Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و Published: August 14, 2014 doi: 10.3791/51528
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, College of William & Mary
* These authors contributed equally

Abstract

الدراسات التي أجريت في الدروسوفيلاميلانوجاستر الأجنة واليرقات توفر البصيرة الحاسمة في العمليات التنموية مثل مواصفات مصير الخلايا وتوالد الأعضاء. المناعية يسمح التصور تطوير الأنسجة والأعضاء. ومع ذلك، بشرة الواقية التي تشكل في نهاية مرحلة التطور الجنيني يمنع تخلل الأجسام المضادة في أواخر مرحلة الأجنة واليرقات. بينما تشريح قبل المناعية يستخدم بانتظام لتحليل أنسجة اليرقات ذبابة الفاكهة، فإنه يثبت عدم كفاءة بعض التحليلات لأن الأنسجة الصغيرة قد يكون من الصعب تحديد وعزل. يوفر صوتنة بديلا للتشريح اليرقات في بروتوكولات المناعية ذبابة الفاكهة. أنه يسمح للسريع، وتجهيز وقت واحد من عدد كبير من الأجنة في مرحلة متأخرة واليرقات ويحافظ على التشكل في الموقعي. بعد التثبيت في الفورمالديهايد، وsonicated عينة. ثم يتم إخضاع العينة لالمناعية مع مستضد معين نملة الأساسيibodies والأجسام المضادة الثانوية fluorescently المسمى لتصور أنواع الخلايا المستهدفة وبروتينات معينة عبر مضان المجهري. خلال عملية صوتنة، تحديد المكان المناسب لتحقيق sonicating فوق العينة، فضلا عن مدة وشدة صوتنة، أمر بالغ الأهمية. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات طفيفة الاضافيه المناعية بروتوكولات قياسية للبقع عالية الجودة. عن الأجسام المضادة مع إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء، مرات حضانة أطول ضرورية عادة. كدليل على مفهوم لهذا البروتوكول، سهلت صوتنة، وتبين لنا immunostains من ثلاثة أنواع الأنسجة (الخصيتين والمبيض، والأنسجة العصبية) في مجموعة من المراحل التنموية.

Introduction

ذبابة الفاكهة الأجنة واليرقات توفر نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية في كثير من الأعضاء والأنسجة. التصوير من الخلايا الفردية غالبا ما يكون ضروريا في هذه الدراسات من أجل التأكد من البيئات المعقدة التي تتطور الخلايا. التصور من الخلايا في الأنسجة ويمكن تحقيق ذلك من خلال المناعية. موصوفة وصفا جيدا المناعية وجود بروتوكولات لذبابة الفاكهة الأنسجة الجنينية <17 ساعة بعد وضع البيض (أيل ليماسول) 1-3. ومع ذلك، فإن أشكال بشرة وقائية في نهاية مرحلة التطور الجنيني، ومنع تخلل فعالية الأجسام المضادة. وبالتالي، هذه البروتوكولات المناعية غير فعالة في تحليل أنسجة الأجنة في المراحل المتأخرة وفي مراحل لاحقة من نمو اليرقات (1 ش الطور (L1)، 2 الطور الثاني (L2)، و 3 الطور الثالث (L3)). هذا عدم الكفاءة تفرض عائقا أمام فهمنا للعمليات الحيوية التي تحدث خلال هذه الفترة التنموية طويلة 4. TISSرق تشريح هي تقنية تستخدم على نطاق واسع للتحايل على هذا الحاجز 5-7. ومع ذلك، يمكن تشريح يثبت غير فعالة. يمكن استخراج المرهونة من قبل صعوبة في تحديد أو عزل الجنينية والأنسجة اليرقات. وعلاوة على ذلك، وإزالة المادية من الأنسجة المستهدفة قد يسبب الضرر الناجم عن تمزق لهم أو بعدم استخراجها في مجملها.

صوتنة هو الطريقة التي توظف الموجات الصوتية لزعزعة التفاعلات بين الجزيئات. وقد تم استخدامه لتعطيل سلامة بشرة اليرقات ذبابة الفاكهة من أجل immunostain تطوير أنواع الخلايا العصبية 6. وقد تم تكييف هذا البروتوكول لimmunostain أواخر المرحلة الجنينية والغدد التناسلية اليرقات، التي يمكن أن تكون صغيرة مثل 50μm في قطر 8-10. من خلال هذه الدراسات، وقد اتسمت عملية الخلايا الجذعية الجرثومية (GSC) تشكيل مكانة الذكور في مرحلة متأخرة أجنة ذبابة الفاكهة 8-10 وآليات تنظيم وتطوير الخلايا الجذعية المتنوعةتم توضيح ferentiation في مرحلة متأخرة الغدد التناسلية الجنينية واليرقات 9-12. وبالتالي، يوفر صوتنة بديل فعال لتشريح الأنسجة التي قد تكون صعبة بسبب حجم الأنسجة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن المناعية الأنسجة ذبابة الفاكهة في الموقع، وترك الخلايا داخل سياق كائن كامل والحفاظ على التشكل في الموقعي. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لالمناعية مضان من أواخر المرحلة الجنينية في وقت مبكر من خلال / الأنسجة منتصف L3 في الموقع. ويظهر تحليل ذبابة الفاكهة الغدد التناسلية والعصبية في الأنسجة ممثل النتائج لإثبات فعالية هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها هذا البروتوكول المناعية لتحليل الأنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى وكذلك في أنسجة الكائنات الحية الأخرى ذات بشرة الخارجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد قفص مجموعة

  1. تخدير الشباب، والذباب خصبة مع CO 2. نقل الذباب تخدير إلى القفص. للحصول على العائد الأمثل، استخدم 100-120 الذباب الكبار تتراوح بين 2-7 أيام من العمر في 4: 1 نسبة الإناث إلى الذكور. السماح الذباب فترة التأقلم المناسبة، ~ 24 ساعة قبل الحصول على عينة لتثبيت. إذا تم تعيين قفص مع الإناث البكر لتزاوج الذكور، استخدام 36 - فترة التأقلم 48 ساعة.
  2. في نهاية مفتوحة من القفص، وضع معدة سلفا عصير التفاح لوحة أجار مع انخفاض سنتات الحجم من معجون الخميرة في وسط خلال افتتاح القفص. ثم، مع تأمين الشريط. اغلاق تقاطع بين لوحة أجار عصير التفاح والقفص مع parafilm.
  3. وضع القفص في وعاء مع عصير التفاح الثانوية وحة أجار كقاعدة والسماح للذباب إعادة عند درجة حرارة محددة لفترة زمنية مناسبة على النحو الذي يحدده التجربة.
    ملاحظة: مرات جمع العينات وايسوف تختلف. على سبيل المثال، عندما جمع أواخر مرحلة الأجنة / L1 اليرقات المبكرة (17 - 24 ساعة)، والسماح الذباب لتضع بيضها على لوحات أجار عصير التفاح لمدة 7 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل الشيخوخة من العينة لمدة 17 ساعة عند 25 درجة مئوية. وبالمثل، لمجموعة من منتصف أواخر أول يرقات العمر (36 - 48 ساعة) تسمح الذباب لتضع بيضها لمدة 12 ساعة عند 25 درجة مئوية قبل الشيخوخة من العينة لمدة 36 ساعة عند 25 درجة مئوية.
  4. مرة واحدة في فترة زمنية كاملة، اضغط على قفص على طاولة بحيث تنخفض الذباب بعيدا عن لوحة أجار عصير التفاح بدون تخدير. بسرعة استبدال لوحة استخدامها مع واحد الطازجة التي تحتوي على قطرة من معجون الخميرة. تأمين لوحة جديدة مع الشريط وparafilm وتخزين قفص مع عصير التفاح لوحة أجار كقاعدة.
  5. إزالة بعناية قطرة من لوحة الخميرة المستخدمة مع ملعقة معدنية. مكان غطاء على استخدام عصير التفاح لوحة وضعت الأجنة تسمح للسن إذا لزم الأمر تجريبيا.
    ملاحظة: على الرغم من الشيخوخة العينات، قد يتم تخزين لوحات عند 25 درجة مئوية ما لم ارتفاع درجات الحرارة هي experimentaLLY المطلوبة. أمثلة على كيفية العمر الأجنة لجمع والمذكورة أعلاه (انظر الملاحظة للخطوة 1.3). تتم إزالة عجينة الخميرة قبل عينة الشيخوخة لمنع اليرقات من الزحف إلى الخميرة وكسر آغار تحتها. ما تبقى من أجار عصير التفاح ومعجون الخميرة بقايا توفر المغذيات اللازمة للنمو اليرقات. بينما فقدت الأجنة وضعت مباشرة في عجينة الخميرة من خلال إزالة عجينة الخميرة، وهذه الخسارة هي أفضل من الخميرة وبقايا أجار في العينة التي يمكن أن تقلل كفاءة تلطيخ. ينبغي للمرء أن يختار عدم إزالة عجينة الخميرة، قد يكون المسال الخميرة مع الفوسفات العازلة تريتون X-100 (PBTx)، ويخلط مع فرشاة الطلاء، ومن ثم إزالتها من العينة مع مصفاة الخلية قبل التثبيت.

2. التثبيت

  1. مرة واحدة الأجنة وضعت على طبق عصير التفاح أجار والذين تتراوح أعمارهم بين لنقطة الوقت المطلوب، واستخدام الفرشاة المبللة صغيرة مع الفوسفات العازلة تريتون X-100 (PBTx) حل لإزالة بعناية عينة من اللوحة الإلكترونية.
    ملاحظة: أقدم يرقات متحركة، ويمكن الزحف على الجهة الداخلية من الغطاء. يمكن جمع هذه العينة مماثل مع إزالة الفرشاة.
  2. مسح عينة الفرشاة المحملة ضد التلال التي تواجه المناطق الداخلية من مصفاة الخلية. ثم، وشطف جدران مصفاة والفرشاة مع زجاجة بخ تحتوي على حل PBTx. وضع غطاء طبق بتري تحت مصفاة لالتقاط حل PBTx.
  3. بعد أن تم نقل كل عينة إلى مصفاة، صب بما فيه الكفاية PBTx في مصفاة لرفع عينة من شبكة. ثم، رفع مصفاة وتصب محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
  4. كرر الخطوة 2.3 ثلاث مرات لإزالة الخميرة وذبابة النفايات التي قد تم نقلها جنبا إلى جنب مع العينة.
  5. صب يكفي 50٪ التبييض (NaOCl) / الماء ([ده 2 O) حل في مصفاة لجمع اليرقات من على شبكة. تسمح اليرقات على الجلوس في حل لمدة 5 دقائق. ثم، رفع مصفاة واسكب رانه محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
    مطلوب التبييض فقط في عينات الجنينية الذين تتراوح أعمارهم بين 0-22 ساعة من أجل إزالة الغشاء المشيمي: مذكرة. يمكن حذف تطبيق التبييض لعينات القديمة، ولكن إدراجه ليس ضارا. إذا كان المطلوب إغفال أو استبدال التبييض في هذه الخطوة مع PBTx. ينبغي استخدام التبييض المخفف خلال 24 ساعة من إعداد الحل.
  6. غسل العينة في مصفاة مع PBTx بسكب ما يكفي PBTx في مصفاة لرفع عينة من شبكة. تسمح عينة للجلوس في محلول لمدة 3 دقائق. ثم، رفع مصفاة وتصب محتويات طبق بتري في حاوية النفايات السائلة.
  7. كرر الخطوة 2.6 خمس مرات.
  8. ربت أسفل مصفاة الخلية الجافة، ثم نقل العينة إلى قارورة التلألؤ تحتوي على 1.75 مل من محلول PEMS باستخدام الفرشاة.
  9. العمل في غطاء الدخان التهوية، إضافة 250 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 37٪ و 8 مل من هيبتان الصف كاشف للقارورة التلألؤ.
  10. تسمح القارورة إلى هزة في 200 دورة في الدقيقة أو بسرعة معتدلة مماثلة لمدة 20 دقيقة.
  11. إضافة 10 مل من الميثانول إلى قارورة التلألؤ دون إزالة المرحلة المائية السابقة والسماح القارورة إلى هزة بقوة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
    ملاحظة: الميثانول هو الخطرة. مواصلة العمل في غطاء الدخان التهوية وارتداء القفازات المناسبة.
  12. إزالة قارورة من شاكر وعلى الفور صب محتويات في مصفاة الخلية أكثر من حاوية النفايات السائلة في غطاء محرك السيارة. إضافة الميثانول اضافية لالقارورة وتعمل من خلال مصفاة الخلية اللازمة لضمان تمت إزالة كل عينة.
    ملاحظة: مصافى الخلية قد تستنزف ببطء. لتصحيح هذا، لمس الأنسجة المختبر إلى أسفل مصفاة الخلية من أجل استخلاص الحل من خلال مصفاة بسرعة أكبر. والميثانول، وينبغي أن يكون الفورمالديهايد، وهيبتانتخزينها في حاويات النفايات المناسبة حتى التخلص السليم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  13. أسفل الجافة من مصفاة الخلية باستخدام مختبر الأنسجة، ثم استخدام الفرشاة لنقل عينة المأسورة في مصفاة لأنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي 0.5 مل من الميثانول.
    ملاحظة: إذا قارورة التلألؤ متعددة قيد الاستخدام، أكمل الخطوات 2.12 و 2.13 قارورة واحدة في وقت واحد لمنع عينة من الجفاف على مصافى الخلية.
  14. مرة واحدة تم إضافة العينة إلى أنبوب microcentrifuge، إزالة الميثانول مع ماصة. استقر ضمان العينة إلى أسفل الأنبوب.
  15. شطف العينة في أنبوب microcentrifuge بإضافة حوالي 0.5 مل من الميثانول إلى الأنبوب. الانتظار لعينة لتسوية ثم إزالة الميثانول مع ماصة.
  16. كرر الخطوة 15 ثلاث مرات.
  17. إضافة 0.5 مل من الميثانول إلى أنبوب، ومن ثم تخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

3. الإماهة وإعداد نموذج للالمناعية

  1. إزالة الميثانول من أنبوب microcentrifuge مع ماصة، وترك العينة في أنبوب. الميثانول مخزن النفايات إلى حاوية النفايات المناسبة حتى وقت التخلص السليم.
    ملاحظة: لتعزيز كفاءة صوتنة، استخدم ما لا يزيد عن 3 ملم من عينة استقرت في أسفل أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. يجوز نقل عينة الزائدة إلى أنبوب منفصل مع ماصة قبل البدء في خطوة الإماهة أعلاه. قطع غيض ماصة مع شفرة حلاقة نظيفة يمكن استخدامها لمنع انسداد طرف ماصة.
  2. إضافة 1.0 مل من 50٪ الميثانول / الفوسفات العازلة توين (PBTw) حل للأنبوب والصخور لمدة 3 دقائق.
  3. إزالة حل الميثانول إلى حاوية النفايات المناسبة وشطف مع 1.0 ميكرولتر من PBTw مرتين. بعد كل شطف، والسماح للعينة ليستقر قبل الرسم قبالة PBTw مع ماصة.
  4. إضافة 1.0 مل من مصل بقري الزلال / الفوسفات مخزنة توين (BBTw) مزيج إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الكرسي الهزاز، والسماح للعصيدةلو لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
  5. كرر الخطوة 3.4 مرتين مع الحرص على إزالة BBTw قدر الإمكان دون أن تفقد العينة بعد غسل الماضي.
  6. إضافة 0.5 مل من BBTw إلى الأنبوب ووضع أنبوب على الجليد.

4. صوتنة من عينة

  1. تعيين sonicator إلى 10٪ كحد أقصى السعة وتعيين وقت التشغيل من 2 ثانية صوتنة المستمر.
    ملاحظة: هذه الإعدادات خاصة إلى sonicator مبين في الجدول المواد والمعدات وربما تتطلب الأمثل لsonicators مختلف.
  2. قبل صوتنة من العينة، وتنظيف التحقيق sonicator عن طريق وضع تلميح التحقيق في أنبوب مخروطي 50 مل مليئة منزوع الأيونات الماء وتشغيل sonicator لتنظيف التحقيق. التحقيق sonicator الجاف مع مختبر الأنسجة بعد التشغيل.
  3. غمر التحقيق في أنبوب microcentrifuge تحتوي العينة بحيث يتم وضعه ما يقرب من 3 إلى 4 مم فوق العينة وبدء صوتنة.
  4. إزالة مأنبوب icrocentrifuge ووضعه على الجليد لمدة 30 ثانية على الأقل لتبديد الحرارة من صوتنة والسماح عينة ليستقر على مستوى الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge.
  5. كرر الخطوات من 4.3 و 4.4 حسب الحاجة على أساس العمر من العينة التي يجري تجهيزها.
    ملاحظة: بالنسبة لحجم العينة الأمثل صوتنة والأجنة الذين تقل أعمارهم عن 17 ساعة لا تتطلب صوتنة، ولكن الذين تتراوح أعمارهم بين 17 و 24 ساعة (مرحلة 17 / أوائل-L1) تتطلب اثنين sonications. اليرقات بين 24 - 36 (أوائل / أواسط-L1)، 36 - 48 (منتصف / أواخر-L1)، 48-60 (أوائل / أواسط L2)، 60-72 (منتصف / أواخر-L2)، 72-84 ( في وقت مبكر-L3)، 84-96 (أوائل / أواسط L3)، 96-108 (منتصف / أواخر-L3) ساعة تتطلب 5، 9، 11، 13، 15، 18، و 22 sonications على التوالي. انظر المناقشة لمزيد من التفصيل في الأوقات صوتنة.
  6. شطف مع 1.0 مل BBTw مرتين. بعد كل شطف سماح العينة ليستقر قبل الرسم قبالة BBTw مع ماصة.
  7. إضافة 1.0 مل من BBTw إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الروك، والسماح للعينة لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة. </ لى>
  8. كرر الخطوة 4.7 مرتين.

5. المناعية

  1. منع العينة بإضافة المصل العادي 5٪ المخفف في BBTw إلى أنبوب microcentrifuge. إزالة كتلة بعد هزاز لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: استخدام مصل طبيعي من الأنواع التي يتم إنشاء الأجسام المضادة الثانوية.
  2. تمييع الأجسام المضادة الأولية المناسبة لتركيز العمل في 5٪ المصل العادي / BBTw الحل.
  3. عينة الصخور في الابتدائي يا حل الأجسام المضادة / N عند 4 درجات مئوية أو على الأقل لمدة 3 ساعة على RT (حوالي 22 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تتغير مدة حضانة الأجسام المضادة ودرجات الحرارة. O / N الحضانة عند 4 درجات مئوية أو 3 ساعة على RT يكفي عادة. ومع ذلك، فإن فترة حضانة المرض لمدة يومين قد يؤدي إلى تعزيز جودة تلطيخ، وخاصة مع عينات القديمة أو عند استخدام الأجسام المضادة الأولية منخفضة تقارب. وعادة ما يتم تنفيذ حضانات أطول في 4 درجات مئوية. يجب أن يتم اعتبارات مماثلة عند استخدام الأجسام المضادة الثانوية (انظر 5.10).
  4. السماح عينة لتستقر فيأسفل microfuge أنبوب. رسم من الأجسام المضادة الأولية مع ماصة. حفظ الأجسام المضادة لإعادة استخدامها إذا لزم الأمر.
  5. شطف مع 1.0 مل من BBTw مرتين. بعد كل شطف تسمح عينة ليستقر قبل الرسم قبالة BBTw مع ماصة.
  6. إضافة 1.0 مل من BBTw إلى القارورة والصخور. بعد 3 دقائق على الروك، تسمح عينة لتسوية وإزالة BBTw مع ماصة.
  7. كرر الخطوة 5.6 خمس مرات.
  8. عينة كتلة بإضافة 5٪ المصل العادي / BBTw حل للأنبوب microcentrifuge. إزالة كتلة بعد هزاز لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
    ملاحظة: لا يشترط هذه الخطوة حجب إضافية، لكن قد يحسن نوعية تلطيخ عن الأجسام المضادة المحددة.
  9. تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لتركيز العمل في 5٪ المصل العادي / BBTw الحل.
  10. التفاف أنبوب microcentrifuge في رقائق الألومنيوم لتقليل يتلاشى بسبب التعرض للضوء. عينة الصخور في حل الضد الثانوية لمدة 12 إلى 48 ساعة في 4 درجات مئوية أو على الأقل لمدة 3 ساعة على RT (حوالي 22 درجة مئوية.
  11. السماح عينة لتستقر في قاع microfuge أنبوب. رسم من الأجسام المضادة الثانوية مع ماصة.
  12. شطف مع 1.0 مل من PBTw مرتين. بعد كل شطف تسمح عينة ليستقر قبل الرسم قبالة PBTw مع ماصة.
  13. إضافة 1.0 مل من PBTw إلى القارورة والصخور. بعد 5 دقائق على الروك، والسماح للعينة لتسوية وإزالة PBTw مع ماصة.
  14. كرر الخطوة 5.13 ثلاث مرات.
  15. اختياري: إضافة دابي مخففة 1: 1،000 في PBTw. عينة الصخور ملفوفة في رقائق الألومنيوم لمدة 3 دقائق. ثم إزالة حل دابي مع ماصة. شطف خمس مرات مع 1.0 مل من PBTw، مما يسمح للعينة ليستقر قبل إزالة PBTw مع ماصة.
  16. إضافة 80-100 ميكرولتر من 1،4-diazabicyclo [2.2.2] اوكتان (DABCO) حل لأنبوب microcentrifuge وتخزينها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: قد تكون بديلا وكيل مكافحة تتلاشى آخر قائم على الجلسرين ل.

تحليل 6.

  1. قبل تركيب العينة على الشرائح، إضافة اضافي 5-10 ميكرولتر من DABCO / ف كايسيylenediamine (PPD) antifade حل لأنبوب microcentrifuge.
    ملاحظة: يمكن إضافة عينة على الشرائح دون تشريح. حجم العينة تضاف إلى شريحة يختلف مع حجم غطاء زلة. عندما pipetting لالعينة على الشريحة، يمكن خفض غيض ماصة قبالة باستخدام شفرة حلاقة لمنع عينة القص. غالبا ما يكون من المفيد أن يبطن عينة تصل في الصفوف لتحليل سهلا. إضافة PPD وكيلا antifade إضافية قد لا تكون مطلوبة، ولكن يمكن منع photobleaching من إذا يتم تخزين العينات على المدى الطويل.
  2. ضع بلطف الغطاء الزجاجي الانزلاق على العينة. ثم، آمن انزلاق الغطاء في مكانه تستخدم طلاء الأظافر.
  3. عرض شنت العينة باستخدام المجهر مضان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

للتدليل على فعالية المناعية القائم على صوتنة في تحليل المراحل المتأخرة الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، تم تجهيز البرية من نوع الأجنة واليرقات لالمناعية من الخصية والمبيض، والأنسجة العصبية. تم تصوير عينات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر وتظهر نتائج ممثلة (الشكل 1 والشكل 2). وتكشف النتائج أن البروتوكول وصف فعالة لتصور معالم شكلية وكذلك الخلايا الفردية في الموقع أثناء المراحل المتأخرة الجنينية خلال وقت مبكر / منتصف L3 التنمية ذبابة الفاكهة.

النتائج من الخصية Immunostain:
تطوير الخصية هو نظام جيد وخاصة لتوضيح فعالية البروتوكول منذ الخصيتين نضوج ديناميكي في جميع أنحاء نمو اليرقات. الخصيتين الكبار ذبابة الفاكهة شكل أنبوب ملفوف مع نهاية العمياء واحد، حيث يقع الخلايا الجذعية الجرثومية (GSC) المتخصصة (انظر 13،14 للاستعراضات). في هذا المتخصصة، والمحتشدة GSCs حول مجموعة ضيقة من الخلايا الجسدية غير الإنقسامية يسمى المحور. GSCs الخضوع الانقسام غير المتماثلة لإنتاج GSC التي لا تزال ترتكز على محور والنازحين ابنة gonialblast أن بعيدا عن مكانة الخلايا الجذعية. كما يقسم gonialblast غير كامل، ودعا ملحقات هيولي شكل fusomes، وربط الخلايا داخل spermatogonium. بعد 4 الانقسامات المتتالية، وspermatogonium يبادر الانقسام المنصف لتكوين الحيوانات المنوية.

تشكيل الخصية يبدأ مع رابطة الخلايا الجرثومية البدائية (بغتش) وخلايا السلائف الغدد التناسلية الجسدية (SGPS) خلال مرحلة التطور الجنيني (انظر 15،16 للاستعراضات). تنتج هذه الجمعيات في تشكيل مكانة GSC الوظيفية بنهاية مرحلة التطور الجنيني 8-10. بحلول منتصف L1، GSC الانقسامات غير المتماثلة داخل محراب GSC تؤدي إلى التفريق أمهات المني مع fusomes تشعبت 9. استمر الانقسام GSC غير المتماثلة في جميع أنحاء اليرقاتالتنمية، مما أدى إلى إنتاج أمهات المني إضافية وزيادة مطردة في حجم الغدد التناسلية. وتظهر الصور التمثيلية من أواخر الخصيتين / منتصف L1، L2، L3 والجنينية والمبكرة، immunostained للخلايا الجرثومية، والخلايا محور، وfusomes، (الشكل 1A-D). هذه الصور توضح التغيرات الدينامية في حجم الغدد التناسلية وتمايز الخلايا الجرثومية في الخصية لوحظ مع مرور الوقت.

النتائج من Immunostain المبيض:
وتتكون المبايض الكبار ذبابة الفاكهة من 16-20 وحدات إنتاج البيض الفردية دعا ovarioles (انظر 17،18 للاستعراضات). في نهاية واحدة من كل ovariole، بنية تسمى يحتوي على germarium مكانة الخلايا الجذعية. يتكون مكانة ovariole من GSCs غير متمايزة واثنين من السكان من الخلايا الجسدية: خلايا سقف والخلايا خيوط الطرفية (TFS). على غرار الخصية، GSCs الخضوع الانقسام غير المتماثلة لإنتاج GSC واحد أن يبقى المتاخمة للخلايا الغطاء وخلية ابنة التفاضلي، ودعا الى أرومة كيسية، والتي يتم الضغط بعيدا عن مكانه. وأرومة كيسية يخضع بعد ذلك 4 جولات من انقسام الخلايا لتشكيل الكيس خط الجرثومية، مترابطة من قبل fusome تشعبت. ثم تحيط كل سلالة الجرثومية-الكيس بواسطة خلايا بصيلات لإنتاج البيض الغرفة التي لا تزال تنضج وهو يتحرك إلى أسفل طول ovariole.

مثل الخصيتين، تتشكل المبايض أولا خلال مرحلة التطور الجنيني 16،18. تنشأ ovarioles متعددة من الغدد التناسلية الجنينية واحد يتألف من بغتش وSGPS. بحلول منتصف L3، SGPS تثير السلائف TF الأمامي في المبيض، في حين أن الخلايا الجرثومية لتوطين الخلفي المبيض واقترانه SGP المستمدة من الخلايا المختلطة (ICS) 19-22. بحلول أواخر-L3، خلايا TF تفرق وتنظم في أكوام وجدت في محراب الخلايا الجذعية البالغة، وأنشئت GSCs والخلايا كأب، ويلاحظ خط الجرثومية الكيس التمايز 19،20،23. صور تمثيلية من أواخر مرحلة جنينية مبكرة و/ المبايض منتصف L3، immunostaINED للخلايا الجرثومية، SGPS، المرحلية، السلائف TF، وfusomes ترد، (الشكل 1E، F). تظهر هذه الصور التشكل الطبيعي والتقدم التنموي لسنهم.

النتائج من العصبية Immunostain:
ويستمد الجهاز العصبي المركزي ذبابة الفاكهة (CNS) من الخلايا الجذعية العصبية، ودعا neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء)، التي تنشأ من الظهارة العصبية الجنينية (انظر 24،25 للاستعراضات). مصلحة الدولة للاحصاء في الأجنة واليرقات الفجوة غير متماثلة لانتاج خلايا العقدة الأم (GMC) التي بدورها تولد الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الموجودة في الدماغ الكبار والحبل البطني العصب. لأن مصلحة الدولة للاحصاء اليرقات تثير غالبية الخلايا العصبية الكبار ويمكن تمييز على أساس وضعهم داخل الدماغ، أصبحت أدمغة اليرقات نموذجا هاما لدراسة السلوك NB والتمايز العصبي.

يتكون الدماغ L3 من فصين والحبل البطني العصب في موقع مركزي 24.وتظهر الصور التمثيلية للأدمغة منتصف L3 immunostained لمصلحة الدولة للاحصاء، GMCs، غير متمايزة الخلايا العصبية، الخلايا العصبية غير الناضجة والابتدائية والخلايا الدبقية (الشكل 2A-C) 26-30. تظهر هذه الصور تلطيخ قوي في أنماط التعبير متميزة داخل فصوص الدماغ والحبل البطني العصب. اعتمادا على تصاعد التوجه، والتصوير يسمح لتصور أنسجة المخ من السطح الظهري (الشكل 2A)، السطح البطني (الشكل 2B)، أو في المقطع العرضي السهمي (الشكل 2C).

كفاءة تلطيخ:
وتظهر نتائجنا أن تمثيلية إجراء المناعية القائم على صوتنة هي متعددة. ليس فقط يمكن أن تستخدم لتحديد أنواع معينة من الخلايا ولكن أيضا يمكن أن تستخدم لتشير إلى وجود البروتينات والعضيات محددة. ومع ذلك، قد تنبع النتائج غامضة من الاختلاف المتوقع في الكفاءة تلطيخ. على سبيل المثال، ملطخة مكافحة الأوعية الغدد التناسلية واحد على الأقلفي 73.2٪ من جميع اليرقات فحص (ن = 781)، في حين معاداة Elav الملون في أدمغة 86٪ من اليرقات (ن = 115). وعلاوة على ذلك، نلاحظ أن تلطيخ الكفاءة هو تقريبا يتناسب عكسيا مع المرحلة التنموية. الأجنة في المراحل المتأخرة، ملطخة مكافحة الأوعية 89.8٪ من الغدد التناسلية (ن = 206)، في حين كان موجودا في تلطيخ فقط 59.8٪ و 46.9٪ من اليرقات في L2 و L3 منتصف، على التوالي (ن = 132 و 49). بالإضافة إلى ذلك، صوتنة النتائج في فقدان العينة. عندما تم احتساب عدد الأجنة واليرقات الحاضر في حجم العينة الأمثل صوتنة قبل وبعد صوتنة، تم تحديد ما معدله 41.0٪ من عينة غير صالحة للتحليل (ن = 1165). لتحقيق أقصى قدر من الكفاءة تلطيخ، ينبغي أن يكون الأمثل لبروتوكولات محددة الأجسام المضادة عن طريق تغيير تركيز الأجسام المضادة التي نشرت أو أوقات الأجسام المضادة الحضانة.

الشكل 1
الرقم 1. أنا. mmunostain الغدد التناسلية من ذبابة الفاكهة في الموقع (AD) الصور من الخصيتين في الموقع الأجنة في المراحل المتأخرة (مرحلة 17 / أوائل-L1) خلال وقت مبكر / منتصف L3 اليرقات immunostained مع مكافحة فاسا (AD، أحمر، A'-D ' وحده) للكشف عن الخلايا الجرثومية، ومكافحة Fasicilin الثالث (فاس III) ومكافحة 1B1 (AD، الأخضر؛ A '' - D '' وحدها) للكشف عن خلايا محور وfusomes على التوالي، ودابي (AD، الأزرق، A ' '' '' '-d وحده) للكشف نوى. (A) المرحلة معارض 17 / أوائل L1 الخصية محور اندمجت حديثا وfusomes كروية في الخلايا الجرثومية غير متمايزة. (B) في وقت مبكر / منتصف L1 تظهر الخصية fusomes كروية في GSCs المحلية بالقرب من محور والخلفي في بعض الخلايا الجرثومية ممدود fusomes يدل على التمايز أوائل النطفة. (C) في وقت مبكر / منتصف L2 و (EF) الصور من المبايض في الموقع في أواخر مرحلة الأجنة ومنتصف L3 اليرقات immunostained مع مكافحة فاسا (EF، أحمر؛ E'-F ' وحده) للكشف عن الخلايا الجرثومية، ومكافحة 1B1 (EF، الأخضر، E '' - F '' وحده) للكشف عن fusomes وأغشية الخلايا الجسدية في L3، ومكافحة ازدحام المرور (TJ) (EF، الأزرق، E ' "-F '' 'وحدها) للكشف عن خلايا المبيض الجسدية. (E) المرحلة 17 / أوائل L1 المبيض يدل على أن الخلايا الجسدية وتوزع في جميع أنحاء الغدد التناسلية وأن الخلايا الجرثومية يكون fusomes كروية. (F) في وقت مبكر / منتصف L3يتم تكبير المبيض قليلا، والكشف عن غشاء المرتبطة 1B-1 التعبير يدل التنمية TF السلف في الخلايا الجسدية الأمامي. توجد الخلايا الجرثومية في منتصف L3 في الخلفية الخصيتين، تظهر fusomes كروية، واقترانه TJ إيجابي / 1B1 قاتمة المرحلية الجسدية. جميع الصور هي التوقعات-Z من 4 شرائح مبائر المتعاقبة مع الغدد التناسلية الأمامية الموجهة إلى اليسار. وترد الغدد التناسلية ويشار المحور مع السهم الأصفر في الخصيتين. شريط النطاق هو 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. Immunostain من الأنسجة العصبية ذبابة الفاكهة في الموقع. المبكر / منتصف L3 اليرقات immunostained مع مكافحة Elav ( A 'وحدها) لكشف نوى الخلايا العصبية غير الناضجة والابتدائية، وإما مكافحة بروسبيرو (الايجابيات) (A، الخضراء، A' وحدها) لكشف نوى في GMCs والخلايا العصبية غير متمايزة أو مكافحة عكس قطبية ( الريبو) (BC، الأخضر، B '، C' وحدها) للكشف عن الخلايا الدبقية. كانت تستخدم للكشف عن نواة الخلية، ونوى دابي (A '' 'وحدها AC، الأزرق). جميع الصور مع المنحى الأمامي المباراة. مقطع سهمي المنحى مع بطني إلى اليسار. يظهر (A) القسم الظهرية تلطيخ القوي لإيجابيات وElav في المناطق الطرفية من الفص الدماغ (BL) وعلى طول خط الوسط والأطراف من الحبل البطني العصب (VNC). أقحم في لوحة ويظهر إيجابيات وElav تلطيخ في نواة متميزة على طول خط الوسط VNC. (B) يظهر بطني المقطع العرضي التعبير الواسع النطاق من الريبو إيجابي الخلايا الدبقية وايعشر تلطيخ أقوى على طول خط الوسط VNC والهامش. يظهر (C) مقطع سهمي إثراء الريبو تلطيخ على الوجه البطني للVNC. جميع الصور هي أقسام مبائر واحدة. شريط النطاق هو 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول طريقة لذبابة الفاكهة بنجاح immunostain استهداف الجنينية والأنسجة اليرقات في الموقع، وبالتالي القضاء على الحاجة للتشريح. وفقا لبروتوكولات مسبقة لتلطيخ الأجنة المبكرة 1،2،3، تتم إزالة الغشاء المشيمي باستخدام 50٪ التبييض (NaOCl). يتم إصلاحها في عينات الفورمالديهايد والميثانول. لأن بشرة اليرقات تسبب عينة القديمة لتطفو، ثم يتم تمرير عينة كاملة من خلال خلية مصفاة لضمان الاحتفاظ اليرقات. يتم تخزين العينة، إذا رغبت، في الصف الكيميائية الميثانول. بعد الإماهة، وهي عملية صوتنة تنفيذها بشكل صحيح يعطل سلامة بشرة اليرقات. هذا أمر بالغ الأهمية بعد تشكيل بشرة للسماح تخلل كافية من الأجسام المضادة المطلوبة لالمناعية. قبل تطبيق الأجسام المضادة، هزاز العينة في المصل العادي 5٪ / حل BBTw يمنع الأجسام المضادة غير محدد المفرط ملزمة. ثم تضاف الأجسام المضادة الأولية للكشف عن بروتينات محددة اكسبريسالحوار الاقتصادي الاستراتيجي في النسيج المستهدف. بعد غسل لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير منضم، وتستخدم الأجسام المضادة الثانوية بد أن fluorophores بمناسبة موقع الأجسام المضادة الأولية المربوطة. ويمكن بعد تحليل أن يؤديها مع epifluorescence أو المجهري متحد البؤر.

قد تكون هناك حاجة بعض التعديلات لتحسين النتائج في الظروف الفردية. على وجه الخصوص، السلطة صوتنة وعدد sonications يؤديها قد تتطلب التعديل تبعا للsonicator المستخدمة. كما قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات ذروة التحقيق sonicator فوق العينة وكذلك للحجم حل لsonicators مختلفة أو إذا لم يمكن الحصول على عينة كافية. زيادة العكارة حل يمكن أن تستخدم كمؤشر لتحلل الأنسجة، وبالتالي يوفر مقياسا لأنه عندما صوتنة شديد جدا. إذا أصبح حل العكارة عالية، ويجب أن المجرب النظر في تخفيض عدد sonications يؤديها، وزيادة حجم الحل، ورفع ذروة sonicatoص مسبار فوق العينة، و / أو الحد من قوة sonicator.

التعديلات قد تكون هناك حاجة أيضا في البروتوكول المناعية لتعزيز جودة الصورة. كما هو الحال مع معظم الإجراءات المناعية إشارة إلى نسبة الضوضاء يمكن تغييرها عن طريق تعديل تخفيف الأجسام المضادة، والوقت ودرجة الحرارة من الأجسام المضادة الحضانة مع العينة، و / أو حجب الكواشف المستخدمة. في حين أن كل الأجسام المضادة يجب النظر بشكل مستقل، وخاصة فيما يتعلق الأجسام المضادة التخفيف، نجد أن الحضانة عند 4 درجة مئوية لفترات زمنية أطول يمكن أن تعزز نوعية تلطيخ بعد صوتنة، وخاصة بالنسبة الأجسام المضادة مع إشارة إلى انخفاض نسب الضوضاء وعندما يتم فحص اليرقات الأكبر سنا. في هذه الحالات، قد تستفيد أيضا من نوعية تلطيخ انخفاض طفيف في التخفيف الضد الثانوية. في هذا البروتوكول، ونحن تشمل كلا من BSA والمصل ومنع الكواشف، ويتم إعادة منعت-العينة قبل إضافة الأجسام المضادة الثانوية من أجل زيادة جودة تلطيخ. اعتمادا على استخدام الأجسام المضادةقد أو قد لا يكون مطلوبا د، وإعادة إدراج حظر ومنع كل من الكواشف لتعزيز تلطيخ. إذا تم حذف خطوة عرقلة إعادة، يغسل أطول وأكثر يشطف قد تنتج صورا أكثر نظافة. أخيرا، قد الأجسام المضادة قبل استيعاب زيادة إشارة إلى نسبة الضوضاء. يتم تنفيذ ما قبل امتصاص الأجسام المضادة التي يحتضنها المطلوب مع الأجنة ميهت أو اليرقات قبل استخدامها في immunostain 1.

كما هو موضح في نتائج ممثلة لدينا، صوتنة يسمح لتصور واضح للأنسجة المستهدفة في الموقع وبالتالي يوفر بديل معقول لتشريح الأنسجة في بروتوكولات المناعية. تشريح يمكن أن تكون مرهقة في أجنة ذبابة الفاكهة واليرقات بسبب الصعوبات في تحديد وعزل، واستخراج الأنسجة المستهدفة التالفة. بالتناوب صوتنة الأنسجة يسمح بالبقاء في سياق الكائن الحي بأكمله. لأن صوتنة يتجنب استخراج والأنسجة المتصاعد بين شريحة وسلي غطاءع، فإنه يحفظ أكثر دقة التشكل في الموقع. عمليا، كميات كبيرة من عينة يمكن معالجتها بسرعة أكبر لتحليل المستقبل، لأن العديد من الكائنات الحية يمكن sonicated في نفس الوقت.

على الرغم من صوتنة يوفر بديلا رائعا للتشريح، فقد القيود التي يجب أخذها بعين الاعتبار. صوتنة يعطل مفيد سلامة بشرة اليرقات ولكن يدمر بعض العينات في عملية (انظر ممثل النتائج). الشطف لإزالة الحطام البيولوجي هو مطلوب بعد عملية صوتنة، والتي يمكن زيادة خفض حجم العينة. بالإضافة إلى ذلك، المناعية الأجنة الكاملة واليرقات يترك الأنسجة من الاهتمام جزءا لا يتجزأ من الأنسجة المحيطة بها. هذه الأنسجة المحيطة قد صمة عار إيجابيا أو تظهر الأجسام المضادة غير محددة ملزمة، وبالتالي تقليل جودة الصورة النهائية. أخيرا، تلطيخ الكفاءة يمكن أن تكون متغيرة. قد يتوقف هذا التغير على سن العينة، فعالية صوتنة، والأجسام المضادة خصوصية. نتيجة، صوتنة-BAالمناعية ااا كلها من جبل الأنسجة قد لا تكون دائما الأفضل. على وجه الخصوص، قد يكون المناعية القائم على تشريح أكثر كفاءة عند دراسة الأنسجة كبيرة في وقت متأخر من L3 اليرقات. وعلاوة على ذلك، يمكن صوتنة القص إرل- ومنتصف مرحلة الأجنة. على الرغم من هذه القيود، المناعية القائم على صوتنة هي تقنية فعالة للغاية ومناسبة تماما لتحليل تطور مجموعة متنوعة من أنسجة الأجنة في المراحل المتأخرة خلال وقت مبكر / منتصف L3 اليرقات. في مختبرنا، ونحن نستخدم هذا البروتوكول بانتظام لدراسة الغدد التناسلية التشكل في أجنة ذبابة الفاكهة واليرقات 9،10. وعلاوة على ذلك، فإننا نتوقع أن تنفيذ هذا البروتوكول سوف يثبت المثمر بالتساوي في دراسة تطور الأنسجة الأخرى في ذبابة الفاكهة وغيرها من الكائنات مع بشرة واقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نحن ممتنون ليمان روث وDorthea GODT الذين زودوا يرجى فاسا وازدحام المرور الأجسام المضادة. نود أن نعترف مركز بلومينغتون المالية في جامعة إنديانا للحفاظ على مخزون المقدمة والدراسات ورم هجين البنك التنموية وضعت برعاية معاهد الصحة القومية والتي تحتفظ بها جامعة ولاية ايوا. نشكر جميع أعضاء المختبر Wawersik للحصول على المشورة والدعم. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل علماء مونرو برنامج منح (لAF وLB) وجبهة الخلاص الوطني منح IOS0823151 (لMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10% For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane CAS 142-82-5 n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol CAS 67-56-1 Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10% For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS) ackson ImmunoResearch Laboratories 005-000-121 To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) CAS: 281-57-9 To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10% To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI Invitrogen D3571 1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa 1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7G10 1:10
Mouse anti-1B1 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1 1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Prospero MR1A 1:10
Rat anti-Elav Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7EBA10 1:30
mouse anti-Repo Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 8D12 1:10
Goat anti-rabbit Alexa546 Invitrogen A11010 1:500
Goat anti-mouse Alexa488 Invitrogen A11029 1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633 Invitrogen A21105 1:500
Goat anti-rat Alexa488 Invitrogen A11006 1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages Hand-made; Genesee Scientific Corporation Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier Branson Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe Branson Model #: 102C (CE) EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter Nalgene 190-25-20 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit Nalgene 450-0020 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 90،
-سهلت صوتنة المناعي تلطيخ المرحلة الجنينية في وقت متأخر من اليرقات و<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأنسجة<em&gt; في الموقع</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. … More

Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ. J. Vis. Exp. (90), e51528, doi:10.3791/51528 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter