Abstract
초파리에서 수행 연구는 배아 및 유충은 세포의 운명 사양 및 기관 형성 등의 발생 과정에 중요한 통찰력을 제공 melanogaster. 면역 염색은 조직 및 기관의 개발 시각화한다. 그러나 배아의 끝 부분에 형성하는 보호 표피 늦게 단계의 배아 및 유충에 항체의 투과를 방지 할 수 있습니다. 면역 염색 전에 절개 정기적 초파리 유충의 조직을 분석하는 데 사용되는 반면 작은 조직 찾아서 분리하기 어려울 수 있기 때문에, 그것은 어떤 분석 비효율적 증명한다. 초음파는 애벌레 초파리 면역 염색 프로토콜의 해부에 대한 대안을 제공합니다. 늦은 단계의 배아 및 유충의 대량의 빠른 동시 처리 가능하며 현장 형태로 유지한다. 포름 알데히드에 고정 후, 샘플을 초음파 처리한다. 샘플은 다음 항원 특정 기본 개미와 면역 염색을 실시ibodies 및 형광 표지 이차 항체는 형광 현미경을 통해 표적 세포 유형 및 특정 단백질을 가시화한다. 초음파 처리의 과정에서, 상기 시료에 초음파 프로브뿐만 아니라, 초음파의 강도와 지속 시간의 적절한 배치가 중요하다. 표준 면역 프로토콜로 부가적인 약간의 수정은 고품질의 얼룩을 위해 필요할 수있다. 잡음비 낮은 신호에 대한 항체, 긴 배양 시간은 통상적으로 필요하다. 이 초음파 - 촉진 프로토콜에 대한 개념의 증거로서, 우리는 발달 단계의 범위에서 세 가지 조직 유형 (고환, 난소 및 신경 조직)의 면역 염색을 보여줍니다.
Introduction
초파리의 배아 및 유충은 많은 기관과 조직의 발달 과정을 연구 할 수있는 좋은 모델을 제공합니다. 개별 세포의 세포 이미징을 개발하는 복잡한 환경을 확인하기 위하여, 이들 연구에서 종종 필요하다. 조직에서 세포의 면역 염색을 통해 시각화 달성 될 수있다. 프로토콜 17 시간 달걀 누워 (AEL) 1-3 후 배아 초파리 조직 <존재하는 면역 염색 잘 설명했다. 효과적인 항체의 투과를 방지하는 배아의 단부를 향해 그러나 보호 표피 형태. 따라서, 이러한 면역 염색 프로토콜은 늦게 단계의 배아에서 조직의 분석과 애벌레 개발 (1 차 령 (L1), 2 차 령 (L2), 및 3 차 령 (L3))의 후속 단계에서 비효율적이다. 이 비 효율성이 확장 개발 기간 4 중 발생하는 동적 프로세스에 대한 우리의 이해에 장벽을 부과한다. 담배 마는UE 절제술이 장벽 5-7을 우회 할 수있는 널리 사용되는 기술이다. 그러나, 해부 비효율적 증명할 수 있습니다. 추출은 위치 또는 배아와 애벌레 조직을 분리하는 어려움에 의해 방해를 할 수있다. 또한, 표적 조직의 물리적 제거를 파열 또는 그 전체를 추출하기 위해 실패에 의해 손상 될 수 있습니다.
초음파는 분자간 상호 작용을 방해 음파를 이용하는 방법입니다. 이는 신경 세포 유형 6을 개발하기 위해 발현 사이 초파리 유충 표피의 무결성을 파괴하는데 사용되어왔다. 이 프로토콜은 늦게 단계 배아 직경 8 ~ 10 년으로 50μm 작게 할 수있다 애벌레 생식선을 발현 사이하도록하고있다. 이러한 연구를 통해, 수컷 생식선 줄기 세포 (GSC) 틈새 형성 과정이 말기에있어서 한 줄기 세포 발달과 DIF 조절 초파리 배아 8-10 및 메커니즘후기 배아 생식선 및 유충의 ferentiation 9-12을 밝혀왔다. 따라서, 초음파로 인해 조직의 크기가 어려울 수 있습니다 조직 절개에 대한 효율적인 대안을 제공합니다. 또한, 전체 유기체의 컨텍스트 내에서 셀을 떠나 시츄 형태로 유지 시츄 초파리 조직의 면역 염색을 가능하게한다. 여기에, 우리는 현장에서 초 / 중반 L3 조직을 통해 늦게 단계 배아의 형광 면역 염색에 대한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 초파리 생식선 및 신경 조직의 분석은이 프로토콜의 효능을 입증하기 위해 대표 결과에 나타낸다. 또한,이 면역 프로토콜은 외부 표피와 기타 다른 초파리 생물 조직뿐만 아니라 조직을 분석하도록 구성 될 수있다.
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Protocol
컬렉션 케이지의 1 준비
- CO 2 젊은, 비옥 한 파리를 마취. 케이지에 마취 파리를 전송합니다. 최적의 수율을 얻을 수 사에 나이 2~7일에 이르기까지 100-120 성인 파리를 사용하려면 다음과 남성에 대한 여성의 한 비율입니다. 파리에게 적절한 순응 기간을 허용 ~ 24 시간 고정을 위해 샘플을 획득하기 전에. 48 시간 순응 기간 - 케이지가 처녀 여성으로 설정 한 경우 남성에 사용 36를 결합.
- 케이지의 개방 단부에서 케이지의 구멍에 중심에 효모 페이스트의 한푼 크기의 방울 미리 준비된 사과 주스 한천 플레이트를 배치합니다. 그런 다음, 테이프로 고정합니다. 사과 주스 한천 플레이트와 파라 필름와 케이지의 접합부를 밀봉.
- 염기로서 사과 쥬스 한천 플레이트와 보조 용기에 케이스를 놓고 실험에 의해 결정된 바와 같이 파리 적절한 기간에 대해 정의 된 온도에서 재현 할 수있다.
참고 : 시료 채취 시간 위스콘신다를 것이다. 후기 배아 / 초기 L1 유충 수집 할 때 예를 들어, (17-24 시간)를, 파리는 25 ° C에서 17 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ℃에서 7 시간 동안 사과 주스 한천 접시에 알을 낳기 위해 수 있습니다. 마찬가지로, 중반 후반 첫번째 령 애벌레의 컬렉션 (36-48 시간) 파리 25 ° C에서 36 시간 동안 사전 샘플의 노화에 25 ° C에서 12 시간 동안 알을 낳기 위해 수 있습니다. - 기간이 완료되면 파리 마취없이 떨어져 사과 주스 한천 플레이트에서 드롭 있도록 테이블에 새장을 누릅니다. 신속 효모 페이스트의 방울을 함유 한 신선한 플레이트로 사용을 대체. 테이프와 파라 필름으로 신선한 판을 고정베이스로 사과 주스 한천 플레이트와 케이지를 저장합니다.
- 조심스럽게 금속 주걱 사용 된 플레이트에서 효모 강하를 제거합니다. 실험적으로 필요한 경우 장소 사용되는 사과 주스 접시에 뚜껑 나이에 배아를 마련 할 수 있습니다.
참고 : 샘플을 노화 동안 판은 25 ° C에서 저장 될 수있다 높은 온도가 experimenta가 아니라면에서야이 필요합니다. 상기 기술 한 바와 같다 수집을위한 배아를 나이하는 방법의 예 (단계 1.3 참고 사항을 참조하십시오). 노화를 샘플링하기 전에 효모 페이스트의 제거는 효모에 크롤 링 아래 한천을 깨는에서 유충을 방지하기 위해 수행된다. 나머지 사과 주스 한천과 효모 붙여 넣기 잔류 애벌레 성장을위한 영양분을 제공합니다. 효모 페이스트에 직접 배치 배아 효모 페이스트 제거를 통해 손실되는 반면,이 손실은 염색 효율을 줄일 수있는 샘플 효모 및 한천 잔류하는 것이 바람직하다. 하나는 효모 페이스트를 제거하지 않도록 선택한 경우, 효모는 페인트 브러시와 혼합, 인산염 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx)와 액화 한 후 이전에 고정에 셀 스트레이너를 사용하여 샘플에서 제거 할 수 있습니다.
2 고정
- 사과 주스 한천 플레이트에 배치 배아가 원하는 시점에 세되면, 조심스럽게 일에서 샘플을 제거 인산 버퍼 트리톤 X-100 (PBTx) 용액에 적신 작은 붓을 사용하여전자 판.
참고 : 이전 애벌레 이동하고 뚜껑의 안쪽에 크롤링 할 수 있습니다. 이 샘플은 페인트 브러시와 제거에 의해 유사하게 수집 할 수있다. - 셀 스트레이너의 내부를 향하는 능선에 대한 샘플을 함유 한 페인트 브러시를 닦아주십시오. 그런 다음, 스트레이너의 벽과 PBTx 솔루션을 포함하는 물총 병 붓을 씻어. PBTx 솔루션을 캡처 여과기 아래에 배양 접시 덮개를 놓습니다.
- 모든 샘플은 여과기로 전송 된 후, 메쉬 오프 샘플 인상 여과기로 충분히 PBTx을 붓는다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다.
- 단계를 반복 2.3 세 번 효모를 제거하고 샘플과 함께 전송 된 수 있습니다 폐기물을 비행.
- 메쉬를 유충을 제기하기에 충분한 50 % 표백제 여과기에 (의 NaOCl) / 물 (DDH 2 O) 용액을 붓는다. 유충은 5 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음, 스트레이너를 들어 올려 t을 부어그는 액체 폐기물 용기에서 배양 접시의 내용을 표시합니다.
참고 : - 융모막 막을 제거하기 위해 22 시간 표백제는 0 세 배아 샘플이 필요합니다. 이전 샘플 표백제 애플리케이션은 생략 할 수 있지만, 그것의 포함은 유해하지 않다. 누락이 필요한 경우, PBTx이 단계에서 표백제를 대체. 희석 표백제 용액 준비 24 시간 이내에 사용하시기 바랍니다. - 메시 오프 샘플을 높이기 위해 스트레이너에 충분한 PBTx을 부어 PBTx와 여과기에 샘플을 씻으십시오. 샘플 3 분 동안 용액에 앉아 할 수 있습니다. 그리고, 스트레이너를 올려 액체 폐기물 컨테이너로 페트리 접시의 내용을 붓는다.
- 반복 단계 2.6 다섯 번.
- 셀 스트레이너 건조의 바닥 DAB 후 붓을 사용 PEMS 용액 1.75 ㎖에 함유하는 섬광 바이알로 샘플을 전송.
- 환기 흄 후드에서 작업, 37 %의 포름 알데히드 250 μL와 섬광 유리 병에 시약 등급 헵탄의 8 ML을 추가합니다.
- 유리 병은 200 rpm으로 20 분 동안 비슷한 적당한 속도로 흔들 수 있습니다.
- 이전의 성상을 제거하지 않고 섬광 유리 병에 메탄올 10 mL를 넣고 유리 병은 1 분 동안 500 rpm으로 흔들어 할 수 있습니다.
참고 : 메탄올은 위험합니다. 환기 흄 후드에서 작업하고 적절한 장갑을 착용 계속합니다. - 후드에서 액체 폐기물 용기 위에 셀 스트레이너에 내용을 부어 바로 통에서 유리 병을 제거하고. 바이알에 여분의 메탄올을 첨가하고 모든 샘플이 제거되었는지 확인하기 위해 필요한 셀 스트레이너를 통해 실행.
참고 : 셀 스트레이너 천천히 방전 될 수 있습니다. 이를 해결하기 위해,보다 빠르게 여과기를 통해 용액을 그리기 위해 셀 스트레이너의 바닥 실험실 조직을 터치. 메탄올, 포름 알데히드, 헵탄이 있어야한다제도적 지침에 따라 적절한 폐기 될 때까지 적절한 폐기 용기에 보관. - 실험실 조직을 사용하여 셀 스트레이너의 마른 바닥, 메탄올 0.5 ㎖에 들어있는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 스트레이너에서 캡처 샘플을 전송하기 위해 붓을 사용합니다.
참고 : 여러 섬광 유리 병을 사용하는 경우 단계를 완료 2.12 한 번에 2.13 한 병 셀 스트레이너에 건조에서 샘플을 방지 할 수 있습니다. - 샘플이 microcentrifuge 관에 추가되면, 피펫과 메탄올을 제거합니다. 확인 샘플 튜브의 바닥에 침전되었다.
- 튜브의 메탄올 0.5 ㎖에 첨가하여 microcentrifuge 관에 샘플을 헹군다. 다음 정착 피펫 메탄올을 제거하는 샘플 기다립니다.
- 단계를 반복하여 15 세 번.
- 에서 관에 메탄올 0.5 ML을 추가 한 다음 저장 -20 나중에 사용하기 위해 C 냉동고 °.
3 재수 및 면역 염색을위한 시료의 준비
- 튜브 샘플을 떠나, 피펫 microcentrifuge 관에서 메탄올을 제거합니다. 적절한 폐기 때까지 적절한 폐기 용기에 보관 메탄올 폐기물.
, 초음파 처리 효율을 향상시키기 위해 시료의 더 이상 3mm가 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브의 바닥에 침전 없음 사용 참고. 과잉 시료 위 재수 화 공정을 시작하기 전에 피펫 분리 튜브로 이송 될 수있다. 깨끗한 면도날과 피펫 팁을 절삭하는 피펫 팁의 막힘을 방지하기 위해 사용될 수있다. - 3 분 동안 튜브와 바위에 50 % 메탄올 / 인산 버퍼 트윈 (PBTw) 솔루션의 1.0 ML을 추가합니다.
- 적절한 폐기물 용기에 메탄올 용액을 제거하고 두 번 PBTw의 1.0 μl를 씻어. 각 린스 후, 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
- 소 혈청 알부민 / 인산염 완충 트윈 (BBTw)의 1.0 ML을 추가 바이알과 바위에 섞는다. 로커에 3 분 후, SAMP를 허용르 정착과 피펫 BBTw를 제거합니다.
- 단계를 반복 마지막 세척 후 샘플을 잃지 않고 가능한 한 많은 BBTw을 제거 돌보는 3.4 두 번.
- 튜브에 BBTw의 0.5 mL를 넣고 얼음에 튜브를 배치합니다.
샘플의 4 초음파 처리
- 10 % 최대 진폭에 초음파기를 2 초 일정 초음파의 실행 시간을 지정합니다.
참고 :이 설정은 재료 및 장비 표에 표시된 초음파기에 고유 한 다른 sonicators에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. - 이전 시료의 초음파로, 프로브를 청소하는 탈 이온수 및 실행 초음파기 가득 50 ML 원뿔 튜브에 프로브 팁을 배치하여 초음파기 프로브를 청소합니다. 실행 한 후 실험실 조직과 드라이 초음파기 프로브.
- 이 시료 위에 약 3-4mm 배치되도록 샘플을 함유하는 마이크로 원심 튜브에 프로브를 담그고 초음파 처리를 시작한다.
- m을 제거icrocentrifuge 튜브 초음파로부터 열을 소산 샘플 microcentrifuge 관의 하단에 정착 할 수 있도록 적어도 30 초 동안 얼음에 배치하고.
- 반복 4.3 및 처리되는 샘플의 연령에 따라 필요에 따라 4.4 단계를 반복합니다.
참고 : 최적의 초음파 샘플 볼륨의 경우, 초음파를 필요로하지 않는 미만 17 시간 배아, 그러나 그 시간 17 사이의 24 (/ 17 단계 초기 L1)이이 sonications이 필요합니다. 애벌레 사이 24-36 (초 / 중반-L1), 36-48 (중 /-L1 후반) 48-60 (초 / 중반 L2), 60-72 (중 / 후반 L2), 72-84 ( )-L3 초, 84-96 (초 / 중반 L3), 96-108 (중 / 후반 L3) 시간이 필요 5, 9, 11, 13, 각각 15, 18, 22 sonications. 초음파 시간에 더 정교에 대한 설명을 참조하십시오. - BBTw 두 번 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
- 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다. </ 리>
- 단계를 반복 4.7 두 번.
(5) 면역 염색
- microcentrifuge 관에 BBTw에 희석 5 % 정상 혈청을 추가하여 샘플을 차단합니다. 1 시간 동안 락을 한 후 블록을 제거합니다.
참고 : 보조 항체가 생성되는 종에서 정상 혈청을 사용합니다. - 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 적절한 작업하는 차 항체를 희석.
- 4 ° C에서 또는 (약 22 ° C 실온에서 적어도 3 시간 동안 차 항체 솔루션 O 락 샘플 / N.
주 : 항체 배양 시간 및 온도는 다를 수 있습니다. O / RT에서 N 4 ° C에서 배양 또는 3 시간은 일반적으로 충분합니다. 그러나,이 일의 잠복기는 특히 오래된 샘플 또는 낮은 친화력 차 항체를 사용하는과, 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. 긴 인큐베이션은 일반적으로 4 ° C에서 수행됩니다. 이차 항체 (5.10 참조)을 사용하면 유사한 고려가 이루어져야합니다. - 샘플에 정착 할 수 있도록 허용미세 원심 분리 튜브의 바닥. 피펫 차 항체를 그립니다. 원하는 경우 재사용에 대한 항체를 저장합니다.
- 두 번 BBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 BBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
- 유리 병 바위에 BBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에 3 분 후, 샘플 정착 피펫 BBTw를 제거 할 수 있습니다.
- 반복 단계 5.6 다섯 번.
- microcentrifuge 관에 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액을 첨가함으로써 차단 샘플. 1 시간 30 분 동안 흔들 후 블록을 제거합니다.
이러한 추가적인 차단 단계가 필요하지 않고, 특정 항체 염색 품질을 향상시킬 수 있습니다. - 5 % 정상 혈청 / BBTw 용액에 농도를 작동하는 적절한 보조 항체를 희석.
- 빛 노출로 인해 변색 줄이기 위해 알루미늄 호일에 microcentrifuge 관을 감 쌉니다. 4 ° C에서 12 시간 48 2 차 항체 용액 또는 RT (약 22 ° C에서 적어도 3 시간 동안 바위 샘플.
- 샘플 미세 원심 분리 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 피펫 차 항체를 그립니다.
- 두 번 PBTw의 1.0 ㎖로 씻어. 각 린스 후 샘플 피펫 PBTw을 그리기 전에 정착 할 수 있습니다.
- 유리 병 바위에 PBTw의 1.0 ML을 추가합니다. 로커에서 5 분 후, 샘플 정착 피펫 PBTw를 제거 할 수 있습니다.
- 단계를 반복 5.13 세 번.
- 옵션 : 1,000 PBTw에 : DAPI 1 희석 추가합니다. 록 샘플은 3 분 동안 알루미늄 호일에 싸서; 다음 피펫 DAPI 솔루션을 제거합니다. 샘플 피펫 PBTw를 제거하기 전에 정착 할 수 있도록 PBTw의 1.0 mL를 다섯 번 씻어.
- -20 ° C에서 microcentrifuge 관 및 저장소에 1,4 - 디아 자비 시클로 [2.2.2] 옥탄 (DABCO) 용액 100 ㎕ - 80를 추가합니다.
주의 : 다른 글리세롤 계 안티 - 페이드 에이전트가 대신 할 수있다.
(6) 분석
- DABCO / P-페닐의 10 μL - 슬라이드에 샘플을 설치하기 전에 여분의 5를 추가ylenediamine (PPD) microcentrifuge 관에 antifade 솔루션입니다.
참고 : 샘플 절개없이 슬라이드에 추가 할 수 있습니다. 슬라이드에 추가 샘플 볼륨을 커버 슬립의 크기에 따라 달라집니다. 슬라이드 상에 샘플을 피펫 때 피펫 팁은 시료 전단 않도록 면도날을 이용하여 차단 될 수있다. 그것은 쉬운 분석을위한 행 샘플을 정렬하는 것이 유용하다. 추가 antifade 제로 PPD의 첨가는 필요하지 않을 수 있지만, 샘플 장기 photobleaching에 저장되어있는 경우를 방지 할 수있다. - 부드럽게 샘플을 통해 유리 커버 슬립을 배치합니다. 그런 장소에 보안 커버 슬립은 매니큐어를 사용.
- 보기는 형광 현미경을 이용하여 시료를 탑재.
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Representative Results
마지막 단계의 배아와 현장에서 애벌레 조직의 분석 초음파 기반의 면역 염색의 효능을 입증하기 위해, 야생 형 배아 및 유충은 고환, 난소의 면역 및 신경 조직을 위해 처리 하였다. 샘플은 공 초점 현미경을 통해 몇 군데 있었다 대표적인 결과는 (그림 1과 그림 2)를 나타낸다. 결과는 설명 프로토콜은 초파리 개발의 늦은 배아 초기 통해 / 중간 L3 단계에서 형태 적 특징뿐만 아니라 현장에서 개별 세포를 시각화하는 효과가 있음을 알 수있다.
고환 발현 사이의 결과 :
정소 발달 고환의 성숙이 유충 발달에 걸쳐 동적이기 때문에 프로토콜 효능을 예시하기위한 특히 좋은 시스템이다. 성인 초파리 고환, 13 참조 (생식 줄기 세포 (GSC) 틈새가 위치해 한 블라인드 끝으로 코일 튜브를 형성리뷰 14). 이 틈새에서, GSC를 허브라고 불리는 비 유사 분열 체세포의 꽉 클러스터 주변에 배치된다. GSC를 허브에 고정 상태를 유지하고 gonialblast 딸이 멀리 줄기 세포 틈새에서 변위 한 GSC를 생산하는 비대칭 분열을받을. gonialblast 불완전 분할로, 세포질 확장 spermatogonium 내에서 세포를 연결 fusomes 양식을했다. 4 연속 분할 후, spermatogonium 정자를 형성하는 감수 분열을 시작합니다.
고환의 형성은 배아 동안 원시 생식 세포 (의 PGC)와 체세포 생식 전구 세포 (SGPS)의 관계 (후기 15, 16 참조)로 시작합니다. 이 연관은 배아 8-10의 단부에 의해 작용 GSC 틈새의 형성을 초래한다. 중간 L1으로 GSC 틈새 내의 비대칭 GSC 분열 분지 fusomes 9 정조 세포 분화를 야기. 비대칭 GSC 부문은 애벌레에 걸쳐 계속개발 추가 정조 세포 및 생식선 크기 프로그레시브 증가 생산의 결과. 생식 세포, 허브 세포 및 면역 염색을위한 fusomes 늦은 배아 초 / 중반 L1, L2, L3 및 고환의 대표적인 이미지는, (도 1a-D)를 나타낸다. 이러한 이미지는 시간이 지남에 고환에서 관찰 생식소의 크기와 생식 세포의 분화에 역동적 인 변화를 보여줍니다.
난소 발현 사이의 결과 :
성인 초파리의 난소 ovarioles (후기 17, 18 참조)라고 불리는 16 ~ 20 개인 계란을 생산하는 단위로 구성된다. 각 ovariole의 일단에, 구조가 germarium 줄기 세포 틈새를 포함했다. 캡 세포 및 터미널 필라멘트 세포 (TF들) : ovariole 틈새는 미분화 GSC를하고 체세포의 두 집단으로 구성되어있다. 정소 마찬가지로, GSC를 캡 세포와 차별화 딸 인접하도록 유지 한 GSC를 생성 비대칭 분열을 거쳐멀리 틈새 시장에서 밀려 cystoblast을했다. cystoblast 이후 분기 fusome에 의해 상호 세균 줄 낭종을 형성하는 세포 분열의 4 라운드를 겪는다. 각 생식선-낭종이어서 그것이 ovariole의 길이 아래로 이동 성숙 계속 달걀 챔버를 생성하는 여포 세포에 의해 둘러싸여있다.
고환 마찬가지로, 난소 제 배아 16,18 동안 형성된다. 여러 ovarioles은의 PGC와 SGPS로 구성된 단일 배아 생식선에서 발생한다. 생식 세포는 SGP 파생 혼합 된 세포 (ICS) 19 ~ 22과 난소 후방과 연결하려면 지역화하면서 중간 L3으로 SGPS는 난소 전방에서 TF 전구체에 상승을 제공합니다. 늦은 L3으로 TF 세포 분화와 성인 줄기 세포 틈새에서 발견 된 스택으로 구성, GSC를 모자 세포를 확립하고, 세균 줄 낭종 차별화 19,20,23를 관찰된다. 늦게 단계 배아 초 / 중반 L3 난소, immunosta의 대표 이미지생식 세포, SGPS, IC를, TF 전구체 및 fusomes에 대한 이네 (그림 1E, F) 표시됩니다. 이러한 이미지는 자신의 나이에 대한 정상적인 형태와 발달 진행을 보여줍니다.
신경 발현 사이의 결과 :
초파리 중추 신경계 (CNS)가 신경 줄기 세포로부터 유래되고, 배아 neuroepithelium에서 발생이라고 neuroblasts (NBS)은, (후기 24,25 참조). 배아 및 유충 분할에 NBS 비대칭 차례로, 성인의 뇌와 복부 신경 코드에있는 신경 세포와 신경 교세포를 생성하는 것이 신경절 어머니 세포 (GMC)를 생성한다. 유생 NBS 성인 뉴런의 대부분을 초래하고 뇌 내에서의 위치에 기초하여 구별 될 수 있기 때문에, 유충 뇌 NB 동작 및 신경 분화를 연구하는데 중요한 모델이되고있다.
L3의 뇌는이 돌출부로 구성되며 중앙에 위치한 복부 신경 코드 (24)된다.NBS, GMCs, 미분화 신경 세포, 미성숙 및 기본 신경 세포와 신경 교세포에 대한 면역 염색 중반 L3 뇌의 대표 이미지 (그림 2A-C) 26 ~ 30을 표시됩니다. 이러한 이미지는 뇌의 엽 (叶) 및 복부 신경 코드 내에서 서로 다른 발현 패턴에서 강한 염색을 보여줍니다. 설치 방향에 따라 이미지는 등쪽면 (그림 2A)에서 뇌 조직의 시각화, 복부 표면 (그림 2B) 또는 시상 단면에서 (그림 2C) 수 있습니다.
염색 효율 :
우리의 대표적인 결과는 초음파 기반의 면역 염색 과정이 다양한 것을 보여줍니다. 뿐만는 특정 세포 유형을 식별하기 위해 사용될 수 있지만, 특정 단백질 및 세포 소기관의 존재를 나타 내기 위해 사용될 수있다. 그러나 모호한 결과는 염색 효율의 예상 변화에 기인 할 수 있습니다. 예를 들어, 안티 바사는 적어도 하나의 생식선 스테인드모든 애벌레의 73.2 %에서 조사 (N = 781) 안티 Elav 유충 (N = 115)의 86 %에 머리를 염색하는 동안. 또한, 우리는 효율성을 염색하는 약 발달 단계에 반비례하는 것을 관찰한다. 염색하는 (N = 132, 49) 만 각각 59.8 %와 L2 중순 L3,에서 유충의 46.9 %에 존재하면서 늦게 단계의 배아에서, 안티 - 바사는 (N = 206)를 생식선의 89.8 % 스테인드. 또한, 시료 손실 초음파 결과. 배아 및 최적의 초음파 샘플 볼륨 본 유충의 수는 초음파 처리 전과 후 측정했을 때, 시료의 41.0 %의 평균 분석 (N = 1165)에 부적합 판정 하였다. 효율성을 염색 극대화하기 위해 프로토콜을 발표 항체 농도 또는 항체 배양 시간을 변경하여 특정 항체에 최적화되어야한다.
그림 1 I. 현장에서 초파리의 생식기의 mmunostain (AD) 마지막 단계의 배아에서 현장에서 고환의 이미지 (단계 17 / 조기-L1) 초기를 통해 / 중간 L3 유충 방지 바사 (AD, 빨간색 면역 염색, A'-D ' 단독) 생식 세포, 항 Fasicilin III FAS (III) 및 항-1B1 (AD, 녹색 감지하는 단계;을 '- D')을 단독으로 '는 각각 허브 세포 fusomes를 검출하고 DAPI (AD, 블루, A' '이 핵을 감지하는) 형' '- D' '. (A) 무대 17 / 초 L1의 고환이 미분화 생식 세포에서 새로 합체 허브 및 구형 fusomes을 보여줍니다. (B은) 초기 / 중간-L1은 고환 지역화 GSC를 구형 fusomes를 보여줍니다 생식 세포 분화 초기은 정원 나타내는 fusomes 길쭉한 허브 근처에서 약간 후방. (C) 조기 / 중간 및 L2
현장에서 그림 2 발현 사이 초파리 신경 조직의. 초 / 중반 L3 유충 (안티 Elav으로 면역 염색
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Discussion
이 프로토콜은 성공적 따라서 박리를위한 필요성을 제거 반응계에서 초파리 배아와 유충 표적 조직 발현 사이하는 방법을 제공한다. 초기 배아에게 1,2,3 염색을 위해 사전 프로토콜에 따라, 융모막 멤브레인은 50 % 표백제 (NaOCl을)를 사용하여 제거한다. 샘플은 포름 알데히드와 메탄올에 고정되어 있습니다. 애벌레 표피가 떠있는 오래된 샘플을 발생하기 때문에, 전체 샘플은 애벌레 보존을 보장하기 위해 셀 스트레이너를 통해 전달됩니다. 샘플은 화학적 등급 메탄올, 원하는 경우, 기억된다. 재수 화 한 후, 적절히 구현 초음파 처리는 유생 표피의 무결성을 방해. 이것은 면역 염색에 필요한 항체의 충분한 침투 수 있도록 표피 형성 한 후 중요합니다. 5 % 정상 혈청 샘플을, 항체를 적용 흔들 전에 / BBTw 솔루션은 과도한 특이 항체 바인딩을 방지 할 수 있습니다. 일차 항체는 특정 단백질을 검출 EXPRES 첨가표적 조직에 나오지. 언 바운드 차 항체를 제거하기 위해 세척 한 후, 형광 물질에 결합 된 이차 항체는 결합 된 항체의 위치를 표시하는 데 사용됩니다. 분석은 다음 표면 형광 또는 공 초점 현미경을 수행 할 수 있습니다.
일부 수정은 개별 상황에서 결과를 최적화해야 할 수 있습니다. 특히, 초음파 처리 전력 및 수행 sonications의 수는 사용 초음파기에 따라 조정이 필요할 수있다. 상기 샘플뿐만 아니라 용액의 부피 초음파기 탐침의 높이도 다른 적응 sonicators 또는 충분한 샘플을 얻을 수없는 경우 필요할 수있다. 향상된 용액 탁도 따라서, 초음파가 너무 심한 경우위한 게이지를 제공하고, 조직의 용해의 지표로 사용될 수있다. 용액의 탁도가 높아지는 경우, 실험자는 sonicato의 높이를 높여, 용액 량을 증가 수행 sonications의 수를 감소 고려해야R의 샘플 상기 프로브, 및 / 또는 초음파기 전력을 감소.
개조는 이미지 품질을 향상시키기 위해 면역 프로토콜에 필요할 수있다. 대부분의 면역 염색 절차와 같이 신호 대 잡음비가 항체의 희석, 샘플의 시간과 함께 항체 인큐베이션 온도를 수정 및 / 또는 사용되는 시약을 차단함으로써 변경 될 수있다. 각 항체가 독립적으로 고려되어야하지만, 특히 항체 희석에 대하여, 우리는 긴 시간의 기간 동안 4 ° C에서 배양이 특히 낮은 노이즈 비율로 신호 때 이전 유충을 검사 아르와 항체, 초음파 처리 후 염색 품질을 향상시킬 수 있음을 찾을 수 있습니다. 이러한 경우, 염색 품질도 차 항체 희석 약간 저하 이점있다. 이 프로토콜에서는 BSA로 블로킹 시약 및 혈청 모두를 포함하고, 샘플 염색 품질을 증가시키기 위해 이차 항체를 첨가하기 전에 다시 차단된다. 항체는 사용에 따라모두 차단 시약의 개발, 재 차단 및 포함 또는 염색을 향상시키기 위해 필요하지 않을 수도 있습니다. 다시 차단 단계가 생략되는 경우, 더 이상 세척 헹굼 청소기 이미지를 생성 할 수있다. 마지막으로, 미리 흡수 폴리 클로 날 항체는 신호 대 잡음비를 증가시킬 수있다. 사전 흡수 재수 배아 또는 발현 사이 일에 사용하기 전에 유충으로 원하는 항체를 배양에 의해 수행된다.
우리의 대표적인 결과에서 알 수 있듯이, 초음파는 현장에서 표적 조직의 명확한 시각화 할 수 있으며, 따라서 면역 프로토콜의 조직 절개에 대한 합리적인 대안을 제공합니다. 해부 인해, 위치, 격리 및 손상되지 않은 표적 조직을 추출의 어려움에 초파리의 배아 및 유충에 가실 수 있습니다. 교대의 초음파는 조직 전체 유기체의 컨텍스트에서 유지할 수있다. 초음파는 슬라이드 커버 SLI 사이의 추출 및 장착 조직을 피할 수 있기 때문에p는, 그것을 더 정확하게 시츄 형태로 보존한다. 많은 유기체가 동시에 초음파 처리 될 수 있기 때문에 실제적으로 많은 양의 시료가 더 빨리 미래 분석 처리 될 수있다.
초음파는 해부 훌륭한 대안을 제공하지만 고려해야 할 제한 사항이 있습니다. 초음파는 유리하게 애벌레 표피의 무결성을 방해하지만, 그 과정에서 몇 가지 예제를 (대표 결과를 참조) 파괴합니다. 생물학적 파편을 제거하기 위해 세척하여 상기 샘플의 크기를 줄일 수있는 초음파 처리, 다음 요구된다. 또한, 전체 배아 및 유충을 면역 염색은 주변 조직에 포함 된 관심의 조직을 떠난다. 이 주변 조직에 긍정적 얼룩 또는 비 - 특이 적 항체, 따라서 최종 이미지 품질을 감소 바인딩 보여줄 수있다. 마지막으로, 효율성을 염색하는 변수가 될 수 있습니다. 이 변화는 샘플, 초음파의 효능 및 항체 특이성의 연령에 따라 달라질 수 있습니다. 그 결과, 초음파-BA로전체 마운트 조직 나오지 면역 염색은 항상 바람직하지 않을 수 있습니다. 늦은 L3 유충에 큰 조직을 연구 할 때 특히, 해부 기반의 면역 염색은보다 효율적으로 할 수있다. 또한, 초음파는 early- 및 중간 단계의 배아를 전단 할 수 있습니다. 이러한 제한에도 불구하고, 초음파 기반 면역 초기 / 중간 L3 유충 통해 말기 배아 조직에서의 다양한 개발 분석에 적합하다 고도로 효율적인 기술이다. 우리가 실험실에서, 우리는 정기적으로 초파리의 배아와 애벌레 9,10에서 생식소 형태 형성을 연구하기 위해이 프로토콜을 사용합니다. 또한, 우리는이 프로토콜의 구현이 보호 표피와 초파리에서 다른 조직의 발전을 공부하고 다른 생물에서 동일하게 유익한 일 것으로 예상된다.
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Acknowledgments
우리는 친절 바사 및 트래픽 잼 항체를 공급 루스 리먼과 Dorthea Godt에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 NICHD의 후원하에 개발하고 아이오와의 대학에 의해 관리 제공된 주식과 발달 연구 하이 브리 도마 은행을 유지하기위한 인디애나 대학 블루밍턴 주식 센터에 감사드립니다. 우리는 그들의 조언과 지원을 Wawersik 실험실의 모든 구성원 감사합니다. 이 작품은 먼로 학자 프로그램 그랜트와 NSF (AF 및 LB에) (MW로) IOS0823151을 부여에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
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