Abstract
Drosophila yapılan çalışmalar embriyo ve larva gibi hücre kaderi şartname ve organogenezis gibi gelişimsel süreçlerine önemli bilgi sağlar melanogaster. İmmünoboyama doku ve organların geliştirilmesi görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, embriyojenez sonunda oluşturan bir koruyucu üst deri geç dönem embriyo ve larvalarına antikorların geçirmesini engeller. Immün önce diseksiyon düzenli Drosophila larva dokularının analiz etmek için kullanılır iken, küçük dokular bulmak ve izole etmek zor olabilir çünkü, bazı analizler için verimsiz kanıtlıyor. Sonikasyon larva Drosophila immünoboyamasıdır protokoller diseksiyon için bir alternatif sağlar. Geç evre embriyo ve larvaların çok sayıda hızlı, eşzamanlı işleme izin verir ve yerinde morfolojisi tutar. Formaldehit içinde tespit sonra, bir numune ultrasonik banyoda tutulur. Numune, daha sonra antigen-spesifik primer ant ile imüno tabi tutuluribodies ve floresan etiketli sekonder antikorlar floresan mikroskobu ile hedef hücre tiplerini ve spesifik proteinlerin görselleştirmek için. Sonikasyon işlemi sırasında numunenin üstüne, bir sonikasyon probu, hem de sonikasyon süresi ve yoğunluğu, uygun yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Standart immünoboyama protokolleri Ek bir küçük değişiklikler, yüksek kaliteli lekeler için gerekli olabilir. Gürültü oranı düşük sinyalli antikorlar için, daha uzun inkubasyon süreleri tipik olarak gereklidir. Bu Sonication kolaylaştırdı protokol konseptinin bir kanıtı olarak, gelişim aşamaları bir dizi üç doku tiplerinin (testisler, yumurtalıklar, ve nöral dokular) arasında immunohistokimyasal göstermektedir.
Introduction
Drosophila embriyoları ve larvaları birçok organda ve dokuda gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model sunmaktadır. Tek tek hücrelerin Görüntüleme hücrelerinin geliştiği karmaşık ortamları tespit etmek için, bu çalışmalarda genellikle gereklidir. Dokusunun Görselleştirme imüno yoluyla gerçekleştirilebilir. Protokolleri 17 saat Yumurtlayarak (AEL) 1-3 sonra embriyonik Drosophila dokular <ana kadar immünolekeleme iyi tarif. Etkili antikor nüfuz etmesini önlemek embriyojenez sonuna doğru Bununla birlikte, koruyucu kütikül formlar. Bu nedenle, bu immün protokolleri son aşama embriyolarda dokuların analizi ve larva gelişimi (1. safha (L1), 2. safha (L2) ve 3. instar (L3)) daha sonraki aşamalarında verimsizdir. Bu verimsizlik bu genişletilmiş gelişme döneminde 4 sırasında meydana dinamik süreçleri anlamamıza engel dayatır. Tissue diseksiyonu bu engeli 5-7 aşmak için bir yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ancak, diseksiyon verimsiz kanıtlayabilirim. Ekstraksiyon bulma veya embriyonik ve larva dokuları izole güçlüğü ile ipotekli olabilir. Bundan başka, hedef dokuların fiziksel giderilmesi, bunları kırılması ya da tamamen bunları elde etmek için başarısız olarak zarar görmesine neden olabilir.
Sonikasyon arası etkileşimleri bozmak ses dalgaları kullanan bir yöntemdir. Nöral hücre tipleri 6 geliştirmek immunostain amacıyla Drosophila larva kütikül bütünlüğünü bozmak için kullanılmıştır. Bu protokol geç evre embriyonik ve çapı 8-10 50um kadar küçük olabilir larva organlarında, immunostain adapte edilmiştir. Bu çalışmaları sayesinde, erkek tohum çizgisi kök hücreleri (GSC) hücresi oluşum süreci sonunda aşamasında karakterize edilmiştir kök hücre gelişimini düzenleyen ve dif Drosophila embriyolar 8-10 ve mekanizmaGeç evre embriyonik gonadlar ve larvaları ferentiation 9-12 saptanamamıştır. Böylece, sonikasyon nedeniyle doku boyutu zor olabilir doku diseksiyonu etkili bir alternatif sağlar. Bundan başka, bütün organizmanın bağlamında hücreleri bırakarak ve in situ morfolojisinde muhafaza yerinde Drosophila dokuların imüno-boyanmasını sağlar. Burada, in situ / erken orta L3 dokular içinden geç embriyonik aşama floresanlığıdır immün için adım adım protokol açıklar. Drosophila gonadal ve sinir dokusunun analizi bu protokolün etkinliğini göstermek için Temsilcisi Sonuçlar gösterilir. Ayrıca, bu imüno protokol bir dış kütikül diğer organizmalardaki diğer Drosophila dokusunu ve dokularının analiz edilmesi için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bir Toplama Cage 1. Hazırlık
- CO 2 genç, bereketli sinekler uyutmak. Bir kafese sineklere aktarın. Optimal verim elde 4 yaşı 2-7 gün arasında değişen 100-120 yetişkin sinekler kullanmak için: erkeklerin kadın 1 oranında. Sinekler uygun bir alışma dönemi Veren, ~ 24 saat tespiti için numune alınması öncesinde. 48 saat alışma dönemi - kafes bakire kadın ile kuruldu ise, erkeklere bir kullanımı 36 evlendirdi.
- Kafesin açık ucunda, kafesin açıklığın üzerine merkezi maya hamur bir bozuk para büyüklüğünde damla ile önceden hazırlanmış bir elma suyu agar plaka yerleştirin. Sonra, bant ile sabitleyin. Elma suyu agar plaka ve Parafilm ile kafesi arasında kavşak mühür.
- Baz olarak elma suyu agar plakası ile ikincil bir kap içinde kafes yerleştirin ve deney ile belirlendiği gibi sineklerin uygun bir zaman süresi için, belirli bir sıcaklıkta yeniden sağlar.
Not: Örnek toplama kez wideğişir ll. Geç aşama embriyolar erken / L1 larvaları toplamak, örneğin, (17-24 saat), sinekler 25 ° C'de 17 saat boyunca önce numune yaşlanmaya karşı 25 ° C'de 7 saat boyunca elma sulu agar tabakları üzerinde yumurta bırakmaya izin verir. Benzer şekilde, orta-geç birinci değişim safhasındaki larva toplanması için (36-48 sa) sinekler 25 ° C'de 36 saat boyunca önce numune yaşlanmaya 25 ° C'de 12 saat boyunca yumurta bırakmaya izin verir. - Süre tamamlandıktan sonra sinek anestezi olmadan uzakta elma suyu agar plaka damla böylece, bir masanın üzerine kafes dokunun. Çabuk maya hamur bir damla içeren bir taze, kullanılmış bir plaka değiştirin. Bant ve parafilm ile taze bir tabak Güvenli ve üs olarak elma suyu agar plaka ile kafesi saklayın.
- Dikkatlice bir metal spatula ile kullanılan plaka maya damla çıkarın. Deneysel gerekirse Yer kullanılan elma suyu plaka üzerinde kapak ve yaş embriyolar koydu izin verir.
Not: numuneler, yaşlanma, levhalar 25 ° C'de muhafaza edilebilir, daha yüksek sıcaklıklar Experimenta olmadıkçaLly gerekli. Yukarıda açıklanan koleksiyonu için embriyolar yaş için nasıl örnekler (1.3 adım için nota bakınız). Yaşlanmayı örnek önce maya hamur çıkarılması mayaya tarama ve altında agar kesiliyor larvaları önlemek için yapılır. Kalan elma suyu agar ve maya yapıştırma kalıntı larva büyümesi için besin sağlar. Maya hamur direkt olarak belirtilen embriyolar maya hamur çıkarılması ile kaybolur da, bu kayıp boyama verimini azaltır numunede maya ve agar tortu tercih edilir. Bir maya macun kaldırmak için seçmek, maya, bir boya fırçası ile karıştırılmış Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) ile sıvılaştırılmış ve daha sonra önce tespit üzere bir hücre filtresinden ile numuneden uzaklaştırılabilir.
2. Sabitleme
- Elma suyu ağan plakası üzerine döşenmiş embriyolar Arzu edilen zaman noktasında yaş arası sonra, dikkatli bir şekilde th örneği almak için Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) bir eriyiği ile ıslatılır, küçük bir fırça kullanıne plakası.
Not: Eski larva hareketlidir ve kapağın iç kısmına tarayabilir. Bu örnek, bir fırça ile uzaklaştırılarak elde edilmiş benzer şekilde elde edilebilir. - Bir hücre süzgeç iç bakan sırt karşı örnek yüklü fırça silin. Ardından, süzgeç duvarları ve PBTx çözüm içeren bir bücür şişe fırça durulayın. PBTx çözümü yakalamak için süzgeç altında bir petri kapağı yerleştirin.
- Tüm numune filtresine transfer edilmesinden sonra, örgü kapalı numune yükseltmek için yeterli miktarda süzgeçten PBTx dökün. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz.
- Tekrarlayın Adım 2.3 üç kez maya kaldırmak ve numune ile birlikte aktarılmış olabilir atık uçmak.
- Örgü larvalarını yükseltmek için yeterli% 50 çamaşır suyu içine süzgeçten (NaOCI) / su (GKD 2 O) çözeltisi dökün. Larvaları 5 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Ardından, süzgeç kaldırın ve t dökmeko bir sıvı atık kabına petri içerikleri.
Not: - koryonik membran kaldırmak amacıyla 22 sa Bleach sadece 0 yaş embriyonik örnekleri gereklidir. Büyük örnekler için çamaşır suyu uygulaması atlanabilir, ancak dahil zararlı değildir. Ihmal isteniyorsa, PBTx, bu aşamada ağartıcı değiştirin. Seyreltilmiş ağartıcı çözelti hazırlama, 24 saat içinde kullanılmalıdır. - Örgü kapalı örneği yükseltmek için süzgeç içine yeterince PBTx dökerek PBTx ile süzgeç örnek yıkayın. Örnek 3 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz.
- Tekrarlayın Adım 2.6 beş kez.
- Hücre süzgecinden kuru alt Dab, daha sonra bir fırça ile PEMS çözeltisinin 1.75 ml'sini ihtiva eden bir parıltı şişesine içine örnek aktarmak.
- Bir havalandırılan bir duman başlığı içinde çalışan% 37 formaldehit ve 250 ul sintilasyon şişesine reaktif dereceli heptan 8 ml ekleyin.
- Şişe 200 rpm'de ve 20 dakika için de benzer bir orta hızda çalkalanır izin verin.
- Önceki sulu fazın çıkarmadan sintilasyon şişesine 10 ml metanol eklenir ve şişe 1 dakika boyunca 500 rpm'de sallamak kuvvetli bir şekilde izin verir.
Not: Metanol tehlikelidir. Havalandırılan bir davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven giymeye devam. - Kaputu bir sıvı atık kabına üzerinde bir hücre süzgeç içine içeriğini dökün hemen sallantýyý şişe çıkarın ve. Şişeye ilave metanol ekleyin ve bütün numune kaldırıldı temin etmek için önemli bir hücre süzgecinden çalıştırın.
Not: Hücre süzgeçler yavaş boşalabilir. Bu sorunu çözmek için, daha hızlı bir şekilde süzgecinden çözelti çekmek için bir hücre süzgecinden altına laboratuar doku dokunun. Metanol, formaldehit, ve heptan 'dır olmalıdırkurumsal kurallarına göre uygun bertaraf kadar uygun bir atık kaplarda saklanır. - Laboratuar doku kullanılarak hücre süzgecinden kuru alt metanol ve daha sonra 0.5 ml ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süzgecinden yakalanan örnek aktarmak için bir fırça kullanılır.
Not: Birden fazla ışıma flakon kullanımda ise, tam adımlar 2.12 ve bir seferde 2.13 bir şişe hücre süzgeçler üzerinde kurumasını örnek önlemek için. - Örnek mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sonra, bir pipetle, metanolün çıkması. Emin örnek tüpün dibine yerleşmiştir.
- Tüpe metanol yaklaşık 0,5 ml ilave etmek suretiyle mikrosantrifüj tüpü içinde örnek durulayın. Bundan sonra da dinlendirilir, bir pipet ile metanolün çıkması için numune bekleyin.
- Adım 15 tekrar üç kez.
- Bir tüpe metanol içinde 0.5 ml ilave edilir, ve daha sonra kaydetmek daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C sıcaklıkta dondurucuya.
3. Rehidrasyon ve immün için Numune Hazırlama
- Tüp içinde örnek bırakarak bir pipet ile mikrosantrifüj tüpü ve metanol çıkarın. Uygun bertaraf zamanına kadar uygun bir atık konteynerine Mağaza metanol atık.
, Sonikasyon verimliliğini artırmak için numunenin en fazla 3 mm, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü altındaki yerleşmiş kullanın: edin. Aşırı numunesi yukarıda adım rehidrasyon başlamadan önce bir pipet ile ayrı bir tüpe aktarılır. Temiz bir jilet ile pipet kesme pipet tıkanmasını önlemek için de kullanılabilir. - 3 dakika boyunca tüp ve kaya için% 50 metanol / Fosfat Tampon Tween, (PBTw) çözeltisi 1.0 ml ilave edilir.
- Uygun atık kabına metanol çözüm çıkarın ve iki kez PBTw 1.0 ul ile yıkayın. Her durulama sonra, numune, bir pipet ile ortadan kaldırılmasından önce PBTw oturmasına izin verin.
- Sığır Serumu Albümini / Fosfat Tamponlu Tween (BBTw) 1,0 ml ilave edilir ve şişe kaya karıştırın. Bir rocker 3 dakika sonra, SAMP sağlarle yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için.
- Tekrarlayın Adım Son yıkamadan sonra, numune kaybetmeden mümkün olduğu kadar BBTw kaldırmak için dikkat 3.4 iki kere verilir.
- Tüpe BBTw 0.5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tüp yerleştirin.
Örnek 4. Sonikasyon
- 10% maksimum genlik için sonikator ayarlayın ve 2 sn sabit sonikasyonun bir çalışma süresini tayin.
Not: Bu ayarlar Malzeme ve Ekipmanları Tablo belirtilen sonikatöre özgü ve farklı sonicators için optimizasyon gerektirebilir. - Önceki örnek, sonikasyon işlemine, prob temizlemek için deiyonize su ve çalıştırma sonikatör ile dolu bir 50 ml'lik konik bir tüp içine prob ucunu yerleştirerek sonikatör probu temizleyin. Koşudan sonra laboratuvar dokusu ile kuru Sonikatör prob.
- Bu numune üzerinde yaklaşık 3-4 mm konumlandığı şekilde numuneyi içeren mikrosantrifüj tüpü içine daldırın ve sonikasyon probu başlar.
- M çıkarınicrocentrifuge boru sonikasyon ısı dağılımı ve örnek mikrosantrifüj tüp dibinde biriken izin vermek için en az 30 saniye boyunca buz üzerine yerleştirin ve.
- Tekrar 4.3 ve işlenen numune yaşına göre gerektiğinde 4.4 adımları.
Not: Optimum Sonication örnek hacmi için, Sonikasyon gerekmez daha genç 17 saat embriyolar, ancak bu saat 17 ila 24 (/ 17 aşama, erken-L1) iki sonikasyon gerektirir. Larva arası 24-36 (erken / orta-L1), 36-48, (orta /-L1 geç) 48 - 60 (erken / orta-L2), 60-72 (orta / geç-L2), 72-84 ( )-L3 erken, 84-96 (erken / orta-L3), 96-108 (orta / geç-L3) hr gerektiren 5, 9, 11, 13, sırasıyla 15, 18 ve 22 sonikasyon. Sonication kez daha hazırlanması için tartışma bakın. - BBTw iki kez 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin.
- Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir. </ Li>
- Tekrarlayın Adım 4.7 iki kez.
5. immün
- Mikrosantrifüj tüpüne BBTw içinde seyreltilmiş,% 5, normal serumu ilave ederek örnek bloke eder. 1 saat boyunca sallanan sonra bloğunu çıkarın.
Not: İkincil antikorlar uretıldığı türleri normal serum kullanın. - % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk birincil antikorlar seyreltilir.
- 4 ° C'de ya da (yaklaşık 22 ° C oda sıcaklığında en azından 3 saat için primer antikor çözeltisi O kaya örnek / K.
Not: Antikor inkübasyon süreleri ve sıcaklıklar değişebilir. O / N, oda sıcaklığında, 4 ° C'de inkübasyon ya da 3 saat tipik olarak yeterlidir. Bununla birlikte, iki günlük bir inkübasyon süresi, daha eski numune ya da düşük affiniteli primer antikorlar ile kullanıldığında, boyama kalitesini artırabilir. Daha uzun bekletme tipik olarak 4 ° C'de gerçekleştirilir. Sekonder antikor (5.10) kullanıldığında benzer sonuçlar elde edilmektedir gerekir. - Örnek yerleşmek için izin vermikrofüj tüpün alt. Pipet ile primer antikorlar kapalı çizin. Arzu edildiği takdirde yeniden kullanım için antikorlar kaydedin.
- Iki BBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin.
- Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir.
- Tekrarlayın Adım 5.6 beş kez.
- Mikrosantrifüj tüpüne% 5 normal serumu / BBTw çözeltisi eklenerek Blok örneği. 1 saat 30 dakika boyunca sallanan sonra blok çıkarın.
Bu ilave bir bloke etme adım gerekli değildir, ancak özel antikorlar için boyama kalitesini iyileştirebilir: edin. - % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk sekonder antikorlar seyreltilir.
- Işığa maruz kalma nedeniyle solmasını azaltmak için bir alüminyum folyo içinde mikrosantrifüj tüpü sarın. 4 ° C'de 12 saat 48 için ikincil bir antikor ya da çözelti içinde, oda sıcaklığında (yaklaşık 22 ° C'de en az 3 saat boyunca Kaya örneği.
- Örnek mikrofuge'de tüpünün dibine yerleşmek için izin ver. Pipet ile ikincil antikorlar kapalı çizin.
- Iki PBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile PBTw kapalı çizmeden önce yerleşmek için izin.
- Flakon ve kaya PBTw 1.0 ml ekleyin. Kızağa üzerinde 5 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile PBTw kaldırmaktır.
- Tekrarlayın Adım 5.13 üç kez.
- İSTEĞE BAĞLI: 1,000 PBTw in: DAPI 1 seyreltilmiş ekleyin. Kaya örnek 3 dakika için alüminyum folyoya sarılmıştır; daha sonra bir pipet ile DAPI çözeltisi çıkarın. Örnek pipetle PBTw çıkarmadan önce çökmesine izin verdikten, PBTw 1.0 ml ile beş kez çalkalayın.
- -20 ° C'de mikrosantrifüj tüpüne ve saklamak için 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) çözeltisi 100 ul - 80 ekleyin.
Not: Başka bir gliserol tabanlı bir anti-solmaya madde için ikame edilebilir.
6. Analiz
- DABKO / p-phen 10 ul - slaytlar üzerine numuneyi monte etmeden önce, ekstra 5 ekleylenediamine (PPD) mikrosantrifüj tüpüne antifade çözüm.
Not: Örnek diseksiyonu olmadan slaytlar eklenebilir. Bir slayta eklenen Numune hacmi kapak kayma boyutuna göre değişir. Slayt üzerine örnek pipetlerken, pipet ucu numune kesme önlemek için bir jilet kullanarak kesilebilir. Bu kolay analiz için satırları örnek sıraya genellikle faydalıdır. Ilave madde olarak antifade DSD eklenmesi gerekli olmayabilir, ancak örnekler uzun süreli saklandığı takdirde, ışıkla önleyebilir. - Yavaşça numune üzerinde cam kapak kayma yerleştirin. Sonra, yerde güvenli kapak kayma oje kullanarak.
- Görünüm floresan mikroskopi kullanılarak örnek monte edilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geç evre embriyonik ve larva in situ dokularının analizi içinde sonikasyon bazlı imüno etkinliğini göstermek için, vahşi tip embriyoları ve larva testis, yumurtalık immün ve nöral doku için işlenmiştir. Numuneler konfokal mikroskobu ile görüntülendi ve temsili sonuçları (Şekil 1 ve Şekil 2) gösterilmiştir. Sonuçlar tarif edilen protokol Drosophila gelişiminin geç embriyonik erken aracılığıyla / orta L3 aşamalarında morfolojik özelliklerin yanı sıra, tek tek hücrelerin in situ görselleştirmek için etkili olduğunu ortaya koymaktadır.
Testis immunostain sonuçları:
Testis gelişimi testis olgunlaşması larva gelişimi boyunca dinamik olduğundan protokol etkinliğini gösteren için özellikle iyi bir sistem. Yetişkin Drosophila testis, 13 (bkz germ kök hücre (GSC) niş yer almaktadır bir kör uç ile bir sarmal tüp oluşturacakYorumlara 14). Bu niş, GSC'lerin göbek olarak adlandırılan mitotik olmayan somatik hücre sıkı bir küme etrafında dizilmiş. GSC'lerin hub demirlemiş kalır ve bu gonialblast bir kızı uzak kök hücre niş yer değiştiren bir GSC üretmek için asimetrik bölünme tabi. Gonialblast eksik böler gibi, sitoplazmik uzantıları spermatogonyum içindeki hücreleri bağlayan, fusomes formu çağırdı. 4 ardışık bölümden sonra, spermatogonyum spermi oluşturmak üzere mayoz başlatır.
Testis oluşumu embriyonik dönemde primordial germ hücrelerinden (PGC'leridir) ve somatik gonadal öncü hücreler (SGP) derneğinden (yorumlara 15,16 bakınız) ile başlar. Bu ilişki, embriyojenez, 8-10 sonunda bir işlevsel GSC niş oluşumu ile sonuçlanır. Orta-L1 tarafından, GSC niş içinde asimetrik GSC bölümler dallı fusomes 9 spermatogonium farklılaşan yol açar. Asimetrik GSC bölünme larva boyunca devamgeliştirme, ek spermatogonia gonad boyut progresif artış miktarda ortaya çıkar. Germ hücreleri, merkezi hücreleri ve fusomes için immunohistokimyasal geç embriyonik ve erken / orta-L1, L2 ve L3 testis Temsilcisi görüntüleri, (Şekil 1A-D) gösterilir. Bu görüntüler, zamanla testiste gözlenmiştir gonad boyutu ve germ hücre farklılaşmasında dinamik değişimleri göstermektedir.
Yumurtalık immunostain sonuçları:
Yetişkin Drosophila yumurtalık ovarioles (inceleme için bakınız 17,18) adı 16-20 bireysel yumurta üreten birimleri oluşmaktadır. Her bir ovaryol bir ucunda, bir yapı, bir kök hücre germarium niş içerir adlandırılır. Kap hücreleri ve terminal filament hücreleri (TF): ovaryol niş farklılaşmamış GSC 'lerin ve somatik hücre iki nüfusun oluşmaktadır. Testise benzer, GSC'lerin kapak hücreleri ve bir farklılaştırıcı kızı hücreye bitişik kalır bir GSC üretmek için asimetrik bölünme geçmesi, Uzak niş itilir bir hücre çekirdeği, çağırdı. Hücre çekirdeği daha sonra, bir kollara ayrılmış fusome ile birbirlerine bağlanmış bir mikrop hattı kist oluşturmak için hücre bölünmesi 4 mermi maruz kalır. Her bir tohum çizgisi kist-o ovaryol uzunluğu boyunca aşağı hareket ederken olgunlaşmaya devam bir yumurta elde etmek için bölme folikül hücreleri ile çevrilidir.
Testisler gibi, yumurtalıklar ilk Embriyogenesis 16,18 sırasında oluşur. Çoklu ovarioles PGCs ve sGPS oluşan tek embriyonik gonad ortaya çıkar. Germ hücreleri SGP-türetilmiş karışmış hücreler (IC) 19-22 ile yumurtalık posterior ve iştiraki lokalize iken orta-L3, SGP, yumurtalık anterior TF öncüleri doğuran. Geç-L3, TF hücreleri ayırt etmek ve erişkin kök hücre niş bulunan yığınlar halinde organize, GSC'lerin ve kap hücreler kurulmuş, ve germ-line kist farklılaşma 19,20,23 görülmektedir. Geç evre embriyonik ve erken / orta-L3 yumurtalıklar, immunosta Temsilcisi görüntülerigerm hücreleri, sGPS, IC, TF öncüleri ve fusomes için ined, (Şekil 1E, F) gösterilmiştir. Bu görüntüler yaşlarına normal morfoloji ve gelişim ilerlemesini gösterir.
Sinir immunostain sonuçları:
Drosophila merkezi sinir sistemi (MSS) sinir kök hücrelerinden türetildiği, embriyonik epitele ortaya çıkan nöro-olarak adlandırılan (NBS), (24,25 yorumlara bakınız). Embriyo ve larva ayrımdanda Onaylanmış asimetrik sırayla, yetişkin beyin ve ventral sinir kablosu bulunan nöronlar ve glial hücreleri oluşturmak, bu ganglion anne hücreleri (GMC) üretmek için. Larva Onaylanmış yetişkin nöronların çoğunluğu doğuran ve beyin içinde konumlarına göre ayırt edilebilir, çünkü larva beyinleri NB davranış ve nöral farklılaşma çalışmak için önemli bir model haline gelmiştir.
L3 beyninin iki lobu oluşur ve merkezi bir konumda bulunan ventral sinir kablosu 24 edilir.Onaylanmış, GMC'ler, farklılaşmamış nöronlar, olgunlaşmamış ve primer nöronlar ve glial hücreleri için immunohistokimyasal orta-L3 beyinlerin Temsilcisi görüntüleri (Şekil 2A-C) 26-30 gösterilmiştir. Bu görüntüler beyin lobları ve ventral sinir kordonu içerisinde farklı ifade şekillerine kuvvetli boyanma gösterir. Yönünü montaj bağlı olarak, görüntüleme dorsal yüzeyi (Şekil 2A) için beyin dokusu görselleştirme, ventral yüzeyi (Şekil 2B), veya sagital kesitte (Şekil 2C) için izin verir.
Boyama verimliliği:
Bizim temsilcisi sonuçları sonifikasyon tabanlı İmmünoboyama prosedürü çok yönlü olduğunu göstermektedir. Sadece bu özel hücre tiplerinin belirlenmesi için kullanılabilir, ancak, aynı zamanda, belirli proteinler ve organellerin varlığını göstermek için kullanılabilir. Ancak, belirsiz sonuçlar boyama verimliliği beklenen varyasyonun kaynaklanıyor olabilir. Örneğin, anti-vaza en az bir gonad lekeliTüm larvaların% 73.2 incelendiğinde (n = 781), anti-ELAV larvaları (n = 115)% 86 beyinleri lekeli iken. Ayrıca, verimlilik boyama yaklaşık gelişme aşamasına kadar ters orantılı olduğunu görmekteyiz. Lekeleme (N = 132 ve 49) sadece sırasıyla% 59.8 ve L2 ve L3 orta okuyun, larvaların% 46.9 oranında mevcut iken geç evre embriyolarda anti-vasa (n = 206) gonad 89.8% boyandı. Buna ek olarak, örnek kaybına sonikasyon ile sonuçlanır. Embriyolar ve optimum sonikasyon numune hacmi içindeki mevcut olan larva sayısı, yukarıda ve sonikasyon sonrasında sayılmıştır olduğunda, numunenin% 41.0 arasında bir ortalama analizi (n = 1165) için uygun tespit edilmiştir. Verimliliği maksimize etmek için boyama, yayınlanmış protokoller antikor konsantrasyonları ya da antikor bir bekleme süresi değiştirilmesiyle özel antikorlar için optimize edilmelidir.
Şekil 1. I. yerinde Drosophila Erbezlerinden mmunostain (AD) geç dönem embriyoların in situ testis Görüntüleri (evre 17 / erken-L1) erken yoluyla / orta-L3 larvası, anti-Vasa (AD, kırmızı ile boyanmış; A'-D ' yalnız) germ hücrelerinin anti-Fasicilin III (Fas III) ve anti-1B1 (AD, yeşil algılamak için; A '- D') tek başına ', sırasıyla göbek hücreleri ve fusomes tespit etmek ve DAPI (AD, mavi A' 'çekirdekleri) algılamak için yalnız' 'D' '. (A) Sahne 17 / erken L1 testis farklılaşmamış germ hücreleri yeni kaynaştığı hub ve küresel fusomes gösterir. (B) Erken / orta-L1 testis lokalize GSC' lerin küresel fusomes gösterir germ hücreleri, erken Spermatogonial farklılaşmasının gösterge fusomes uzatılmış merkezi yakınında ve bazı posterior. (C) Erken / orta ve L2
In situ Şekil 2. immunostain Drosophila nöral dokularda. Erken / orta-L3 larvaları (anti-ELAV ile boyanmış
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, böylece başarılı bir diseksiyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, in situ Drosophila embriyonik ve larva hedef dokulara immunostain için bir yöntem sağlar. Erken embriyolar 1,2,3 boyanması için önce protokoller gereğince, koryonik membran% 50 çamaşır suyu (NaOCl) kullanılarak kaldırılır. Numuneler formaldehit ve metanol giderilmiştir. Larva kütikül yüzer eski numune neden olduğu için, bütün numune daha sonra larva tutulmasını sağlamak için bir hücre süzgecinden geçirildi. Örnek kimyasal dereceli metanol içinde, arzu edildiği takdirde, depolanır. Rehidrasyon sonra, düzgün bir şekilde uygulandığı sonifikasyon süreci larva manikür bütünlüğünü bozar. Bu immün için gerekli antikorların yeterli geçirgenliğine izin vermek için üst deri oluşumundan sonra kritiktir. % 5, normal serum örneği, antikor uygulamadan önce sallanan / BBTw çözelti aşırı olmayan antikor bağlanmasını engeller. Birincil antikorlar, daha sonra özel proteinler Expres tespit etmek için ilave edilirbu da hedef doku sed. Bağlanmamış primer antikorları uzaklaştırmak için yıkandıktan sonra, fluoroforlar bağlı ikincil antikorlar bağlı primer antikorların konumunu işaretlemek için kullanılır. Analiz sonra epifluoresan veya konfokal mikroskobu ile yapılabilir.
Bazı değişiklikler her bir durum içinde iyi sonuçları elde etmek için gerekli olabilir. Özellikle, güç ve sonikasyon yapılmıştır sonikasyon sayısı, kullanılan sonikatöre olarak ayarlanması gerekebilir. Numunenin üstüne, hem de çözelti hacmine sonikasyon probu yüksekliğine Adaptasyonlar ayrıca, farklı sonicators ya da yeterli sayıda örnek temin edilemiyorsa gerekebilir. Artan çözüm bulanıklık nedenle, sonifikasyon çok şiddetli olduğunda bir göstergesi sağlar doku lizis bir göstergesi olarak kullanılır ve edilebilir. Çözüm bulanıklık yüksek olursa, deneyci sonicato yüksekliğini yükselterek, çözelti hacmini artırarak, yapılan sonikasyon sayısını azaltarak düşünmelisinizr numunenin üstüne, prob, ve / veya sonikatör gücünü azaltır.
Değişiklikler aynı zamanda görüntü kalitesini artırmak için İmmünoboyama protokolde gerekli olabilir. En immun prosedürlerde olduğu gibi gürültü oranı sinyal antikor seyreltme, zaman ve numune ile antikor inkübasyon sıcaklığını değiştirerek, ve / veya kullanılan reaktifler engelleyerek değiştirilebilir. Her biri bağımsız bir şekilde antikor, dikkat edilmesi gereken birlikte, özellikle antikor seyreltme ile ilgili olarak, daha uzun süreler boyunca 4 ° C'de inkübasyon özellikle de düşük gürültü oranı sinyal-ve ne zaman daha büyük larvalar test edildi antikorlar için, sonikasyon sonra boyama kalitesini artırmak fark etmiştir. Bu durumlarda, boyama kalitesi ayrıca ikincil antikor seyreltme bir miktar azalma yararlanabilir. Bu protokol, bloke edici tepkin maddeler olarak BSA ve serum her ikisini de ve örnek boyama kalitesini artırmak için ikincil antikor ilave edilmeden önce bloke edilmiş hale getirildi. Antikorların da bağlı olarak,Her iki bloke edici tepkin maddeler d, yeniden bloke edilmesi ve dahil etme ya da lekeleme arttırılması için gerekli olabilir veya olmayabilir. Yeniden engelleme adım atlanırsa, uzun yıkar ve daha çalkalamalann temiz görüntü üretebilir. Son olarak, ön-emici poliklonal antikorlar, gürültü oranı sinyal arttırabilir. Ön-absorpsiyon rehidre embriyolar ya da immunostain 1 kullanılmadan önce larva ile istenen antikorun inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir.
Bizim için temsili sonuçlar gösterdiği gibi, ses etkisi in situ hedef dokuların açık görselleştirme sağlar ve böylece immünoboyama protokolleri doku diseksiyon için makul bir alternatif sağlar. Diseksiyon nedeniyle yerini izole ve hasarsız hedef dokulara ayıklanması zorluklara Drosophila embriyoları ve larvaları hantal olabilir. Alternatif olarak sonikasyon dokular tüm organizmanın bağlamında kalmasını sağlar. Sonication bir slayt ve bir kapak SLI arasındaki çıkarma ve montaj dokuları önler Çünküs, daha doğru yerinde morfolojik olarak korur. Birçok organizma aynı anda sonikasyona tabi olabilir pratik olarak, örneğin büyük miktarlarda, daha hızlı bir şekilde ilerde analiz edilmek üzere işlenebilir.
Sonication diseksiyon için harika bir alternatif olsa, bunu dikkate alınmalıdır sınırlamaları vardır. Sonikasyon avantajlı larva manikür bütünlüğünü bozan, ancak süreç içinde bazı örnek (Temsilcisi Sonuçlar bakın) yok eder. Biyolojik enkaz kaldırmak için durulama fazla örnek boyutunu azaltabilirsiniz sonikasyon işlemine, aşağıdakiler gereklidir. Buna ek olarak, tüm embriyolar ve larvaları immünolekeleme çevre dokular içine gömülü ilgilenilen doku bırakır. Bu çevreleyen dokular olumlu leke veya non-spesifik antikor böylece nihai görüntü kalitesini azaltarak, bağlama gösterebilir. Son olarak, verimliliği boyanarak değişken olabilir. Bu değişkenlik numune sonikasyon etkinlik ve antikor spesifikliği yaşına bağlıdır. Sonuç, sonikasyon-ba olaraktüm montaj doku sed immünoboyamasıdır her zaman tercih olmayabilir. Geç-L3 larvaları büyük dokuları inceleyerek Özellikle, diseksiyonu tabanlı İmmünoboyama daha verimli olabilir. Ayrıca, sonikasyon erken ve orta evre embriyolar yamultabilirsiniz. Bu kısıtlamalara rağmen, sonifikasyon tabanlı İmmünoboyama erken / orta-L3 larvaları ile geç evre embriyolar çeşitli dokularda gelişimini analiz etmek için uygundur son derece etkili bir tekniktir. Laboratuvarda, düzenli Drosophila embriyoları ve larvaları 9,10 gonad morfolojilerinden incelemek için bu protokolü kullanın. Ayrıca, bu protokolün uygulanması koruyucu manikür ile Drosophila diğer dokuların gelişimini incelemek ve diğer organizmalarda eşit verimli olacağını tahmin ediyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz nazik Vasa ve Trafik Jam antikorlar temin Ruth Lehman ve Dorthea Godt minnettarız. Biz NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi tarafından tutulan sağlanan hisse senetleri ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası korumak için Indiana Üniversitesi Bloomington Stok Merkezi'ni kabul etmek istiyorum. Biz onların tavsiye ve destek için Wawersik laboratuar tüm üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma Monroe Scholars Program Grant ve NSF (AF ve LB) (MW) IOS0823151 hibe ile finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
