Abstract
Gli studi condotti in Drosophila melanogaster embrioni e larve forniscono informazioni cruciali nei processi di sviluppo, come specifica il destino delle cellule e organogenesi. Immunocolorazione permette la visualizzazione di sviluppare tessuti e organi. Tuttavia, una cuticola protettiva che si forma al termine della embriogenesi impedisce permeazione di anticorpi in embrioni in fase avanzata e larve. Mentre dissezione prima della colorazione viene regolarmente utilizzato per analizzare i tessuti di Drosophila larvali, si rivela inefficiente per alcune analisi, perché i piccoli tessuti possono essere difficili da individuare e isolare. Sonicazione fornisce un'alternativa alla dissezione nei protocolli di immunoistochimica Drosophila larvali. Esso consente una rapida, l'elaborazione simultanea di un gran numero di embrioni in fase avanzata e le larve e mantiene nella morfologia situ. Dopo fissazione in formaldeide, un campione viene sonicato. Campione viene quindi sottoposto ad immunocolorazione con antigene-specifica formica primariaibodies e anticorpi secondari fluorescente di visualizzare tipi di cellule bersaglio e proteine specifiche mediante microscopia a fluorescenza. Durante il processo di sonicazione, il corretto posizionamento di una sonda sonicating sopra il campione, nonché la durata e l'intensità della sonicazione, è critica. Additonal piccole modifiche ai protocolli di immunoistochimica standard possono essere richiesti per le macchie di alta qualità. Per gli anticorpi con basso rapporto segnale rumore, tempi di incubazione più lunghi sono in genere necessari. Come un proof of concept per questo protocollo sonicazione-facilitato, mostriamo immunoistochimiche su tre tipi di tessuto (testicoli, ovaie, e tessuti neurali) ad una serie di stadi di sviluppo.
Introduction
Embrioni di Drosophila e larve forniscono un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo in molti organi e tessuti. Imaging delle singole cellule è spesso necessario in questi studi per verificare gli ambienti complessi in cui le cellule si sviluppano. Visualizzazione di cellule nei tessuti può essere realizzato attraverso immunostaining. Ben descritti immunoistochimica esistono protocolli per i tessuti embrionali di Drosophila <17 ore dopo la deposizione delle uova (AEL) 1-3. Tuttavia, un protettivo forme cuticola verso la fine dell'embriogenesi, impedendo efficace permeazione anticorpo. Così, questi protocolli immunostaining sono inefficienti per l'analisi dei tessuti in embrioni in ritardo-fase e nelle successive fasi di sviluppo larvale (1 ° instar (L1), 2 ° instar (L2), e 3 ° instar (L3)). Questa inefficienza impone un ostacolo alla nostra comprensione dei processi dinamici che si verificano durante il periodo di sviluppo prolungato 4. Tissue dissezione è una tecnica largamente impiegato per aggirare questa barriera 5-7. Tuttavia, dissezione può rivelarsi inefficiente. L'estrazione può essere gravato da difficoltà nel trovare o isolare embrionale e tessuti larvali. Inoltre, la rimozione fisica dei tessuti bersaglio può causare danni da loro rottura o omettendo di estrarli nella loro interezza.
La sonicazione è un metodo che impiega onde sonore disturbare interazioni intermolecolari. È stato usato per disturbare l'integrità della cuticola larvale Drosophila per immunostain sviluppare tipi di cellule neurali 6. Questo protocollo è stato adattato per immunostain ritardo-fase embrionale e larvale gonadi, che può essere piccolo come 50 micron di diametro 8-10. Attraverso tali studi, il processo di maschio di cellule staminali germinali (GSC) formazione di nicchia è stata caratterizzata nell'ultima fase embrioni di Drosophila 8-10 e meccanismi che regolano lo sviluppo delle cellule staminali e difdifferenzia- nell'ultima fase gonadi embrionali e le larve sono stati chiariti 9-12. Così, sonicazione fornisce un'alternativa efficiente per la dissezione dei tessuti che può essere difficile a causa delle dimensioni del tessuto. Inoltre, esso consente immunocolorazione di tessuti di Drosophila in situ, lasciando le cellule nel contesto dell'intero organismo e mantenuto in situ morfologia. Qui, descriviamo un protocollo step-by-step per fluorescenza immunoistochimica di ritardo-fase embrionale attraverso primi tessuti / mid-L3 in situ. Analisi di Drosophila gonadica e neurale tessuto è mostrato nelle Rappresentante dei risultati per dimostrare l'efficacia di questo protocollo. Inoltre, questo protocollo immunostaining può essere adattato ad analizzare altri tessuti di Drosophila così come i tessuti in altri organismi con una cuticola esterna.
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Protocol
1 Preparazione di una gabbia Collection
- Anestetizzare giovani, mosche fertili con CO 2. Trasferimento mosche anestetizzati ad una gabbia. Per ottenere il rendimento ottimale, utilizzare 100-120 mosche adulte che vanno da 2-7 giorni di età in un rapporto 4: 1 di femmine ai maschi. Consenti mosche un adeguato periodo di acclimatazione, ~ 24 ore prima di ottenere il campione per il fissaggio. Se la gabbia è stato istituito con femmine vergini accoppiato ai maschi, un uso un 36 - periodo di acclimatazione ore 48.
- Sulla estremità aperta della gabbia, mettere una piastra di agar succo di mela pre-preparata con una goccia monetina imprese di lievito in pasta al centro sopra l'apertura della gabbia. Quindi, fissare con nastro adesivo. Sigillare la giunzione tra la piastra di agar succo di mela e la gabbia con Parafilm.
- Posizionare la gabbia in un contenitore secondario con succo di mela piastra di agar come la base e consentire in linea di riprodurre ad una temperatura definita per un adeguato periodo di tempo determinato dall'esperimento.
Nota: i tempi di prelievo dei campioni will variare. Ad esempio, quando si raccolgono fase embrioni fine / inizio larve L1 (17-24 ore), permettono di mosche depongono le uova su piastre di agar succo di mela per 7 ore a 25 ° C prima della maturazione del campione per 17 ore a 25 ° C. Allo stesso modo, per una collezione di metà-fine primo larve instar (36 - 48 ore) permettono le mosche a deporre le uova per 12 ore a 25 ° C prima della maturazione del campione per 36 ore a 25 ° C. - Una volta che il periodo di tempo è completa, toccare la gabbia su un tavolo in modo che le mosche cadono lontano dalla piastra di agar succo di mela senza anestesia. Sostituire velocemente la piastra utilizzata con una nuova contenente una goccia di lievito in pasta. Fissare la piastra fresca con nastro adesivo e parafilm e conservare la gabbia con succo di mela piastra di agar come base.
- Rimuovere con cautela la goccia lievito dalla piastra utilizzato con una spatola metallica. Mettere il coperchio sulla piastra utilizzato succo di mela e consentono di cui gli embrioni di età, se necessario, sperimentalmente.
Nota: Durante l'invecchiamento dei campioni, le piastre possono essere conservati a 25 ° C a meno che temperature più alte sono Experimentally richiesta. Esempi di come invecchiare embrioni per la raccolta sono descritti in precedenza (vedi nota per la fase 1.3). Rimozione di lievito pasta prima di assaggiare l'invecchiamento viene eseguita per evitare che le larve di eseguire la scansione nel lievito e rompere l'agar sotto. Il restante succo di mela agar e incolla lievito residuo fornire sostanze nutritive per la crescita delle larve. Mentre gli embrioni di cui direttamente nella pasta lievito sono persi attraverso la rimozione lievito in pasta, questa perdita è preferibile lievito e residui di agar nel campione che può ridurre l'efficienza colorazione. Se uno sceglie di non rimuovere la pasta di lievito, lievito può essere liquefatto con tampone fosfato Triton X-100 (PBTx), mescolato con un pennello, e poi rimosso dal campione con un colino cella prima della fissazione.
2 Fissazione
- Una volta che gli embrioni di cui alla piastra di succo di mela agar sono invecchiati al punto di tempo desiderato, utilizzare un piccolo pennello bagnato con la soluzione tampone fosfato Triton X-100 (PBTx) per rimuovere con attenzione campione dal the piastra.
Nota: le larve più vecchie sono mobili e possono strisciare sulla parte interna del coperchio. Tale campione può essere raccolto in modo simile con asportazione con un pennello. - Pulire il pennello campione di carichi contro la cresta rivolta verso l'interno di un colino cella. Poi, lavare le pareti del filtro e il pennello con un flacone con spruzzatore contenente soluzione PBTx. Mettere un coperchio capsula di Petri sotto il filtro per catturare la soluzione PBTx.
- Dopo tutto il campione è stato trasferito al colino, versare abbastanza PBTx nel filtro per sollevare il campione fuori dalla rete. Quindi, sollevare il colino e versare il contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi.
- Ripetere il punto 2.3 tre volte per rimuovere il lievito e volano rifiuti che possono essere stati trasferiti con il campione.
- Versare abbastanza 50% di candeggina (ipoclorito di sodio) / acqua (DDH 2 O) soluzione nel filtro per sollevare le larve fuori dalla rete. Lasciare le larve di sedersi in soluzione per 5 min. Quindi, sollevare il filtro e versare tegli contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi.
Nota: Bleach è richiesto solo nei campioni embrionali di età compresa tra 0-22 ore, al fine di rimuovere la membrana coriale. L'applicazione di candeggina per campioni anziani può essere omesso, ma la sua inclusione non è dannosa. Se omissione si desidera, sostituire la candeggina in questa fase con PBTx. Candeggina diluita deve essere utilizzato entro 24 ore di preparazione della soluzione. - Lavare campione nel colino con PBTx versando abbastanza PBTx nel filtro per sollevare il campione fuori dalla rete. Lasciare campione di sedersi in soluzione per 3 min. Quindi, sollevare il colino e versare il contenuto della capsula di Petri in un contenitore di rifiuti liquidi.
- Ripetere il punto 2.6 cinque volte.
- Tamponare la parte inferiore del filtro cella a secco, poi trasferire campione in una fiala di scintillazione contenente 1,75 ml di soluzione PEMS con un pennello.
- Lavorare sotto cappa ventilata, aggiungere 250 ml di formaldeide al 37% e 8 ml di eptano grado reagente alla fiala di scintillazione.
- Lasciare che il flaconcino a scuotere a 200 rpm o una simile velocità moderata per 20 minuti.
- Aggiungere 10 ml di metanolo a scintillazione fiala senza rimuovere la fase acquosa precedente e consentire il flaconcino a scuotere vigorosamente a 500 rpm per 1 min.
Nota: Il metanolo è pericoloso. Continuare a lavorare in una cappa ventilata e indossare guanti adeguati. - Rimuovere fiala da shaker e versare immediatamente il contenuto in un colino cellule sopra un contenitore di rifiuti liquidi nella cappa. Aggiungi metanolo in più per il flaconcino e correre attraverso il filtro, se necessario, delle cellule al fine di garantire tutti i campioni è stato rimosso.
Nota: filtri cellula può defluire lentamente. Per ovviare a questo, toccare un tessuto laboratorio al fondo del filtro cella per disegnare la soluzione attraverso il filtro più rapidamente. Metanolo, formaldeide, e eptano dovrebbe essereimmagazzinato in appositi contenitori per rifiuti fino a corretto smaltimento secondo le linee guida istituzionali. - Fondo secco di filtro cella utilizzando un tessuto di laboratorio, quindi utilizzare un pennello per il trasferimento del campione catturato nel filtro in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 0,5 ml di metanolo.
Nota: Se più fiale di scintillazione sono in uso, completare i passaggi 2.12 e 2.13 una fiala alla volta per evitare che si secchi campione su filtri cellulari. - Una volta che il campione è stato aggiunto alla provetta, eliminare il metanolo con una pipetta. Garantire campione è depositata sul fondo della provetta.
- Sciacquare campione nella provetta con l'aggiunta di circa 0,5 ml di metanolo al tubo. Attendere per il campione di risolvere quindi rimuovere il metanolo con una pipetta.
- Ripetere il passaggio 15 tre volte.
- Aggiungere 0,5 ml di metanolo al tubo, e poi conservare in freezer a -20 ° C per un uso successivo.
3. reidratazione e preparazione di campioni per Immunostaining
- Rimuovere metanolo dalla provetta con una pipetta, lasciando il campione nel tubo. Conservare rifiuti metanolo al contenitore rifiuti appropriato fino al momento corretto smaltimento.
Nota: Per migliorare l'efficienza sonicazione, utilizzano non più di 3 mm di campione stabilirono sul fondo della provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Campione in eccesso può essere trasferita in un tubo separato con una pipetta prima di iniziare la fase di reidratazione sopra. Tagliare la punta della pipetta con una lama di rasoio pulito può essere usato per prevenire l'intasamento della punta della pipetta. - Aggiungere 1,0 ml di una soluzione al 50% di metanolo / tampone fosfato Tween (PBTw) al tubo e rock per 3 min.
- Rimuovere la soluzione di metanolo al contenitore dei rifiuti corretto e risciacquare con 1,0 ml di PBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare il campione di stabilirsi prima svinatura il PBTw con una pipetta.
- Aggiungere 1,0 ml di albumina sierica bovina / Tampone fosfato Tween (BBTw) mescolare al flaconcino e rock. Dopo 3 minuti su una sedia a dondolo, consentire la sample di stabilirsi e rimuovere il BBTw con pipetta.
- Ripetere il punto 3.4 due volte avendo cura di rimuovere quanto più BBTw possibile senza perdere campione dopo l'ultimo lavaggio.
- Aggiungere 0,5 ml di BBTw al tubo e posizionare il tubo in ghiaccio.
4 Sonicazione di Campione
- Impostare il sonicatore al 10% dell'ampiezza massima e designare un tempo di funzionamento di 2 sec costante sonicazione.
Nota: Queste impostazioni sono specifiche del sonicatore indicato nei Materiali e attrezzature Tavolo e possono richiedere l'ottimizzazione per i diversi sonicatori. - Prima di sonicazione di campione, pulire la sonda sonicatore posizionando la punta della sonda in un tubo da 50 ml riempita con acqua deionizzata e corsa di sonicazione per pulire la sonda. Sonda sonicatore secco con tessuto in laboratorio dopo l'esecuzione.
- Immergere la sonda nella provetta contenente campione in modo che sia posizionato a circa 3-4 mm sopra il campione e iniziare a sonicazione.
- Rimuovere il mtubo icrocentrifuge e metterlo in ghiaccio per almeno 30 secondi per dissipare il calore da sonicazione e permettere campione di stabilirsi sul fondo della provetta.
- Ripetere i punti 4.3 e 4.4, come necessario in base all'età di campione in fase di elaborazione.
Nota: Per ottimizzare il volume del campione sonicazione, gli embrioni più giovani di 17 ore non richiedono sonicazione, ma quelli tra 17 e 24 ore (fase 17 / early-L1) richiedono due sonications. Larve tra 24 - 36 (inizio / metà-L1), 36 - 48 (metà / fine-L1), 48 - 60 (inizio / metà-L2), 60-72 (metà / fine-L2), 72-84 ( early-L3), 84-96 (inizio / metà-L3), 96-108 (metà / fine-L3) hr richiedono 5, 9, 11, 13, 15, 18, e 22 sonications rispettivamente. Vedere di discussione per ulteriori elaborazioni sui tempi di sonicazione. - Sciacquare con 1,0 ml BBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare il campione di stabilirsi prima di trarre fuori BBTw con una pipetta.
- Aggiungere 1,0 ml di BBTw nel flacone e rock. Dopo 3 minuti a bilanciere, permettono il campione di stabilirsi e rimuovere il BBTw con pipetta. </ Li>
- Ripetere il punto 4.7 due volte.
5. Immunostaining
- Blocco campione con l'aggiunta di 5% di siero normale diluito in BBTw alla provetta. Rimuovere blocco dopo dondolo per 1 ora.
Nota: Utilizzare siero normale dalla specie in cui si generano gli anticorpi secondari. - Diluire gli anticorpi primari di appropriarsi concentrazione di lavoro in 5% di siero normale soluzione / BBTw.
- Campione di roccia in soluzione anticorpo primario O / N a 4 ° C o per almeno 3 ore a temperatura ambiente (circa 22 ° C.
Nota: i tempi di incubazione dell'anticorpo e le temperature possono variare. O / N di incubazione a 4 ° C o 3 ore a temperatura ambiente è tipicamente sufficiente. Tuttavia, un periodo di incubazione di due giorni può migliorare la qualità della colorazione, soprattutto con i campioni più grandi o quando si utilizzano anticorpi primari a bassa affinità. Incubazioni più lunghe sono in genere eseguite a 4 ° C. Analoghe considerazioni devono essere effettuate quando si utilizza anticorpi secondari (vedi 5.10). - Lasciare che il campione di stabilirsi afondo della provetta per microcentrifuga. Aspirare anticorpi primari con pipetta. Salvare gli anticorpi per il riutilizzo, se desiderato.
- Sciacquare con 1,0 ml di BBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare campione di stabilirsi prima di trarre fuori BBTw con una pipetta.
- Aggiungere 1,0 ml di BBTw nel flacone e rock. Dopo 3 minuti sul bilanciere, permettono campione di stabilirsi e rimuovere BBTw con pipetta.
- Ripetere il punto 5.6 cinque volte.
- Campione Block con l'aggiunta di 5% di siero normale soluzione / BBTw alla provetta. Rimuovere blocco dopo dondolo per 30 minuti a 1 ora.
Nota: Questo passaggio di bloccaggio supplementare non è necessario, ma può migliorare la qualità della colorazione degli anticorpi specifici. - Diluire anticorpi secondari di appropriarsi concentrazione di lavoro in 5% di siero normale soluzione / BBTw.
- Avvolgere provetta in un foglio di alluminio per ridurre il deterioramento causato da esposizione alla luce. Campione di roccia in soluzione di anticorpo secondario per 12-48 ore a 4 ° C o per almeno 3 ore a temperatura ambiente (circa 22 ° C.
- Lasciare campione a stabilirsi al fondo della provetta da microcentrifuga. Aspirare anticorpi secondari con pipetta.
- Sciacquare con 1,0 ml di PBTw due volte. Dopo ogni lavaggio lasciare campione di stabilirsi prima svinatura il PBTw con una pipetta.
- Aggiungere 1,0 ml di PBTw nel flacone e rock. Dopo 5 min a bilanciere, permettono il campione di stabilirsi e rimuovere il PBTw con pipetta.
- Ripetere il punto 5.13 tre volte.
- OPTIONAL: Aggiungi DAPI diluito 1: 1000 in PBTw. Campione di roccia avvolta in un foglio di alluminio per 3 min; quindi rimuovere soluzione DAPI con una pipetta. Sciacquare cinque volte con 1,0 ml di PBTw, permettendo campione di stabilirsi prima di rimuovere PBTw con pipetta.
- Aggiungi 80-100 ml di 1,4-diazabiciclo soluzione [2.2.2] ottano (DABCO) per provetta e conservare a -20 ° C.
Nota: un altro agente anti-fade base di glicerolo-può essere sostituito.
6 Analisi
- Prima del campione di montaggio su vetrini, aggiungere un extra di 5-10 ml di DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade soluzione provetta.
Nota: Il campione può essere aggiunto alle diapositive senza dissezione. Volume del campione aggiunto a una diapositiva varia con le dimensioni coprioggetto. Quando pipettaggio del campione sul vetrino, la punta della pipetta può essere tagliato con una lama di rasoio per evitare campione di taglio. Spesso è utile per allineare campione in file per l'analisi facile. L'aggiunta di PPD come agente antifade aggiuntivo potrebbe non essere necessaria, ma può impedire photobleaching se i campioni vengono conservati a lungo termine. - Posizionare delicatamente antiscivolo copertura in vetro sopra del campione. Poi, polizza di copertura sicura in posizione con smalto.
- Visualizza montato campione utilizzando la microscopia a fluorescenza.
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Representative Results
Per dimostrare l'efficacia di immunoistochimica basata sonicazione-analisi di ritardo-fase embrionale e tessuti larvali in situ, wild-type embrioni e larve sono stati trattati per immunoistochimica dei testicoli, ovaie e tessuto neurale. I campioni sono stati ripresi tramite microscopia confocale e risultati rappresentativi sono mostrati (Figura 1 e Figura 2). I risultati rivelano che il protocollo descritto è efficace per la visualizzazione di caratteri morfologici, nonché le singole cellule in situ durante / mid-L3 fasi tardo-embrionale fino all'inizio dello sviluppo di Drosophila.
I risultati di Testicolo Immunostain:
Sviluppo del testicolo è un particolarmente buon sistema per illustrare l'efficacia del protocollo in quanto testicoli maturazione è dinamico durante lo sviluppo larvale. Testicoli adulti Drosophila formano un tubo spiralato con una estremità cieca, dove il cellule staminali germinali (GSC) di nicchia si trova (vedi 13,14 per le recensioni). In questa nicchia, GSC sono disposte attorno a un gruppo stretto di cellule somatiche non mitotiche chiamato hub. GSC subiscono divisione asimmetrica per produrre un GSC che rimane ancorato al mozzo e una figlia gonialblast che è spostato lontano dalla nicchia delle cellule staminali. Come il gonialblast divide in modo incompleto, estensioni citoplasmatiche chiamate forma fusomes, che collega le cellule all'interno del spermatogonio. Dopo 4 divisioni successive, il spermatogonio avvia meiosi per formare lo sperma.
Formazione del testicolo inizia con l'associazione delle cellule germinali primordiali (PGC) e somatiche cellule precursori gonadi (SGPS) durante l'embriogenesi (cfr 15,16 per le recensioni). Questa associazione si traduce nella formazione di una nicchia GSC funzionale per la fine del embriogenesi 8-10. A metà L1, divisioni GSC asimmetrici all'interno della nicchia SGC danno luogo a differenziare spermatogoni con fusomes ramificati 9. Asimmetrica divisione GSC continua per tutta larvalesviluppo, con conseguente produzione di spermatogoni aggiuntivo e un progressivo aumento delle dimensioni delle gonadi. Immagini rappresentative della testicoli / mid-L1, L2 e L3 embrionali tardivi e precoci, immunostained per le cellule germinali, cellule hub, e fusomes, sono mostrati (Figura 1A-D). Queste immagini illustrano i cambiamenti dinamici in formato gonade e la differenziazione delle cellule germinali nei testicoli osservati nel corso del tempo.
I risultati di Immunostain Ovaio:
Ovaie adulti Drosophila sono composte da 16-20 singole unità-base di uova che producono detti ovarioli (cfr 17,18 per le recensioni). Ad una estremità di ciascun ovariole, una struttura chiamata germarium contiene una nicchia di cellule staminali. La nicchia ovariole è composto da GSC indifferenziato e due popolazioni di cellule somatiche: cellule del cappuccio e cellule di filamenti terminali (TFS). Simile al testicolo, GSC subiscono divisione asimmetrica per produrre un GSC che rimane adiacente alle cellule del cappuccio e una cella differenziante figlia, Chiamato cystoblast, che viene spinto lontano dalla nicchia. Il cystoblast subisce in seguito 4 cicli di divisione cellulare per formare una cisti linea germinale, collegati tra loro da un fusome ramificata. Ogni linea germinale-cisti è poi circondato da cellule follicolari per produrre una camera uovo che continua a maturare come si muove lungo la lunghezza del ovariole.
Come testicoli, ovaie sono prima formate durante l'embriogenesi 16,18. Più ovarioli derivano da una singola gonade embrionale composto da PGC e di PSC. A metà L3, di PSC danno origine a precursori TF presso anteriore dell'ovaio, mentre le cellule germinali si localizzano al posteriore ovaio e associato con le cellule mescolate SGP-derivati (CI) 19-22. Alla fine del-L3, le cellule TF differenziano e organizzano nelle pile si trovano nella nicchia di cellule staminali adulte, GSC e le cellule del cappuccio sono stabiliti, e la differenziazione germinale cisti si osserva 19,20,23. Immagini rappresentative della in ritardo-fase embrionale e l'inizio / ovaie mid-L3, immunostained per le cellule germinali, SGPS, circuiti integrati, precursori TF, e fusomes, sono mostrati (Figura 1E, F). Queste immagini mostrano la morfologia normale e la progressione di sviluppo per la loro età.
Risultati da neurale Immunostain:
Il sistema nervoso centrale Drosophila (CNS) è derivato da cellule staminali neurali, chiamate neuroblasti (NBS), che derivano da neuroepitelio embrionale (cfr 24,25 per le recensioni). NBs in embrioni e larve divide asimmetricamente per la produzione di cellule madri ganglio (GMC), che, a loro volta, generano neuroni e cellule gliali presenti nel cervello adulto e di cordone nervoso ventrale. Perché NBs larvali danno luogo alla maggior parte dei neuroni adulti e possono essere distinte in base alla loro posizione all'interno del cervello, il cervello larvali sono diventati un importante modello per studiare il comportamento NB e differenziamento neurale.
Il cervello L3 è composto di due lobi e un cordone nervoso ventrale centrale 24.Immagini rappresentative di cervelli mid-L3 immunostained per NBs, GMC, i neuroni indifferenziati, i neuroni immaturi e primarie e cellule gliali sono mostrati (Figura 2A-C) 26-30. Queste immagini mostrano una forte colorazione nel pattern di espressione distinti all'interno dei lobi cerebrali e il cordone nervoso ventrale. A seconda direzione di montaggio, l'imaging permette la visualizzazione tessuto cerebrale dalla superficie dorsale (Figura 2A), superficie ventrale (Figura 2B), o in sezione sagittale (Figura 2C).
Efficienza colorazione:
I nostri risultati rappresentativi dimostrano che una procedura di immunoistochimica a base di sonicazione-è versatile. Non solo può essere usato per identificare i tipi cellulari specifici, ma anche può essere usato per indicare la presenza di proteine e organelli specifici. Tuttavia, i risultati ambigui possono derivare dalla variazione attesa in termini di efficienza colorazione. Ad esempio, anti-vasa macchiato almeno una gonadenel 73,2% di tutte le larve esaminati (n = 781), mentre anti-Elav macchiato cervelli nel 86% delle larve (n = 115). Inoltre, osserviamo che la colorazione efficienza è approssimativamente inversamente proporzionale alla fase di sviluppo. In embrioni in fase avanzata, anti-vasa macchiata 89,8% delle gonadi (n = 206), mentre la colorazione era presente solo nel 59,8% e il 46,9% delle larve in L2 e L3 metà, rispettivamente (n = 132 e 49). Inoltre, i risultati sonicazione in perdita di campione. Quando il numero di embrioni e larve presenti in un volume ottimale campione sonicazione è stato contato prima e dopo sonicazione, una media del 41,0% del campione è stata determinata inadatto per analisi (n = 1165). Per massimizzare l'efficienza colorazione, protocolli dovrebbero essere ottimizzati per anticorpi specifici alterando le concentrazioni di anticorpi pubblicati o tempi di incubazione dell'anticorpo.
Figura 1 I. mmunostain delle gonadi Drosophila in situ (AD) Immagini di testicoli in situ in embrioni in fase avanzata (stadio 17 / early-L1) fino all'inizio / metà-L3 larve immunoistochimica con anticorpi anti-Vasa (AD, rosso, A'-D ' solo) per rilevare le cellule germinali, anti-Fasicilin III (Fas III) e anti-1B1 (AD, verde, A '' - D '' solo) per rilevare rispettivamente le cellule hub e fusomes, e DAPI (AD, blu, A ' '' '' D 'da solo) per rilevare nuclei. (A) Fase 17 / inizio L1 testicolo mostra l'hub di recente fuse e fusomes sferiche nelle cellule germinali indifferenziate. (B) Sacra / mid-L1 testicolo mostra fusomes sferiche in GSC localizzate nei pressi del centro e in alcune cellule germinali posteriori allungate fusomes indicativi della prima differenziazione spermatogoni. (C) Sacra / mid-L2 e
Figura 2 Immunostain di tessuti neurali Drosophila in situ. Sacra / mid-L3 larve immunostained con anti-Elav (
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Discussion
Questo protocollo fornisce un metodo per indirizzare correttamente immunostain Drosophila embrionale e tessuti larvali in situ, eliminando così la necessità di dissezione. Come per i protocolli precedenti per la colorazione embrioni precoci 1,2,3, la membrana corionica viene rimossa con il 50% di candeggina (NaOCl). I campioni sono fissati in formaldeide e metanolo. Poiché la cuticola larvale provoca campione più vecchio a stare a galla, l'intero campione viene fatto passare attraverso una cella-filtro per garantire la conservazione delle larve. Campione viene memorizzato, se lo si desidera, nella chimica-grade metanolo. Dopo reidratazione, un processo di sonicazione correttamente attuato interrompe l'integrità della cuticola larvale. Questo è fondamentale dopo la formazione cuticola per consentire una sufficiente permeazione di anticorpi necessari per immunocolorazione. Prima di applicare gli anticorpi, dondolo il campione in un siero normale 5% / soluzione BBTw previene fissazione eccessiva di anticorpi non specifico. Gli anticorpi primari sono poi aggiunti per rilevare proteine specifiche expressed nel tessuto bersaglio. Dopo il lavaggio per rimuovere gli anticorpi non legati primari, anticorpi secondari legati a fluorofori sono usati per contrassegnare la posizione di anticorpi primari legati. L'analisi può essere eseguita con epifluorescenza o microscopia confocale.
Alcune modifiche possono essere necessarie per ottimizzare i risultati nei singoli casi. In particolare, il potere sonicazione e il numero di sonications eseguite possono richiedere modifiche a seconda del sonicatore utilizzato. Adattamenti all'altezza della sonda sonicatore sopra il campione e per volume di soluzione può anche essere richiesto per diversi sonicatori o se campione sufficiente non può essere ottenuta. Aumento della torbidità soluzione può essere usata come indicatore di lisi dei tessuti e, quindi, fornisce un indicatore per quando sonicazione è troppo grave. Se la soluzione diventa elevata torbidità, lo sperimentatore deve considerare la riduzione del numero di sonications eseguite, aumentando volume della soluzione, aumentando l'altezza del sonicatosonda r sopra il campione, e / o riducendo la potenza di sonicazione.
Alterazioni può essere richiesto anche nel protocollo immunostaining per migliorare la qualità dell'immagine. Come con la maggior parte delle procedure di immunoistochimica il rapporto segnale-rumore può essere modificata modificando la diluizione degli anticorpi, il tempo e la temperatura di incubazione dell'anticorpo con il campione, e / o il blocco dei reagenti utilizzati. Mentre ogni anticorpo deve essere considerato in modo indipendente, in particolare per quanto riguarda la diluizione degli anticorpi, troviamo che l'incubazione a 4 ° C per periodi più lunghi può migliorare la qualità della colorazione dopo sonicazione, soprattutto per gli anticorpi con basso rapporto segnale rumore e quando le larve anziani sono esaminati. In questi casi, la qualità della colorazione può anche beneficiare di una leggera riduzione della diluizione anticorpo secondario. In questo protocollo, includiamo sia BSA e siero come reagenti di blocco, e il campione viene nuovamente bloccato prima aggiunta di anticorpi secondari, al fine di aumentare la qualità della colorazione. A seconda delle utilizzano anticorpid, ri-blocco e l'inclusione di entrambi i reagenti bloccanti possono o non possono essere tenuti a migliorare la colorazione. Se la fase di ri-blocco viene omesso, lavaggi più lunghi e più risciacqui possono produrre immagini più nitide. Infine, gli anticorpi policlonali pre-assorbenti possono aumentare il rapporto segnale rumore. Pre-assorbimento avviene tramite l'incubazione l'anticorpo desiderato con embrioni o larve prima di utilizzare in un immunostain 1 reidratati.
Come dimostrato nei nostri risultati rappresentativi, sonicazione permette per una chiara visualizzazione dei tessuti bersaglio in situ e, quindi, fornisce una ragionevole alternativa alla dissezione dei tessuti nei protocolli di immunoistochimica. La dissezione può essere ingombrante in embrioni di Drosophila e larve a causa di difficoltà nel localizzare, isolare, e l'estrazione di tessuti bersaglio non danneggiate. In alternativa sonicazione permette tessuti di rimanere nel contesto dell'intero organismo. Perché sonicazione evita di estrazione e tessuti di montaggio tra una diapositiva e un sli copertinap, conserva più precisamente in situ morfologia. Praticamente, grandi quantità di campione possono essere trattati in modo più rapido per le analisi future, dal momento che molti organismi possono essere sonicati contemporaneamente.
Anche se sonicazione offre una grande alternativa per dissezione, essa ha dei limiti che devono essere considerati. Sonicazione sconvolge beneficamente l'integrità della cuticola larvale ma distrugge qualche campione nel processo (vedi Rappresentante dei risultati). Risciacquo per rimuovere i detriti biologici è necessaria a seguito del processo di sonicazione, che può ridurre ulteriormente la dimensione del campione. Inoltre, immunocolorazione embrioni interi e larve lascia il tessuto di interesse incorporati nei tessuti circostanti. Questi tessuti circostanti possono macchiare positivamente o mostrare un legame di anticorpi non specifico, riducendo in tal modo la qualità dell'immagine finale. Infine, la colorazione efficienza può essere variabile. Questa variabilità può dipendere dall'età di campione, l'efficacia sonicazione e specificità anticorpale. Come risultato, sonicazione-baimmunocolorazione sed di tutto-mount tessuto può non essere sempre preferibile. In particolare, immunostaining base dissezione-può essere più efficiente quando si studia grandi tessuti in tardo-L3 larve. Inoltre, sonicazione può tosare early e mid-stage embrioni. Nonostante queste limitazioni, immunostaining base sonicazione-è una tecnica altamente efficiente che si adatta bene per analizzare lo sviluppo di una varietà di tessuti in embrioni in ritardo-fase con l'inizio / metà-L3 larve. Nel nostro laboratorio, usiamo regolarmente questo protocollo per studiare gonade morfogenesi in embrioni di Drosophila e larve 9,10. Inoltre, prevediamo che l'attuazione di questo protocollo si rivelerà altrettanto fecondo nello studio dello sviluppo di altri tessuti in Drosophila e in altri organismi con una cuticola protettiva.
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Acknowledgments
Siamo grati a Ruth Lehman e Dorthea Godt che ci ha gentilmente fornito gli anticorpi Vasa e traffico Jam. Vorremmo riconoscere il Bloomington Stock Center presso l'Indiana University per mantenere le scorte e la Developmental Studies Ibridoma Banca, sotto gli auspici del NICHD e mantenuti da The University of Iowa. Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Wawersik per i loro consigli e sostegno. Questo lavoro è stato finanziato dalla Monroe Scholars Program Grant (per AF e LB) e NSF concedere IOS0823151 (a MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
