende målinger uden Venus. Selvom brugen af mCherry ikke har den ekstra fordel, som Venus protein, vi er nu i stand til at rumme måling i grøn-udtrykkende cellelinjer.
Sammenfattende har vi udviklet et sæt reporter kokoppevira med forskellige applikationer, herunder high-throughput plade-læser eller højt indhold billedbehandling ASSAys. Disse vira vil undersøgelse af den virale livscyklus meget hurtigere end traditionelle metoder, og kan anvendes til grundforskning samt anvendt antiviral forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre og ingen patenter afventer for virus eller screeningsmetoder.
Acknowledgments
Vi takker SIGA Technologies (Corvallis, OR) for at give ST-246. DKR blev støttet af en NIH uddannelse tilskud i immunologi til Boston University (5T32AI 7309). Dette arbejde blev støttet delvist af P41 086.180, NIH RO1AI1096159-01, og RO3 (til JHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
