Summary
Vi beskriver bruken av et fluorescerende reporter vaccinia virus som muliggjør sanntids måling av viral infektivitet og genekspresjon gjennom stadium-spesifikke ekspresjon av spektralt atskilte rapportør fluoroforer. Vi detalj en plate-basert fremgangsmåte for nøyaktig å identifisere stadiet hvor virusreplikasjon blir påvirket som reaksjon på lite molekyl hemming.
Abstract
Poxviruses er en familie av doble strandet DNA virus som inkluderer aktive menneskelige patogener som monkeypox, molluscum contagiousum og Contagalo virus. Familien omfatter også koppevirus, Variola. På grunn av kompleksiteten i poxvirus replikering, mange spørsmål fortsatt om deres genuttrykk strategi. I denne artikkelen beskriver vi konseptualisering og bruk av rekombinante vaccinia virus som muliggjør sanntidsmåling av enkle og flere stadier av viral genuttrykk i en high-throughput format. Dette aktiveres ved bruk av spectrally distinkte fluorescerende proteiner som journalister for hver av de tre stadier av virusreplikasjon. Disse virusene gir et høyt signal-til-støy-forholdet og samtidig beholde trinns spesifikke uttrykk mønstre, slik at plate-baserte analyser og mikroskopiske observasjoner av virusreplikasjon og formering. Disse verktøyene har bruk for antiviral oppdagelse, studier av virus-vert interaksjon, og evolusjonær biologi.
Introduction
Tradisjonelt er virus uttrykk studert ved hjelp av molekylærbiologiske teknikker (f.eks nordblotting, western blotting, microarray hybridisering, etc.) en. Selv om disse metodene er i stand til å gi detaljerte opplysninger med hensyn til å kategorisere uttrykk endringer av enkelte mRNA eller proteiner, de er vanligvis ikke mottagelig for real-time og høy gjennomstrømning prosesser. Alternative tilnærminger med fluoresens-baserte journalister har blitt brukt tidligere når du arbeider med poxviruses; har imidlertid deres utvikling og bruk blitt motivert av varierte mål. Flere slike fremgangsmåter ble utformet for seleksjon av rekombinante virus 2,3. Disse teknikkene uttrykke EGFP ved riktig innlemmelse og uttrykk for eksogene DNA fra rekombinante vaccinia kloner. Tilsvarende flere vaccinia stammer stabilt uttrykker løselig EGFP eller GFP-merket proteiner uttrykt under en innfødt vaccinia arrangøren har blitt mye brukt. Disse er typtisk brukes til å kvantifisere virus oppføring og replikering under antistoff-baserte nøytraliseringstanker analyser, kjemisk hemming, eller sammenligning av antiviral effekt 4-6. Selv om disse virus har vist seg nyttig, er de begrenset i sin evne til å gi detaljert informasjon om punktet for inhibering på grunn av deres bruk av en enkelt tvetydig tidlig / sen viral promoter. Tidligere metoder har også gjort bruk av EGFP protein med suboptimale signal-til-støy-egenskaper.
På grunn av kompleksiteten i poxvirus replikering og mangelen på eksisterende verktøy tilgjengelig til analysen sanntid endringer i viral genekspresjon, har vi utviklet en pakke med singel og flertrinns reporter virus 7,8. Som beskrevet i tidligere publikasjoner, disse virusene uttrykke en, to, eller tre spectrally forskjellige fluorescerende proteiner fra innfødte vaccinia arrangører under tidlig, middels, eller sene stadier i infeksjon. Disse virusene kan være ossed som indikatorer på virusreplikasjon fremgang ved hjelp av en fluorescens mikroskop, og de er like godt egnet for high-throughput plate-og-leser baserte analyser. Disse virusene er enkle å bruke i stedet for villtype virus, vokser med liknende kinetikk for å nå tilsvarende titere 7. Under planleggingen og etableringen av disse virusene, ble mye omsorg tatt i å velge fluoroforene som har høye signal-til-bakgrunn egenskaper med overlegen folde effektivitet for å lette pålitelig kvantifisering med rask tilbakemelding til endringer i uttrykk (Venus, mCherry og TagBFP). I tillegg ble kombinasjoner av viral arrangører valgt som produserer high fidelity, entydig scenen spesifikke uttrykk, og gir informasjon om hele spekteret av tidlig (C11R promoter), middels (G8R promoter) og sen (F17R promoter) genuttrykk, i motsetning til tvetydig tidlig / sent arrangører.
Disse virusene kan bli brukt som et verktøy for investigating livssyklusen til den prototypiske poxvirus, vacciniavirus. Mye er fortsatt ikke kjent om verten-virus samspill til tross for sin lange historie av studien. Vaccinia er kompleks, produsere over 200 unike proteiner, hvorav mange er immunmodulerende og vert antagonistiske. Ved infeksjon begynner vaccinia virus umiddelbart tidlig mRNA transkripsjon. Dette er tilrettelagt av en RNA polymerase og transkripsjonsfaktorer som ble lastet på viral genom under virion emballasje og holdt i en midlertidig stoppet status inntil infeksjon. Denne tidlige uttrykk produserer proteiner som kreves for undertrykkelse av vertens immunsystemet (mRNA Decapping, dsrna beslaglegging, og lokkefugl reseptor proteiner samt hemmere av apoptose, stress respons, og Toll, IL, og NF-κB signal) og genomet replikering. Tidlig uttrykk produserer også transkripsjonsfaktorer som er nødvendige for mellom uttrykk. Intermediate uttrykk inkluderer uttrykk for sent stadium transkripsjonsfaktorer. Detteexpression cascade fører til produksjon av strukturelle og enzymatiske virusproteiner i sene stadier av infeksjonen, som er nødvendig for fullstendig montering av det modne vaccinia virion.
Vårt sett av fluorescerende reporter virus muliggjør rask fremgang å bli gjort i forståelsen av poxvirus biologi. En av de mest vanlige og tidkrevende metoder innen virologien er veksten assay. Dette innebærer typisk å infisere celler, enacting en serie av behandlinger, høsting virus ved lysering av infiserte celler og kvantifisere resulterende viral titer ved plaque-assay. Ved hjelp av rapportørvirus som er beskrevet her gjør det mulig for sanntids måling av virusvekst som lett kan analyseres og sammenlignes mellom en rekke behandlinger som utføres i parallell. Vi regner med dette settet av reagenser vil bli brukt i ulike protokoller for å identifisere endringer i viral genuttrykk i respons til medikamentell behandling, RNAi knockdown, eller vertsområde begrensning.
Denne metode gjør det også mulig med høy innholdsanalyse på en større skala enn tidligere tilgjengelig, slik at for høy gjennomstrømning anti-viral medikamentskjermer for spesifikt definerte mål etapper av interesse. Mens mange potensielle behandlinger for å bekjempe poxvirus infeksjon har blitt identifisert, den eneste FDA godkjente terapi effektive for behandling av poxvirus infeksjon er den asykliske phosphonate nukleosid, Cidofovir, og behandling med vaccinia immunglobulin 9,10. Til tross for utryddelsen av kopper i 1977 11, poxviruses fortsatt være en betydelig trussel mot menneskers helse 12. Opphør av utbredt vaksinering mot Variola viruset har ført til økt mottakelighet for andre poxviruses 13. For eksempel er regioner i Sentral-Afrika tidligere beskyttet av vaksinasjon opplever en bølge i Monkeypox virusinfeksjoner 14. Betydelig bekymring har også værtreist om den latente mottakelighet for bevisst utsetting av Variola virus. På grunn av de begrensede behandlinger for tiden tilgjengelig, det er et presserende behov for utvikling av nye behandlinger. Disse rapportørvirus tillater rask og høy gjennomstrømning lite molekyl inhibitor screening for hemming av en spesifikk fase av viral replikasjon. Identifisering av hemmere som retter seg mot virus uttrykk stadier øyeblikket ikke målet for hemming vil lette utviklingen av kombinasjonsterapi med økt potens.
Mye kan merkes om vaccinia cellebiologi ved å observere endringer i hver fase er genuttrykk. Demping av kjemisk eller genetisk manipulering av en infisert vertcelle er vanligvis uttrykt i form av reduserte virale titere. Men ved å sammenligne endringer i hvert stadium av viral uttrykk cascade, kan man få en mer fullstendig forståelse av hvordan virus fitness er virkningensert ved en bestemt behandling. Disse data har vist seg å korrelere godt med den tradisjonelle virustiter utgang, men mer detaljert mekanistisk informasjon, så vel som høy gjennomstrømning evner 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Plate Cells
- Dissosiere HeLa-celler fra platen og fortynnes i vekstmedium (DMEM, 2 mM L-glut, 10% FBS) til omtrent 2,0 x 10 5 celler / ml. Tilsett 100 ul / brønn i en svart-vegger, klar flatbunnet 96-brønns plate (20 000 celler / brønn).
- Inkuber cellene ved 24 timer inntil sammenflytende i en 37 ° C inkubator + 5% CO2.
2. Infisere celler
- Spe virus og infisere celler.
- Thaw TrpV (Triple virus; Tidlig Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) og PLV (Arrangøren-mindre Venus) fluorescerende virus og disaggregate hjelp sonikering for fem minutter. Alternativt kan rå virus stocks bli blandet 1:1 med 0,25 mg / ml trypsin i smitte media og inkubert ved 37 ° C i 30 min.
- Fortynne råolje virusstammene i 37 ° C-infeksjon media (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). For høy MOI infeksjoner (10 PFU / celle), fortynne virus lager til 1,0 x 10 7 PFU / ml forutsatt 5 x 10 4celler / brønn og et inokulum volum på 50 pl. Plan om å infisere tre replikat brønner for hver behandling med TrpV og ytterligere tre replikat brønner for samme behandling med PLV å gjøre rede for bakgrunnen fluorescens spesifikke for hver behandling.
- Infect brønnene ved tilsetning av 50 ul / brønn fortynnet virus i smittemateriale. Dette er definert som tid = 0 timer etter infeksjon (0 hpi).
- Fortynne ønsket behandling forbindelser til infeksjon media. For alle behandlinger en enkelt 2x konsentrat-blanding fortynning bør gjøres og anvendes til å replikere brønner (for eksempel 350 ul totalvolum i seks 96-brønner med 50 mL hver).
- Fortynne eksperimentelle forbindelser til infeksjon media.
- Fortynne kjøretøy-kontroll løsemiddel (f.eks PBS, DMSO) inn infeksjon media. Merk: Lignende endelige konsentrasjoner av kjøretøy-kontroll løsemidler bør brukes som søkte om eksperimentelle forbindelser (for eksempel hvis din IBT lager er laget med DMSO og brukes på en endelig-konsentrasjonenns av en mL / ml, deretter bruke DMSO alene på en mL / ml som bilen kontroll).
- Fortynne kontrollforbindelser inn infeksjon media. Anbefalte kontroll forbindelser innbefatter: 3,6 uM (1 pg / ml) 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (ARAC), 50 uM (11,7 pg / ml) isatin β-tiosemikarbazon (IBT), 60 uM (50 pg / ml) rifampicin eller 5 mikrometer (1,9 mikrogram / ml) ST-246 8,15,16. Se Representative Resultater for forventede effekter. Merk: gjøre denne fortynning på to ganger (2 x) den ønskede sluttkonsentrasjon fordi dette tilsettes i forholdet 1:1 til det volum som allerede er i brønnen.
- Umiddelbart etter tilsetningen av virus, tilsett 50 pl infeksjon medier som inneholder ønskede behandlinger og kontroller som fortynnet i trinn 2.2. NB: For å analysere for inhibering før tidlig ekspresjon, kan forbindelsen (e) enten tilsettes direkte til de fortynnede viruspodestoff (trinn 2.1.2) eller vertsceller før infeksjon (før trinn 2.1.3).
- Inkuber 6-24 hr i en 37 & #176, C inkubator + 5% CO 2.
Tre. Fix Cells
- Løser cellene ved tilsetning av 100 ul 8% paraformaldehyd til infeksjon media som allerede er i hver brønn. Inkuber ved romtemperatur i 15 min beskyttet mot lys. Merk: Det anbefales å legge 2x PFA (8%) direkte til infeksjon media for å hindre aerosolization av smittsom vaccinia som kan oppstå hvis høytiter media er invertert direkte inn avfall fatet før fiksering.
- Fjern fiksativ ved å snu platen inn i avfalls fatet.
- Tilsett 100 ul PBS romtemperatur.
- Tett plate med optisk klar selvklebende film. Merk: Plater kan oppbevares ved 4 ° C hvis ikke lese umiddelbart. Pass på å returnere forseglede plater til romtemperatur før du leser for å unngå kondens fra forvrenge spektrofotometer målinger.
4. Kvantifisere Virus Vekst
- Mål endepunkt fluorescens ved 515:530 for Venus, 587:610 for mCherry, og 415:457 feller TagBFP (Magnetiseringsutkobling: Utslipps bølgelengde i nm). Fire målinger bør i gjennomsnitt per brønn ved hjelp av optimaliserte innstillinger gevinst for hver kanal. Merknad: Den korrekte utslipp bølgelengde kan være forskjellig avhengig av hvilken modell og filterkarakteristikker av din plateleser. Dette kan bestemmes empirisk ved å utføre en emisjonsbølgelengde skanning for å bestemme det punkt hvor det er den største forskjell mellom TrpV og PLV for hver kanal.
- Normalisere rådata for å lette sammenligningen mellom eksperimenter.
- For hver kanal, bestemme gjennomsnittet av replikere TrpV og PLV brønner.
- Trekk fra de slemme PLV-infiserte bakgrunns målinger fra de slemme TrpV-smittede eksperimentelle målinger for hver behandling.
- Normalisere data ved å dele hver bakgrunn trekkes verdien av kjøretøyet bare verdi godt.
- Når et eksperiment har blitt gjentatt flere ganger, en enveis variansanalyse (enveis ANOVA) test og multippel comparison post-test kan utføres for å bestemme om noen av behandlingene reflekterer en statistisk signifikant forskjell fra kjøretøyet bare behandlingen for hver kanal.
. 5 Alternative Protokoll: Kinetic Plate Analyser
- Utfør alle trinn gjennom tillegg av behandlinger (trinn 2,3).
- Seal plate med selvklebende film og plass i plateleser kammer ekvilibrerte til 37 ° C. Merk: Spesielle hensyn må tas for å holde platene konsekvent på 37 ° C for å unngå unødig stress i cellene og kondens. For kinetiske undersøkelser, er det spesielt viktig å bruke en bufret medium (natriumbikarbonat og HEPES) for å opprettholde riktig pH uten tilsetning av 5% CO2.
- Set plate leseren få manuelt for å hindre metning av senere tidspunkter. Merk: Nøyaktig gevinst optimalisering kan fås ved å utføre et endepunkt analyser under lignende forhold.
- Acquire timeavlesninger for 8-24 HPI og normalisere ved hjelp simiLar prosedyre som i endepunkt analysen (trinn 4,2).
- Individuell tidspunkter kan bli analysert for statistisk signifikans ved hjelp av lignende fremgangsmåter som den tidligere beskrevne endepunkt assay.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som et eksempel på en typisk bruk av disse viruser, ble trippel fluorescens-reporter virus brukes til å sammenligne det punktet av hemming av flere veldefinerte poxvirus-inhibitorer.
HeLa-celler ble sådd ut i vevskultur behandlede sorte vegger klare flatbunnet 96-brønners plater og inkubert over natten. Sammenflytende monolag ble infisert ved en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 10 ved hjelp av enten trippel reporter virus (TrpV, tabell 1), eller promoter-mindre Venus (PLV), som angitt på platen kartet (fig. 1). Infeksjon media inneholdende behandlinger ble tilsatt for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,1% DMSO, 3,6 mM (1 pg / ml) ARAC, 50 uM (11,7 pg / ml) IBT, 5 uM (1,9 mikrogram / ml) ST-246 eller 60 uM (50 pg / ml) Rifampicin i triplikat. 0,1% DMSO ble anvendt som kjøretøykontroll siden all inhibitor stocks ble brukt ved en mikroliter / ml i DMSO. Platen ble returnert til en 37 ° C incubator inntil 18 HPI. Celler ble fiksert i 15 minutter ved tilsetning av 100 ul 8% PFA til alle brønnene og lagret i PBS som er beskyttet mot lys inntil avlest på en plateavleser. Fluorescens målingene ble utført ved hjelp av en Tecan Infinite M1000 plateleser og i-kontroll programvare (v1.5.14.0) etter bunn lese fire poeng per brønn ved eksitasjon: utslippsbølgelengder av 515:530, 587:610, 415:457 nm for Venus , mCherry, og TagBFP fluoroforene, henholdsvis. Før siste målingene, ble gevinst optimalisert for å tillate maksimal signal uten metning av sensorer (gevinst var typisk 235, 255, 235 for grønn, rød og blå målinger, henholdsvis).
Figur 1. Representant layout av infeksjoner og medikamentelle behandlinger på 96-brønns plate. Diagram av 96-brønns plate infeksjon og lite molekyl tillegg ordningen brukes for crspise representative resultater. Triple fluorescerende virus (TrpV; lysere grå) uttrykker tidlig Venus, middels mCherry, og sent TagBFP eller promoter-mindre Venus (PLV; mørkere grå) brukes i tre eksemplarer kolonner. 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (Arac), isatin β-thiosemicarbazone (IBT), rifampicin, ST-246 og DMSO kjøretøy kontroll med testet konsentrasjon er angitt til høyre. Klikk her for å se større bilde.
Relative fluorescensenheter (RFU) for hver replikat ble normalisert for hver kanal. Først ble den midlere fluorescensintensitet for PLV brønner subtrahert fra den gjennomsnittlige intensitet av TrpV brønner for hver behandling for å gjøre rede for bakgrunnsintensitet bidratt av hvert medikament. Deretter ble denne verdien delt på bakgrunn subtrahert midlere intensitet av DMSO-behandlede TrpV brønner (villtype vekst). Resultatene oppnådd etter behandling med kjente po resultatenexvirus hemmere var konsistent med tidligere publiserte funn og deres forstått virkningsmekanisme. Denne tidlige avslutning av gentranskripsjon og overgang til middels genekspresjon har vist seg å kreve DNA-replikasjon 17. I samsvar med dette, ARAC, en inhibitor for DNA-replikasjon, viste en dramatisk økning i tidlig genekspresjon (210% DMSO behandles tidlig ekspresjon, Fig. 2) og en fullstendig mangel på mellomliggende og sene uttrykket (0,4% og 0,3% av DMSO behandles mellomliggende og sene uttrykk, henholdsvis figur 2). Mens den eksakte virkningsmekanismen ikke er definert for IBT, er det tenkt å fremme lese-gjennom transkripsjon, som resulterer i økte mengder dsrna, aktivering av RNase L pathway og apoptose 18-20. Som svar på behandlingen IBT en gradvis alvorlig fenotype ble observert i hvilken mellomliggende og sene ekspresjon var signifikant mindre enn DMSO alene (24,7%og 2,9% DMSO ble behandlet for mellomliggende og sene uttrykk, henholdsvis figur 2). En konsekvent, men ikke statistisk signifikant nedgang tidlig fluorescens ble også observert; men dette skyldes dette sannsynligvis IBT-indusert apoptose på dette senere tidspunkt (74.0% av DMSO på 18 HPI). I motsetning til Arac og IBT, de Poxvirus narkotika ST-246 og rifampicin både hemme etter sen genuttrykk under virion montering og modning 15,16. Ingen forandringer i gen-ekspresjon ble observert i alle faser når cellene ble behandlet med enten ST-246 (100,9%, 98,5% og 94,5% av DMSO behandles tidlig, mellomliggende og sene uttrykk, henholdsvis figur 2) eller Rifampicin (107,6%, 104,2% og 106,5% av DMSO behandles tidlig, mellomliggende og sene uttrykk, henholdsvis).
Historisk sett har en kombinasjon av lav MOI (0,01 til 0,1 PFU / celle), og høy MOI (5-10 PFU / celle), vekstmålinger blir brukt når utforske den hemmende effekten av en ny lite molekyl eller virus mutant. Ved en lav MOI, er samlede hemmende effekter ofte er overdrevet av selv mindre inhibering siden bare et subsett av celler blir først infisert. Ved å prøve å definere et punkt i løpet av en infeksjon syklus ved hvilken et virus blir hemmet, er en høy MOI infeksjon sannsynligvis mer hensiktsmessig, da alle celler er infisert av den primære inokulum. Eksperimentet er vist i figur 3 ble utført som i figur 2, med tillegg av et sett av brønner som var infisert med en lavere MOI = 1. Som en hemmer som fungerer post-transkripsjonelt, bør ST-246 ikke påvirke hvilket som helst stadium av genekspresjon ; men det er klart at når bare en undergruppe av celler er infected (figur 3, MOI = 1) er det tydelig hemming av alle ledd i uttrykket (38,4%, 48,9% og 52,9% av DMSO, sammenlignet med 100,9%, 98,5% og 94,5% for MOI = 1 g. MOI = 10 infeksjonsnivå tidlig, mellomliggende og sene uttrykk, henholdsvis, figur 3). Ved 100% inhibering av moden virion dannelse av ST-246, betyr dette at 100% av cellene ble infisert ved MOI = 10 infeksjoner, og et sted mellom 50 og 70% av cellene ble produktivt infiserte under MOI = 1-infeksjon.
Fig. 3. Effekt av infeksjonsnivå på tilsynelatende ST-246-hemming. HeLa-celler infisert som i figur 2 med både høy (MOI = 10), og lav (MOI = 1) TrpV behandlet med ST-246. Relative fluorescensenheter (RFU; bakgrunn trekkes hver kanal basert on PLV vekst for hver behandling og normalisert til TrpV + DMSO) for tidlig (grønn), middels (rød), og sent (blå) viral uttrykk i celler infisert ved enten MOI = 1 eller MOI = 10 og behandlet med 20 mikrometer ST- 246. Klikk her for å se større bilde.
| Navn | Beskrivelse | Ref. |
| TrpV | Triple virus; C11R (tidlig) fremmet Venus, G8R (Intermediate) fremmet mCherry, F17R (Late) fremmet mTagBFP | 7 |
| PLV | Arrangøren-mindre Venus | |
| EV | C11R (tidlig) fremmet Venus | |
| IV | G8R (Intermediate) fremmet Venus | |
| LV | F17R (Late) fremmet Venus | |
| IREV | G8R (Intermediate) fremmet mCherry og C11R (tidlig) fremmet Venus | |
| LREV | F17R (Late) fremmet mCherry og C11R (tidlig) fremmet Venus | |
| LR | F17R (Late) fremmet mCherry | |
| mCherry-A4L | N-terminal fusjon av VENUS fluoroforen til sen-uttrykt viral kjernen protein A4L |
Tabell 1. Liste over vacciniavirus reporter stammer. Tabell beskriver fluorescens reporter virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her har vi beskrevet den praktiske bruken av en flertrinns vaccinia reporter virus (TrpV), noe som gir reproduserbare, tilbakemelding i sanntid tiltak av virusreplikasjon. Ved å bruke veldefinerte Poxvirus hemmere, var vi i stand til å vise at TrpV reagerer på en måte som samsvarer med den forstått virkningsmekanisme for hver inhibitor. Mens TrpV viruset gir den mest omfattende informasjon om virus scenen progresjon, to-trinns (IREV, LREV) og ett-trinns (EV, IV, LV) virus kan også brukes på samme måte, drar nytte av den optimale proteinfolding, stabilitet, og overlegen signal-til-støyforholdet for Venus fluoroforen.
Den proof-of-concept assay i denne protokollen viser gjennomførbarheten av å identifisere den fasen av viral genekspresjon bevirkes ved hjelp av kjente poxvirus-inhibitorer i en enkel, høy gjennomstrømning plate-assay. Denne assay kan utvides til å fullføre rask, omfattende screeningav ukjente kjemiske biblioteker i tillegg. Virusene kan brukes til å infisere små-molekyl behandlede celler med lav MOI, slik at for spesifikk identifisering av forbindelser som blokkerer en hvilken som helst stadium av den virale livssyklus. De hemmere kan da være skjermet ved hjelp TrpV på flere Mois å bestemme stadium av viruset livssyklusen hemmet, fra oppføring (ingen genuttrykk), til tidlig, middels, eller sent genuttrykk eller montering (full genekspresjon, men ingen virus spredning). Vi har brukt denne teknikken for å kunne identifisere en ny anti-poxviral inhibitor med aktivitet mot flere poxviruses, inkludert Monkeypox åtte.
Mens vi har gitt detaljer for anvendelse av disse virus på en plate-leser format, er det like godt egnet for mikroskopisk undersøkelse. Infeksjon og observasjon via fluorescens mikroskop (se figur 2B) gjør det mulig for en celle-for-celle-inspeksjon av viral stadium progresjon, noe som kan være nyttig ien blandet cellekultur innstilling, for eksempel infeksjon i et vev, eller virale eller bakterielle co-infeksjonsforhold. I tillegg, mens disse virusene er laget med henblikk på antiviral screening 8, regner vi med at de skal være av samme nytte i grunnleggende forskning undersøke livssyklusen til vaccinia virus. For eksempel, kan disse virus lett modifiseres ved hjelp av tradisjonelle teknikker til enten manglende eller økt ekspresjon av virale proteiner; kinetikken av virus gen ekspresjon og spredningen kan deretter bli overvåket i sann tid for alle stadier av viral transkripsjon.
Undersøkelser av virus-vert interaksjon kan dra nytte av disse reporter virus også. Disse reportere tillate rask identifisering av fasen av viral replikasjon fullført i løpet av infeksjon av ikke-ettergivende celletyper, for eksempel visse primære cellelinjer, perifere blod leukocytter, eller avvikende art 21,22. Informasjon samlet fra å bruke denneverktøyet ville fremme vår kunnskap om poxvirus vertsområde restriksjons faktorer og funksjonen av virale immun-regulerende proteiner. De virus vil også være nyttig for å identifisere den fasen av virusreplikasjonen inhibert av knockdown av vertsfaktorer som er nødvendige for infeksjon, i enten en hel-genom skala skjermen eller i en rettet lite bibliotek skjerm.
Flere trinn i denne protokollen bør vurderes kritisk når du begynner å bruke disse virusene i et nytt system. Forskjeller i plate-format, vekstmedier, og celletype kan kreve endring av MOI, inokulasjon tid, eller inkubasjon varighet. Det blir spesielt viktig å optimalisere endepunkt inkubasjonstid før skalere opp til high-throughput format. For å bestemme den ideelle inkuberingstid bør en pilot kinetic plate assay bli utført (se trinn 5). Under en kinetisk undersøkelse, er fluorescens målinger gjort hver time i 12-24 timer, og kan brukes til å fastslå tidspunktet for når den greter forskjellen er observert mellom kontroll og behandling virus uttrykk. Betydningen av dette trinnet kan sees i behandling med IBT, hvor inhibering på grunn av økt forekomst av apoptose fører til en tydelig, men ikke statistisk signifikant reduksjon i tidlig ekspresjon. Hvis tidligere tidspunkter (4-8 HPI) ble observert det ville trolig være ingen observerte forskjeller. I tillegg tester en roman hemmende sammensatte bør inneholde flere sammensatte konsentrasjoner. Selv om disse fluorescens reporter virus er i stand til å oppdage små endringer i genekspresjon, kan den ytterligere informasjon som er innhentet ved flere konsentrasjoner føre til en bedre forståelse av deres totale virkning.
Under planleggingen og etableringen av disse virusene, ble mye omsorg tatt i å velge fluoroforene som har høye signal-til-bakgrunn egenskaper 7. The Venus protein ble identifisert som betydelig bedre enn noen annen testet fluorophore, og derfor ble brukt gjennom utviklingen av triple, doble og enkle fluorescerende reporter virus. En begrensning ved å bruke denne fluoroforen er at den ikke kan brukes til å infisere en hvilken som helst cellelinje som allerede inneholder en grønn fluorescerende reporter fusjonsprotein. For å møte analyse under disse omstendigheter, ble flere alternative virus opprettet ved hjelp av rød fluorescerende proteiner (Tabell 1). Ved å uttrykke enten løselig mCherry fra F17R sent arrangøren eller en mCherry-A4L fusjonsprotein fra den naturlige A4L sent arrangøren er vi i stand til å oppnå tilsvarende målinger uten Venus. Selv om bruken av mCherry ikke har den ekstra fordelen levert av Venus protein vi er nå i stand til å imøtekomme måling i grønne-uttrykke cellelinjer.
I sammendraget har vi utviklet et sett med reporter vaccinia virus med ulike programmer, inkludert high-throughput plateleser eller høyt innhold bildebehandling assays. Disse virusene vil gjøre undersøkelse av det virale livssyklusen mye raskere enn tradisjonelle fremgangsmåter, og kan brukes for grunnforskning og anvendt antiviral forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre og ingen patentsøknader for virus eller screening metoder.
Acknowledgments
Vi takker SIGA Technologies (Corvallis, OR) for å gi ST-246. DKR ble støttet av en NIH trening stipend i immunologi til Boston University (5T32AI 7309). Dette arbeidet ble støttet delvis av P41 086180, NIH RO1AI1096159-01, og RO3 (til JHC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS) | Atlanta Biologicals | S12450H | |
| 200 mM L-Glutamine, (L-glut) | Gibco | 25030-081 | |
| 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3603 | |
| 384 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates | Corning | 3712 | |
| Trypsin, 2X, Sterile, Irradiated | Worthington Biochemical Corp. | TRLVMF | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Dimethyl Sulfoxide, Cell Culture (DMSO) | American Bioanalytical | AB03091 | |
| 1-β-D-Arabinofuranosylcytosine (AraC), MW= 280 g/mol | SigmaAldrich Co | C6645 | |
| isatin β -thiosemicarbazone (IBT), MW= 234 g/mol | Fisher Scientific | NC9075202 | |
| Rifampicin, MW= 823 g/mol | SigmaAldrich Co | R3501 | |
| ST-246, MW= 376 g/mol | SIGA Labs, Corvallis, OR | ||
| 8% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | |
| TempPlate RT optically clear film | USA Scientific | 2978-2700 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 |
References
- Yen, J., Golan, R., Rubins, K. Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1. J Vis Exp. 26 (26), (2009).
- Hansen, S. G., Cope, T. A., Hruby, D. E. BiZyme: a novel fusion protein-mediating selection of vaccinia virus recombinants by fluorescence and antibiotic resistance. BioTechniques. 32 (5), 1182-1187 (2002).
- Popov, S., Mirshahidi, S., Essono, S., Song, R., Wang, X., Ruprecht, R. M. Generation of recombinant vaccinia viruses via green fluorescent protein selection. DNA and Cell Biology. 28 (3), 103-108 (2009).
- Bartee, E., Mohamed, M. R., Lopez, M. C., Baker, H. V., McFadden, G. The addition of tumor necrosis factor plus beta interferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts. Journal of Virology. 83 (2), 498-511 (2009).
- Ward, B. M., Moss, B. Visualization of intracellular movement of vaccinia virus virions containing a green fluorescent protein-B5R membrane protein chimera. Journal of Virology. 75 (10), 4802-4813 (2001).
- Johnson, M. C., Damon, I. K., Karem, K. L. A rapid, high-throughput vaccinia virus neutralization assay for testing smallpox vaccine efficacy based on detection of green fluorescent protein. Journal of Virological Methods. 150 (1-2), 14-20 (2008).
- Dower, K., Rubins, K. H., Hensley, L. E., Connor, J. H. Development of Vaccinia reporter viruses for rapid, high content analysis of viral function at all stages of gene expression. Antiviral Research. 91 (1), 72-80 (2011).
- Dower, K., et al. Identification of a pyridopyrimidinone inhibitor of orthopoxviruses from a diversity-oriented synthesis library. Journal of Virology. 86 (5), 2632-2640 (2012).
- De Clercq, E. Clinical Potential of the Acyclic Nucleoside Phosphonates Cidofovir, Adefovir, and Tenofovir in Treatment of DNA Virus and Retrovirus Infections. Clinical Microbiology Reviews. 16 (4), 569-596 (2003).
- Prichard, M. N., Kern, E. R. Orthopoxvirus Targets for the Development of New Antiviral Agents. Antiviral Research. 10, (2012).
- Fenner, F. A successful eradication campaign. Global eradication of smallpox. Reviews of Infectious Diseases. 4 (5), 916-930 (1982).
- Breman, J. G., Henderson, D. A. Poxvirus dilemmas--monkeypox, smallpox, and biologic terrorism. The New England. Journal of Medicine. 339 (8), 556-559 (1998).
- Baker, R. O., Bray, M., Huggins, J. W. Potential antiviral therapeutics for smallpox, monkeypox and other orthopoxvirus infections. Antiviral Research. 57, 1-2 (2003).
- Rimoin, A. W., et al. Major increase in human monkeypox incidence 30 years after smallpox vaccination campaigns cease in the Democratic Republic of Congo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U S A. 107 (37), 16262-167 (2010).
- Sodeik, B., Griffiths, G., Ericsson, M., Moss, B., Doms, R. W. Assembly of vaccinia virus: effects of rifampin on the intracellular distribution of viral protein p65. Journal of Virology. 68 (2), 1103-1114 (1994).
- Grosenbach, D. W., Jordan, R., Hruby, D. E. Development of the small-molecule antiviral ST-246 as a smallpox therapeutic. Future Virology. 6 (5), 653-671 (2011).
- Broyles, S. S. Vaccinia virus transcription. Journal of General Virology. 84 (9), 2293-2303 (2003).
- Condit, R. C., Niles, E. G. Regulation of viral transcription elongation and termination during vaccinia virus infection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression. 1577 (2), 325-336 (2002).
- Díaz-Guerra, M., Rivas, C., Esteban, M. Inducible expression of the 2-5A synthetase/RNase L system results in inhibition of vaccinia virus replication. Virology. 227 (1), 220-228 (1997).
- Cohrs, R. J., Condit, R. C., Pacha, R. F., Thompson, C. L., Sharma, O. K. Modulation of ppp(A2’p)nA-dependent RNase by a temperature-sensitive mutant of vaccinia virus. Journal of Virology. 63 (2), 948-951 (1989).
- Sánchez-Puig, J. M., Sánchez, L., Roy, G., Blasco, R. Susceptibility of different leukocyte cell types to Vaccinia virus infection. Virology Journal. 1 (1), (2004).
- Bengali, Z., Satheshkumar, P. S., Yang, Z., Weisberg, A. S., Paran, N., Moss, B. Drosophila S2 cells are non-permissive for vaccinia virus DNA replication following entry via low pH-dependent endocytosis and early transcription. PLoS One. 6 (2), (2011).
