Abstract
Den subkutana matrigel plug-analys på möss är en metod för val för utvärdering in vivo av pro- och anti-angiogena faktorer. I denna metod, är önskvärda faktorer införes i kall-vätske ECM-imitatör gel som, efter subkutan injektion, stelnar och bildar en miljö mimicking cancern milieu. Denna matris tillåter penetrering av värdceller, såsom endotelceller och således bildandet av vaskulaturen.
Häri föreslår vi en ny modifierad matrigel plug-analys, som kan utnyttjas för att illustrera angiogena potentialen av en pool av faktorer som utsöndras av cancerceller, i motsats till en specifik faktor (t.ex. bFGF och VEGF) eller ombud. Kontakten innehåller ECM-imitatör gel används för att introducera den mottagande (dvs, mus) med en pool av faktorer som utsöndras till CM för snabbväxande tumörgenere glioblastomceller. Vi har tidigare beskrivit en omfattande jämförelse av den angiogena potentialen hosU-87 MG humant glioblastom och dess vilande-härledd klon, i detta system modell, som visar inducerad angiogenes i U-87 MG-parentala celler. Den CM framställs genom att filtrera insamlade media från sammanflytande vävnadsodlingsplattor av endera cellinje efter 48 timmars inkubation. Därför innehåller den enda faktorerna som utsöndras av celler, utan cellerna själva. Beskrivs här är en kombination av två avbildningsmetoder, mikrobubblor kontrastförstärkt ultraljud och intravital fibered-konfokal endomicroscopy, för en exakt, realtid karakterisering av den omfattning, morfologi och funktionalitet nybildade blodkärl i pluggarna.
Introduction
Den matrigel plug angiogenes analysen beskrevs först av Kibbey et al. 1992, där det användes för att utvärdera angiogenes stimulering av peptiden SIKVAV (Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val) 1. I motsats till andra in vivo-angiogenesanalyser, liksom mus korneal angiogenes eller chick korioallantoismembranet analyser är denna analys relativt enkelt att utföra två. Den injicerade ECM-imitatör gel kan innehålla celler, proangiogena eller en anti-angiogena föreningar och / eller faktorer. Vid utvärdering av aktiviteten för en anti-angiogen förening, pluggen normalt innehåller en blandning av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och fibroblasttillväxtfaktor (FGF), och den anti-angiogena substans kan administreras direkt in i pluggen eller systemiskt 3, 4.
ECM-imitatör gel injiceras subkutant där den stelnar inom några minuter. Bedömning av blodkärl rekrytering i den resulterande pluggen är typically utförs genom mätning av hemoglobinnivåer inom pluggen, genom fluorescenssignalmätning efter injektion av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -märkt dextran, genom immunfärgning av histologiska sektioner för endotelceller specifika markörer eller genom fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 2,5, 6. Men bara denna bedömning kan slutpunkten analys och saknar information om funktionaliteten och morfologi av blodkärl. Dessutom mätningar av plasmavolym, antingen genom hemoglobinnivåer eller genom att använda dextran-FITC som indikator, kan vara missvisande, eftersom innehålls blodet påverkas av storleken på blodkärlen och omfattningen av stagnerande pooler av blod. Detta är särskilt viktigt när rekryterade kärl präglas av den förbättrade permeabilitet och retention (EPR) effekt 7.
Vi föreslår här en ny, mer exakt, metod för visualisering av de rekryterade blodkärl genom att kombinera två kompletterande avbildningsmetoder. High-upplösning mikrobubblor kontrastförstärkt ultraljud (US) i kombination med intravital fibrösa-konfokal endomicroscopy kan ge information inte bara om blodkärl täthet, utan även på deras morfologi och funktionalitet. Dessutom kan denna analys utföras vid flera tidpunkter därmed möjliggöra övervakning av angiogenes kinetik. USA är en allmänt använd avbildningsmodalitet som besitter hög rumslig upplösning för blodkärl avbildning efter intravenös (iv) injektion av mikrobubblor som uteslutande kvar i blodomloppet 8-11. Mikrobubblorna är gasfyllda mikrobubblor som ger en stark ekogena signal när den exciteras med en amerikanska puls och därmed fungera som en bra kontrastmedel. 3D-bilder av pluggen förvärvas med hjälp av amerikanska bildsystem programvara efter mikrobubblor förstörelse. De resulterande bilderna består av bildramar före och efter förstörelse av mikrobubblor och återspeglar skillnaden i videointensiteten i färg. Dessa overlayedbilderna visas automatiskt av programvaran. Följaktligen kan procent av funktionella fartyg inom pluggen kvantifieras. Högupplöst fibered confocal endomicroscopy fungerar som en kompletterande avbildningsmodalitet genom att rapportera om blodkärl morfologi. I denna minimalt invasiva metod erhålls bilder efter intravenös administrering av FITC-konjugerad dextran 12. Den fluorescerande polymer färgämnen i blodet och därmed fungerar som en "kontrastmedel" för blodkärl morfologi och blodflöde. Eftersom den injicerade polymeren vid en storlek på 70 kDa, det kan bara passera läckande fartyg som funnit i tumörvaskulatur. Detta kommer att resultera i hög bakgrund från FITC-märkt dextran utanför blodkärlen. Följaktligen kan fibered konfokal endomicroscopy användas för att visualisera typiska kännetecknen för EPR verkan i tumör neovasculature- förstorade, läckande, högt trassliga fartyg, med trubbiga ändar.
Detta system modellen descrisäng i jämförelse av angiogena potential U-87 MG mänskligt glioblastom och dess vilande klon 13. Vaskularisering inom pluggarna utvärderades tre veckor efter ECM-härma gel inokulering. Det visade sig att vaskularisering inom pluggar innehåller CM från U-87 MG snabbväxande tumörgenereceller ökade signifikant vad gäller antal, täthet och funktionalitet, jämfört med vaskularisering inom pluggar innehåller CM från vilande tumörgenereceller. Därför författarna kunde dra slutsatsen att CM isolerad från U-87 MG snabbväxande tumörgenereceller innehåller högre halter av pro-angiogena faktorer, jämfört med CM från vilande tumörgenereceller. Dessa faktorer stimulerar bildandet av funktionella blodkärl genom positivt påverka alla steg i angiogena kaskaden (dvs spridning, groning, migration och slutligen bildandet av rörformiga strukturer av endotelceller).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla animaliska förfaranden godkändes och utförs i enlighet med normerna i Tel Aviv University Sackler School of Medicine Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Konditionerat medium Framställning
- Seed 2 x 10 6 U-87 MG-celler i en 10 cm odlingsplatta i en volym av 8 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin / nystatin lösning.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C; 5% CO 2 tills uppnå full konfluens vid 48 tim.
- Med hjälp av en 10 ml spruta, dra tillbaka alla medel från plattan och filtrera genom ett 0,45 ìm filter till en 15 ml tub.
- Utan att tvätta cellerna plattan, tillsätt 1 ml trypsin-lösning (0,25%) och inkubera.
- När alla celler är fristående, inaktivera trypsinet med användning av åtminstone 5 ml DMEM kompletterat med 10% FBS och förforma en cellräkning.
- Överför CM till en glasrundkolv och koncentrera under högvakuum rotationsindunstare. För att påskynda processen, öka badtemperaturen till 37 ° C, om så önskas. Fortsätt tills CM uppnår en pastaliknande konsistens.
- Resuspendera CM från varje odlingsplatta i 400 pl saltlösning. När du använder mer än en platta, använd motsvarande volym. Till exempel för två kulturplattor, använda 800 | il. Använd varje platta för fyra möss.
- För att jämföra olika cellinjer eller behandlingar, justera volymen enligt den cellförhållandet emot i steg 1.6. Till exempel, om en platta innehåller 1.5x fler celler, tillsätt 200 ìl av saltlösning till de redan existerande 400 pl. Detta kommer att vara den justerade CM
OBS: Den kommer att användas senare för att normalisera CM koncentration.
- Innan ympa ECM-härma gel i möss, förbereda följande material:
- Tillväxtfaktorer reducerad fenolfri ECM-härmare gel (tina över natten, en dag före experimentet, vid 4 ° C på is).
- Elektrisk rakapparat.
- Ketamin och xylazin i syfte att söva mössen.
- Iskall 1.000 l sterila tips.
- Iskall 1 ml spruta och 27 G nålar.
- Förbered för varje mus en 1,5 ml Eppendorf-rör innehållande 80 pl justerade CM och hålla på is.
- Till varje rör till 600 | il iskall tillväxtfaktorer reducerad fenolfri ECM-härmare gel som tinades över natten vid 4 ° C, på is. ECM-härmare gel är flytande under 4 ° C och stelnar vid kroppstemperatur; i syfte att förhindra ECM-härma gelén stelnar, använd iskalla 1000 il tips. Blanda rören försiktigt utan att bilda bubblor och hålla på is.
- Söva 6 veckor gamla BALB / c-möss med användning av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (12 mg / kg). Bekräfta korrekt anestesi enligt den institutionella djuromsorg och användning kommitté, dvs innan du påbörjar experimentet. Djur har nått sin rätta plan av anestesi när de inte längre svarar på en fast tå nypa.
- Raka buken av mössen och desinficera med hjälp av en kirurgisk scrub / alkohol.
- Använd en kall 1 ml spruta och en 27 G-nål för att injicera innehållet i röret subkutant Eppendorf. Utför injektionen mycket långsamt för att förhindra bubbelbildning. När all volym administreras, inte mata nålen i flera minuter, tills stel inträffar.
3. Utvärdering av ECM-härmare Gel Plug Vaskularisering Använda Ultraljud
OBS: Denna del av protokollet kräver förkunskaper i drift ett ultraljud system eller assistans av en auktoriserad tekniker.
- Före start, har ffter material och instrument redo:
- Elektrisk rakapparat.
- Hårborttagnings kräm.
- Ketamin och xylazin i syfte att söva mössen.
- Icke riktade mikrobubblor.
- Aktiveringsanordning.
- USA bildsystem, inklusive en 55 MHz 708 sond och en 3D förvärvs mikromanipulator.
- Mät vaskularisering inom pluggarna tre veckor efter inokulering:
OBS: I U-87 MG-baserade djurmodell, var 3 veckor fann att representera den perfekta tidpunkten för avbildning. Enligt olika inställningar, kalibrera vaskularisering kinetik början från ett par dagar efter ympning av pluggar.- Bedöva möss med användning av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (12 mg / kg). Bekräfta korrekt anestesi enligt den institutionella djuromsorg och användning kommitté, dvs innan du påbörjar experimentet. Djur har nått sin rätta plan av anestesi när de inte längre svarar på en fast tå nypa.
- Rakabukområdet av mössen och behandla med hårborttagningskräm.
- Fäst mössen supinely på scenen av mikro manipulator.
- Med hjälp av en 1 ml spruta innehållande saltlösning och en 30 G nål, placera nålen inne svansvenen, fixa nålen ordentligt och lossa sprutan.
- Ställ upp för Kontrast 3D-mode bild förvärv session:
- Tryck på "3D" för att initiera 3D motorstadium och placera givaren i mitten av det önskade skanningsområdet.
- Tryck på "3D" och input skannings avstånd och steglängd, tryck sedan "Scan".
- Se till att hela pluggen scannades i 3D-bilddata som visas. Om inte, justera givaren så att hela kontakten är synlig i genomsökningen och upprepa steg 3.5.2.
- Tryck på "Kontrast" och tryck tidsvinst kompensation (TGC) styr åt vänster för att göra bilden mörkare.
- Aktivera mikrobubblorna med en flaska mixer som är designated för aktiveringen av mikrobubblor för 45 sek.
- Blanda i en 1 ml spruta 50 ul av mikrobubblor med 50 | il koksaltlösning.
- Ersätt den saltlösningsinnehållande lösgjort spruta med en spruta innehållande aktiverade mikrobubblor. Injicera de utspädda mikrobubblorna i svansvenen av mössen, vänta några sekunder för bubblorna att nå ett stabilt tillstånd, och sedan skaffa 3D kontrastförstärkt cine slinga av pluggen, med hjälp av 3D-förvärvet motorn:
- Tryck på "3D" och välj "Scan" för att skaffa 3D kontrastförbättrade bilder och tryck "Cine Store" för att spara bilddata.
- Tryck på "3D" och klicka "Destroy 3D" att förstöra mikrobubblorna.
- Tryck på "3D" igen och välj "Scan" för att få en post-förstörelse cine slinga, tryck sedan på "Cine Store".
- Generera overlay bildramar före och efter förstörelse av mikrobubblor:
- I &# 8220; Referens Inställningar "på vänster sida av skärmen klickar du på" Skapa referens ".
- Tryck på "Study Management" för att öppna före förstörelsen cine slinga förvärvats.
- Klicka på "Process Cine" att generera grön kontrast overlay, klicka sedan på "Load Into 3D".
- Använd den amerikanska bildbehandlingsprogram för att kvantifiera den resulterande 3D-bild för blodvolymen inom pluggar:
- Tryck på "Scan / Freeze" och tryck sedan på "Lägesinställningar".
- Klicka på "Volym" och välj "Parallell".
- Skapa en 3D-volym av målvävnaden genom att segmentera en serie konturer.
- Klicka på "Finish" för att slutföra segmentering.
OBSERVERA: Volymen av kontrastmedlet kommer att visas på den nedre vänstra sidan av skärmen.
- I slutet av förfarandet, placera möss i en varm, ren och torr, lugn miljö borta frånandra djur. Ge värmen med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kirurgiskt värmedyna eller en glödlampa (50-75 watt), placerades 12-14 inches bort från gnagare. Övervaka möss kontinuerligt tills upprätthålla upprätt hållning och gå normalt.
4. Utvärdering av ECM-härmare Gel Plug kärl Morfologi Använda fibered Confocal Endomicroscopy
OBS: denna del av protokollet sker omedelbart efter amerikanska avbildning och det kräver förkunskaper att driva fibered konfokala endomicroscopy bildsystem, eller biträde av en auktoriserad tekniker.
- Innan du börjar, har följande material och instrument redo:
- Kirurgi verktyg som pincett, sax och absorber sytråd.
- FITC-konjugerat dextran (70 KDa).
- Kalibreringslösningar (tre rör vardera innehållande väteperoxid, vatten eller fluorescerande lösning).
- Avbildningssystemet och ensond lämplig för avbildning av blodkärl enligt tillverkaren.
- Bedöva möss med användning av ketamin (100 mg / kg) och xylazin (12 mg / kg).
- Administrera iv, via svansvenen, 200 pl 10 mg / ml FITC-märkt dextran.
- Desinficera buken med hjälp av en kirurgisk scrub / alkohol och tillämpa ett litet snitt ca 1 cm från pluggen.
- Placera endomicroscopy sonden ovanpå pluggen försiktigt samtidigt hålla pluggen intakt.
- Förvärv:
- När sonden är inställd på kontakten, tryck på "Start laser" med fotpedalen. Fluorescensen ska visas på skärmen.
- Förvärva korta filmer (upp till 30 sek) genom att trycka "Record" på skärmen eller "Välj" med fotpedalen.
- Mellan filmer, tvätta sonden genom att placera spetsen i ett rör innehållande vatten.
- När du är klar, ta bort sonden och rengöra spetsen med en bomullsspets.
- För att analysera medelvärdet vessel diameter:
- Klicka på "Identifiera mikrokärl" -ikonen i övre panelen för att öppna kärlet detektionsmodulen fönstret.
- Klicka på "Inställningar" och markera "Mean kärldiametern" i "Statistisk av intresse" och "Display histogram barer" i "Visningsläge".
- Klicka på "Identifiera" för att visa valda mätningarna.
- För att analysera den fluorescerande signalintensiteten i områden som gränsar till blodkärl:
- Klicka på "Skapa cirkel ROI" i den vänstra panelen och skapa en cirkel i det intressanta området.
- Klicka på "Beräkna histogram inom ROI" att beräkna värden relaterade till denna region.
5. Post-processuell Behandling av möss
- Vid slutet av varje avbildningsförfarande, placera mössen i en varm, ren, torr, tyst miljö från andra djur. Ge värmen med hjälp av ett kommersiellt aTillgängligt kirurgisk värmedyna eller en glödlampa (50-75 W), placerade 12-14 i väg från gnagare. Övervaka möss kontinuerligt tills upprätthålla upprätt hållning och gå normalt.
- För ytterligare analys av pluggar "vaskularisering vid ytterligare tidpunkter, tillämpa följande återställnings villkor:
- Sutur litet snitt använder absorberbara suturer.
- Ge möss smärtlindring såsom buprenorfin (1 mg / kg) subkutant, och återgå till enskilda burar.
- Följ alla djur för att avgöra om ytterligare smärtstillande behandling är nödvändig och omvärdera dagligen för att övervaka och bedöma om nöd.
- Vid slutpunkten av experimentet, euthanize möss genom att först applicera isofluran, följt av cervikal dislokation.
- Om ytterligare avbildning kommer att utföras i veckorna efter de inledande avbildningssteg, bör alla förfaranden hållas så sterilt som möjligt. En kirurgisk hud skrubba bör utföras, steril waTER och steril bomulls tips bör användas för att rengöra endomicroscopy sonden, och sonden ska desinficeras mellan varje djur använder sterilt vatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Implantation ECM-imitatör gel pluggar med CM från snabbväxande angiogen tumör genere cellinje U-87 MG, resulterar i omfattande angiogenes. Denna kärl kan i stor utsträckning utforskas med hjälp av två kompletterande avbildningsmetoder.
Mikrobubblor kontrastförstärkt amerikanska avbildning avslöjar omfattande rekrytering av funktionella blodkärl i kontakten genom att illustrera omfattande blodflöde inom U-87 MG CM lastade pluggar, i motsats till omätbara blodflöde inom pluggar innehåller CM från vilande tumörgenereceller (Figur 1) .
Morfologi av dessa nybildade blodkärl stryks av fibered konfokala endomicroscopy (Figur 2). Blodkärl inom pluggar laddade med U-87 MG CM uppvisade morfologi som är typiskt för den förbättrade permeabilitet och retention (EPR) effekt för makromolekyler såsom dextran-FITC vid 70 kDa storlek används här. Blodkärl förstorades och mycket ta ngled, med icke-kontinuerlig och trög flöde (Figur 2A, C). Dessutom var läckage av blod observer till den omgivande miljön, såsom visas med hög fluorescerande signal utanför blodkärlen (figur 2B).
Figur 1:. Mikrobubblor kontrastförstärkt amerikanska avbildning Efter intravenös administrering av mikrobubblor och destruktion, U-87 MG CM innehåller pluggar uppvisar ökad vaskularisering (i grönt). Pluggar innehåller CM från U-87 MG-härledda vilande tumörgenere celler användes som kontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
"Src =" / filer / ftp_upload / 51525 / 51525fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2: Fiber konfokalmikroskopi avbildning. (A) Intravenös administrering av 70 KDa Dextran-FITC, möjliggör visualisering av blodflöde och blodkärl morfologi. U-87 MG CM innehåller pluggar kärl består av läckande, förstorade fartyg med Blunts slutar. Blodkärl läckage uppvisas av fluorescerande signal utanför kärl. Normal kärl i mus buken användes som kontroll. (B) Lysrör signalintensitet i områden som gränsar till blodkärl. Den fluorescerande signalen exemplifieras av ett spektrum från rött till vitt. Mörkröd representerar låg signalintensitet, medan vitt står för hög fluorescerande signal. U-87 MG CM innehåller pluggar visar en tydlig fluorescerande signal utanför kärlen, medan ingen signal visas utanför normala kärl. (C) Medelvärde Vessel Diameter (MVD) i blodkärl i U-87 MG CM innehåller pluggar (22,4 um) är significantly högre jämfört med MVD av normala kärl (6,7 mikrometer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinera kompletterande avbildningsmetoder gör att förvärvandet av information om olika angiogeneskomponenternas mikrokärlstäthet, funktionalitet och morfologi. Loading CM på ECM-härmare gel pluggar genererar en tumör mikromiljö, vilken är separerad från andra cellpopulationer, såsom endotelceller, som rekryteras och extravasera in i pluggen.
Genom att utföra, parallellt, mikrobubblor kontrastförstärkt amerikanska avbildning och fibered konfokal endomicroscopy bildbehandling, kan vi dra slutsatsen att en pool av faktorer som utsöndras av snabbväxande angiogena tumörer genererar celler, utan cellerna cancer själva, inte bara rekrytera blodkärl, men också bilda funktionella kärl med EPR typiska egenskaper. Dessutom tillåter denna metod separationen mellan effekterna av de utsöndrade faktorerna och cell-till-cellinteraktion i tumörmikromiljö.
Information som erhålls från USA och fibered konfokalendomicroscopy är dock utsatt för begränsningen av avbildningsteknik. Till exempel, när man använder fibered konfokala endomicroscopy avbildning, är det omöjligt att avbilda en enda specifik blodkärl över tiden, eller till samma område vid pluggen.
ECM-imitatör gel plug-analysen är relativt lätt att utföra, och detta är ihållande vid lastning CM med ECM-härma gel. Dock är en kritisk fråga som bör tas under övervägande CM till ECM-härma gel andel. Höga volymer av CM kan förhindra ECM-härma gel från stelnar. Därför bör CM beloppet inte överstiga ca 13% av ECM-härma gel.
Denna metod kan justeras för olika experimentella system och applikationer. Till exempel kan den användas för att utvärdera anti-angiogena läkemedel genom lastning CM från pre- och post-behandlade celler. Dessutom kan andra cellinjer användas under dessa experimentinställningar. Emellertid är kalibrering krävs för att enpply den optimala CM koncentrationen. Dessutom bör den perfekta tidpunkten för avbildning optimeras enligt varje modellsystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotary Vacuum Evaporator | - | - | - |
| Growth-factors reduced phenol-free Matrigel | BD Bioscience | FAL356231 | Thaw overnight, at 4 °C on ice |
| Depilatory cream | - | - | - |
| Vevo2100 US imaging system | VisualSonics Inc. | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| 55 MHz 708 probe | VisualSonics Inc. | - | - |
| Vevo2100 imaging software | VisualSonics Inc. | - | - |
| VialMix | DEFINITY Imaging | VMIX | - |
| DEFINITY microbubbles | DEFINITY Imaging | DE4 | Activate for 45 sec using VialMix before use |
| CellVizio (Fibered confocal endomicroscope) | Mauna Kea Technologies | - | Requires previous knowledge in operating or the assistance of an authorized technician |
| ProFlex MiniO/30 probe | Mauna Kea Technologies | - | - |
| 70 kD FITC-labeled dextran | Sigma-Aldrich | 46945 | - |
| ImageCell software | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Calibration Kit | Mauna Kea Technologies | - | - |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco Life Tecchnologies | 41965-039 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Penicillin/streptomycin/nystatin solution | Biological Industries | 03-032-1B |
References
- Kibbey, M. C., Grant, D. S., Kleinman, H. K. Role of the SIKVAV site of laminin in promotion of angiogenesis and tumor growth: an in vivo Matrigel model. J Natl Cancer Inst. 84, 1633-1638 (1992).
- Passaniti, A., et al. A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin, and fibroblast growth factor. Lab Invest. 67, 519-528 (1992).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, 32-40 (2003).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137, 4511-4513 (1996).
- Adini, A., et al. Matrigel cytometry: a novel method for quantifying angiogenesis in vivo. J Immunol Methods. 342, 78-81 (2009).
- Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46, 6387-6392 (1986).
- Lindner, J. R. Microbubbles in medical imaging: current applications and future directions. Nat Rev Drug Discov. 3, 527-532 (2004).
- Kuliszewski, M. A., et al. Molecular imaging of endothelial progenitor cell engraftment using contrast-enhanced ultrasound and targeted microbubbles. Cardiovasc Res. 83, 653-662 (2009).
- Stieger, S. M., et al. Ultrasound assessment of angiogenesis in a matrigel model in rats. Ultrasound Med Biol. 32, 673-681 (2006).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent. Manner. Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).
- Segal, E., Satchi-Fainaro, R. Design and development of polymer conjugates as anti-angiogenic agents. Adv Drug Deliv Rev. 61, 1159-1176 (2009).
- Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PLoS One. 7, 44395 (2012).
