Protocol
1. Embryo Forberedelse
- Hvis det ikke gjøres rutinemessig som en del av embryo kultur, de-gelé embryoene med 2,5% cystein, pH 8,0 før fiksering 8. Selv om det ikke er absolutt nødvendig, er det nyttig å deretter fjerne befruktning konvolutter manuelt før fiksering ved hjelp av fine tang.
- Bruk glass Pasteur pipetter å overføre embryoene. Pipetten ikke er bred nok til å overføre embryo så bruk en diamant penn for å kutte glass pipetten på et punkt bred nok til å plukke opp et embryo. Eliminere de skarpe kantene av pipetter etter klipping ved raskt passerer kuttspiss gjennom flammen på en Bunsen-brenner til å smelte de skarpe kantene.
MERK: Care må tas, som glasset kan fortsatt være varm nok til å forårsake brannskader selv om det ser ut til å ha avkjølt ved visuell inspeksjon.
- Bruk glass Pasteur pipetter å overføre embryoene. Pipetten ikke er bred nok til å overføre embryo så bruk en diamant penn for å kutte glass pipetten på et punkt bred nok til å plukke opp et embryo. Eliminere de skarpe kantene av pipetter etter klipping ved raskt passerer kuttspiss gjennom flammen på en Bunsen-brenner til å smelte de skarpe kantene.
- Utføre embryo fiksering i etapper. Først forberede hetteglass til bruk i embryo fiksering. Bruk disse ampullene for alle trinn inkludert finalenlagring. Bruk ampuller som er klare med en god Teflon segl i lokket, noe som åpner for overvåking av embryoer under alle trinn i prosessen. Label hetteglass med passende eksperimentell informasjon ved hjelp av permanent markør, og deretter dekke etiketten med klar tape, som selv permanent markør, vil gå tapt i løpet av prosedyren på grunn av bruk av alkohol og andre løsemidler.
- Bruk Mempfa å fikse embryoer. Foreta et lager av 8% paraformaldehyd i grupper på 50 til 100 ml på en gang. Bruker omtrent 75% av den nødvendige H2O og oppvarm til 50-60 ° C, som er nødvendig for å få formaldehydet til løsningen.
MERK: Denne løsningen er litt annerledes enn den Memfa brukt i eldre protokoll som er publisert versjoner i som utnytter det paraformaldehyde snarere enn formaldehyd. - Tilsett 2-3 dråper 10N NaOH eller inntil pH-verdien er ca. 7,5 (bruk pH-papir for å kontrollere pH-verdien). Paraformaldehyd er meget giftig, og derfor generere stamløsning i en avtrekkshette. Når paraformaldehyd er i oppløsning, filtrere oppløsningen gjennom Whatman papir i en beholder og tilsett friskt H 2 O til det endelige volum. Om nødvendig, lagre paraformaldehyd løsning ved 4 ° C i 1-2 uker.
- Sette sammen de gjenværende komponenter i Mempfa fikseringsløsning (tabell 1). Sikre at den endelige arbeids konsentrasjon av formaldehydet er 4%. Lagre alle komponenter i fiksering løsning ved 4 ° C som aksjer.
- Ved hjelp av et kutt glass pipette, fikse embryoene ved å legge embryoene til de merkede glassampuller som er fylt med de ca 3-4 ml Mempfa løsning (tabell 1). Unngå å fikse mer enn 20-30 embryoer per hetteglass. Tilsett embryoer med et minimum av væskeoverføring fra embryo medium. Fikse embryoer i Mempfa løsning for 2 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- For sen endoderm strukturer utføre i situs på manuelt isolerte gut og endoderm derivater 9,10Som gir mulighet for god inntrengning av sonden, og også unngår hulrom farging.
- Lagre en løsning av 100% metanol ved -20 ° C. Etter paraformaldehydet fiksering, erstatte Mempfa løsning med ca 4 ml av -20 ° C, 100% metanol for oppbevaring av embryoene.
- Virvel ampullene etter tilsetning av metanol for å hindre at embryoene fester seg til glass eller andre embryoer. Sørg også for at ampullene er tett forseglet fordi metanol kan fordampe i fryseren over tid hvis løs.
MERK: Embryoer kan oppbevares i minst ett år, og sannsynligvis lengre, i metanol før farging uten tap av in situ hybridisering kvalitet.
- Bruk Mempfa å fikse embryoer. Foreta et lager av 8% paraformaldehyd i grupper på 50 til 100 ml på en gang. Bruker omtrent 75% av den nødvendige H2O og oppvarm til 50-60 ° C, som er nødvendig for å få formaldehydet til løsningen.
2. Probe Forberedelse
- Bruk 1-2 ug templat-DNA for å gjøre digoksigenin-merkede prober. Cut-plasmid inneholdende den passende DNA-sekvensen i 5'-enden av genet av interesse med et restriksjonsenzym egnet for that vektor for å danne antisense-prober.
MERK: plasmid bør ha en passende RNA polymerase bindingsstedet (f.eks T7, T3, eller SP6). - Tillat DNA, vann, NTP blande og polymerase-buffer for å oppvarmes til romtemperatur før montering sonden syntesereaksjonen. Tilsett komponenter av RNA-syntesereaksjonen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør i den rekkefølge som er oppført i tabell 2. Juster volumet av vann tilsatt for å bringe det totale volumet av sonden syntesereaksjonen til 20 ul. Monter reaksjonen ved romtemperatur, fordi komponenter av polymerase buffer kan utfelle templat-DNA ved høye konsentrasjoner og kulde.
- Inkuber transkripsjonsreaksjon i 2 timer ved 37 ° C.
MERK: Inkubasjoner av litt lengre enn to timer fører til ingen bivirkninger, men også viser litt økt avkastning. Hvis inkubert i en time, vil utbyttet bli redusert, men likevel tilstrekkelig til å sikre en god probe.- Mens man venter på at transkripsjonsreaksjon til slutt, må en agarosegel som vil bli brukt til å teste kvaliteten av sonden. Smelt 1 ug av agarose i 100 ml 1 x TAE-buffer (se Tabell 1) ved oppvarming av oppløsningen til kokepunktet. Fjern fra varme løsningen når agarose pulveret er fullstendig oppløst.
- Tilsett 2 ul etidiumbromid stamoppløsning (10 mg / ml) til ca. 100 ml agarosegel når agarose er avkjølt til ca. 60 ° C for å tillate visualisering av RNA under ultrafiolett lys (UV).
MERK: Dette agarosegel løsning kan holdes i en 60 ° C inkubator, slik at fremtidige gels kan helles uten gjentatt smelting. Pass på etidiumbromid på grunn av potensielle toksisitet.
- Tilsett 1 mL DNaseI (RNase fri karakter) til transkripsjonsreaksjon etter 2 timers inkubering og inkuberes i ytterligere 10 minutter ved 37 ° C for å eliminere templat DNA.
- Fjern en ul av reaksjonsblandingen tilsjekk på 1% agarose-TAE-gel, og til resten (20 ul) tilsett 80 pl 1% SDS i TE-buffer (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA), 10 ul 5M NH 4-acetat, og 220 ul kald etanol. Vortex-blanding kraftig, og satt til side på is inntil resultatene av RNA kvalitetskontrollen er kjent.
- Kjør en mL av RNA fjernet før nedbør på 1% agarose-TAE gel. For å lette lasting på gelen, tilsett 4-5 mL vann og 1 mL av standard laste fargestoff til RNA. Se RNA på gelen ved hjelp av en UV-transilluminator lys for å kontrollere kvaliteten av sonden (se diskusjon).
- Utfelle den gjenværende RNA som ble avsatt på is i trinn 2.5 ved å spinne i en mikrosentrifuge ved full hastighet i 10 til 15 min. Tegn av supernatanten med en trukket ut glass pipette og la tørke kort.
- Resuspender sonde med 1 ml av RNA hybridiserings-buffer (tabell 1) i Eppendorf-rør. Vortex og briefly oppvarme røret til 37 ° C og igjen vortex. Overfør sonden løsning til en 15 ml skrukork polystyrenrør og fyll opp til 7-10 ml med RNA hybridiseringsbuffer. Merk: Sonden kan fortynnes ytterligere (10 fold ytterligere fortynning kan fortsatt fungere) ofte resulterer i lav bakgrunn, men fargereaksjonene vil også ta lengre tid.
3. In situ hybridisering
- Ta embryoene som er lagret i -20 ° C metanol, og tillates å oppvarmes til romtemperatur. Utføre hele fremgangsmåten i glassampullene. Hvis forskjellige embryoer fra en gruppe kommer til å bli sett på av ulike sonder, holde dem i en enkelt hetteglass til like før sondene som minsker variabilitet og arbeidskraft på den første dagen.
- Rehydrere embryoene gjennom en metanol serier som beskrevet i tabell 3 (se tabell 1 for vaske oppskrifter) som forberedelse for tilsetning av proben. Rotér Embryos etter hver endring for å sikre at de ikke fester seg til sidene eller hverandre, og rocke embryoene ved å montere hetteglassene på en nutator. Når overføring av væsker, sjekk innsiden av caps for å sikre at embryoer ikke har blitt fanget der.
- Når i sonden løsning, hybridiserer embryoene over natten som beskrevet i tabell 3.
- Fjerne sonden løsning. Lagre brukt sonde ved å lagre i et 15 ml skrukork polystyren-rør, markert med dato og antall ganger sonden er blitt brukt, ved -20 ° C.
NB: Det samme sonde kan brukes om igjen mange ganger for etterfølgende in situ hybridiseringer helt til kolorimetriske reaksjoner begynner å ta en unormalt lang tid for å nå ønsket intensitet.- Når sonden er fjernet, fremstille de embryoer for antistoffarging mot sonden gjennom serie av vaskinger som er skissert i tabell 4. Endre temperaturen som kreves (tabell 4) ved å bevege than nutator, med ampuller med embryo festet, direkte inn hybridisering ovner som er satt til riktig temperatur.
- Utgjør den passende volum av MTB + HTSS + BR + anti-Dig antistoff (tabell 4) på den tiden at embryoene blir inkubert i MTB + HTSS + BR blokkering løsning slik at antistoffet er blokkert før du legger til embryoer. Gjør blokkeringsløsninger friskt på bruksdagen.
- Fjern det antistoffløsning og begynne vaskinger som beskrevet i tabell 5 nedenfor inkubasjon over natten med antistoff. Utføre minst tolv 30 min vaskinger for å kunne forberede seg for farging med den alkaliske fosfatase-substrat og redusere bakgrunnen så mye som mulig. Bruk enten MAB buffer eller TBT løsning (tabell 1) for vasketrinnene.
MERK: TBT løsning er TTW som har 2 mg / ml BSA tilsatt.- Bytt ut den siste vaskeløsning med BM Purple alkalisk fosfatase underlaget. Utføre farging REACsjon ved enten romtemperatur eller 37 ° C.
MERK: Farging er raskere ved 37 ° C, men hvis stå natten over, kan uakseptabel bakgrunnsfarging ofte være et resultat. Fargereaksjonene vil ofte kreve over natten farging og romtemperatur er det tryggeste for dette. - Hvis ytterligere farging er nødvendig og BM lilla løsning er å ta på en blå farge, erstatte fargeløsning med frisk BM Purple og sette rørene i 37 ° C. Hvis mål-mRNA er meget rikelig, sette embryoene i fargeløsning ved 4 ° C over natten og deretter flytte embryoene til værelsestemperatur eller 37 ° C for å tillate bedre kontroll av fargingsreaksjonen.
- Overvåke nye reaksjoner nøye, så tid til sluttresultatet varierer betydelig mellom ulike mål RNA. For å være konsekvent stoppe flekker reaksjon (se 3.4) når det ikke er nye områder av uttrykk som oppstår med lengre inkubasjonstid. Viktigere, hvis in situ hybridisering blir brukt som en analysefor eksperimenter ser på forskjellige behandlingsgrupper, bruker samme tid for fargereaksjoner mellom behandlings- og kontroll embryoer.
- Bytt ut den siste vaskeløsning med BM Purple alkalisk fosfatase underlaget. Utføre farging REACsjon ved enten romtemperatur eller 37 ° C.
- Stopp fargningsreaksjon og forberede embryoer for lagring og bildeopptak ved å endre væsker som skissert i tabell 6. Ikke beveg embryoene på dette stadiet fordi fjerning av flekken kan visualiseres som lilla farging av metanol rundt embryoer.
MERK: Ofte embryoer har en lys blåfarging av fargingsoppløsningen og kald metanol kan i det minste delvis å fjerne det, selv om dette ikke er tilstrekkelig til å fjerne tunge bakgrunn eller hulrom farging. Kald metanol refererer til metanol, som er opprettholdt i en -20 ° C fryser.- Rehydrere embryoene og fikse flekken med Mempfa (Tabell 6). Når fast, fjern Mempfa og vaske embryoene med 25% metanol.
- Fjerne 25% metanol og tilsett bleking løsning hvis fjerning av endogen pigmenter nødvendig. Pass på bleking løsning som det kan føre til brannskader. Observere bleking tett som det skjer relativt raskt, og graden av bleking kan varieres for forskjellige effekter (figur 2).
- Dehydrere embryo gjennom en metanol-serien til 100% metanol for langtidslagring etter bleking, eller overføre til PBS for korttidslagring og påfølgende imaging (se tabell 6).
4. Imaging Embryoet
- Når et embryo har gjennomført fargeprosessen, bilde embryoet slik at informasjon om hvor det aktuelle genet uttrykkes fanges for et bredere publikum. Bruke 1% agarose som bakgrunn for å vise innskuddet embryoer.
MERK: agarose gir en blå / grå bakgrunn som står i kontrast godt med fosteret og den blå fargen på fargereaksjon. Det hjelper også diffuse distraherende skygger og refleksjoner som kan lede oppmerksomheten fra embryo.- Legg agarose til vann og deretter kok til agarose er oppløst og deretter la avkjøles til 50 før strømme inn i petriskål. Som med TAE gel løsning, lagre agarose løsning i 55 ° C inkubator for flere bruksområder. Hell agarose til en dybde på omtrent 2 mm inn i petriskål. Om nødvendig, justere dybden av agarose for å gi en litt forskjellig nyanse av bakgrunnen.
- Etter rehydratisering fra lagring i metanol til en vandig løsning (PBS eller TTW), ved anvendelse av en metanol-serien, plasserer embryoene i en petriskål med agarose base (se tabell 6). Hold løsningen rent og om nødvendig, bruke enkle filtrering for å fjerne små partikler som kan forstyrre ren bakgrunn av gode bilder.
- Til bilde embryoene fra alternative synspunkter, for eksempel fra ventral side, skjære tynne kanaler i agarosen å passe embryoet bruker fine tang og plassere embryoene i disse kanalene for orientering (Figur 3 MERK: De fleste stadier har en særegen posisjon som de antar når den plasseres i løsningen. For eksempel, blastula-trinns embryoer pleier å sitte dyr siden opp. Når embryoene begynner å forlenge, lå de på sin side.
- Bruke fiberoptisk lyskilde for å belyse embryoet fra en grunn vinkel, noe som skaper skygger på embryoet som gir dybde til bildet og hjelpe skjelne overflatestrukturer. Fordi bleking kan eliminere pigment som gir nyttige landemerker, bruker skygging for sterkt bleket embryoer.
- Tømme embryoene til bilde flekker som er dypt inne i fosteret, slik som i ryggstreng, lunge eller regioner av hjernen, (figur 4). For å oppnå dette, sette embryoene gjennom en metanol serien før i 100% metanol.
- Etter fullstendig nedsenking i metanol, overføre embryoene til en oppløsning av en del benzylalkohol og to deler benzyl blinzoate (Babb). Embryoene vil i utgangspunktet flyter på overflaten, men som metanol blandes med Babb, vil de synke ned i Babb. Utføre alle trinn arbeider med Babb i glassflasker eller retter; Babb vil smelte noen plast eller maling.
- Når ryddet, se embryoene med overført lys som kommer nedenfra embryo. Justere intensiteten av lyset, så vel som vinkelen fra nedenfor til å forbedre kontrast og gi den beste farge.
- Når du viser ryddet embryoer heve glasset petriskål ut av basen. Gjør dette ved å bruke to andre petriskål lokk for å heve det slik at regionen av fatet med embryo er forhøyet.
MERK: Dette har fordelen av å ta bunnen ut av fokus og eliminere forstyrrende effekter fra ufullkommenhet eller flekker på mikroskop base som kan forstyrre bildet.
5. Dobbelt in situ hybridisering
- For å samtidig se uttrykket mønster av two forskjellige gener i en enkelt embryo, syntetisere to prober, en for hver av de forskjellige gener. Syntetisere en probe ved hjelp av DIG-11-UTP som en merkelapp som beskrevet ovenfor. Fortynn produktet av transkripsjonsreaksjon i RNA hybridiserings-buffer for å gi en 3x mer konsentrert enn proben anvendt for enkelt- in situ hybridiseringer.
- Syntetisere den andre proben av interesse ved bruk av den samme protokoll som for DIG-merket probet med unntagelse av at fluorescein-12-UTP må erstattes for DIG-11-UTP. Fortynn produktet av transkripsjonsreaksjon i RNA hybridiserings-buffer for å gi en 3x mer konsentrert enn proben anvendt for enkelt- in situ hybridiseringer.
- Bland de to konsentrerte prober i et 1: 1 forhold. For best resultat, bruk den fluorescein-merket probe for genet som viser den sterkeste uttrykk i den eneste in situ hybridisering protokollen.
- Bruk samme in situ hybridisering protokollen beskrevet for enkelt in situ </ Em> hybridiseringer, bortsett fra å bruke dobbelt probe (probe inneholdende 1,5 x konsentrert blanding av digoxigeninmerket og fluorescein-merkede prober) ved slutten av den første dag i stedet for en enkelt in situ hybridisering probe.
- Flg enkelt hybridisering protokollen på den andre dagen av den doble in situ hybridisering protokollen, bortsett fra bruk anti-fluorescein-AP Fab-fragmenter ved en 1: 4000 fortynning i stedet for anti-DIG-AP Fab-fragmenter. Vaske ut overflødig antistoff fra embryo som i singel in situ-protokollen og gjennomføre den første farge reaksjon ved hjelp av BM-Purple AP underlaget.
- Etter den første fargen reaksjon, inaktivere flourescein antistoff i 0,1 M glysin pH 2.0 for 40 min etterfulgt av fem ti min vasker i MAB. Blokkere embryoene i MAB + HTSS + BR for 90 min. Tilsett anti-DIG-antistoff ved en 1: 2000 fortynning i MAB + HTSS + BR og inkuber ved 4 ° C over natten.
- Dagen etter, vaske embryoene thgrundig.vasket i MAB (12 vaskinger av 30 min) for å fjerne overskudd av antistoff.
- Vask embryoene i 10 min i AP Buffer (tabell 1) og deretter flekken med BCIP (0,5 mg / ml i AP Buffer).
MERK: in situ kombinasjonen bør gi en mørk blå-fiolett flekk for første fargereaksjon, og en lyseblå farge reaksjon for den andre (figur 5). - Stoppe den endelige fargen reaksjon ved å fjerne AP buffer og skyll tre ganger med MTB. Fix embryoene med Mempfa i 10 min. Vask embryoene med fem raske vasker i MAB eller TBT.
- Med denne fargekombinasjon, er bruk av metanol i de etterfargings behandlinger ikke lenger mulig, da det vil eliminere BCIP alene farge. Lagre embryoene etter farging og fiksering i PBS med 0,02% natriumazid. Farging intensitet kan være svak med dobbel i situs. Dersom dette er et problem, redusere vasker til fire, hver av 2 timers varighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruken av vev spesifikke prober kan gi fremragende informasjon i forhold til staten utvikling for bestemte organer. I de følgende eksemplene er stadiet av embryo basert på Nieuwkoop og Faber rekkefølgetabellen 11. Hvis man bruker prober skjema gener som blir uttrykt etter differensiering, kardial troponin I i trinn 28 til 30, for eksempel (figur 1C), nærvær eller størrelsen på en differensiert organ kan vurderes på ethvert stadium stolpe differensiering. År siden, embryologists var i stand til å gjøre en slik analyse basert på bemerkelsesverdig kunnskap om histologi fra tidlig embryo 12,13, men at kompetansen har vært i stor grad tapt for den nåværende generasjon av embryologists. Selv om, kan tapet av denne kompetansen anses beklagelig, pålitelighet og brukervennlighet av in situ hybridisering teknikker gjør identifisering av spesifikke vev tilgjengelig for alle forsker. Vev som er relativt lite synlig, tHan skravering kjertlene ved fosterstadiet 25 for eksempel (figur 1 A), kan levende merket ved hjelp av i situs uten behov for spesifikke antistoffer eller histologiske teknikker (figur 1C). Også bruken av hele festet på situs gjør det mulig å vise hele organet i sammenheng med hele embryoet heller enn å stole på slutning av histologiske seksjoner (figur 2). Selv vev som er dypt inne i embryo inkludert optisk stilken (figur 4) kan sees lett og bruk av embryo lysning kan gi skarp avgrensning av organgrenser.
Bleking av embryoer for å fjerne endogen pigment bruker peroxide løsninger i stor grad har eliminert behovet for å bruke albino embryoer som mangler pigment. Bleking for forskjellige tider kan være nyttig. For eksempel, hvis flekken er sterk, at en lettere bleking gir mulighet for en viss pigmentering for å bli sett kan være nyttig fordi det helestrømmer for bedre iscenesettelse og orientering av embryoet (Figur 2A). Imidlertid, hvis flekken er et område der det er høye nivåer av pigment, slik som nyre (figur 2B), i nærheten av fullstendig eliminering av pigmentet ved lengre inkubasjon i blekeløsningen gir et bedre resultat.
Embryoer har en tendens til å ta opp bestemte stillinger når den er i løsning. Etter neurulation, har de en tendens til å ligge flatt på sine sider. Dette er greit for bilder av flanken (figur 2B), men kan være et problem med andre områder. Bruk av en agarose basen gjør det mulig å kutte kanaler inn i agarose som kan bruke til å orientere embryoer. For eksempel er blod forstadier lokalisert til den ventrale side av embryoet (figur 2A) og den fulle utstrekning av fargingen er vanskelig å observere. Posisjonering av embryoet i en kanal med den ventrale siden opp, gjør så full visning av at genuttrykk mønster (figur 3A). Bruken av doble in situ hybridisering kan vise forholdet mellom to genutrykksmønster innenfor en enkelt organisme (figur 5) som eliminerer nødvendigheten av å sammenligne mellom forskjellige embryoer som kan ha små forskjeller i morfologi. Kanskje det viktigste anvendelse av in situ hybridisering gir en mulighet for å tydelig merke celler tidligere for å fjerne histologisk differensiering basert på ekspresjon av gener som blir uttrykt i tidlige progenitorceller av en linje, slik som pax2 som blir uttrykt i mange vev i tidlig embryo, før differensiering (figur 4A). Evnen til å identifisere stamfedre og vev som ikke er tydelig atskilt basert på histologi, for eksempel myeloide celle forløpere (figur 1B), har tillatt forskere til å spørre mye mer detaljerte spørsmål om tilstanden til et organ utvikling og også for å vurdere resultatene av eksperimentell manipulation designet for å forårsake ektopisk differensiering av en vev.
Fig. 1: Eksempler på hele braketten in situ hybridisering på Xenopus embryoer Den blå farging fra en in situ-hybridisering eksperiment kan klart avgrense utvikle strukturer av Xenopus tidlig embryo (a) et fremre riss av en scene 26 embryo utheving klekke kjertel. som avgrenses av uttrykket av uvs.2 14 (B) En ventral visning av en embryoer som viser plasseringen av tidlige myeloide celler på scenen 20 bruker uttrykket av myeloperoxydase 15 som en markør (C) Den tidlige hjerte på scenen 28.. - 30 er visualisert ved uttrykket av hjerte troponin I 16. En klar fordel ved å bruke denne metoden er at alledisse genutrykksmønster ble visualisert ved hjelp av ulike sonder men protokollen som brukes er identisk i alle tilfeller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Forskjellige nivåer av bleking kan anvendes for å visualisere farging i embryoet (A) Denne blå flekker langs bunnen av denne embryo viser ekspresjon av hemoglobin i de ventrale blod øyer ved ca. trinnet 36. Dette er et område av. embryo som er bare lett pigmenteres og dermed embryoet ble ikke bleket i lang tid, som kan sees av den beige-fargede pigment i øyet og langs flanken av embryoet. Å kunne se den pigmentering gir bedre visualisering av scenen av embryoet. Hvis fargingen er i et område med større naturlig pigment, slik som nervesystemet og flanken av embryoet, vil bidra til bedre bleke vise in situ som vist i B. (B) Her ekspresjonen av pax8 17 i formings nyre , pronephric duct og hindbrain er best visualisert etter bleking har fjernet nesten alle endogen pigment. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Manipulering av agarose basen kan hjelpe til med orienteringen av embryoene Imaging spesifikke regioner av embryo kan være vanskelig fordi de har en tendens til å ta opp bestemte stillinger i formen (A) På tadpole stadier embryoet vil ligge på siden.. . Ved kuttting en fin kanal i agarose (svarte piler) embryoet kan sees fra ventral side, her viser hemoglobin uttrykk på scenen 36, med nok stabilitet til å fange et godt bilde. (B) Dette ventral utsikt over hand1 uttrykk på scenen 20 skisserer den laterale plate mesoderm 6. Embryoet er plassert i et lite hull som stabilisert sin posisjon med den ventrale siden opp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Indre organer kan sees i både ugjennomsiktig, innskuddet og i ryddet embryoer I en innskuddet embryo farget for pax2 på scenen 34 (A), syns stilken (gul pil) kan visualiseres relativt lettsom kan farging ned nevralrøret. Men detaljene er ikke skarp. Ved å fjerne fosteret (B) grensene for uttrykk områder, inkludert den optiske stilken (gul pil) er skarpere. Den grad av rengjøring er vist ved evnen til å se begge øynene i denne erte embryo. Også oppmerksom på at noen flekker har akkumulert i de interne hulrom (lilla pil), et vanlig problem når du ser ryddet embryoer.
Figur 5:. En representant dobbel in situ hybridisering på en Xenopus embryo Uttrykk for den laterale plate markør, hand1, er visualisert ved den lyseblå flekker på scenen 26. Expression of etv2 innenfor utviklings blodkar er visualisert ved mørk blå lilla flekk. Uttrykk for hand1 er vanligvis svært intens, og dermed ble det brukt for tHan svakere fluorescein-merket probe og BCIP kombinasjon. Den utnyttet digoxigeninmerket probe og BM-lilla kombinasjon for den svakere etv2 uttrykk.
| Navn | Endelig Konsentrasjon | Beløp / 100 ml |
| Mempfa | 1 mM MgSO4 | 100 ul av 1 M MgSO4 |
| (Oppbevares ved 4 ° C) | 2 mM EGTA, pH 8,0 | 10 ml 20 mM EGTA, pH 8,0 |
| 0,1 M MOPS, pH 7,5 | 10 ml 1 M MOPS, pH 7,5 | |
| 4% paraformaldehyd, pH 7,5 | 50 ml av 8% Paraformaldehyd, pH 7.5 | |
| TTW | 50 mM Tris, pH 7.4 | 5 ml av 1 M Tris, pH 7.4 |
| 200 mM NaCl | 4 ml av 5 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ul Tween 20 | |
| 100X Denhardfs Solution | 2% BSA | 2 g BSA |
| (Filtrere gjennom 0,2 mikrometer filter, | 2% PVP-40 | 2 g PVP-40 |
| butikken ved -20 ° C) | 2% Ficoll 400 | 2 g Ficoll 400 |
| 20X SSC | 3 M NaCl | 17.5 g NaCl |
| 300 mM trinatriumcitrat | 8.8 g trinatriumcitrat | |
| RNA Hybridisering Buffer | 50% formamid | 50 ml av 100% formamid |
| (Oppbevares ved 4 ° C) | 5x SSC | 25 ml 20x SSC |
| 1 mg / ml gjær RNA | 4 ml 1 mg / ml gjær-RNA oppløst i 50% formamid | |
| 1X Denhardfs Solution | 1 ml av 100 x Denhardfs Løsning | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ul Tween 20 | |
| 5 mM EDTA, pH 8,0 | 1 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0 | |
| MAB | 100 mM Maleinsyre | 1,16 g maleinsyre |
| (PH 7,5, oppbevares ved 4 ° C) | 150 mM NaCl | 0,88 g NaCl |
| MTB + HTSS + BR | 100 mM Maleinsyre | 96 ml av MTB |
| 4% varmebehandlet Sheep Serum | 4 ml av varmebehandlet Sheep Serum (varmebehandlet ved 55 ° C i 30 min og porsjonert) | |
| 2% Blokkering Reagens | 2 g Roche Blokkering Reagens | |
| MTB + HTSS + BR + anti-Dig antistoff | 100 mM Maleinsyre | 96 ml av MTB |
| 4% Heat Trflere ganger Sheep Serum | 4 ml av varmebehandlet Sheep Serum | |
| 2% Blokkering Reagens | 2 g Roche Blokkering Reagens | |
| 1: 10.000 Anti-Dig-AP, Fab Fragments Antistoff | 1,5 mL av Anti-Digoxygenin-AP, Fab Fragments Antistoff | |
| Alkalisk fosfatase (AP) Buffer | 100 mM Tris, pH 9.5 | 10 ml 1 M Tris, pH 9.5 |
| 50 mM MgCl2 | 5 ml av 1 M MgCl2 | |
| 100 mM NaCl | 2,5 ml 4 M NaCl | |
| 0,1% Tween 20 | 100 ul Tween 20 | |
| Bleking Solution | 0,3% H 2 O 2 | 3,34 ml 30% H 2 O 2 |
| 5% Formamid | 5 ml 100% Formamid | |
| 0,5% SSC | 2,5 ml 20x SSC | |
| Clearing Solution | 1/3 Benzylalkohol | 33 ml |
| 2/3 benzylbenzoat | 67 ml |
Tabell 1: Løsning Oppskrifter
| Navn | Beløp |
| Dig-NTP Mix | 5 pl av 20 mM CTP |
| (40 ul reaksjon) | 5 pl av 20 mM GTP |
| 5 pl av 20 mM ATP | |
| 3,25 mL på 20mm UTP | |
| 3,5 mL av 10mm Dig-11-UTP | |
| 18,25 mL destillert, autoklaveres vann | |
| Probe Synthesis | x ul templat DNA(Avhengig av konsentrasjon) |
| (20 ul reaksjon) | x mL destillert, autoklaveres vann |
| 4 mL av Dig-NTP mix | |
| 0,5 mL av RNAse inhibitor | |
| 2 mL av 10X RNA polymerase buffer | |
| 2 mL av RNA polymerase |
Tabell 2: Probesyntese Oppskrifter
| Navn på Reagens | Omtrentlig Volume | Varighet | Temperatur |
| 100% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, rocking | Romtemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, rocking | Romtemperatur |
| TTW | 2 ml | 10 min, rocking | Romtemperatur |
| Pre-varm RNA Hybridisering Buffer og Probe til 65 ° C | |||
| TTW | 4 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| TTW | 4 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| RNA Hybridisering Buffer | 2 ml | 10 min, rocking | Romtemperature |
| Forvarmet RNA hybridiseringsbuffer | 2 ml | 1 time, rocking | 65 ° C |
| Probe Solution | 1 ml | Over natten, gynge | 65 ° C |
Tabell 3: Skritt for First Day of In Situ Hybridisering Protocol (ca 3 timer totalt)
| Navn på Reagens | Omtrentlig Volume | Varighet | Temperatur | ||||
| Pre-varm RNA hybridiseringsbuffer og 02.x SSC til 65 ° C og 2 x SSC til 37 ° C | |||||||
| Returnere sonde løsning på tube for gjentatt bruk | |||||||
| RNA Hybridisering Buffer | 2 ml | 10 min, rocking | 65 ° C | 2X SSC | 2 ml | 20 min, rocking | 37 ° C |
| 2X SSC | 2 ml | 20 min, rocking | 37 ° C | ||||
| 0,2xSSC | 4 ml | 1 time, rocking | 65 ° C | ||||
| 0,2xSSC | 4 ml | 1 time, rocking | 65 ° C | ||||
| MTB + HTSS + BR | 1,5 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur | ||||
| MTB + HTSS + BR + anti-DIG antistoff | 1,5 ml | Over natten, gynge | 4 ° C |
Tabell 4: Skritt for Second Day of In Situ Hybridisering Protocol (ca 4 timer totalt)
| Navn på Reagens | Omtrentlig Volume | Varighet | Temperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| MAB | 4 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| BM Purple AP Underlag | 500-750 mL | Over natten, rocking (se tekst) | Romtemperatur / 37 ° C (se tekst) |
Tabell 5: Trinn for Third Day of In Situ Hybridisering Protocol (ca 7 timer)
| Navn på Reagens | Omtrentlig Volume | Varighet | Temperatur |
| 25% Metanol | 2 ml 5 min, rocking | Romtemperatur | |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 100% Metanol (kald) | 2 ml | 20 min, rocking | Romtemperatur |
| 100% Metanol (kald) | 2 ml | Varierer, ingen rocking | Romtemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| Mempfa | 2 ml | 30 min, rocking | Romtemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| Bleking Solution | 4 ml | 40 min-tre timer, rocking | Romtemperatur / 37 ° C (se tekst) |
| Lagring Embryoet | |||
| 25% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 50% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 75% Metanol | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 100% Metanol | 4 ml | Oppbevares ved -20 ° C | |
| 1 x PBS | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 1 x PBS | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
| 1 x PBS | 2 ml | 5 min, rocking | Romtemperatur |
Tabell 6: Fremgangsmåte for Stoppe In Situ Hybridisering, Bleking og Lagring av befruktede egg
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muligheten til å bruke in situ hybridisering for å visualisere uttrykket mønster av spesifikke gener forblir den mest brukte metode for å identifisere spesifikke organer eller celletyper i Xenopus embryo. Dette er på grunn av flere fordeler som tilbys av denne teknikken. Uttrykket av et gen kan identifisere spesifikke strukturer godt før noen histologiske tegn på differensiering slik tilfellet for nkx2.5 uttrykk i hjertet stamfedre før noen klar avgrensning av disse cellene 18. Når alle de reagenser som er i hånden, er det også svært kostnadseffektivt. Generasjon av mange individuelle sonder, som kan være effektivt gjenbrukes, er mulig med litt ekstra tid og kostnader investering annet enn å skaffe plasmidene som koder for gener av interesse. I vår erfaring, kan sonder gjenbrukes i mange år med lite tap i aktivitet til tross for den uunngåelige små fortynninger som kommer med hver bruk. Til slutt, er det lite optimalisering krav som stillesrødt når utnytte ulike sonder.
Kvaliteten på sonden syntese er en viktig faktor i suksessen til protokollen. Det er mange måter å kontrollere kvaliteten av RNA-probe, men ganske enkelt å kjøre RNA-probe på en TAE-gel er en hurtig og enkel fremgangsmåte som er helt pålitelig. Vi bruker rutinemessig etidiumbromid å farge RNA og som krever spesiell håndtering og disponering av gels av de fleste institusjoner. Giftfri alternativer er kommersielt tilgjengelig selv om vi ikke har spesielt sammenlignet de for visualisere sonder. Sonden skal kjøres som et enkelt bånd, selv om det vil synes noe uklar sammenlignet med DNA på en TAE-gel. Et estimat for mengden av RNA kan fås en god reaksjon vil ha omtrent 1 pg / pl av RNA. En lett visualiseres bandet vil representere minst 0,5 mikrogram av RNA og en lys bandet vil utgjøre over 1 mikrogram. Men klart ikke helt nøyaktig og krever litt erfaring, kvantifisering basert på gelen er rapid og robusthet i situ prosedyren gjør at den kan fungere godt. Hvis det er bekymring for repeterbarhet, kan man enkelt bruke UV absorbans å kvantifisere en liten mengde av transkripsjon reaksjon, selv om vi ikke har funnet dette å være et stort problem. Endelig, gjør det mulig for en gel for å se om det templat-DNA er blitt eliminert. Dersom gelen indikerer at det ikke er RNA, er de to mest sannsynlige forklaringer er en dårlig DNA-templat, eller at transkripsjonsbuffer ikke fungerer godt. Oppvarming av transkripsjonsbuffer til 37 ° C og grundig blanding før bruk, eller tilsetning av 1 ul av frisk 100 mM DTT til transkripsjons reaksjon kan av og til å hjelpe med den sistnevnte. En viktig komponent i transkripsjonsreaksjonsbuffer er spermidin, og det kan utfelles DNA-templatet ved lave temperaturer som gjør oppvarmingen av bufferen viktig. DTT i bufferen kan også utfelles signifikant inhibering av reaksjonen. Hvis et bunnfall kommer til syne i den buffer, varme oppløsningen ogvortex kraftig. Det er ikke behov for å ta noen uvanlige forholdsregler, slik som å behandle vannet med DEPC eller autoklave tips og rør, for å hindre at RNAse aktivitet. Tilstedeværelsen av den kommersielle ribonuklease inhibitor gir betydelig beskyttelse mot RNaser fra omgivelsene. Legg merke til at andre UTP etikettene kan anvendes, slik som fluorescein, selv i vår erfaring, digoksigenin-merket UTP og anti-digoksigenin antistoff-kombinasjonen gir den mest konsistente resultater.
Tidlige protokoller for sonde generering antyder at alkalisk hydrolyse av de syntetiserte prober bør gjøres 4 for å tillate større probe penetrasjon. Hydrolyse av sonden synes ikke å hjelpe til med in situ-hybridisering prosessen; RNA-prober som er større enn 500 bp vanligvis gir et utmerket signal og prober som er lengre enn 2 kb i lengde også fungere godt. Kortere prober kan fungere hvis målet RNA er rikelig, men lengre sonder vil gi better nett farging. Det synes ikke å være noen klar fordel i å bruke alkaliske fordøyelsen å bryte opp lengre sonder.
Omsorg i den innledende behandling av embryoene er svært viktig. Fjerning av befruktning konvolutten er spesielt nyttig for embryoer etter nevrale fold nedleggelse og før naturlig klekking ut av befruktning konvolutt. Under forlengelse av embryo inne i befruktning konvolutt, blir embryoet krøllet og hvis fast i den posisjonen, embryoene er vanskeligere å image etter in situ hybridisering. Men hvis embryoene blir fjernet fra befruktning konvolutten før fiksering, de hurtig rette ut. Hvis embryoer blir skadet under membranen fjerning, tillate dem å helbrede såret før fiksering, fordi skadet vev kan resultere i en falsk in situ hybridisering signal på sårstedet. Om små, sårene leges veldig raskt, ofte i løpet av minutter 19. Senere trinn kan også skade embryoene DUring væskeoverføring og så forsiktighet er nødvendig ved skifte av løsninger. Skade i tidlige trinn innebærer vanligvis at embryoet blir sterkt skadet ved slutten av prosedyren og skadede områder vil forårsake falsk in situ signaler ved synet av skade. Videre kan inntil 30 embryoer bli undersøkt i en enkelt hetteglass, men med flere embryoer er det større sjanser for høy bakgrunn utvikler i løpet av kolo reaksjon, men øke vasker på dag 3 eller vaske over natten kan kompensere for dette.
I denne protokollen, er antall trinn er redusert, og bruken av flere vanlige reagenser er blitt eliminert. Legg merke til at denne protokollen eliminerer flere trinn som brukes i mange andre protokoller, inkludert en proteinase K-fordøyelse, og bruken av eddikanhydrid for å blokkere positivt ladede grupper. Disse trinnene kan likevel være nyttig når man ser på pattedyr og fugle embryoer, men i å bruke Xenopus, eliminere disse trinnene har liten innvirkning on de endelige resultatene av in situ hybridisering. Laboratoriet er ikke bestemt hvorvidt disse samme forenklinger kan påføres in situ hybridisering protokoller for andre arter. Proteinase K fordøyelsen spesielt kan likevel være påkrevet i andre embryoer som chick eller mus der sonde penetrasjon kan ha større begrensninger.
Bruken av BM lilla substratet er enkel og pålitelig. Det finnes imidlertid en rekke andre alternativer som er tilgjengelige for de utløsende, farge alkaliske substrater som kreves for å lokalisere target-RNA i embryo. Spesielt er en kombinasjon av NBT / BCIP som vanligvis anvendes 4 og fungerer bra. Noen farge reagenser er oppløselige i metanol, og i dette tilfelle vil bruken av metanol etter farging eliminere flekken og må unngås. Andre fargekombinasjoner kan også brukes når du utfører dobbel i situs. Bruken av en tilsvarende kombinasjon (NBT / BCIP fremfor BM lilla) har også vist segå være svært robust når du bruker museembryoer 20. Den blå fargen på farging og den endogene pigment av embryoet er ofte vanskelig å skille klart i bilder. Bruk av albino embryo vil også eliminere pigment men bleking løsningen er nesten like effektivt, og er mye mer praktisk som det ikke krever vedlikehold av albino voksne for avl. Hvis fargingen er forholdsvis svak, kan sterk bleking understreke at farging. Hvis farging er sterk, kan forlate noen lys pigment være en effektiv kontrast og også hjelpe til med å orientere og iscenesettelse embryo.
Etter hybridisering over natten i RNA-probe, kan protokollen som avviker fra den rent manuell protokoll som er beskrevet her ved bruk av en in situ hybridisering robot. Bruken av in situ hybridisering robot sparer nesten en hel dag som Dag to og Dag tre av håndboken protokollen kan bli redusert til en dag som roboten fungerer gjennom natten end kan gjøre alle de aktuelle temperaturendringer. Roboten er også veldig konsekvent i sine resultater og gir mulighet for samtidig sondering av mange eksempler effektivt. Det gjenstår en fordel å gjøre den første dagen etter hånden som det gir mulighet for gjenbruk av prober og anvendelse av mindre volumer av reagens. Den eneste betydelige ulempen med å bruke en robot er den første prisen for instrumentet.
Denne protokollen drøfter noen av måtene å effektivt bilde en in situ hybridisering. Det er viktig å gjøre det så mye av informasjonen kan gå tapt hvis bildet er dårlig. I mange tilfeller, avbildning av in situ resultatene av et eksperiment som krever samme tid som den innledende eksperiment. Noen elementer av prosedyren variabler som graden av bleking har et element av personlig preferanse. Andre bildeeffekter kan oppnås ved å plassere parabolen på en farget basen. Ofte en liten blå nyanse til agar kan understreke den dype blå farging av i situ hybridisering. Enkelt sagt petriskål som inneholdt agar over et ark av blå plast for å få den ønskede virkning.
Men metodene som er skissert her gi grunnlag med å utforske bildemuligheter. Embryoer kan vises enten ryddet (laget gjennomsiktig for bedre visning interne strukturer) eller innskuddet (sett som de vises under normale lysforhold). Noen av vedtaket i forhold til hvordan bildet embryoet er avhengig av stedet av uttrykket. Hvis uttrykket er på eller nær overflaten av embryoet, er det best å image embryoet uten clearing. Det er flere fordeler med å bruke de innskuddet embryoer. Prosessen med å rydde embryoene krever mange trinn og kjemikalier som brukes for å fjerne embryoene er vanskelige å håndtere. Også flere hulrom i embryo tillate utfelling av alkaliske fosfat-substrater som kan resultere i falsk hulrom farging. Spesielt blastocoel av tidlige embryoer og pharyngeal hulrom ofte viser flekker (figur 4). Denne falske farging er ikke synlig i embryoer som ikke er klarert. For det meste, selv moderat dypt ekspresjon kan visualiseres i innskuddet embryoer, inkludert mesodermal vev så som hjerte, nyre, og somites og endodermal stuctures slike som skjoldbruskkjertelen og leveren. Flytte embryoene gjennom en metanol-serien til enten hydrat i PBS for visning eller satt i 100% metanol for lagring tillater flere runder med lagring og bildebehandling. Metanol lagring gjør det interessant å prøve forskjellige modifikasjoner til bildebehandling over lengre tid.
Det er noen ulemper å bruke in situ hybridisering for å se på genekspresjon. Nivåer av uttrykk er strengt tatt ikke kvantifiserbare selv sammenligning innenfor et embryo og brutto endringer i uttrykk og endringer i uttrykk domene størrelse er vanligvis åpenbare. Som med andre RNA-baserte teknikker, betyr det ikke gi noen informasjon som to proteinene som kodes av genet som er av interesse, som kan begrense tolkning av resultatene. Endelig, er det ofte vanskelig å bestemme hva som kan være bakgrunnsfarging i forhold til sant uttrykk domene. Dette er spesielt et problem med gener med en ukjent uttrykksmønster som kan være utbredt. Ofte er en probe som genereres fra den forstand tråd av det samme genet brukt som en kontroll for ikke-spesifikk farging. Bruk av en senstråden kontroll kan gi litt informasjon om et problem med reagenser, men det gir ikke definitive bevis på at flekker basert på antisense probe er helt nøyaktig. Resultater fra en in situ er vanligvis bemerkelsesverdig konsekvent på tvers embryoer når flere embryoer blir brukt, og dette kan brukes som et mål på tillit i en fargingsmønster. Dessuten kan forskjellige antisense-prober, generert fra forskjellige deler av genet, spesielt ikke-translaterte områder, bli brukt for å se om de gir den samme fargemønster. Hvis de gjør det,det gir også tilliten til observerte fargingsmønsteret dersom det er identiske. Fortynnede sonder kan også brukes med langvarig eksponering for fargeløsning for å se om den samme fargemønster fremkommer. En faktor som vanligvis skaper tillit i et fargemønster er om dette mønsteret svarer til en bestemt embryonale struktur. Nok i situs har nå blitt gjort med et stort utvalg av gener som nye uttrykk mønstre sannsynligvis vil relativt sjeldne hendelser. Store databaser med in situ bilder er blitt etablert for ulike organismer som kan brukes til å sammenligne bilderesultater. For Xenopus embryo, Xenbase (www.xenbase.org) er et utmerket eksempel på en ressurs som kan brukes til å forstå uttrykk mønstre. Andre modellorganismer har også lignende, omfattende databaser av bilder.
Til tross for disse potensielle begrensninger, in situ hybridisering er fortsatt en kraftig og pålitelig verktøy som er svært nyttig forstudiet av organogenesen. Det er sannsynlig å forbli metoden for valg for å identifisere celletyper og undersøke endring i genuttrykk domener i overskuelig fremtid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labguake Tube Shakers | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR Vials | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| Ribonucleoside Triphosphate Set, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | Invitrogen | 10777-019 | |
| T7 RNA Polymerase | Fermentas | EPO111 | |
| T3 RNA Polymerase | Fermentas | EPO101 | |
| SP6 RNA Polymerase | Fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| Sheep Serum | Wisent | 31150 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| BM purple Ap Substrate | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb fragments | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | Sigma | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | Sigma | E-3889-25G | |
| Paraformaldehyde | BioShop | PAR070.500 | |
| Formamide | VWR | CAFX0420-4 | |
| RNA | Roche | 10109223001 | |
| Maleic Acid | VWR | CAMX0100-3 | |
| tri-Sodium Citrate | BioShop | CIT001 | |
| Hydrogen Peroxide (30% Solution) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| Benzyl Alcohol | Sigma | B-1042 | |
| Benzyl Benzoate | Sigma | B-6630 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 |
References
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differentiation in Xenopus requires the cyclin-dependent kinase inhibitor, p27Xic1. Cardiovasc Res. 79, 436-447 (2008).
- Zhao, Y., et al. The expression of alphaA- and betaB1-crystallin during normal development and regeneration, and proteomic analysis for the regenerating lens in Xenopus laevis. Mol Vis. 17, 768-778 (2011).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Kirilenko, P., Weierud, F. K., Zorn, A. M., Woodland, H. R. The efficiency of Xenopus primordial germ cell migration depends on the germplasm mRNA encoding the PDZ domain protein Grip2. Differentiation. 76, 392-403 (2008).
- Deimling, S. J., Drysdale, T. A. Fgf is required to regulate anterior-posterior patterning in the Xenopus lateral plate mesoderm. Mech Dev. , (2011).
- Fletcher, R. B., Harland, R. M. The role of FGF signaling in the establishment and maintenance of mesodermal gene expression in Xenopus. Dev Dyn. 237, 1243-1254 (2008).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Park, E. C., Hayata, T., Cho, K. W., Han, J. K. Xenopus cDNA microarray identification of genes with endodermal organ expression. Dev Dyn. 236, 1633-1649 (2007).
- Horb, M. E., Slack, J. M. Endoderm specification and differentiation in Xenopus embryos. Dev Biol. 236, 330-343 (2001).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Pub. (1994).
- Gebhardt, D. O., Nieuwkoop, P. D. The Influence of Lithium on the Competence of the Ectoderm in Ambystoma Mexicanum. J Embryol Exp Morphol. 12, 317-331 (1964).
- Nieuwkoop, P. D. Pattern formation in artificially activated ectoderm (Rana pipiens and Ambystoma punctatum). Dev Biol. 6, 255-279 (1963).
- Sato, S. M., Sargent, T. D. Molecular approach to dorsoanterior development in Xenopus laevis. Dev Biol. 137, 135-141 (1990).
- Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
- Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
- Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
- Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
- Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
- Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).
