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Biology

देर चरण भ्रूण और लार्वा के sonication-मदद की immunofluorescence धुंधला Published: August 14, 2014 doi: 10.3791/51528
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biology, College of William & Mary
* These authors contributed equally

Abstract

ड्रोसोफिला में प्रदर्शन अध्ययन भ्रूण और लार्वा ऐसे सेल भाग्य विनिर्देश और जीवोत्पत्ति के रूप में विकास की प्रक्रिया में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान मेलानोगास्टर. Immunostaining ऊतकों और अंगों के विकास के दृश्य के लिए अनुमति देता है. हालांकि, embryogenesis के अंत में है कि रूपों एक सुरक्षात्मक छल्ली देर चरण भ्रूण और लार्वा में एंटीबॉडी के पारगमन को रोकता है. Immunostaining से पहले विच्छेदन नियमित ड्रोसोफिला लार्वा ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है जबकि छोटे ऊतकों का पता लगाने और अलग करने के लिए मुश्किल हो सकता है, क्योंकि यह कुछ विश्लेषण के लिए अक्षम साबित होता है. Sonication लार्वा ड्रोसोफिला immunostaining प्रोटोकॉल में विच्छेदन के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. यह देर चरण भ्रूण और लार्वा की बड़ी संख्या के त्वरित, एक साथ प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है और सीटू आकारिकी में रखता है. Formaldehyde में निर्धारण के बाद, एक नमूना sonicated है. नमूना तो प्रतिजन विशेष प्राथमिक चींटी साथ immunostaining के अधीन हैibodies और fluorescently लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से लक्ष्य प्रकार की कोशिकाओं और विशिष्ट प्रोटीन कल्पना करने के लिए. Sonication की प्रक्रिया के दौरान, नमूना ऊपर एक sonicating जांच, साथ ही sonication की अवधि और तीव्रता के उचित स्थान के लिए महत्वपूर्ण है. मानक immunostaining प्रोटोकॉल के लिए अतिरिक्त मामूली संशोधनों उच्च गुणवत्ता दाग के लिए आवश्यक हो सकता है. शोर अनुपात को कम संकेत के साथ एंटीबॉडी के लिए, अब ऊष्मायन बार आम तौर पर आवश्यक हैं. इस sonication-मदद की प्रोटोकॉल के लिए अवधारणा के एक सबूत के रूप में, हम विकास के चरणों की एक श्रृंखला में तीन प्रकार के ऊतकों (वृषण, अंडाशय, और तंत्रिका ऊतकों) की immunostains दिखा.

Introduction

ड्रोसोफिला भ्रूण और लार्वा कई अंगों और ऊतकों में विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करते हैं. व्यक्ति की कोशिकाओं की इमेजिंग कोशिकाओं का विकास में जो परिसर के वातावरण का पता लगाने के क्रम में इन अध्ययनों में अक्सर आवश्यक है. ऊतकों में कोशिकाओं के दृश्य immunostaining के माध्यम से पूरा किया जा सकता है. प्रोटोकॉल 17 घंटा अंडा बिछाने (AEL) 1-3 के बाद भ्रूण ड्रोसोफिला ऊतकों <के लिए मौजूद immunostaining अच्छी तरह से वर्णित. प्रभावी एंटीबॉडी पारगमन को रोकने embryogenesis के अंत की ओर हालांकि, एक सुरक्षात्मक छल्ली रूपों,. इस प्रकार, इन immunostaining प्रोटोकॉल देर चरण भ्रूण में ऊतकों के विश्लेषण में और लार्वा विकास (1 सेंट instar (एल 1), 2 एन डी instar (एल 2), और 3 instar (L3)) के बाद के चरणों में अक्षम हैं. इस अक्षमता इस विस्तारित विकासात्मक अवधि 4 के दौरान हो कि गतिशील प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ के लिए एक बाधा लगाता है. TISSUE विच्छेदन इस बाधा 5-7 नाकाम करने के लिए एक व्यापक रूप से कार्यरत तकनीक है. हालांकि, विच्छेदन अक्षम साबित हो सकता है. निष्कर्षण लगाने या भ्रूण और लार्वा ऊतकों को अलग करने में कठिनाई से भारग्रस्त किया जा सकता है. इसके अलावा, लक्ष्य ऊतकों के भौतिक हटाने उन्हें rupturing द्वारा या उनकी संपूर्णता में उन्हें निकालने में नाकाम रहने से नुकसान का कारण बन सकता है.

Sonication intermolecular बातचीत परेशान करने के लिए ध्वनि तरंगों को रोजगार कि एक विधि है. यह तंत्रिका कोशिका प्रकार 6 विकासशील immunostain के क्रम में ड्रोसोफिला लार्वा छल्ली की अखंडता को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल देर चरण भ्रूण और व्यास 8-10 में 50μm के रूप में छोटे रूप में हो सकता है जो लार्वा gonads, immunostain के लिए अनुकूलित किया गया है. इस तरह के अध्ययन के माध्यम से, पुरुष germline स्टेम सेल (GSC) आला गठन की प्रक्रिया अंतिम चरण में बताया गया है स्टेम सेल के विकास और अलग विनियमित करने ड्रोसोफिला भ्रूण 8-10 और तंत्रदेर चरण भ्रूण gonads और लार्वा में ferentiation 9-12 elucidated किया गया है. इस प्रकार, sonication क्योंकि ऊतक आकार के लिए मुश्किल हो सकता है कि ऊतक विच्छेदन के लिए एक कारगर विकल्प प्रदान करता है. इसके अलावा, यह पूरे जीव के संदर्भ में कोशिकाओं को छोड़ने और सीटू आकारिकी में बनाए रखने, बगल में ड्रोसोफिला ऊतकों के immunostaining सक्षम बनाता है. यहाँ, हम बगल में जल्दी / मध्य L3 ऊतकों के माध्यम से देर चरण भ्रूण के प्रतिदीप्ति immunostaining के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन. ड्रोसोफिला जननांगों और तंत्रिका ऊतक के विश्लेषण से इस प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता प्रदर्शित करने के लिए प्रतिनिधि परिणाम में दिखाया गया है. इसके अलावा, इस immunostaining प्रोटोकॉल एक बाहरी छल्ली साथ अन्य जीवों में अन्य ड्रोसोफिला ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Protocol

एक संग्रह केज की 1. तैयारी

  1. सीओ 2 के साथ युवा, उपजाऊ मक्खियों anesthetize. एक पिंजरे में anesthetized मक्खियों स्थानांतरण. , इष्टतम उपज प्राप्त एक 4 पर उम्र के 2-7 दिन से लेकर 100-120 वयस्क मक्खियों का उपयोग करने के लिए: पुरुषों के लिए महिलाओं की 1 अनुपात. मक्खियों एक उपयुक्त दशानुकूलन अवधि की अनुमति दें, ~ 24 घंटा निर्धारण के लिए नमूना प्राप्त करने के लिए पहले. 48 घंटा दशानुकूलन अवधि - पिंजरे कुंवारी महिलाओं के साथ स्थापित किया गया था, तो पुरुषों के लिए एक प्रयोग एक 36 mated.
  2. पिंजरे के खुले अंत में, पिंजरे के उद्घाटन पर केंद्र में खमीर पेस्ट की एक सिक्के के आकार बूंद के साथ एक पूर्व तैयार सेब का रस अगर प्लेट जगह है. फिर, टेप के साथ सुरक्षित है. सेब का रस अगर प्लेट और parafilm साथ पिंजरे के बीच जंक्शन सील.
  3. आधार के रूप में सेब का रस अगर प्लेट के साथ एक माध्यमिक कंटेनर में पिंजरे प्लेस और प्रयोग द्वारा निर्धारित मक्खियों समय का एक उचित अवधि के लिए एक निर्धारित तापमान पर पुन: पेश करने की अनुमति है.
    नोट: नमूना संग्रह टाइम्स वाईभिन्न हो जाएगा. देर चरण भ्रूण / जल्दी एल 1 लार्वा एकत्रित करते हैं, उदाहरण के लिए, (17-24 घंटा), मक्खियों 25 डिग्री सेल्सियस पर 17 घंटे के लिए पूर्व नमूना की उम्र बढ़ने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 7 घंटे के लिए सेब का रस अगर प्लेटों पर अंडे देना करने की अनुमति. इसी तरह, मध्य देर पहले instar लार्वा का एक संग्रह के लिए (36 - 48 घंटे) मक्खियों 25 डिग्री सेल्सियस पर 36 घंटे के लिए पूर्व नमूना की उम्र बढ़ने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए अंडे देना करने की अनुमति.
  4. समय अवधि पूरी होने पर मक्खियों संज्ञाहरण के बिना दूर सेब का रस अगर थाली से ड्रॉप, ताकि एक मेज पर पिंजरे टैप करें. जल्दी खमीर पेस्ट की एक बूंद से युक्त एक ताजा एक साथ इस्तेमाल किया प्लेट की जगह. टेप और parafilm के साथ ताजा प्लेट को सुरक्षित और आधार के रूप में सेब का रस अगर प्लेट के साथ पिंजरे की दुकान.
  5. ध्यान से एक धातु रंग के साथ खेतों में थाली से खमीर बूंद को हटा दें. प्रयोगात्मक यदि आवश्यक जगह इस्तेमाल किया सेब का रस प्लेट पर ढक्कन और उम्र के लिए भ्रूण रखी अनुमति देते हैं.
    नोट: नमूने उम्र बढ़ने जबकि, प्लेटें 25 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है उच्च तापमान experimenta हैं जब तकlly की आवश्यकता है. ऊपर वर्णित हैं संग्रह के लिए भ्रूण उम्र तक के उदाहरण (1.3 चरण के लिए नोट देखें). उम्र बढ़ने के नमूने के लिए पूर्व खमीर पेस्ट का हटाया खमीर में रेंगने और नीचे अगर तोड़ने से लार्वा को रोकने के लिए किया जाता है. शेष सेब का रस अगर और खमीर पेस्ट अवशेषों लार्वा विकास के लिए पोषक तत्वों प्रदान करते हैं. खमीर पेस्ट में सीधे रखी भ्रूण खमीर पेस्ट को हटाने के माध्यम से खो रहे हैं, वहीं इस नुकसान धुंधला क्षमता को कम कर सकते हैं कि नमूने में खमीर और अगर अवशेषों के लिए बेहतर है. एक खमीर पेस्ट दूर करने के लिए नहीं चुनना चाहिए, खमीर एक पेंट ब्रश के साथ मिश्रित, फास्फेट बफर ट्राइटन X-100 (PBTx) के साथ तरलीकृत, और उसके बाद पूर्व निर्धारण करने के लिए एक सेल झरनी के साथ नमूना से हटाया जा सकता है.

2 फिक्सेशन

  1. सेब का रस अगर प्लेट पर रखी भ्रूण वांछित समय बात करने के लिए आयु वर्ग के जाने के बाद, ध्यान से वें से नमूना दूर करने के लिए फास्फेट बफर ट्राइटन X-100 (PBTx) समाधान के साथ गीला एक छोटे तूलिका का उपयोगई प्लेट.
    नोट: पुराने लार्वा मोबाइल हैं और ढक्कन के अंदर पर क्रॉल कर सकते हैं. यह नमूना एक तूलिका के साथ हटाने के द्वारा इसी प्रकार एकत्र किया जा सकता है.
  2. एक सेल झरनी के इंटीरियर का सामना करना पड़ रिज के खिलाफ नमूना लदी तूलिका साफ कर लें. फिर, झरनी की दीवारों और PBTx समाधान युक्त एक धार की बोतल के साथ तूलिका कुल्ला. PBTx समाधान पर कब्जा करने झरनी के नीचे एक पेट्री डिश कवर रखें.
  3. सभी नमूना छलनी करने के लिए स्थानांतरित किया गया है, के बाद जाल बंद नमूना जुटाने की छलनी में पर्याप्त PBTx डालना. फिर, झरनी उठा और एक तरल अपशिष्ट कंटेनर में पेट्री डिश की सामग्री डाल.
  4. दोहराने कदम 2.3 तीन बार खमीर को हटाने और नमूने के साथ तबादला किया गया है कि हो सकता है बेकार उड़ान भरने के लिए.
  5. मेष लार्वा बंद जुटाने के लिए पर्याप्त 50% ब्लीच झरनी में (NaOCl) / पानी (DDH 2 हे) समाधान डालो. लार्वा 5 मिनट के लिए समाधान में बैठने की अनुमति. फिर, झरनी उठा और टी उंडेलवह एक तरल अपशिष्ट कंटेनर में पेट्री डिश की सामग्री.
    नोट: - कोरियोनिक झिल्ली को दूर करने के क्रम में 22 घंटा ब्लीच केवल 0 वृद्ध भ्रूण नमूनों में आवश्यक है. पुराने नमूनों के लिए ब्लीच का आवेदन छोड़ा जा सकता है, लेकिन इसके शामिल किए जाने के लिए हानिकारक नहीं है. चूक वांछित है, PBTx साथ इस चरण में ब्लीच की जगह. पतला ब्लीच समाधान तैयारी के 24 घंटे के भीतर किया जाना चाहिए.
  6. जाल से दूर नमूना जुटाने की छलनी में पर्याप्त PBTx गिरने से PBTx साथ झरनी में नमूना धो लें. नमूना 3 मिनट के लिए समाधान में बैठने की अनुमति. फिर, झरनी उठा और एक तरल अपशिष्ट कंटेनर में पेट्री डिश की सामग्री डाल.
  7. दोहराने कदम 2.6 पांच बार.
  8. सेल झरनी सूखे के नीचे थपका, तो एक तूलिका का उपयोग PEMS समाधान की 1.75 मिलीग्राम से युक्त एक जगमगाहट शीशी में नमूना हस्तांतरण.
  9. एक हवादार धूआं हुड में काम करते हुए, 37% formaldehyde के 250 μl और जगमगाहट शीशी अभिकर्मक ग्रेड हेपटैन के 8 मिलीलीटर जोड़ें.
  10. शीशी 200 आरपीएम या 20 मिनट के लिए एक समान मध्यम गति से हिला करने की अनुमति दें.
  11. पिछले जलीय चरण को हटाने के बिना जगमगाहट शीशी मेथनॉल के 10 एमएल जोड़ें और शीशी 1 मिनट के लिए 500 rpm पर सख्ती शेक करने के लिए अनुमति देते हैं.
    नोट: मेथनॉल खतरनाक है. एक हवादार धूआं हुड में काम करते हैं और उपयुक्त दस्ताने पहनने के लिए जारी.
  12. हुड में एक तरल अपशिष्ट कंटेनर पर एक सेल झरनी में सामग्री डाल तुरंत प्रकार के बरतन से शीशी निकालें और. शीशी के लिए अतिरिक्त मेथनॉल जोड़ें और सभी नमूना हटा दिया गया है यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक के रूप में सेल झरनी के माध्यम से चलाते हैं.
    नोट: सेल strainers धीरे धीरे ख़त्म कर सकता है. इसके उपचार के लिए और अधिक तेजी से छलनी के माध्यम से समाधान आकर्षित करने के क्रम में सेल झरनी के नीचे करने के लिए एक प्रयोगशाला ऊतक स्पर्श. मेथनॉल, formaldehyde, और हेपटैन होना चाहिएसंस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार उचित निपटान तक उचित अपशिष्ट कंटेनर में संग्रहित.
  13. एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग सेल झरनी के सूखे तल, तो मेथनॉल के 0.5 मिलीलीटर युक्त एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब झरनी में कब्जा नमूना स्थानांतरित करने के लिए एक तूलिका का उपयोग करें.
    नोट: कई जगमगाहट शीशियों उपयोग में हैं, तो पूरा चरणों 2.12 और एक समय पर 2.13 एक शीशी सेल strainers पर सुखाने से नमूना रोकने के लिए.
  14. नमूना microcentrifuge ट्यूब में जोड़ा गया है एक बार, एक विंदुक के साथ मेथनॉल हटा दें. सुनिश्चित नमूना ट्यूब के नीचे बसे है.
  15. ट्यूब मेथनॉल के लगभग 0.5 मिलीलीटर जोड़कर microcentrifuge ट्यूब में नमूना कुल्ला. तो बसा एक विंदुक के साथ मेथनॉल हटाने के लिए नमूने के लिए प्रतीक्षा करें.
  16. दोहराएँ चरण 15 तीन बार.
  17. एक में ट्यूब मेथनॉल के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और फिर दुकान -20 बाद में उपयोग के लिए सेल्सियस फ्रीजर.

3 रिहाइड्रेशन और immunostaining के लिए नमूना तैयार करना

  1. ट्यूब में नमूना छोड़ने, एक विंदुक के साथ microcentrifuge ट्यूब से मेथनॉल निकालें. उचित निपटान के समय तक उचित अपशिष्ट कंटेनर को स्टोर मेथनॉल बेकार.
    , Sonication दक्षता बढ़ाने के लिए नमूना का कोई अधिक से अधिक 3 मिमी 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के नीचे बसे उपयोग करें: ध्यान दें. अतिरिक्त नमूना ऊपर पुनर्जलीकरण कदम की शुरुआत से पहले एक विंदुक के साथ एक अलग ट्यूब को हस्तांतरित किया जा सकता है. एक स्वच्छ धार के साथ विंदुक टिप काटना पिपेट टिप के clogging रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. 3 मिनट के लिए ट्यूब और रॉक करने के लिए एक 50% मेथनॉल / फास्फेट बफर बीच (PBTw) समाधान के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें.
  3. उचित अपशिष्ट कंटेनर को मेथनॉल समाधान निकालें और दो बार PBTw के 1.0 μl से कुल्ला. प्रत्येक कुल्ला के बाद, नमूना एक विंदुक के साथ PBTw बंद ड्राइंग से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. गोजातीय सीरम albumin / बफर फॉस्फेट बीच (BBTw) के 1.0 मिलीलीटर जोड़ें शीशी और रॉक करने के लिए मिश्रण. एक घुमाव पर 3 मिनट के बाद, samp की अनुमतिLe व्यवस्थित और पिपेट साथ BBTw दूर करने के लिए.
  5. दोहराने कदम पिछले धोने के बाद नमूना खोने के बिना संभव के रूप में ज्यादा BBTw को दूर करने के ख्याल रख 3.4 दो बार.
  6. ट्यूब BBTw के 0.5 मिलीलीटर जोड़ने और बर्फ पर ट्यूब रखें.

नमूना के 4 Sonication

  1. 10% अधिकतम आयाम को sonicator सेट और 2 सेकंड लगातार sonication के एक रन के समय नामित.
    नोट: ये सेटिंग्स सामग्री और उपकरण तालिका में संकेत sonicator के लिए विशिष्ट हैं और विभिन्न sonicators के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है.
  2. पहले नमूने के sonication करने, जांच को साफ करने के लिए विआयनीकृत पानी और रन sonicator से भरा एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जांच टिप रखकर sonicator जांच साफ. चलाने के बाद प्रयोगशाला ऊतक के साथ सूखी sonicator जांच.
  3. यह नमूना ऊपर लगभग 3 से 4 मिमी तैनात है इतना है कि नमूना युक्त microcentrifuge ट्यूब में जांच डूब और sonication शुरू.
  4. एम निकालेंicrocentrifuge ट्यूब sonication से गर्मी फैलने और नमूना microcentrifuge ट्यूब के तल पर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए कम से कम 30 सेकंड के लिए बर्फ पर जगह और.
  5. दोहराएँ 4.3 और कार्रवाई की जा रही नमूना की उम्र के आधार पर जरूरत के रूप में 4.4 कदम.
    नोट: इष्टतम sonication नमूना मात्रा के लिए, sonication की आवश्यकता नहीं है छोटी से 17 घंटा भ्रूण, लेकिन उन घंटा 17 के बीच और 24 (/ 17 चरण प्रारंभिक एल 1) दो sonications की आवश्यकता है. लार्वा के बीच 24-36 (प्रारंभिक / मध्य एल 1), 36-48, (मध्य /-एल 1 देर से) 48-60 (प्रारंभिक / मध्य एल 2), 60-72 (मध्य / देर एल 2), 72-84 ( )-L3 जल्दी, 84-96 (प्रारंभिक / मध्य L3), 96-108 (मध्य / देर L3) घंटा की आवश्यकता 5, 9, 11, 13, क्रमश: 15, 18, और 22 sonications. Sonication टाइम्स पर आगे विस्तार के लिए चर्चा देखें.
  6. BBTw दो बार 1.0 मिलीलीटर के साथ कुल्ला. प्रत्येक कुल्ला करने के बाद नमूना एक विंदुक के साथ BBTw बंद ड्राइंग से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  7. शीशी और रॉक को BBTw की 1.0 मिलीलीटर जोड़ें. घुमाव पर 3 मिनट के बाद, नमूना व्यवस्थित और पिपेट साथ BBTw दूर करने के लिए अनुमति देते हैं. </ ली>
  8. दोहराने कदम 4.7 दो बार.

5 Immunostaining

  1. Microcentrifuge ट्यूब BBTw में पतला 5% सामान्य सीरम जोड़कर नमूना ब्लॉक. 1 घंटे के लिए कमाल के बाद ब्लॉक निकालें.
    नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी उत्पन्न कर रहे हैं, जिसमें प्रजातियों से सामान्य सीरम का प्रयोग करें.
  2. 5% सामान्य सीरम / BBTw समाधान में एकाग्रता काम कर उचित प्राथमिक एंटीबॉडी पतला.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर या (लगभग 22 डिग्री सेल्सियस आरटी पर कम से कम 3 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान हे में रॉक नमूना / एन.
    नोट: एंटीबॉडी ऊष्मायन समय और तापमान भिन्न हो सकते हैं. हे / आरटी पर एन 4 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन या 3 घंटा आमतौर पर पर्याप्त है. हालांकि, एक दो दिन ऊष्मायन अवधि विशेष रूप से पुराने नमूनों या कम आत्मीयता प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है जब साथ, धुंधला गुणवत्ता बढ़ाने सकता है. अब incubations आम तौर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं. माध्यमिक एंटीबॉडी (5.10 देखें) का उपयोग करते समय मिलते जुलते विचार किया जाना चाहिए.
  4. नमूना को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देंmicrofuge ट्यूब के नीचे. विंदुक के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी बंद ड्रा. अगर वांछित पुनः उपयोग के लिए एंटीबॉडी बचाओ.
  5. दो बार BBTw की 1.0 मिलीलीटर के साथ कुल्ला. प्रत्येक कुल्ला करने के बाद नमूना एक विंदुक के साथ BBTw बंद ड्राइंग से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  6. शीशी और रॉक को BBTw की 1.0 मिलीलीटर जोड़ें. घुमाव पर 3 मिनट के बाद, नमूना व्यवस्थित और पिपेट साथ BBTw दूर करने के लिए अनुमति देते हैं.
  7. दोहराने कदम 5.6 पांच बार.
  8. Microcentrifuge ट्यूब 5% सामान्य सीरम / BBTw समाधान जोड़कर ब्लॉक नमूना. 1 घंटा 30 मिनट के लिए कमाल के बाद ब्लॉक निकालें.
    इस अतिरिक्त अवरुद्ध चरण आवश्यक नहीं है, लेकिन विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए धुंधला गुणवत्ता में सुधार हो सकता है: ध्यान दें.
  9. 5% सामान्य सीरम / BBTw समाधान में एकाग्रता काम कर उचित माध्यमिक एंटीबॉडी पतला.
  10. प्रकाश जोखिम की वजह से लुप्त होती कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में microcentrifuge ट्यूब लपेटें. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे से 48 के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में या आर टी (लगभग 22 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 3 घंटे के लिए रॉक नमूना.
  11. नमूना microfuge ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें. विंदुक के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी बंद ड्रा.
  12. दो बार PBTw की 1.0 मिलीलीटर के साथ कुल्ला. प्रत्येक कुल्ला करने के बाद नमूना एक विंदुक के साथ PBTw बंद ड्राइंग से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं.
  13. शीशी और रॉक को PBTw की 1.0 मिलीलीटर जोड़ें. घुमाव पर 5 मिनट के बाद, नमूना व्यवस्थित और पिपेट साथ PBTw दूर करने के लिए अनुमति देते हैं.
  14. दोहराने कदम 5.13 तीन बार.
  15. वैकल्पिक: 1,000 PBTw में: DAPI 1 पतला जोड़ें. रॉक नमूना 3 मिनट के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे; फिर एक विंदुक के साथ DAPI समाधान निकालने. नमूना पिपेट साथ PBTw हटाने से पहले व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देता है, PBTw की 1.0 मिलीलीटर के साथ पांच बार कुल्ला.
  16. -20 डिग्री सेल्सियस पर microcentrifuge ट्यूब और स्टोर करने के लिए 1,4-diazabicyclo [2.2.2] ओकटाइन (DABCO) समाधान के 100 μl - 80 जोड़ें.
    नोट: एक और ग्लिसरॉल आधारित विरोधी फीका एजेंट के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है.

6 विश्लेषण

  1. DABCO / P-Phen के 10 μl - स्लाइड पर नमूना बढ़ते से पहले, एक अतिरिक्त 5 जोड़ylenediamine (पीपीडी) microcentrifuge ट्यूब antifade समाधान.
    नोट: नमूना विच्छेदन बिना स्लाइड्स में जोड़ा जा सकता है. एक स्लाइड में जोड़ा नमूना मात्रा कवर पर्ची आकार के साथ बदलता रहता है. स्लाइड पर नमूना pipetting जब, पिपेट टिप नमूना बाल काटना को रोकने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग बंद कटौती हो सकती है. यह आसान विश्लेषण के लिए पंक्तियों में नमूना अप लाइन के लिए अक्सर उपयोगी है. एक अतिरिक्त antifade एजेंट के रूप में पीपीडी के अलावा आवश्यक नहीं किया जा सकता है, लेकिन नमूने लंबी अवधि के जमा हो जाती है अगर photobleaching रोका जा सकता है.
  2. धीरे नमूना से अधिक गिलास को कवर पर्ची जगह. फिर, जगह में सुरक्षित कवर पर्ची नेल पॉलिश का उपयोग कर.
  3. देखें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग नमूना मुहिम शुरू की.

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Representative Results

देर चरण भ्रूण और बगल में लार्वा ऊतकों के विश्लेषण में sonication आधारित immunostaining की प्रभावकारिता का प्रदर्शन करने के लिए, जंगली प्रकार भ्रूण और लार्वा वृषण, अंडाशय के immunostaining, और तंत्रिका ऊतक के लिए प्रोसेस किया गया. नमूने confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से imaged थे और प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 1 और चित्रा 2) दिखाए जाते हैं. परिणाम वर्णित प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला विकास की देर भ्रूण जल्दी के माध्यम से / मध्य L3 चरणों के दौरान रूपात्मक सुविधाओं के साथ ही बगल में व्यक्ति की कोशिकाओं दृश्यमान करने के लिए प्रभावी है कि पता चलता है.

वृषण Immunostain से परिणाम:
वृषण विकास वृषण परिपक्वता लार्वा विकास भर में गतिशील है के बाद से प्रोटोकॉल प्रभावकारिता illustrating के लिए एक विशेष रूप से अच्छी व्यवस्था है. वयस्क ड्रोसोफिला वृषण, 13 देखना (germline स्टेम सेल (GSC) आला स्थित है जहां एक अंधे अंत के साथ एक coiled ट्यूब फार्मसमीक्षा के लिए 14). इस जगह में, GSCs हब कहा जाता गैर mitotic दैहिक कोशिकाओं के एक तंग क्लस्टर के आसपास arrayed रहे हैं. GSCs हब के लिए लंगर डाले रहता है और उस gonialblast एक बेटी दूर स्टेम सेल आला से विस्थापित है कि एक GSC निर्माण करने के लिए विषम विभाजन से गुजरना. Gonialblast अधूरे बांटता के रूप में, cytoplasmic एक्सटेंशन spermatogonium भीतर कोशिकाओं को जोड़ने, fusomes फार्म कहा जाता है. 4 लगातार डिवीजनों के बाद, spermatogonium शुक्राणु के लिए फार्म अर्धसूत्रीविभाजन शुरू की.

वृषण गठन embryogenesis दौरान मौलिक रोगाणु कोशिकाओं (PGCs) और दैहिक जननांगों अग्रदूत साबित कोशिकाओं (SGPS) के संघ (समीक्षा के लिए 15,16 देखें) के साथ शुरू होता है. इस संस्था embryogenesis 8-10 के अंत तक एक कार्यात्मक GSC आला के गठन में यह परिणाम है. मध्य एल 1 से, GSC आला भीतर असममित GSC डिवीजनों branched fusomes 9 के साथ spermatogonia फर्क को जन्म दे. असममित GSC डिवीजन लार्वा भर में जारीविकास, अतिरिक्त spermatogonia और जननपिंड आकार में एक प्रगतिशील वृद्धि के उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप. जर्म कोशिकाओं, हब कोशिकाओं, और fusomes के लिए immunostained देर भ्रूण और जल्दी / मध्य L1, L2, और L3 वृषण के प्रतिनिधि छवियों,, (चित्रा 1 ए डी) दिखाए जाते हैं. इन छवियों को समय के साथ वृषण में मनाया जननपिंड आकार और रोगाणु सेल भेदभाव में गतिशील परिवर्तन वर्णन.

अंडाशय Immunostain से परिणाम:
वयस्क ड्रोसोफिला अंडाशय ovarioles (समीक्षा के लिए 17,18 देखें) कहा जाता है 16-20 व्यक्ति अंडा उत्पादक इकाइयों से बना रहे हैं. प्रत्येक ovariole के एक छोर पर, एक संरचना germarium एक स्टेम सेल आला शामिल बुलाया. टोपी कोशिकाओं और टर्मिनल रेशा कोशिकाओं (TFS): ovariole आला undifferentiated GSCs और दैहिक कोशिकाओं की दो आबादी से बना है. वृषण के लिए इसी प्रकार, GSCs टोपी कोशिकाओं और एक फर्क बेटी सेल के निकट बनी हुई है कि एक GSC निर्माण करने के लिए विषम विभाजन से गुजरनादूर आला से धक्का दिया है जो एक cystoblast, कहा जाता है. cystoblast बाद में एक branched fusome से जुड़े एक रोगाणु लाइन पुटी, फार्म करने के लिए कोशिका विभाजन के 4 दौर आए. प्रत्येक germline-पुटी तो यह ovariole की लंबाई नीचे कदम के रूप में परिपक्व जारी है कि एक अंडे चैम्बर निर्माण करने के लिए कूप कोशिकाओं से घिरा हुआ है.

वृषण की तरह, अंडाशय पहले embryogenesis 16,18 दौरान गठन कर रहे हैं. एकाधिक ovarioles PGCs और SGPS के शामिल एक भी भ्रूण जननपिंड से उत्पन्न होती हैं. रोगाणु कोशिकाओं SGP व्युत्पन्न intermingled कोशिकाओं (आईसीएस) 19-22 के साथ अंडाशय पीछे और सहयोगी को स्थानीय बनाना, जबकि मध्य L3 करके, SGPS, अंडाशय पूर्वकाल में TF व्यापारियों को जन्म दे. देर L3 करके, TF कोशिकाओं को अलग और वयस्क स्टेम सेल आला में पाया ढेर में संगठित करने, GSCs और टोपी कोशिकाओं स्थापित कर रहे हैं, और रोगाणु लाइन पुटी भेदभाव 19,20,23 मनाया जाता है. देर चरण भ्रूण और जल्दी / मध्य L3 अंडाशय, immunosta के प्रतिनिधि छवियाँजर्म कोशिकाओं, SGPS, आईसीएस, TF व्यापारियों, और fusomes लिए ined, (चित्रा 1E, एफ) दिखाए जाते हैं. इन छवियों को अपनी उम्र के लिए सामान्य आकृति विज्ञान और विकासात्मक प्रगति दिखाते हैं.

तंत्रिका Immunostain से परिणाम:
ड्रोसोफिला केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) तंत्रिका स्टेम सेल से ली गई है, भ्रूण neuroepithelium से उठता है कि कहा जाता neuroblasts (एनबीएस), (समीक्षा के लिए 24,25 देखें). भ्रूण और लार्वा विभाजन में एनबीएस asymmetrically बारी में, वयस्क मस्तिष्क और उदर तंत्रिका कॉर्ड में पाया न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं को उत्पन्न, कि नाड़ीग्रन्थि मां कोशिकाओं (जीएमसी) के उत्पादन के लिए. लार्वा एनबीएस वयस्क न्यूरॉन्स के बहुमत को जन्म दे सकता है और मस्तिष्क के भीतर अपनी स्थिति पर आधारित प्रतिष्ठित किया जा सकता है, क्योंकि लार्वा दिमाग नायब व्यवहार और तंत्रिका भेदभाव के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल बन गए हैं.

L3 मस्तिष्क दो पालियों की रचना की और एक केन्द्र स्थित उदर तंत्रिका कॉर्ड 24 है.एनबीएस, GMCs, undifferentiated न्यूरॉन्स, अपरिपक्व और प्राथमिक न्यूरॉन्स और glial कोशिकाओं के लिए immunostained मध्य L3 दिमाग के प्रतिनिधि छवियों (चित्रा 2A सी) 26-30 दिखाए जाते हैं. इन छवियों को मस्तिष्क लोब और उदर तंत्रिका कॉर्ड के भीतर विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न में मजबूत धुंधला दिखा. अभिविन्यास बढ़ते पर निर्भर करता है, इमेजिंग पृष्ठीय सतह (2A चित्रा) से मस्तिष्क के ऊतकों दृश्य, उदर सतह (चित्रा 2 बी), या बाण के समान पार अनुभाग में (चित्रा -2) के लिए अनुमति देता है.

धुंधला दक्षता:
हमारे प्रतिनिधि परिणाम एक sonication आधारित immunostaining प्रक्रिया बहुमुखी है कि प्रदर्शित करता है. न केवल यह विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन यह भी विशिष्ट प्रोटीन और organelles की उपस्थिति का संकेत किया जा सकता है. हालांकि, अस्पष्ट परिणाम धुंधला दक्षता में उम्मीद की भिन्नता से स्टेम सकता है. उदाहरण के लिए, विरोधी वासा कम से कम एक जननपिंड दागसभी लार्वा की 73.2% में जांच (एन = 781) विरोधी Elav लार्वा (एन = 115) के 86% में दिमाग दाग है. इसके अलावा, हम दक्षता धुंधला मोटे तौर पर विकास मंच के विपरीत आनुपातिक है कि निरीक्षण करते हैं. धुंधला (एन = 132 और 49) क्रमश: केवल 59.8% और L2 और मध्य L3, पर लार्वा की 46.9% में उपस्थित थे जबकि देर चरण भ्रूण में, विरोधी वासा, (एन = 206) gonads की 89.8% दाग. इसके अलावा, नमूना नुकसान में sonication के परिणामों. भ्रूण और एक इष्टतम sonication नमूना मात्रा में लार्वा वर्तमान की संख्या से पहले और sonication के बाद गिना गया था, नमूना के 41.0% के एक औसत विश्लेषण (एन = 1165) के लिए अनुपयुक्त निर्धारित किया गया था. दक्षता धुंधला को अधिकतम करने के लिए, प्रोटोकॉल प्रकाशित एंटीबॉडी सांद्रता या एंटीबॉडी ऊष्मायन बार बदलकर विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1 मैं. बगल में ड्रोसोफिला gonads की mmunostain (ई) देर चरण भ्रूण में बगल में वृषण की छवियाँ (चरण 17 / प्रारंभिक एल 1) जल्दी के माध्यम से / मध्य L3 लार्वा विरोधी वासा (ई, लाल के साथ immunostained; A'डी ' अकेले) रोगाणु कोशिकाओं, विरोधी Fasicilin III (फैस तृतीय) और विरोधी 1B1 (ई, हरी पता लगाने के लिए, एक '' - डी ') अकेले' क्रमशः हब कोशिकाओं और fusomes पता लगाने के लिए, और DAPI (ई, नीले, एक ' 'नाभिक का पता लगाने के लिए) अकेला' 'डी' '. (ए) स्टेज 17 / जल्दी एल 1 वृषण undifferentiated जर्म कोशिकाओं में नव coalesced हब और गोलाकार fusomes से पता चलता है. (बी) / जल्दी मध्य एल 1 वृषण स्थानीयकृत GSCs में गोलाकार fusomes से पता चलता है रोगाणु कोशिकाओं जल्दी spermatogonial भेदभाव का संकेत fusomes लम्बी केंद्र के पास और कुछ पीछे में. (सी) / जल्दी मध्य L2 और (एफई) छवियाँ बगल में देर चरण भ्रूण में और मध्य L3 लार्वा लाल विरोधी वासा (एफई, साथ immunostained गया है;. E'एफ ' अकेले) रोगाणु कोशिकाओं, विरोधी 1B1 (एफई, हरी पता लगाने के लिए, 'ई - L3 पर fusomes और दैहिक कोशिका झिल्ली का पता लगाने के लिए अकेले' एफ ''), और विरोधी ट्रैफिक जाम (टी जे) (एफई, नीले, 'ई' अकेले 'एफ' '') दैहिक डिम्बग्रंथि कोशिकाओं का पता लगाने के लिए. (ई) स्टेज 17 / जल्दी एल 1 अंडाशय दैहिक कोशिकाओं जननपिंड भर में वितरित कर रहे हैं और कि रोगाणु कोशिकाओं गोलाकार fusomes है कि पता चलता है. (एफ) / जल्दी मध्य L3अंडाशय थोड़ा बढ़ा है और TF पूर्वज विकास का संकेत झिल्ली जुड़े -1 बी -1 अभिव्यक्ति पूर्वकाल दैहिक कोशिकाओं में पाया जाता है. मध्य L3 में जर्म कोशिकाओं, वृषण पीछे में स्थित गोलाकार fusomes दिखाने के लिए, और टी जे सकारात्मक / 1B1 साथ सहयोगी दैहिक आईसीएस मंद कर रहे हैं. सभी छवियों बाईं ओर उन्मुख जननपिंड पूर्वकाल के साथ 4 लगातार confocal स्लाइस के Z-अनुमानों हैं. Gonads रेखांकित कर रहे हैं और केंद्र वृषण में एक पीले तीर के साथ संकेत दिया है. स्केल बार 10 माइक्रोन है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
बगल में चित्रा 2 Immunostain ड्रोसोफिला तंत्रिका ऊतकों की. प्रारंभिक / मध्य L3 लार्वा (एंटी Elav साथ immunostained ए '' एक अकेला) अपरिपक्व और प्राथमिक न्यूरॉन्स के नाभिक पता लगाने के लिए, और विरोधी प्रोस्पेरो (पेशेवरों) (ए, या तो हरी ' रेपो) (ई.पू., हरी, अकेले B'सी ') glial कोशिकाओं का पता लगाने के लिए. नाभिक और DAPI (एसी, नीले, अकेले ए '' ') सभी सेल नाभिक का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था. सभी छवियों पूर्वकाल के साथ उन्मुख. बाईं ओर उदर के साथ उन्मुख बाण के समान अनुभाग. (ए) पृष्ठीय खंड मस्तिष्क लोब (बीएल) के परिधीय क्षेत्रों में और उदर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) के midline और परिधि साथ पेशेवरों और Elav के लिए मजबूत धुंधला से पता चलता है. पैनल में इनसेट वीएनसी midline के साथ अलग नाभिक में पेशेवरों और Elav धुंधला से पता चलता है. (बी) वेंट्रल पार अनुभाग रेपो सकारात्मक glial कोशिकाओं वाई के व्यापक अभिव्यक्ति से पता चलता हैवीएनसी midline और परिधि साथ मजबूत धुंधला वें. (सी) बाण के समान अनुभाग VNC के उदर चेहरे पर रेपो धुंधला के संवर्धन से पता चलता है. सभी छवियाँ एक confocal वर्गों रहे हैं. स्केल बार 20 माइक्रोन है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इस प्रकार विच्छेदन के लिए आवश्यकता को नष्ट करने, बगल में ड्रोसोफिला भ्रूण और लार्वा ऊतकों लक्ष्य immunostain करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. जल्दी भ्रूण 1,2,3 धुंधला के लिए पूर्व प्रोटोकॉल के अनुसार, कोरियोनिक झिल्ली 50% ब्लीच (NaOCl) का उपयोग कर निकाल दिया जाता है. नमूने formaldehyde और मेथनॉल में तय कर रहे हैं. लार्वा छल्ली फ्लोट करने के लिए पुराने नमूने का कारण बनता है, इसलिए पूरे नमूना तो लार्वा प्रतिधारण सुनिश्चित करने के लिए एक सेल झरनी के माध्यम से पारित कर दिया है. उदाहरणार्थ रासायनिक ग्रेड मेथनॉल में, अगर वांछित, संग्रहीत किया जाता है. पुनर्जलीकरण के बाद, एक ठीक से लागू sonication प्रक्रिया लार्वा छल्ली की अखंडता को बाधित. इस immunostaining के लिए आवश्यक एंटीबॉडी के पर्याप्त पारगमन के लिए अनुमति देने के लिए छल्ली गठन के बाद महत्वपूर्ण है. एक 5% सामान्य सीरम में नमूना, एंटीबॉडी लागू करने के कमाल से पहले / BBTw समाधान अत्यधिक अविशिष्ट एंटीबॉडी बाध्यकारी रोकता है. प्राथमिक एंटीबॉडी तो विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए जोड़ रहे हैंलक्ष्य ऊतक में sed. अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी हटाने के लिए धोने के बाद, fluorophores के लिए बाध्य माध्यमिक एंटीबॉडी बाध्य प्राथमिक एंटीबॉडी के स्थान चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है. विश्लेषण तो epifluorescence या confocal माइक्रोस्कोपी के साथ किया जा सकता है.

कुछ संशोधनों के व्यक्तिगत परिस्थितियों में परिणामों का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हो सकता है. विशेष रूप से, sonication शक्ति और प्रदर्शन sonications की संख्या का इस्तेमाल किया sonicator के आधार पर समायोजन की आवश्यकता हो सकती. नमूना ऊपर के साथ ही समाधान मात्रा को sonicator जांच की ऊंचाई के रूपांतरों भी अलग sonicators के लिए या पर्याप्त नमूना प्राप्त नहीं किया जा सकता है यदि आवश्यक हो सकता है. बढ़ी हुई समाधान मैलापन इसलिए, sonication भी गंभीर है जब के लिए एक गेज प्रदान करता है, ऊतक सेल का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. समाधान मैलापन उच्च हो जाता है, प्रयोगकर्ता sonicato की ऊंचाई बढ़ाने, समाधान की मात्रा में वृद्धि, प्रदर्शन sonications की संख्या को कम करने पर विचार करना चाहिएआर नमूना ऊपर जांच, और / या sonicator शक्ति को कम करने.

बदलाव भी छवि गुणवत्ता बढ़ाने के लिए immunostaining प्रोटोकॉल में आवश्यक हो सकता है. सबसे immunostaining प्रक्रियाओं के साथ ही शोर अनुपात करने के लिए संकेत एंटीबॉडी कमजोर पड़ने, समय और नमूने के साथ एंटीबॉडी ऊष्मायन के तापमान को संशोधित करने, और / या इस्तेमाल किया अभिकर्मकों अवरुद्ध करके बदला जा सकता है. प्रत्येक एंटीबॉडी स्वतंत्र रूप से विचार किया जाना चाहिए, विशेष रूप से एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के संबंध में, हम अब समय अवधि के लिए 4 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन विशेष रूप से कम शोर अनुपात करने के लिए संकेत है और जब बड़े लार्वा जांच कर रहे हैं के साथ एंटीबॉडी के लिए, sonication के बाद धुंधला गुणवत्ता में वृद्धि कर सकते हैं. इन उदाहरणों में, धुंधला गुणवत्ता भी माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने में मामूली कमी से लाभ हो सकता है. इस प्रोटोकॉल में, हम अवरुद्ध अभिकर्मकों के रूप में बीएसए और सीरम दोनों शामिल हैं, और नमूना धुंधला गुणवत्ता बढ़ाने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के अलावा पूर्व अवरुद्ध कर रहे है. एंटीबॉडी का उपयोग पर निर्भर करता हैदोनों अवरुद्ध अभिकर्मकों के विकास, फिर से अवरुद्ध और शामिल किए जाने या धुंधला बढ़ाने के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता. फिर से अवरुद्ध कदम छोड़ा जाता है, तो अब washes और अधिक rinses क्लीनर छवियों का उत्पादन हो सकता है. अंत में, पूर्व अवशोषित पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी शोर अनुपात करने के लिए संकेत वृद्धि हो सकती है. पूर्व अवशोषण rehydrated भ्रूण या एक immunostain 1 में उपयोग करने से पहले लार्वा के साथ वांछित एंटीबॉडी incubating द्वारा किया जाता है.

हमारे प्रतिनिधि परिणाम में प्रदर्शन के रूप में, sonication के बगल में लक्ष्य ऊतकों का स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देता है और इस प्रकार immunostaining प्रोटोकॉल में ऊतक विच्छेदन के लिए एक उचित विकल्प प्रदान करता है. विच्छेदन के कारण, लगाने को अलग, और undamaged लक्ष्य ऊतकों निकालने में कठिनाइयों को ड्रोसोफिला भ्रूण और लार्वा में बोझिल हो सकता है. वैकल्पिक रूप से sonication के ऊतकों पूरे जीव के संदर्भ में रहने के लिए अनुमति देता है. Sonication एक स्लाइड और एक कवर SLI के बीच निकालने और बढ़ते ऊतकों से बचा जाता है क्योंकिपी, इसे और अधिक सही सीटू आकारिकी में बरकरार रखता है. कई जीवों एक साथ sonicated जा सकता है क्योंकि व्यावहारिक रूप से, नमूना की बड़ी मात्रा में, और अधिक तेजी से भविष्य के विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती है.

Sonication के विच्छेदन के लिए एक शानदार विकल्प प्रदान करता है, यह माना जाना चाहिए कि सीमाएं हैं. Sonication लाभदायक लार्वा छल्ली की अखंडता को बाधित लेकिन इस प्रक्रिया में कुछ नमूना (प्रतिनिधि परिणाम देखें) नष्ट कर देता है. जैविक मलबे को हटाने के लिए Rinsing आगे नमूना आकार को कम कर सकते हैं जो sonication प्रक्रिया, निम्नलिखित आवश्यक है. इसके अलावा, पूरे भ्रूण और लार्वा immunostaining आसपास के ऊतकों में एम्बेडेड हित के ऊतक छोड़ देता है. ये आसपास के ऊतकों सकारात्मक दाग या गैर विशिष्ट एंटीबॉडी इस प्रकार अंतिम छवि गुणवत्ता को कम करने, बंधन दिखा सकते हैं. अंत में, दक्षता धुंधला चर हो सकता है. इस परिवर्तनशीलता नमूना, sonication प्रभावकारिता, और एंटीबॉडी विशिष्टता की उम्र पर निर्भर हो सकता है. परिणामस्वरूप, sonication के बीए के रूप मेंपूरे माउंट ऊतक के SED immunostaining हमेशा बेहतर नहीं हो सकता है. देर L3 लार्वा में बड़े ऊतकों का अध्ययन करते समय विशेष रूप से, विच्छेदन आधारित immunostaining अधिक कुशल हो सकता है. इसके अलावा, sonication early- और मध्य चरण भ्रूण वंचित कर सकते हैं. इन सीमाओं के बावजूद, sonication आधारित immunostaining जल्दी / मध्य L3 लार्वा के माध्यम से देर चरण भ्रूण में ऊतकों की एक किस्म के विकास का विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है कि एक अत्यधिक कुशल तकनीक है. हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से ड्रोसोफिला भ्रूण और लार्वा 9,10 में जननपिंड morphogenesis अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें. इसके अलावा, हम इस प्रोटोकॉल के कार्यान्वयन के एक सुरक्षात्मक छल्ली साथ ड्रोसोफिला में अन्य ऊतकों के विकास का अध्ययन करने में और अन्य जीवों में समान रूप से उपयोगी साबित होगा कि आशा.

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Acknowledgments

हमारा अनुरोध है वासा और ट्रैफिक जाम एंटीबॉडी की आपूर्ति की जो रूथ लीमैन और Dorthea Godt के लिए आभारी हैं. हम NICHD के तत्वावधान में विकसित और आयोवा विश्वविद्यालय द्वारा बनाए रखा प्रदान की स्टॉक और विकास अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक को बनाए रखने के लिए इंडियाना विश्वविद्यालय में ब्लूमिंगटन शेयर सेंटर स्वीकार करना चाहते हैं. हम उनकी सलाह और समर्थन के लिए Wawersik प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद. इस काम मुनरो विद्वान कार्यक्रम अनुदान और NSF (वायुसेना और लेग के लिए) (मेगावाट) IOS0823151 अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10% For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane CAS 142-82-5 n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol CAS 67-56-1 Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10% For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS) ackson ImmunoResearch Laboratories 005-000-121 To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) CAS: 281-57-9 To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10% To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI Invitrogen D3571 1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa 1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7G10 1:10
Mouse anti-1B1 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1 1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Prospero MR1A 1:10
Rat anti-Elav Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7EBA10 1:30
mouse anti-Repo Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 8D12 1:10
Goat anti-rabbit Alexa546 Invitrogen A11010 1:500
Goat anti-mouse Alexa488 Invitrogen A11029 1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633 Invitrogen A21105 1:500
Goat anti-rat Alexa488 Invitrogen A11006 1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages Hand-made; Genesee Scientific Corporation Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier Branson Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe Branson Model #: 102C (CE) EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter Nalgene 190-25-20 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit Nalgene 450-0020 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter

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References

  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 90, भ्रूण लार्वा sonication निर्धारण immunostain इम्यूनोफ्लोरेसेंस जीवोत्पत्ति विकास
देर चरण भ्रूण और लार्वा के sonication-मदद की immunofluorescence धुंधला<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; टिश्यूज<em&gt; बगल में</em
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Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. … More

Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ. J. Vis. Exp. (90), e51528, doi:10.3791/51528 (2014).

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