Abstract
Die subkutane Matrigel Plug-Assay in Mäusen, ist ein Verfahren der Wahl für die in vivo-Bewertung von pro- und anti-angiogene Faktoren. Bei diesem Verfahren werden die gewünschten Faktoren Kaltflüssigkeits ECM-mimische Gel, das nach subkutaner Injektion verfestigt, um eine Umgebung imitiert die Krebs Milieu bilden eingeführt. Diese Matrix ermöglicht das Eindringen von Wirtszellen, wie beispielsweise Endothelzellen und damit die Bildung von Gefäßen.
Hierbei schlagen wir eine neue modifizierte Matrigel Stecker Assay, der ausgenutzt werden kann, um die angiogene Potential von einem Pool von Faktoren, die durch die Krebszellen sezerniert zu illustrieren, im Gegensatz zu einem bestimmten Faktor (zB bFGF und VEGF) bzw. Agenten. Der Stecker enthält ECM-Mimik-Gel verwendet, um den Host (zB Maus) mit einem Pool von Faktoren, auf die CM schnell wachsender Tumor erzeugende Glioblastomzellen abgesondert einzuführen. Wir haben zuvor beschriebenen einen ausführlichen Vergleich der angiogene Potential vonU-87 MG menschlichen Glioblastom und deren ruhenden abgeleiteten Klon, in diesem Systemmodell, welches induzierte Angiogenese in der U-87-MG-Elternzellen. Das CM wird durch Filtern gesammelt Medien aus zusammenfließenden Gewebekulturplatten mit einer der beiden Zelllinie nach 48 Stunden Inkubation vorbereitet. Daher enthält sie nur Faktoren von den Zellen sezerniert wird, ohne die Zellen selbst. Beschrieben wird hier die Kombination von zwei bildgebenden Verfahren, Microbubbles kontrastverstärkte Ultraschallbilderzeugung und intravitalen fibered konfokale endomicroscopy für eine genaue Echtzeit-Charakterisierung des Ausmaßes, der Morphologie und Funktionalität der neu gebildete Blutgefäße innerhalb der Stecker.
Introduction
Das Matrigel Stecker Angiogenese-Test wurde zuerst von Kibbey et al. 1992, wo es verwendet wurde, um die Angiogenese-Stimulation durch das Peptid SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1 zu bewerten. Im Gegensatz zu anderen in vivo-Angiogenese-Assays, wie die Maus korneale Angiogenese oder Hühner-Chorioallantoismembran-Assays, ist dieser Test relativ leicht, 2 um. Das injizierte ECM-mimische Gel kann Zellen pro-angiogenen oder einer anti-angiogenen Verbindungen und / oder Faktoren enthalten. Bei der Beurteilung der Aktivität eines anti-angiogenen Verbindungen, enthält der Stecker in der Regel eine Mischung aus den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) und Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) und der anti-angiogene Substanz kann direkt in den Stopfen oder systemisch 3 verabreicht werden, 4.
Das ECM-Mimik Gel wird subkutan injiziert, wo es innerhalb von Minuten erstarrt. Beurteilung der Blutgefäß Rekrutierung in der resultierenden Stecker typically durch Messen der Hämoglobinspiegel innerhalb des Steckers, durch Fluoreszenzsignalmessung nach der Injektion von mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) -markiertem geführt Dextran durch Immunfärbung Histologieschnitten für Endothelzellen-spezifische Marker oder durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) 2,5, 6. Allerdings erlaubt diese Einschätzung nur Endpunktanalyse und es fehlt Informationen über die Funktionalität und die Morphologie der Blutgefäße. Zusätzlich wurden Messungen des Plasmavolumens, entweder durch Hämoglobinniveaus oder durch Verwendung von Dextran-FITC als Indikator kann irreführend sein, da Blutgehalt wird durch die Größe der Blutgefäße und der Umfang der stagnierenden Pools von Blut beeinflusst. Dies ist besonders wichtig, wenn die angeworben Gefäßsystem wird durch die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt 7 gekennzeichnet.
Wir hier schlagen eine neue, genauere, Verfahren zur Visualisierung der eingestellten Blutgefäße durch die Kombination von zwei sich ergänzenden bildgebenden Verfahren. High auflösenden Mikrokontrastverstärkten Ultraschall (US) in Kombination mit intravital fibred-konfokale Endomikroskopie können nicht nur Informationen über Blutgefäßdichte, sondern auch auf ihre Morphologie und Funktionalität bieten. Darüber hinaus kann diese Analyse zu verschiedenen Zeitpunkten, wodurch so die Überwachung der Angiogenese-Kinetik erfolgen. US ist eine weit verbreitete Bildgebungsmodalität, die eine hohe räumliche Auflösung für Blutgefäße Bildgebung nach intravenöser (iv) Injektion von Mikrobläschen, die sich ausschließlich in dem vaskulären Kompartiment 8-11 bleiben besitzt. Die Mikrobläschen sind gasgefüllten Mikrobläschen, die eine starke echogenen Signal, wenn sie mit einem US-Puls angeregt und damit als gutes Kontrastmittel dienen. 3D-Bilder des Steckers mit dem US-Bildgebungssystem-Software folgende Mikroblasen Zerstörung erworben. Die resultierenden Bilder werden aus Bildfeldern vor und nach der Zerstörung von Mikroblasen besteht und geben den Unterschied im Videointensität in der Farbe. Diese überlagertBilder werden von der Software automatisch angezeigt. Folglich kann der Prozentsatz an funktionellen Gefäße innerhalb des Steckers zu quantifizieren. Hohe Auflösung fibered konfokalen Endomikroskopie dient als komplementäre Bildgebungsverfahren durch die Berichterstattung auf die Blutgefäße Morphologie. In diesem minimal invasiven Verfahren werden die Bilder nach intravenöser Verabreichung von FITC-konjugiertem Dextran 12 erworben. Die fluoreszierende Polymerfarbstoffe in die Blutbahn und dient als "Kontrastmittel" für die Blutgefäße der Morphologie und der Blutfluss bei. Da darüber hinaus die injizierte Polymer in einer Größe von 70 kDa, es kommt immer nur undichte Gefäße nach Tumorvaskulatur gefunden. Dies wird in hohem Hintergrund von der FITC-markiertem Dextran außerhalb der Blutgefäße führen. Folglich kann fibered konfokalen endomicroscopy verwendet, um typische Eigenschaften des EPR-Effekt in Tumor neovasculature- vergrßerte undicht, hoch verheddert Gefäße sichtbar zu machen, mit stumpfen Enden ist.
Das Systemmodell beschrie wurdeBett im Vergleich der angiogene Potential von U-87-MG-menschlichen Glioblastom und deren ruhenden Klon 13. Gefäßbildung in den Steckern bewertet 3 Wochen veröffentlichen ECM-Mimik Gel Impfung. Es wurde gezeigt, dass die Vaskularisierung in Stecker mit CM von U-87-MG schnell wachsenden Tumor erzeugenden Zellen wurde hinsichtlich der Anzahl, Dichte und Funktionalität wesentlich erhöht, wenn sie mit der Vaskularisierung innerhalb Stecker mit CM von den ruhenden Tumorerzeugenden Zellen verglichen. Daher konnten die Autoren schließen, dass CM, isoliert aus U-87-MG schnell wachsenden Tumor erzeugenden Zellen enthält höhere pro-angiogenen Faktoren, verglichen mit dem CM von ruhenden Tumorerzeugenden Zellen. Diese Faktoren stimulieren die Bildung von funktionellen Blutgefäße durch positiv auf alle Schritte der angiogenen Kaskade (dh Proliferation, Sprießen, Migration und schließlich die Bildung von röhrenförmigen Strukturen von Endothelzellen).
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Protocol
HINWEIS: Alle Tier Verfahren genehmigt und in Übereinstimmung mit den Standards von der Universität Tel Aviv Sackler School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt.
1. Anlage Nährmedienzubereitung
- Seed 2 x 10 6 U-87-MG-Zellen in einer 10 cm-Kulturplatte in einem Volumen von 8 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin / Nystatin-Lösung ergänzt.
- Zellen bei 37 ° C; 5% CO 2 bis zum Erreichen vollständigen Konfluenz bei 48 Stunden.
- Mit einem 10-ml-Spritze, zurückzutreten alle Medium von der Platte und durch ein 0,45 um Filter in eine 15-ml-Tube.
- Ohne Waschen der Zellen Platte, 1 ml Trypsin-Lösung (0,25%) und Inkubation.
- Wenn sämtliche Zellen abgelöst werden, inaktivieren Trypsin unter Verwendung von mindestens 5 ml DMEM mit 10% FBS und die Vorform eine Zellzahl.
- Übertragen der CM in einen Glasrundkolben und konzentriere unter Hochvakuumrotationsverdampfer. Um den Prozess zu beschleunigen, erhöhen die Badtemperatur auf 37 ° C, falls gewünscht. Fortfahren, bis der CM erreicht eine pastöse Textur.
- Resuspendieren CM von jedem Kulturplatte in 400 ul Kochsalzlösung. Bei der Verwendung von mehr als einer Platte verwenden äquivalentes Volumen. Beispielsweise wird für 2 Kulturplatten, verwenden 800 & mgr; l. Verwenden Sie jede Platte für 4 Mäusen.
- Um verschiedene Zelllinien oder Behandlungen zu vergleichen, nach dem Zellen-Verhältnis in Schritt 1.6 empfangen Einstellen der Lautstärke. Zum Beispiel, wenn eine Platte enthält 1.5x mehr Zellen, fügen Sie 200 ul Kochsalzlösung zu den bereits bestehenden 400 ul. Dies wird die angepasst cm
HINWEIS: Es wird später um CM Konzentration zu normalisieren werden.
- Vor der Inokulation des ECM-Mimik Gel in Mäuse, bereiten Sie die folgenden Materialien:
- Wachstumsfaktoren reduziert phenolfrei ECM-Mimik-Gel (tauen über Nacht, einen Tag vor dem Experiment, bei 4 ° C auf Eis).
- Elektrorasierer.
- Ketamin und Xylazin, um die Mäuse zu betäuben.
- Eiskalte 1000 ul sterilen Spitzen.
- Eiskalte 1-ml-Spritze und 27 G Nadeln.
- Bereiten Sie für jede Maus ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 80 ul eingestellt CM und auf Eis halten.
- Zu jedem Röhrchen, fügen Sie 600 ul eiskaltem Wachstumsfaktoren reduziert phenolfrei ECM-Mimik Gel, das über Nacht bei 4 ° C auf Eis aufgetaut wurde. Das ECM-Mimik-Gel ist in 4 ° C flüssig und verfestigt sich bei Körpertemperatur; um die ECM-Mimik Gel erstarrt zu vermeiden, verwenden eiskalten 1000 ul Tipps. Rohre Vorsichtig mischen, ohne Bildung von Blasen und auf Eis halten.
- Anesthetize 6 Wochen alten BALB / c-Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (12 mg / kg). Überprüfen Sie die Narkose nach der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss, dh vor dem Beginn des Experiments. Tiere haben ihren richtigen Ebene der Narkose erreicht, wenn sie nicht mehr zu einer festen Zehen Prise reagieren.
- Rasieren Sie die Bauchraum der Mäuse und desinfizieren mit einem chirurgischen Scheuer / Alkohol.
- Verwenden eines kalten 1 ml Spritze und einer 27 G-Nadel, um den Inhalt des Eppendorfgefäß subkutan zu injizieren. Führen Sie die Injektion sehr langsam, um eine Blasenbildung zu verhindern. Sobald alle Volumen verabreicht wird, nicht die Nadel für einige Minuten auszuwerfen, bis zur Verfestigung auftritt.
3. Bewertung der ECM-Mimik Gel Stecker Vaskularisierung mittels Ultraschall
HINWEIS: Dieser Teil des Protokolls ist, Vorkenntnisse zum Betrieb eines Ultraschall-Bildgebungssystem, oder die Unterstützung durch einen autorisierten Techniker.
- Bevor Sie beginnen, die fach Materialien und Instrumente bereit:
- Elektrorasierer.
- Enthaarungscreme.
- Ketamin und Xylazin, um die Mäuse zu betäuben.
- Nicht gezielte Mikroblasen.
- Aktivierungsvorrichtung.
- US-Bildgebungssystem mit einem 55 MHz-708 Sonde und einer 3D-Erfassungsmikromanipulator.
- Messen Sie Vaskularisierung in den Steckern 3 Wochen nach der Inokulation:
HINWEIS: In der U-87 MG-basierten Tiermodell, wurde 3 Wochen gefunden, dass die ideale Zeitpunkt zur Bildgebung dar. Unter verschiedenen Einstellungen, Kalibrierung Gefäß Kinetik ab ein paar Tage nach der Inokulation von Steckern.- Anesthetize Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (12 mg / kg). Überprüfen Sie die Narkose nach der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss, dh vor dem Beginn des Experiments. Tiere haben ihren richtigen Ebene der Narkose erreicht, wenn sie nicht mehr zu einer festen Zehen Prise reagieren.
- Rasieren Sie dieBauchraum der Mäuse und Behandlung mit Enthaarungscreme.
- Fixieren die Mäuse supinely auf der Bühne des Mikromanipulators.
- Mit einer 1 ml Spritze mit Kochsalzlösung und eine 30-G-Nadel, legen Sie die Nadel in die Schwanzvene, fixieren Sie die Nadel fest und lösen Sie die Spritze.
- Für den Kontrast 3D-Modus Bildaufnahme Sitzung festgelegt:
- Drücken Sie auf "3D", um die 3D-Motorphase zu initialisieren und legen Sie die Wandler in der Mitte des gewünschten Scanbereichs.
- Drücken Sie "3D" und geben Sie den Scan-Entfernung und Schrittgröße, und drücken Sie "Scan".
- Stellen Sie sicher, dass der gesamte Stecker wurde in den angezeigten 3D-Bilddaten gescannt. Wenn nicht, stellen Sie den Schwinger so dass der gesamte Stecker in der Scan-und wiederholen Sie Schritt 3.5.2 zu sehen ist.
- Drücken Sie "Kontrast", und drücken Sie die Zeitverstärkungsausgleich (TGC) steuert nach links, um das Bild dunkler zu machen.
- Aktivieren Sie die Mikrobläschen mit einem Fläschchen Mixer, desi istFür die Aktivierung von Mikroblasen für 45 sec finierten.
- Mischen Sie in einer 1 ml Spritze 50 ul von Mikrobläschen mit 50 ul Kochsalzlösung.
- Ersetzen Sie die Kochsalzlösung, die gelöste Spritze mit einer Spritze mit aktivierten Mikroblasen. Injizieren Sie den verdünnten Mikrobläschen in die Schwanzvene der Mäuse, warten Sie einige Sekunden, bis die Luftblasen, um einen stabilen Zustand zu erreichen, und dann erwerben 3D kontrastverstärkten Kinoschleife des Steckers, mit dem 3D-Akquisition Motor:
- Drücken Sie "3D" und wählen Sie "Scan", um 3D-kontrastverstärkten Bilder erwerben und drücken Sie die "Cine Store", um die Bilddaten zu speichern.
- Drücken Sie "3D" und klicken Sie auf "Destroy 3D", um die Mikrobläschen zerstören.
- Drücken Sie "3D" erneut und wählen Sie "Scan", um ein post-Zerstörung Kinoschleife zu erwerben, und drücken Sie "Cine Store".
- Generieren Sie das Overlay-Bild-Frames vor und nach der Zerstörung der Mikrobläschen:
- In der &# 8220; Referenz-Einstellungen "auf der linken Seite des Bildschirms klicken Sie auf" Create Reference ".
- Drücken Sie auf "Study Management", das erworbene vorge Zerstörung Kinoschleife zu öffnen.
- Klicken Sie auf "Process Cine", um die grüne Gegensatz Overlay zu erzeugen, klicken Sie auf "Laden in 3D".
- Verwenden Sie die US-Imaging-Software, um die daraus resultierenden 3D-Bild für das Blutvolumen in den Steckern zu quantifizieren:
- Drücken Sie auf "Scan / Einfrieren" und drücken Sie "Modus-Einstellungen".
- Klicken Sie auf "Lautstärke" und wählen Sie "Parallel".
- Erstellen eines 3D-Volumen des Zielgewebes durch Segmentieren einer Reihe von Konturen.
- Klicken Sie auf "Fertig stellen", um die Segmentierung zu vervollständigen.
ANMERKUNG: Das Volumen des Kontrastmittels werden auf der unteren linken Seite des Bildschirms angezeigt.
- Am Ende des Verfahrens, legen Mäuse in einem warmen, trockenen, sauberen, ruhigen Umgebung vonandere Tiere. Sorgen für Wärme mit Hilfe eines handelsüblichen chirurgischen Heizkissen oder eine Glühlampe (50-75 Watt), von Nagetieren platziert 12-14 Zentimeter entfernt. Überwachen Sie Mäusen fortlaufend, bis die Aufrechterhaltung aufrechte Körperhaltung und in der Regel zu Fuß.
4. Bewertung der ECM-Mimik Gel Stecker Gefäßsystem Morphologie Mit Fibered konfokale Endomikroskopie
HINWEIS: In diesem Teil des Protokolls ist unmittelbar nach US-Bildgebung durchgeführt und es Vorkenntnisse für den Betrieb des fibered konfokalen Endomikroskopie-Bildgebungssystem, oder die Hilfe von einem autorisierten Techniker erfordert.
- Bevor Sie beginnen, die folgenden Materialien und Instrumente bereit:
- Chirurgie Werkzeuge wie Zangen, Scheren und resorbierbare Nähfäden.
- FITC-konjugiertes Dextran (70 kD).
- Eichlösungen (drei Röhren, die jeweils Wasserstoffperoxid, Wasser oder fluoreszierende Lösung).
- Das Abbildungssystem und eineSonde für Tomographie des Gefäßsystems gemäß Hersteller.
- Anesthetize Mäuse mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (12 mg / kg).
- Verabreichen iv über die Schwanzvene 200 & mgr; l von 10 mg / ml FITC-markiertes Dextran.
- Desinfizieren Sie den Bauchbereich mit einem chirurgischen Scheuer / Alkohol und wenden Sie einen kleinen Schnitt in etwa 1 cm vom Stecker.
- Legen Sie die Endomikroskopie Sonde auf der Oberseite des Steckers vorsichtig, während die Stecker intakt.
- Übernahme:
- Sobald die Sonde auf dem Stecker eingestellt, drücken Sie "Start Laser" mit dem Fußpedal. Die Fluoreszenz sollte auf dem Bildschirm angezeigt werden.
- Erwerben Kurzfilme (bis zu 30 Sekunden), indem Sie "Record" auf dem Bildschirm oder mit dem Fußpedal "Auswählen".
- Zwischen Filme, waschen Sie die Sonde, indem Sie die Spitze in ein Röhrchen mit Wasser.
- Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Sonde und reinigen Sie die Spitze mit einem Wattestäbchen.
- Zur Analyse mittlere vessel Durchmesser:
- Klicken Sie auf das Symbol "Detect Mikrogefäße" in der oberen Platte, das Gefäß Detektionsmodul-Fenster zu öffnen.
- Klicken Sie auf "Einstellungen" und markieren Sie "Mean Gefäßdurchmesser" in der "Statistik von Interesse" und "Anzeige Histogrammbalken" im "Anzeigemodus".
- Klicken Sie auf "Erkennen", um die ausgewählten Messungen anzuzeigen.
- Um die Fluoreszenzsignalintensität in Bereichen angrenzend an Blutgefäßen zu analysieren:
- Klicken Sie auf "Erstellen Kreis ROI" im linken Fenster und erstellen Sie einen Kreis in den Bereich von Interesse.
- Klicken Sie auf "Compute Histogramm innerhalb ROI", um die Werte in dieser Region bezogen zu berechnen.
5. nach Eingriff Die Behandlung der Mäuse
- Am Ende eines jeden bildgebendes Verfahren, legen Mäuse in einem warmen, trockenen, sauberen, ruhigen Umgebung von anderen Tieren. Sorgen für Wärme mit einem handels einvailable chirurgische Heizkissen oder eine Glühlampe (50-75 W), platziert in 12-14 weg von Nagetieren. Überwachen Sie Mäusen fortlaufend, bis die Aufrechterhaltung aufrechte Körperhaltung und in der Regel zu Fuß.
- Zur weiteren Analyse der Stecker "Vaskularisierung bei zusätzlichen Zeitpunkten gelten die folgenden Wiederherstellungsbedingungen:
- Naht der kleinen Schnitt mit resorbierbaren Fäden.
- Geben Mäusen Analgesie wie Buprenorphin (1 mg / kg) subkutan, und zum Einzelkäfigen.
- Beachten Sie alle Tiere, um festzustellen, ob weitere analgetische Behandlung erforderlich und ist neu zu bewerten täglich zur Überwachung und Bewertung für Not.
- Am Endpunkt des Experiments euthanize Mäusen indem zuerst Isofluran, gefolgt durch zervikale Dislokation.
- Wenn zusätzliche Bildgebung in den Wochen nach der Anfangsabbildungsschritte durchgeführt werden, sollten alle Verfahren möglichst steril gehalten werden. Ein chirurgisches Hautpeeling durchgeführt werden soll, steril water und sterile Wattestäbchen verwendet werden zum Reinigen der Endomikroskopie Sonde, und sollte die Sonde zwischen jedem Tier mit sterilem Wasser zu desinfizieren.
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Representative Results
Die Implantation ECM-Mimik Gel Stecker mit CM von schnell wachsenden angiogene Tumormittel generiereZellLinie U-87 MG, führt zu umfangreichen Angiogenese. Das Gefäßsystem kann weitgehend durch die Verwendung von zwei komplementären Bildgebungsverfahren untersucht werden.
Microbubbles kontrastverstärkten Bildgebung offenbart US zügige Einstellung Funktionsblutgefäße in den Stecker durch umfangreiche Blutfluss zur Veranschaulichung im U-87 MG CM geladenen Stecker, im Gegensatz zu nicht nachweisbaren Blutflusses innerhalb Stecker CM aus ruhenden Tumor erzeugende Zellen, die (Abbildung 1) .
Die Morphologie dieser neu gebildeten Gefäße um fibered konfokalen endomicroscopy (Abbildung 2) hervorgehoben. Blutgefäße innerhalb Stecker mit U-87 MG CM geladen ausgestellt typisch für die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung für Makromoleküle, wie Dextran-FITC bei 70 kDa Größe hier verwendeten Morphologie. Blutgefäße wurden vergrößert und hoch ta ngled mit nicht kontinuierlichen und träge Strömung (2A, C). Auch wurde Austreten von Blut in die Umgebung zu beobachten, was durch hohe Fluoreszenzsignal außerhalb der Blutgefäße (2B) dargestellt.
Abb. 1: Mikroblasen Kontrastmittel-Bildgebung US Nach intravenöser Verabreichung von Mikrobläschen und ihre Zerstörung, U-87-MG-CM, die Stecker eine erhöhte Durchblutung (in grün). Plugs, die CM von U-87 MG abgeleiteten ruhenden Tumor erzeugende Zellen wurden als Kontrolle verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Abbildung 2: Fiber konfokalen Mikroskopie. (A) Die intravenöse Verabreichung von 70 KDa Dextran-FITC, ermöglicht die Darstellung der Durchblutung und Blutgefäße Morphologie. U-87-MG-CM, die Stecker Gefäßsystem besteht aus undicht, vergrößerte Gefäße mit Blunts endet. Blutgefße Austretens durch Fluoreszenzsignal außerhalb des Gefäßsystems gezeigt. Normale Vaskulatur in Maus Abdomen wurde als Kontrolle verwendet. (B) Fluoreszenzsignalintensität in Bereichen angrenzend an die Blutgefäße. Das Fluoreszenzsignal wird durch ein Spektrum von rot nach weiß exemplifiziert. Dunkelrot bedeutet niedrige Signalintensität, während weiß steht für hohe Fluoreszenzsignal. U-87-MG-CM, die Stecker zeigen eine deutliche Fluoreszenzsignal außerhalb der Gefäße, solange ein Signal außerhalb der normalen Gefäßen gezeigt. (C) mittlere Gefäßdurchmesser (MVD) von Blutgefäßen im U-87-MG-CM, die Stecker (22,4 um) significantly höher als im MVD von normalen Gefäßen (6,7 um). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Die Kombination von komplementären Bildgebungsverfahren ermöglicht den Erwerb von Informationen über die verschiedenen Komponenten der Angiogenese "Gefäßdichte, Funktion und Morphologie. Lade CM auf ECM-mimische Gelpfropfen erzeugt ein Tumor-Mikroumgebung, die aus anderen Zellpopulationen getrennt ist, wie Endothelzellen, die in den Stecker rekrutiert werden und extravasate.
Durch Ausführen, parallel Mikrobläschen kontrastverstärkten Bildgebung und US fibered konfokalen endomicroscopy Bildgebung, können wir schließen, dass ein Pool von Faktoren, die durch schnell wachsenden Tumoren angiogene Erzeugungszellen sezerniert wird, ohne dass die Krebszellen selbst können nicht nur rekrutieren Blutgefäße, aber Auch bilden funktionelle Gefäßsystem mit EPR typischen Eigenschaften. Außerdem ermöglicht dieses Verfahren die Trennung zwischen den Auswirkungen der sekretierten Faktoren und Zell-Zell-Wechselwirkung in der Tumormikroumgebung.
Informationen vom US erhalten und fibered konfokalenendomicroscopy ist jedoch auf die Beschränkung der Bilderzeugungstechnik unterzogen. Zum Beispiel werden bei der Verwendung des mit Fasern versehenen konfokalen endomicroscopy Bildgebung, ist es unmöglich, ein Abbild eines einzelnen spezifischen Blutgefß im Laufe der Zeit oder auch die gleiche Fläche auf dem Stecker.
Die ECM-mimische Gelstopfens Assay ist relativ leicht durchzuführen, und dies wird aufrechterhalten, wenn das Laden CM mit der ECM-mimische Gels. , Ein kritischer Punkt, der in Betracht gezogen werden sollten Allerdings ist die CM an ECM-Mimik Gelanteil. Große Mengen von CM könnte die ECM-Mimik Gel erstarrt zu verhindern. Daher sollte CM Menge etwa 13% der ECM-mimische Gel nicht überschreiten.
Diese Methode kann für verschiedene experimentelle Systeme und Anwendungen angepasst werden. Zum Beispiel kann es verwendet werden, um anti-angiogenen Medikamenten durch Laden CM prä- und post-behandelten Zellen zu beurteilen. Es können auch andere Zelllinien, unter diesen experimentellen Einstellungen verwendet werden. Allerdings ist die Kalibrierung, um eine erforderlichepply die optimale Konzentration CM. Darüber hinaus sollte der ideale Zeitpunkt für die Bildgebung nach jedem Modellsystem optimiert werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary Vacuum Evaporator | - | - | - |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 4 °C on ice |
| Depilatory cream | - | - | - |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | - | - |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | - |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 sec using VialMix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | - | - |
| 70 kD FITC-labeled dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin/streptomycin/nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
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