Abstract
Studies uitgevoerd in Drosophila melanogaster embryo's en larven leveren cruciale inzicht in ontwikkelingsprocessen zoals lot van de cel specificatie en organogenese. Immunokleuring maakt de visualisatie van ontwikkelende weefsels en organen. Echter, een beschermende cuticula die zich vormt aan het eind van embryogenese voorkomt permeatie van antilichamen in late-embryo's en larven. Terwijl dissectie voor immunokleuring wordt regelmatig gebruikt om Drosophila larvale weefsels analyseren inefficiënt sommige analyses blijkt omdat kleine weefsels moeilijk kan zijn te lokaliseren en te isoleren. Sonicatie biedt een alternatief voor dissectie in larvale Drosophila immunostaining protocollen. Het maakt een snelle, gelijktijdige verwerking van grote aantallen late-embryo's en larven en onderhoudt in situ morfologie. Na fixatie in formaldehyde, wordt een monster gesonificeerd. Monster wordt vervolgens onderworpen aan immunokleuring met antigen-specifiek primair antibodies en fluorescent gelabelde secundaire antilichamen aan doelcel types en specifieke proteïnen te visualiseren via fluorescentiemicroscopie. Tijdens het proces van sonicatie, juiste plaatsing van een sonicatie sonde boven het monster, alsmede de duur en intensiteit van sonicatie, kritisch. Additonal kleine wijzigingen standaard immunokleuring protocollen die noodzakelijk zijn voor hoge kwaliteit vlekken. Op antilichamen met een lage signaal-ruisverhouding, langere incubatietijden zijn typisch noodzakelijk. Als een proof of concept voor deze-geluidsgolven gefaciliteerd protocol, laten we immunostains van drie soorten weefsel (testikels, eierstokken, en zenuwweefsel) op een afstand van ontwikkelingsstadia.
Introduction
Drosophila embryo's en larven bieden een uitstekend model om ontwikkelingsprocessen te studeren in veel organen en weefsels. Beeldvorming van afzonderlijke cellen is vaak noodzakelijk in deze studies om de complexe omgevingen waarin cellen ontwikkelen bepalen. Visualisatie van cellen in weefsels kunnen worden bereikt door immunokleuring. Goed beschreven immuunkleuring protocollen bestaan voor embryonale Drosophila weefsels <17 uur na de eileg (AEL) 1-3. Echter, een beschermende cuticula vormt tegen het einde van embryogenese voorkomende effectieve antilichaam permeatie. Aldus zijn deze immunokleuring protocollen inefficiënt in de analyse van weefsels in late-stadium embryo en in latere fasen van larvale ontwikkeling (1e instar (L1), 2e instar (L2) en 3e instar (L3)). Deze inefficiëntie legt een barrière voor ons begrip van de dynamische processen die optreden tijdens deze uitgebreide ontwikkelingsperiode 4. Tissue dissectie is een uitgebreid toegepast techniek om deze barrière 5-7 omzeilen. Echter, dissectie ondoeltreffend. Extractie kan worden bezwaard door de moeilijkheden bij het lokaliseren of het isoleren van embryonale en larvale weefsels. Verder kan de fysieke verwijdering van doelwitweefsels schade veroorzaken door scheuren hen of door niet uitpakken in hun geheel.
Sonicatie is een methode die geluidsgolven maakt gebruik van intermoleculaire interacties te verstoren. Het is gebruikt om de integriteit van de Drosophila larven cuticula verstoren om immunostain ontwikkelen neurale celtypes 6. Dit protocol is aangepast om late-fase embryonale en larvale geslachtsklieren, van slechts 50 urn diameter 8-10 kan immunostain. Door middel van deze studies, is het proces van de mannelijke kiembaan stamcellen (GSC) niche-formatie werd gekenmerkt in een vergevorderd stadium Drosophila embryo's 8-10 en mechanismen tot regeling van stamcellen ontwikkeling en differentiatie in een vergevorderd stadium embryonale gonaden en larven zijn opgehelderd 9-12. Aldus sonicatie biedt een efficiënt alternatief voor weefsel dissectie die kan moeilijk zijn vanwege weefselgrootte. Bovendien maakt immunokleuring van Drosophila weefsels in situ, waardoor cellen in de context van het hele organisme en handhaven situ morfologie. Hier is een stap-voor-stap protocol voor fluorescentie immunokleuring van late-fase embryonale beschrijven we door vroege / midden-L3 weefsels in situ. Analyse van Drosophila gonadale en neuraal weefsel in de Representatieve resultaten voor de werkzaamheid van dit protocol aangetoond. Bovendien kan dit immunokleuring protocol worden aangepast aan andere Drosophila weefsels en weefsels in andere organismen te analyseren met een buitenste cuticula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Voorbereiding van een collectie Cage
- Verdoven jonge, vruchtbare vliegen met CO 2. Transfer verdoofde vliegt naar een kooi. Om optimale opbrengst te verkrijgen, gebruik 100-120 volwassen vliegen variëren van 2-7 dagen oud op een 4: 1 verhouding vrouwtjes mannetjes. Laat vliegt een passende acclimatiseringsperiode, ~ 24 uur voorafgaand aan het verkrijgen monster voor fixatie. Als de kooi werd opgezet met maagdelijke vrouwtjes gepaard met mannen, een gebruik van een 36 - hr acclimatiseringsperiode 48.
- Aan het open uiteinde van de kooi, plaats een voorbereide appelsap agarplaat met een dime-sized druppel gistpasta in het midden over de opening van de kooi. Dan, stevig met tape. Dicht de kruising tussen de appelsap agar plaat en de kooi met Parafilm.
- Plaats de kooi in een secundaire container met appelsap agar plaat als de basis en laat de vliegen te reproduceren bij een bepaalde temperatuur gedurende een passende periode van tijd, zoals bepaald door het experiment.
Opmerking: Monsterneming keer will variëren. Bijvoorbeeld, bij het verzamelen late stadium embryo / vroege L1 larven (17-24 uur), laten vliegen eieren op appelsap agarplaten gelegd voor 7 uur bij 25 ° C vóór veroudering van het monster gedurende 17 uur bij 25 ° C. Ook voor een verzameling van larven mid-late eerste instar (36-48 uur) laten vliegen eieren leggen gedurende 12 uur bij 25 ° C vóór veroudering van het monster gedurende 36 uur bij 25 ° C. - Zodra de tijd is voltooid, tikt u op de kooi op een tafel, zodat vliegen vallen weg van de appelsap agarplaat zonder verdoving. Sluit meteen de gebruikte plaat met een verse met een druppel gistpasta. Bevestig de verse plaat met tape en parafilm en bewaar de kooi met appelsap agar plaat als basis.
- Verwijder de gist daling van de gebruikte plaat met een metalen spatel voorzichtig. Plaats het deksel op de gebruikte appelsap plaat en laat gelegd embryo's leeftijd als experimenteel nodig.
Opmerking: Tijdens het verouderingsproces monsters, kunnen de platen bij 25 ° C worden bewaard, tenzij hogere temperaturen zijn experimenlly vereist. Voorbeelden van hoe embryo's voor de collectie zijn hierboven beschreven ouder (zie toelichting voor stap 1.3). Verwijdering van gist deeg voorafgaand aan veroudering proeven uitgevoerd om de larven te voorkomen kruipen in de gist en het opbreken van de agar eronder. De resterende appelsap agar en gist Lijmresten voedingsstoffen voor larvale groei. Terwijl rechtstreeks volgens de gistpasta embryo verloren gaan gistpasta verwijderen, dit verlies de voorkeur gist en agar residu in het monster die kleuring efficiëntie verminderen. Indien men kiezen de gistpasta niet te verwijderen, kan gist worden vloeibaar gemaakt met fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx), gemengd met een kwast en daarna uit het monster met een cel zeef voor fixatie.
2 Fixatie
- Eenmaal gelegd op de appelsap agarplaat's naar de gewenste tijdstip zijn gerijpt, met een kleine penseel bevochtigd met fosfaatbuffer Triton X-100 (PBTx) oplossing om zorgvuldig uit th verwijderen monstere plate.
Opmerking: Oudere larven zijn mobiel en kan kruipen naar de binnenkant van het deksel. Dit monster kan op dezelfde manier worden verzameld door het verwijderen met een penseel. - Veeg de sample-beladen penseel tegen de binnenkant gerichte nok van een cel zeef. Daarna spoel de muren van de zeef en de penseel met een spuit fles met PBTx oplossing. Plaats een petrischaal deksel onder de zeef om de PBTx oplossing vast te leggen.
- Na al het monster is overgedragen aan de zeef, giet genoeg PBTx in de zeef om het monster uit het gaas te verhogen. Til de zeef en giet de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container.
- Herhaal stap 2.3 drie keer om gist te verwijderen en vliegen afval die mogelijk zijn overgedragen, samen met het monster.
- Giet genoeg 50% bleekwater (NaOCl) / water (DDH 2 O) oplossing in de zeef om de larven van de maas te tillen. Laat larven zitten in oplossing gedurende 5 minuten. Til de zeef en giet thij de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container.
Opmerking: Bleach is alleen nodig in embryonale samples 0 t - 22 uur teneinde het chorion membraan te verwijderen. De toepassing van bleekwater om oudere monsters kunnen worden weggelaten, maar de opname is niet schadelijk. Als omissie is gewenst, vervang het bleekmiddel in deze stap met PBTx. Verdund bleekwater moet worden gebruikt binnen 24 uur van de oplossing voorbereiding. - Was monster in de zeef met PBTx door gieten genoeg PBTx in de zeef om het monster uit het gaas verhogen. Laat monster te zitten in oplossing voor 3 minuten. Til de zeef en giet de inhoud van de petrischaal in een vloeibaar afval container.
- Herhaal stap 2.6 vijf keer.
- Dep de onderkant van de cel zeef droog, daarna monster over in een scintillatieflesje met 1,75 ml PEMS oplossing met behulp van een penseel.
- Werken in een geventileerde zuurkast, voeg 250 ul van 37% formaldehyde en 8 ml van reagenskwaliteit heptaan de scintillatieflesje.
- Laat het flesje te schudden bij 200 rpm of soortgelijke matige snelheid gedurende 20 minuten.
- Voeg 10 ml methanol scintillatieflesje zonder de voorafgaande waterfase en laat de flacon krachtig schudden bij 500 rpm gedurende 1 minuut.
Opmerking: Methanol is gevaarlijk. Blijven werken in een geventileerde zuurkast en draag geschikte handschoenen. - Verwijder de flacon uit shaker en giet onmiddellijk inhoud in een cel zeef boven een vloeibaar afval container in de kap. Voeg extra methanol aan de flacon en lopen door de cel zeef als nodig is om ervoor te zorgen alle monster is genomen.
Opmerking: Cell filters kan langzaam leeglopen. Om dit te verhelpen, drukt een laboratorium weefsel onderaan de cel zeef om de oplossing door de zeef sneller trekken. Methanol moet formaldehyde en heptaan zijnopgeslagen in daarvoor bestemde containers tot het weggooien volgens de institutionele richtlijnen. - Droge bodem van cel zeef met een klinisch weefsel vervolgens een penseel monster meegenomen in de zeef overbrengen naar een 1,5 ml microcentrifugebuis met 0,5 ml methanol.
Opmerking: Als er meerdere scintillatieflesjes in gebruik zijn, voert u stap 2.12 en 2.13 een flesje op een moment om monster te voorkomen uitdrogen op mobiele filters. - Nadat het monster is toegevoegd aan de microcentrifugebuis verwijderen methanol met een pipet. Zorgen monster is neergedaald op de bodem van de buis.
- Spoel monster in de microcentrifugebuis door toevoeging van ongeveer 0,5 ml methanol buis. Wachten voor het monster om vervolgens genoegen te verwijderen methanol met een pipet.
- Herhaal stap 15 drie keer.
- Voeg 0,5 ml methanol aan de buis, en vervolgens op te slaan in een -20 ° C vriezer voor later gebruik.
3 Rehydratie en Voorbereiding van de Steekproef voor Immunokleuring
- Verwijder methanol uit de microcentrifugebuis met een pipet, waardoor het monster in de buis. Store methanol afval naar de daarvoor bestemde container op het moment van weggooien.
Opmerking: sonicatie efficiëntie, gebruik niet meer dan 3 mm monster zich op de bodem van 1,5 ml microcentrifugebuis. Excess monster worden overgebracht naar een afzonderlijke buis met een pipet, alvorens met de rehydratatietrap hierboven. Het snijden van de pipetpunt met een schone scheermesje kunnen worden gebruikt om verstopping van de pipetpunt voorkomen. - Voeg 1,0 ml van een 50% methanol / fosfaatbuffer Tween (PBTw) oplossing aan de buis en rock gedurende 3 minuten.
- Verwijder methanol oplossing voor de juiste afvalbak en spoel af met 1,0 pi PBTw tweemaal. Na elke spoeling de sample te regelen vóór het tekenen van de PBTw met een pipet.
- Voeg 1,0 ml van Bovine serum albumine / fosfaat gebufferde Tween (BBTw) mixen om de flacon en rock. Na 3 min op een rocker, laat de sample om zich te vestigen en te verwijderen van de BBTw met pipet.
- Herhaal stap 3.4 tweemaal zorg zoveel BBTw mogelijk verwijderen zonder na de laatste wasbeurt verlies monster.
- Voeg 0,5 ml van BBTw aan de buis en plaats de buis op ijs.
4 Sonicatie van Monster
- Stel de sonicator tot 10% maximale amplitude en wijst een looptijd van 2 sec constant geluidsgolven.
Opmerking: Deze instellingen zijn specifiek voor de in de materialen en apparatuur Tabel sonicator en kan optimalisatie voor verschillende sonicators vereisen. - Voorafgaand aan ultrasoonapparaat van het monster, het reinigen van de sonicator sonde door het plaatsen van de sonde in een 50 ml conische buis gevuld met gedemineraliseerd water en run sonicator om de sonde te reinigen. Droog sonicator sonde met laboratorium weefsel na run.
- Dompel de sonde in de microcentrifugebuis bevattende monster zodat het zich ongeveer 3-4 mm boven het monster en begin sonicatie.
- Verwijder de microcentrifuge buis en plaats op ijs gedurende ten minste 30 seconden om warmte van sonificatie en laat monster bezinken op de bodem van de microcentrifugebuis.
- Herhaal de stappen 4.3 en 4.4 als nodig is gebaseerd op leeftijd monster wordt verwerkt.
Opmerking: Voor een optimale sonicatiebuffer monstervolume, embryo's die jonger zijn dan 17 uur hoeft geluidsgolven niet nodig, maar die tussen 17 en 24 uur (stadium 17 / vroege-L1) vereisen twee sonications. Larven tussen de 24 - 36 (vroege / midden-L1), 36-48 (half / eind-L1), 48 - 60 (vroege / midden-L2), 60-72 (half / eind-L2), 72-84 ( begin-L3), 84-96 (vroege / mid-L3), 96-108 (mid / late-L3) hr vereisen 5, 9, 11, 13, respectievelijk 15, 18 en 22 sonications. Zie de bespreking voor het verder uitwerken van geluidsgolven tijden. - Spoelen met 1,0 ml BBTw tweemaal. Na elke spoeling laat het monster te regelen alvorens af BBTw met een pipet.
- Voeg 1,0 ml van BBTw aan de flacon en rock. Na 3 min op de wip, het monster op te lossen en te verwijderen van de BBTw met pipet. </ Li>
- Herhaal stap 4.7 twee keer.
5 Immunokleuring
- Blokkeer monster door toevoeging van 5% normaal serum verdund in BBTw de microcentrifugebuis. Verwijder blok na schommelen gedurende 1 uur.
Opmerking: Gebruik een normale serum van de soorten waarbij de secundaire antilichamen worden opgewekt. - Verdunnen primaire antilichamen te eigenen werken concentratie in 5% normaal serum / BBTw oplossing.
- Rock monster primaire antilichaamoplossing O / N bij 4 ° C of gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (ongeveer 22 ° C.
Opmerking: Antibody incubatie tijden en temperaturen kunnen variëren. O / N incubatie bij 4 ° C of 3 uur bij kamertemperatuur is meestal voldoende. Er kan evenwel een tweedaagse incubatie afgevend verbeteren, vooral bij oudere monsters of wanneer lage affiniteit primaire antilichamen gebruikt. Langere incubaties worden typisch uitgevoerd bij 4 ° C. Soortgelijke overwegingen moeten wordt opgenomen met secundaire antilichamen (zie 5.10). - Laat monster om zich te vestigen opbodem van microcentrifugebuis. Tap primaire antilichamen met pipet. Besparen indien gewenst antilichamen voor hergebruik.
- Spoelen met 1,0 ml van BBTw tweemaal. Na elke spoeling toe monster te regelen alvorens af BBTw met een pipet.
- Voeg 1,0 ml van BBTw aan de flacon en rock. Na 3 min op de wip, zodat monster om zich te vestigen en te verwijderen BBTw met pipet.
- Herhaal stap 5.6 vijf keer.
- Vak monster door toevoeging van 5% normaal serum / BBTw oplossing voor de microcentrifugebuis. Verwijder blok Schud gedurende 30 minuten tot 1 uur.
Noot: de extra blokkering stap is niet vereist, maar kan afgevend specifieke antilichamen te verbeteren. - Verdunnen secundaire antilichamen te eigenen werken concentratie in 5% normaal serum / BBTw oplossing.
- Wikkel microcentrifugebuis in aluminiumfolie te verminderen verkleuring door blootstelling aan licht. Rock monster secundair antilichaam oplossing 12 tot 48 uur bij 4 ° C of gedurende ten minste 3 uur bij kamertemperatuur (ongeveer 22 ° C.
- Laat monster te regelen tot de onderkant van microfugebuis. Tap secundaire antilichamen met pipet.
- Spoelen met 1,0 ml van PBTw tweemaal. Na elke spoeling toe monster te regelen vóór het tekenen van de PBTw met een pipet.
- Voeg 1,0 ml van PBTw aan de flacon en rock. Na 5 min op de wip, het monster op te lossen en te verwijderen van de PBTw met pipet.
- Herhaal stap 5.13 drie maal.
- OPTIONEEL: Voeg DAPI- verdund 1: 1.000 in PBTw. Rock monster gewikkeld in aluminiumfolie gedurende 3 minuten; verwijder vervolgens DAPI oplossing met een pipet. Spoel vijf keer met 1,0 ml van PBTw, waardoor sample te regelen voordat PBTw verwijderen met pipet.
- Toevoegen 80-100 gl 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octaan (DABCO) oplossing microcentrifugebuis en bewaar bij -20 ° C.
Opmerking: Een andere-glycerol gebaseerde anti-fade middel kan worden vervangen.
6 Analyse
- Voor de montage van monster op dia's, een extra 5 - 10 ul van DABCO / p-phenyleendiamine (PPD) antifade oplossing voor microcentrifugebuisje.
Opmerking: De steekproef kan tot dia's worden toegevoegd zonder dissectie. Monstervolume toegevoegd aan een dia varieert met dekglas grootte. Bij het pipetteren monster op dia, kan de pipet worden afgesneden met een scheermesje om monster scheren voorkomen. Het is vaak handig om monster line-up in rijen voor eenvoudige analyse. De toevoeging van PPD als extra antifade middel kan niet vereist, maar kan voorkomen fotobleken wanneer monsters worden bewaard op lange termijn. - Plaats voorzichtig glazen afdekplaat slip of een monster. Dan, veilige dekglas op zijn plaats met behulp van nagellak.
- Bekijk gemonteerde monster met behulp van fluorescentie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de werkzaamheid van sonicatie gebaseerde immunokleuring in analyse van laat-stadium embryonale en larvale weefsels in situ aantonen, werden wildtype embryo's en larven bewerkt voor immunokleuring van testes, ovaria en zenuwweefsel. Monsters werden afgebeeld via confocale microscopie en representatieve resultaten worden getoond (Figuur 1 en Figuur 2). Resultaten blijkt dat het beschreven protocol is effectief voor het visualiseren van morfologische kenmerken als individuele cellen in situ tijdens de late-embryonale tot begin / midden L3 stadia van Drosophila ontwikkeling.
Resultaten van Testis Immunostain:
Testis ontwikkeling is een bijzonder goed systeem voor het illustreren protocol efficacy sinds teelballen rijping is dynamisch gedurende de larvale ontwikkeling. Adult Drosophila testikels vormen een opgerolde buis met een blind uiteinde, waar de kiembaan stamcellen (GSC) niche ligt (zie 13,14 voor reviews). In deze niche, zijn GSCs gekleed rond een strakke cluster van niet-mitotische somatische cellen genaamd de hub. GSCs ondergaan asymmetrische delen tot GSC die verankerd blijft aan de naaf en een dochter gonialblast die weg van de stamcellen verplaatst produceren. Als gonialblast scheidt onvolledige cytoplasmatische uitbreidingen genoemd fusomes vorm verbindt de cellen in de spermatogonium. Na 4 opeenvolgende divisies, de spermatogonium initieert meiose om sperma te vormen.
Testis formatie begint met de vereniging van de primordiale kiemcellen (PGC) en somatische gonadale voorlopercellen (Sgps) tijdens de embryogenese (zie 15,16 voor reviews). Deze vereniging resulteert in de vorming van een functionele GSC niche eind embryogenese 8-10. Tegen het midden van L1, asymmetrische SGR verdeeldheid binnen de SGR niche aanleiding geven tot differentiëren spermatogonia met vertakte fusomes 9. Asymmetrische GSC divisie blijft de hele larvaleontwikkeling, resulterend in productie van extra spermatogonia en een geleidelijke verhoging van gonaden maat. Representatieve beelden van late embryonale en vroege / mid-L1, L2 en L3 testes, immunostained voor kiemcellen, hub cellen en fusomes zijn (Figuur 1A-D). Deze beelden illustreren de dynamische veranderingen in gonad grootte en kiemcel differentiatie waargenomen in testes na verloop van tijd.
Resultaten van Ovarium Immunostain:
Adult Drosophila eierstokken zijn samengesteld uit 16-20 individuele ei-producerende eenheden genaamd ovarioles (zie 17,18 voor reviews). Aan een uiteinde van elk ovariole, een structuur die het germarium bevat stamcellen. De ovariole niche is samengesteld uit ongedifferentieerde GSCs en twee populaties van somatische cellen: cap cellen en terminal filament cellen (TFS). Net als bij de testis, GSCs ondergaan asymmetrische delen tot GSC dat grenst aan de dop cellen en een onderscheidende dochter cel blijft produceren, Zogenaamde cystoblast, die weg van de nis wordt gedrukt. De cystoblast vervolgens ondergaat 4 rondes van celdeling een kiem-lijn cyste, onderling verbonden door een vertakt fusome vormen. Elke kiemlijn-cyste wordt vervolgens omgeven door follikelcellen een ei kamer die blijft rijpen omdat de lengte van de ovariole beweegt produceren.
Net als testikels, eierstokken worden eerst gevormd tijdens de embryogenese 16,18. Meerdere ovarioles ontstaan uit een embryonale gonaden uit PGC en SGPS. Door mid-L3, SGPS aanleiding geven tot TF voorlopers in de eierstok anterior, terwijl kiemcellen lokaliseren aan de eierstok posterior en associëren met SGP-afgeleide vermengd cellen (ICs) 19-22. Door de late-L3, TF cellen differentiëren en te organiseren in de stapels gevonden in de volwassen stamcellen, zijn GSC en cap cellen opgericht, en de kiem-lijn cyste differentiatie wordt waargenomen 19,20,23. Representatieve beelden van late-fase embryonale en vroege / midden-L3 eierstokken, immunostained voor kiemcellen, SGPS, IC's, TF voorlopers, en fusomes, worden getoond (Figuur 1E, F). Deze beelden tonen normale morfologie en ontwikkelingsstoornissen progressie voor hun leeftijd.
Resultaten van Neural Immunostain:
De Drosophila centrale zenuwstelsel (CNS) is afgeleid van neurale stamcellen, genaamd neuroblasts (AI's), die ontstaan uit embryonale neuroepithelium (zie 24,25 voor reviews). De AI in embryo's en larven delen asymmetrisch ganglion moedercellen (GMC) die op hun beurt genereren neuronen en gliale cellen in de volwassen hersenen en buikzenuwkoord produceren. Omdat larvale AI's geven aanleiding tot de meeste volwassen neuronen en kunnen worden onderscheiden op basis van hun positie binnen de hersenen, hebben larvale hersenen een belangrijk model voor het bestuderen NB gedrag en neurale differentiatie worden.
De L3 hersenen bestaan uit twee lobben en een centraal gelegen buikzenuwkoord 24.Representatieve beelden van mid-L3 hersenen immunostained voor NBS GMCs, ongedifferentieerde neuronen, onvolwassen en primaire neuronen en gliacellen worden getoond (Figuur 2A-C) 26-30. Deze beelden tonen een sterke kleuring in verschillende expressie-patronen in de hersenen lobben en de buikzenuwkoord. Afhankelijk van de montage oriëntatie, beeldvorming zorgt voor hersenweefsel visualisatie van het dorsale oppervlak (Figuur 2A), ventrale oppervlak (figuur 2B), of in sagittale doorsnede (figuur 2C).
Vlekken efficiëntie:
De representatieve resultaten tonen dat een ultrasoonapparaat-gebaseerde immunokleuring procedure is veelzijdig. Niet alleen kan worden gebruikt om specifieke celtypen te identificeren, maar ook kan worden gebruikt om de aanwezigheid van specifieke eiwitten en organellen geven. Echter, dubbelzinnige resultaten komen voort uit verwachte variatie in kleuring efficiëntie. Bijvoorbeeld, anti-vasa gekleurd tenminste een gonadenin 73.2% van de larven onderzocht (n = 781), terwijl anti-Elav gekleurd hersenen in 86% van de larven (n = 115). Verder zien we dat het kleuren van de efficiëntie is ruwweg omgekeerd evenredig met ontwikkelingsstadium. Eind-embryo's, anti-vasa gekleurde 89,8% van de geslachtsklieren (n = 206), terwijl kleuring aanwezig was slechts 59,8% en 46,9% van de larven in L2 en L3 mid-respectievelijk (n = 132 en 49). Bovendien sonicatie resultaten in verlies van monster. Wanneer het aantal embryo's en larven aanwezig in een optimale sonicatie monstervolume werd geteld voor en na sonicatie werd gemiddeld 41,0% van het monster bepaald ongeschikt voor analyse (n = 1165). Om maximale vlekken doeltreffendheid moeten protocols worden geoptimaliseerd voor specifieke antilichamen door het veranderen gepubliceerd concentraties antilichaam of antilichaam incubatietijden.
Figuur 1 I. mmunostain van Drosophila geslachtsklieren in situ (AD) Beelden van de testes in situ in een laat stadium van embryo's (stadium 17 / vroege-L1) tot begin / midden-L3 larven immunostained met anti-Vasa (AD, rood, A'-D ' alleen) aan kiemcellen, anti-Fasicilin III (Fas III) en anti-1B1 (AD, groene sporen; A '' - D 'alleen') naar hub cellen en fusomes respectievelijk detecteren, en DAPI (AD, blauw; A ' ''-d '' 'alleen) om de kernen te detecteren. (A) Stage 17 / begin L1 testis toont de onlangs samengevoegd hub en sferische fusomes in ongedifferentieerde kiemcellen. (B) Vroeg / mid-L1 testis toont sferische fusomes in GSCs gelokaliseerde in de buurt van de hub en in sommige posterior kiemcellen langwerpig fusomes indicatief vroege spermatogonial differentiatie. (C) Vroeg / mid-L2 en
Figuur 2 Immunostain van Drosophila zenuwweefsel in situ. Vroege / mid-L3 larven immunostained met anti-Elav (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol verschaft een werkwijze succesvol immunostain richten Drosophila embryonale en larvale weefsels in situ, waardoor de noodzaak voor dissectie. Als per eerdere protocollen voor het kleuren van de vroege embryo's 1,2,3, is het chorion membraan verwijderd met behulp van 50% bleekwater (NaOCl). Monsters worden gefixeerd in formaldehyde en methanol. Omdat de larvale cuticula veroorzaakt oudere monster drijven, wordt het gehele monster vervolgens door een cel-zeef om larvale retentie waarborgen. Sample is opgeslagen, desgewenst in chemische kwaliteit methanol. Na rehydratie, een goed uitgevoerd sonicatie proces verstoort de integriteit van de larvale cuticula. Dit is essentieel na cuticula vorming tijdig voldoende permeatie van antilichamen die voor immunokleuring. Voor het aanbrengen van antilichamen, het schommelen van het monster in een 5% normaal serum / BBTw oplossing voorkomt een overmatig niet-specifieke binding van antilichaam. Primaire antilichamen worden vervolgens aan specifieke eiwitten expres detecterensed in het doelweefsel. Na wassen om niet gebonden primaire antilichamen te verwijderen, worden secundaire antilichamen gebonden aan fluoroforen gebruikt om de locatie van het gebonden primaire antilichamen te markeren. Analyse kan dan worden uitgevoerd met epifluorescentie of confocale microscopie.
Sommige wijzigingen kunnen nodig zijn om de resultaten in de individuele omstandigheden te optimaliseren. In het bijzonder kunnen sonicatie kracht en het aantal sonications uitgevoerd worden afgesteld afhankelijk van de gebruikte sonicator. Aanpassingen aan de hoogte van de sonicator probe boven het monster alsook oplossingsvolume kan ook nodig voor verschillende sonicators of indien voldoende monster niet worden verkregen. Verhoogde oplossing troebelheid kan worden gebruikt als indicator van weefsel lysis en verschaft derhalve een graadmeter voor als sonicatie veel trilt. Als oplossing troebelheid hoog wordt, moet de onderzoeker overwegen het verminderen van het aantal sonications uitgevoerd, verhogen oplossing volume, het verhogen van de hoogte van de sonicator probe boven het monster en / of vermindering sonicator vermogen.
Wijzigingen kunnen ook nodig zijn in de immunostaining protocol om de beeldkwaliteit te verbeteren. Zoals bij de meeste immunokleuring procedures de signaal-ruisverhouding kan worden veranderd door aanpassing antilichaam verdunning en temperatuur antilichaam incubatie met monster, en / of blokkerende reagentia gebruikt. Terwijl elk antilichaam zelfstandig moet worden beschouwd, in het bijzonder met betrekking tot antilichaamverdunning, vinden we dat incubatie bij 4 ° C voor langere perioden afgevend na sonicatie kan verbeteren, vooral voor antilichamen met een lage signaal-ruis verhouding en wanneer oudere larven worden onderzocht. In die gevallen kan afgevend ook profiteren van een lichte daling van de secundaire antilichaam verdunning. In dit protocol, we zowel BSA en serum als blokkerende reagentia en het monster voorafgaand opnieuw geblokkeerd toevoeging van secundaire antilichamen om kleurafgevend verhogen. Afhankelijk van de antilichamen gebruiktd, re-blocking en integratie van zowel het blokkeren van reagentia kan wel of niet worden verplicht om vlekken te verbeteren. Indien de re-blokkerende stap wordt weggelaten, kan langer wast en meer spoelingen schoner beelden te produceren. Tenslotte kan pre-absorberende polyklonale antilichamen de signaal-ruisverhouding te verhogen. Pre-absorptie wordt uitgevoerd door incuberen van het gewenste antilichaam met gerehydrateerd embryo's of larven vóór gebruik in een immunostain 1.
Zoals aangetoond in onze representatieve resultaten, geluidsgolven zorgt voor duidelijke visualisatie van doelwitweefsels in situ en geeft dus een redelijk alternatief voor weefsel dissectie in immunostaining protocollen. Dissectie kan omslachtig in Drosophila embryo's en larven zijn als gevolg van moeilijkheden bij het lokaliseren, isoleren, en het extraheren onbeschadigd doelwitweefsels. Afwisselend sonicatie laat weefsels in de context van het gehele organisme te blijven. Omdat geluidsgolven vermijdt uitpakken en monteren van weefsels tussen een glijbaan en een cover slip is beter behoudt in situ morfologie. Praktisch, kan grote hoeveelheden staal sneller voor toekomstige analyse verwerkt, omdat veel organismen gelijktijdig kunnen gesonificeerd.
Hoewel soniceren biedt een geweldig alternatief voor dissectie, het heeft beperkingen die moeten worden overwogen. Sonicatie gunstig verstoort de integriteit van de larvale cuticula maar vernietigt enkele voorbeelden in het proces (zie Representatieve resultaten). Spoelen aan biologische resten te verwijderen is vereist na de geluidsgolven proces, dat steekproefgrootte verder kunnen verlagen. Bovendien immunokleuring gehele embryo's en larven laat het weefsel plaats ingebed in de omringende weefsels. Deze omliggende weefsels kan positief of vlekken vertonen niet-specifieke antilichaam binden, waardoor uiteindelijke beeldkwaliteit verminderen. Tenslotte kleuring efficiëntie kan variabel zijn. Deze variabiliteit kan afhangen van de leeftijd van het monster, sonificatie werkzaamheid en antilichaamspecificiteit. Hierdoor sonicatie-based immunostaining van whole-mount weefsel kan niet altijd de voorkeur. In het bijzonder kan-dissectie gebaseerd immunostaining efficiënter zijn bij het bestuderen van grote weefsels in late-L3 larven. Bovendien kunnen geluidsgolven vroeg-en midden-stadium embryo's te scheren. Ondanks deze beperkingen,-geluidsgolven gebaseerde immunostaining is een zeer efficiënte techniek die goed geschikt is voor het analyseren van de ontwikkeling van een verscheidenheid van weefsels in een laat stadium van embryo's door middel van vroege / midden-L3 larven. In ons lab, dit protocol gebruiken we regelmatig om gonad morfogenese studeren in Drosophila embryo's en larven 9,10. Verder verwachten wij dat de uitvoering van dit protocol even vruchtbaar in het bestuderen van de ontwikkeling van andere weefsels in Drosophila en in andere organismen zal blijken met een beschermende cuticula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Ruth Lehman en Dorthea Godt die zo vriendelijk geleverd Vasa en Traffic Jam antilichamen. We willen graag de Bloomington Stock Center aan de Universiteit van Indiana erkennen voor het onderhoud van de voorraden en de Developmental Studies Hybridoma Bank ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa. Wij danken alle leden van de Wawersik lab voor hun advies en ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de Monroe Scholars Program Grant (naar AF en LB) en NSF verlenen IOS0823151 (op MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
