Abstract
Undersøgelser udført i Drosophila melanogaster embryoner og larver giver afgørende indsigt i udviklingsprocesser såsom celle skæbne specifikation og organogenesis. Immunfarvning giver mulighed for visualisering af udvikle væv og organer. Men en beskyttende neglebånd, der udgør ved udgangen af embryogenese forhindrer gennemtrængning af antistoffer i sene embryoner og larver. Mens dissektion før immunfarvning regelmæssigt bruges til at analysere Drosophila larvernes væv, det viser sig ineffektiv for nogle analyser fordi små væv kan være svært at finde og isolere. Lydbehandling giver et alternativ til dissektion i larvernes Drosophila immunfarvning protokoller. Det giver mulighed for hurtig, samtidig behandling af et stort antal sene embryoner og larver og har i stedet morfologi. Efter fiksering i formaldehyd, en prøve sonicated. Prøven underkastes derefter immunofarvning med antigen-specifikke primære myreibodies og fluorescensmærkede sekundære antistoffer for at visualisere mål celletyper og specifikke proteiner via fluorescensmikroskopi. Under processen med lydbehandling, korrekt placering af en sonikerende sonde over prøven, samt varigheden og intensiteten af lydbehandling, er kritisk. Det kan være nødvendigt Additonal mindre ændringer af standard immunfarvning protokoller efter kvalitet pletter høj. For antistoffer med lavt signal-støj-forholdet, længere inkubationstider er typisk nødvendig. Som en proof of concept for denne lydbehandling lettet protokol, viser vi immunostains tre vævstyper (testikler, æggestokke, og neurale væv) på en afstand af udviklingsstadier.
Introduction
Drosophila embryoner og larver giver en fremragende model til at studere udviklingsprocesser i mange organer og væv. Scanning af individuelle celler er ofte nødvendigt i disse undersøgelser for at fastslå de komplekse miljøer, hvor celler udvikler. Visualisering af celler i væv kan gøres ved immunfarvning. Velbeskrevet immunfarvning protokoller findes for embryonale Drosophila væv <17 timer efter æglægning (AEL) 1-3. Men en beskyttende neglebånd formularer mod slutningen af embryogenese, der hindrer effektiv antistof gennemtrængning. Således er disse immunfarvning protokoller er ineffektive i analysen af væv i sene fostre og i de efterfølgende faser af larvernes udvikling (1. stadie (L1), 2. stadie (L2), og 3. stadie (L3)). Denne ineffektivitet pålægger en barriere for vores forståelse af dynamiske processer, der opstår i løbet af denne forlængede udviklingsperiode 4. Tissue dissektion er en almindeligt anvendt teknik til at omgå denne barriere 5-7. Imidlertid kan dissektion bevise ineffektiv. Ekstraktion kan tynget af vanskeligheder med at finde eller isolering embryonale og larvernes væv. Desuden kan fysisk fjernelse af målvæv forårsage skade ved at briste dem eller ved ikke at udvinde dem i deres helhed.
Sonikering er en metode, der anvender lydbølger til at forstyrre intermolekylære interaktioner. Det er blevet anvendt til at forstyrre integriteten af Drosophila larvestadiet kutikula for at immunfarve udvikle neurale celletyper 6. Denne protokol er blevet tilpasset til immunfarve senfase embryonale og larvernes kønskirtler, som kan være så lille som 50 um i diameter 8-10. Gennem sådanne undersøgelser, er processen med mandlige germline stamcelle (GSC) niche dannelse blevet karakteriseret i sent stadium Drosophila embryoner 8-10 og mekanismer, der regulerer stamceller udvikling og difrentiering i sene stadier embryonale gonader og larver er blevet belyst 9-12. Således lydbehandling giver et effektivt alternativ til væv dissektion, der kan være vanskelig på grund af væv størrelse. Desuden giver det mulighed for immunfarvning af Drosophila væv in situ, hvilket efterlader cellerne inden for rammerne af hele organismen og opretholdelse in situ morfologi. Her beskriver vi en trin-for-trin-protokol til fluorescens immunfarvning af sen-fase embryonale gennem tidlig / midt-L3 væv in situ. Analyse af Drosophila gonade og nervevæv er vist i Repræsentative resultater at påvise effekten af denne protokol. Endvidere kan denne immunfarvning protokol tilpasses til at analysere andre Drosophila væv samt væv i andre organismer med en ydre kutikula.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af en samling Cage
- Bedøve unge, frugtbare fluer med CO 2. Overførsel bedøvede fluer til et bur. For at opnå optimalt udbytte ved at bruge 100-120 voksne fluer spænder fra 2-7 dage gammel på en 4: 1-forhold mellem kvinder til mænd. Tillad fluer en passende akklimatiseringsperiode ~ 24 timer forud for opnåelse af prøven til fiksering. Hvis buret blev oprettet med jomfruelige hunner parret til mænd, en anvendelse en 36-48 timers akklimatisering periode.
- På den åbne ende af buret, placere en forud forberedt æblesaft agarplade med en dime-størrelse dråbe gær pasta i midten over åbningen i buret. Derefter fastgør med tape. Seal krydset mellem æblesaft agarplade og buret med Parafilm.
- Placer buret i en sekundær beholder med æblesaft agarplade som base og lade fluerne til at reproducere ved en defineret temperatur i et passende tidsrum, som fastsættes af eksperimentet.
Bemærk: Indsamling gange will variere. For eksempel, når indsamling embryoer sen / tidlig L1 larver (17 - 24 timer), tillade fluer at lægge æg på æblejuice agarplader i 7 timer ved 25 ° C før ældning af prøven i 17 timer ved 25 ° C. Tilsvarende for en samling af mid-sen første stadie larver (36 - 48 timer) tillader fluer at lægge æg i 12 timer ved 25 ° C før ældning af prøven i 36 timer ved 25 ° C. - Når tidsperioden er færdig, skal du trykke på bur på et bord, så fluer falde væk fra æblesaft agarplade uden bedøvelse. Hurtigt erstatte den brugte plade med en frisk ene indeholder en dråbe af gær pasta. Fastgør frisk plade med tape og parafilm og gemme buret med æblesaft agarplade som base.
- Fjern forsigtigt gær fald fra de anvendte plade med en metal spatel. Placer låget på brugte æblesaft plade og tillader lagt embryoner til alder, hvis eksperimentelt nødvendigt.
Bemærk: Mens aldring prøver, kan pladerne opbevaret ved 25 ° C, medmindre højere temperaturer er Experimentally påkrævet. Eksempler på, hvordan man ældes embryoner til indsamling er beskrevet ovenfor (se note til trin 1.3). Fjernelse af gær pasta før prøve aldring udføres for at forhindre larver i at kravle ind i gær og bryde op agar nedenunder. Den resterende æblesaft agar og gær pasta rest giver næringsstoffer for larvernes vækst. Mens embryoner, der er direkte i gær pasta går tabt gennem gær pasta fjernelse dette tab er at foretrække frem for gær og agar rest i prøven, der kan reducere farvning effektivitet. Hvis man vælger ikke at fjerne gær pasta, kan gær flydende med fosfatbuffer Triton X-100 (PBTx), blandet med en pensel, og derefter fjernet fra prøven med en cellefilter før fiksering.
2. Fiksering
- Når embryoner, der er på æblejuice agarplade har alderen til det ønskede tidspunkt, skal du bruge en lille pensel vædet med fosfatbuffer Triton X-100 (PBTx) løsning til forsigtigt at fjerne prøve fra the plade.
Bemærk: Ældre larver er mobile og kan kravle på indersiden af låget. Denne prøve kan indsamles på samme måde ved at fjerne med en pensel. - Tør prøve-belæsset pensel mod den indvendige vendende højderyg i en celle si. Derefter skylles væggene i sien og pensel med en sprayflaske indeholdende PBTx løsning. Placer en petriskål stout sien at fange PBTx løsning.
- Efter alt at prøven er blevet overført til si, hæld nok PBTx i sien til at hæve prøven fra masken. Derefter løfte si og hælde indholdet af petriskålen i en flydende affaldsbeholder.
- Gentag trin 2.3 tre gange for at fjerne gær og flyve affald, der kan være blevet overført sammen med prøven.
- Hæld nok 50% blegemiddel (NaOCI) / vand (Hedeselskabet 2 O) løsning i sien til at hæve larverne fra masken. Tillad larver til at sidde i opløsning i 5 min. Løft derefter sien og hæld ud than indholdet af petriskål i et flydende affald.
Bemærk: Bleach kræves kun i embryonale prøver alderen 0-22 timer for at fjerne den chorion membran. Anvendelsen af blegemiddel til ældre prøver kan udelades, men dets optagelse er ikke skadelig. Hvis der ønskes undladelse, udskifte blegemiddel i dette trin med PBTx. Fortyndet blegemiddel bør anvendes inden 24 timer af opløsning forberedelse. - Vask prøve i sien med PBTx ved at hælde nok PBTx i sien til at hæve prøven fra masken. Tillad prøven at sidde i opløsningen i 3 minutter. Derefter løfte si og hælde indholdet af petriskålen i en flydende affaldsbeholder.
- Gentag trin 2.6 fem gange.
- Dup bunden af cellefilter tørre, og derefter overføre prøven i et scintillationshætteglas indeholdende 1,75 ml PEMS opløsning ved hjælp af en pensel.
- Arbejde i et ventileret stinkskab tilsættes 250 pi af 37% formaldehyd og 8 ml reagenskvalitet heptan til scintillationshætteglas.
- Lad hætteglasset rystes ved 200 rpm eller en lignende moderat hastighed i 20 min.
- Der tilsættes 10 ml methanol til scintillationshætteglas uden forudgående vandige fase fjernes og tillade hætteglasset rystes kraftigt ved 500 rpm i 1 min.
Bemærk: Methanol er farligt. Fortsæt med at arbejde i et ventileret stinkskab og bære egnede handsker. - Fjern hætteglasset fra shaker og straks hælde indholdet i en celle si over en flydende affaldscontainer i hætten. Tilføj ekstra methanol til hætteglasset og løbe gennem cellefilter som nødvendigt for at sikre, at alle prøven er blevet fjernet.
Bemærk: Cell sier kan dræne langsomt. For at afhjælpe dette, skal du trykke et laboratorium væv til bunden af cellen si for at trække opløsningen gennem sien hurtigere. Methanol bør formaldehyd og heptan væreoplagres i egnede affaldsbeholdere indtil korrekt bortskaffelse som pr institutionelle retningslinjer. - Tør bunden af cellefilter hjælp af et laboratorium væv, derefter bruge en pensel til at overføre prøve fanget i sien til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 0,5 ml methanol.
Bemærk: Hvis der er flere scintillationsflasker er i brug, komplet trin 2.12 og 2.13 et hætteglas ad gangen for at forhindre prøve fra tørring på celle harper. - Når prøven er blevet tilføjet til mikrocentrifugerør, fjernelse af methanol med en pipette. Sikre prøven er fast til bunden af røret.
- Skyl prøven i mikrocentrifugerør ved tilsætning ca. 0,5 ml methanol til røret. Vent for prøve at bosætte derefter fjerne methanol med en pipette.
- Gentag trin 15 tre gange.
- Tilsæt 0,5 ml methanol til røret, og derefter opbevares i en -20 ° C fryser til senere brug.
3. Rehydrering og Udarbejdelse af Prøve til Immunfarvning
- Fjernelse af methanol fra mikrocentrifugerør med en pipette, der forlader prøven i røret. Store methanol affald til den passende affaldsbeholder indtil tidspunktet for korrekt bortskaffelse.
Bemærk: For at øge lydbehandling effektivitet, brug ikke mere end 3 mm prøve afgjort i bunden af den 1,5 ml mikrocentrifugerør. Overskydende prøve kan overføres til et separat rør med en pipette, før du begynder rehydratiseringstrinnet ovenfor. Skæring pipettespidsen med et rent barberblad kan anvendes til at forhindre tilstopning af pipettespidsen. - Tilsæt 1,0 ml af en 50% methanol / fosfatbuffer Tween (PBTw) opløsning til røret og rock i 3 min.
- Fjern methanolopløsning til den korrekte affaldsbeholder og skyl med 1,0 pi PBTw to gange. Efter hver udvaskning skal prøve at bundfælde sig, før aftapning af PBTw med en pipette.
- Tilsæt 1,0 ml okseserumalbumin / Fosfatbufferet Tween (BBTw) blandes til hætteglasset og rock. Efter 3 min på en rocker, tillader Sample til at bosætte sig og fjerne BBTw med pipette.
- Gentag trin 3.4 to gange tog sig for at fjerne så meget BBTw som muligt uden at miste prøve efter den sidste vask.
- Tilsæt 0,5 ml BBTw til røret og læg røret på is.
4. Sonikering af prøve
- Indstil ultralydsapparat til 10% maksimal amplitude og udpege en køretid på 2 sek konstant lydbehandling.
Bemærk: Disse indstillinger er specifikke for sonikatoren angivet i materialer og udstyr Bord og kan kræve optimering for forskellige sonicators. - Forud for lydbehandling prøve, rense sonikatoren sonden ved at placere probespidsen i en 50 ml konisk rør fyldt med demineraliseret vand og løbe sonicator at rense sonden. Tør sonikator sonde med laboratorie væv efter løb.
- Nedsænkes sonden i mikrocentrifugerør indeholdende prøven, så det er placeret cirka 3 til 4 mm over prøven og begynde sonikering.
- Fjern microcentrifuge rør og placere den på is i mindst 30 sekunder til at sprede varme fra lydbehandling og lad prøven sig på bunden af mikrocentrifugerør.
- Gentag trin 4.3 og 4.4 efter behov baseret på alder af prøve, der behandles.
Bemærk: For optimal lydbehandling prøvevolumen, embryoner yngre end 17 timer kræver ikke lydbehandling, men dem mellem 17 og 24 timer (trin 17 / tidlig-L1) kræver to sonications. Larverne mellem 24-36 (tidlig / midt-L1), 36-48 (midten / slutningen-L1), 48-60 (tidligt / midt-L2), 60-72 (midten / slutningen-L2), 72-84 ( tidlig-L3), 84-96 (tidligt / midt-L3), 96-108 (midten / slutningen-L3) hr kræver 5, 9, 11, 13, 15, 18, og 22 sonications hhv. Se diskussion for yderligere uddybning af lydbehandling tider. - Skyl med 1,0 ml BBTw to gange. Efter hver udvaskning Lad prøven bundfælde sig, før aftapning BBTw med en pipette.
- Tilsæt 1,0 ml BBTw til hætteglasset og rock. Efter 3 min på vippen, tillade prøven at bosætte sig og fjerne BBTw med pipette. </ Li>
- Gentag trin 4.7 to gange.
5. Immunfarvning
- Bloker prøven ved tilsætning af 5% normalt serum fortyndet i BBTw til mikrocentrifugerør. Fjern blok efter rocking i 1 time.
Bemærk: Brug normalt serum fra de arter, hvor de sekundære antistoffer er genereret. - Fortyndet primære antistoffer til passende arbejde koncentration i 5% normalt serum / BBTw løsning.
- Rock prøve i primær antistofopløsning O / N-ved 4 ° C eller i mindst 3 timer ved stuetemperatur (ca. 22 ° C.
Bemærk: Antistof inkubationstider og temperaturer kan variere. O / N-inkubation ved 4 ° C eller 3 timer ved stuetemperatur er typisk tilstrækkelig. Dog kan en to-dages inkubationstid forbedre farvning kvalitet, især med ældre stikprøver eller når der anvendes lav-affinitet primære antistoffer. Længere inkubationer udføres typisk ved 4 ° C. Tilsvarende overvejelser skal foretages ved brug af sekundære antistoffer (se 5.10). - Tillad prøve at afregne tilbunden af mikrofugerør. Tegn off primære antistoffer med pipette. Gem antistoffer til genbrug, hvis det ønskes.
- Skyl med 1,0 ml BBTw to gange. Efter hver udvaskning tillade prøve at bundfælde sig, før aftapning BBTw med en pipette.
- Tilsæt 1,0 ml BBTw til hætteglasset og rock. Efter 3 min på vippen, tillade prøve at bosætte sig og fjerne BBTw med pipette.
- Gentag trin 5.6 fem gange.
- Blok prøven ved tilsætning af 5% normalt serum / BBTw løsning på mikrocentrifugerør. Fjern blok efter rocking i 30 minutter til 1 time.
Bemærk: Denne supplerende blokering trin er ikke påkrævet, men kan forbedre farvning kvalitet til specifikke antistoffer. - Fortyndet sekundære antistoffer til passende arbejde koncentration i 5% normalt serum / BBTw løsning.
- Wrap mikrocentrifugerør i aluminiumfolie for at reducere fading på grund af udsættelse for lys. Rock prøve i sekundært antistof opløsning i 12 til 48 timer ved 4 ° C eller i mindst 3 timer ved stuetemperatur (ca. 22 ° C.
- Tillad prøve at bilægge til bunden af mikrofugerør. Tegn off sekundære antistoffer med pipette.
- Skyl med 1,0 ml PBTw to gange. Efter hver udvaskning tillade prøve at bosætte sig, før der drages off PBTw med en pipette.
- Tilsæt 1,0 ml PBTw til hætteglasset og rock. Efter 5 min på vippen, tillade prøven at bosætte sig og fjerne PBTw med pipette.
- Gentag trin 5.13 tre gange.
- EKSTRA: Tilføj DAPI fortyndet 1: 1.000 i PBTw. Stenprøve indpakket i aluminiumsfolie i 3 minutter; derefter fjerne DAPI løsning med en pipette. Skyl fem gange med 1,0 ml PBTw, så prøve at bosætte sig, før du fjerner PBTw med pipette.
- Tilføj 80-100 pi 1,4-diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) opløsning til mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C.
Bemærk: En anden glycerol-baserede anti-fade middel kan erstatte.
6. Analyse
- Før montering prøve på dias, tilføje en ekstra 5 - 10 ul af DABCO / p-Phenylenediamine (PPD) antiblegemiddel løsning mikrocentrifugerør.
Bemærk: Prøven kan tilsættes til objektglas uden dissektion. Prøvevolumen føjet til et dias varierer med dækglas størrelse. Når pipettering prøve på dias, kan pipettespidsen skæres fra ved hjælp af et barberblad for at forhindre prøve klipning. Det er ofte nyttigt at line prøve op i rækker for nem analyse. Tilsætningen af PPD som en ekstra antiblegemiddel middel kan ikke kræves, men kan forhindre fotoblegning hvis prøver opbevares på lang sigt. - Anbring forsigtigt dækglas løbet prøve. Så sikker dækglas på plads ved hjælp af neglelak.
- Se monteret prøve under anvendelse af fluorescensmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere effekten af lydbehandling-baserede immunfarvning i analyse af sen-fase embryonale og larvernes væv in situ blev vildtype-embryoner og larver forarbejdet til immunfarvning af testikler, æggestokke, og nervevæv. Prøver blev afbildet via konfokal mikroskopi og repræsentative resultater er vist (figur 1 og figur 2). Resultaterne viser, at den beskrevne protokol er effektiv til at visualisere morfologiske funktioner samt enkelte celler in situ under sene-embryonale gennem tidlig / midt-L3 stadier af Drosophila udvikling.
Resultater fra Testikel IMMUNOFARVNING:
Testis udvikling er et særlig godt system til illustration protokol effekt da testiklerne modning er dynamisk hele larveudvikling. Voksen Drosophila testikler danne et sammenrullet rør med en blind ende, hvor kimcellelinje stamcelle (GSC) niche er beliggende (se 13,14 for anmeldelser). I denne niche, der GSCS grupperet omkring en stram klynge af ikke-mitotiske somatiske celler kaldet navet. GSCS gennemgå asymmetrisk division til at producere en generalsekretariatet der forbliver forankret til navet og en datter gonialblast der er forskudt væk fra stamceller niche. Som gonialblast skiller ufuldstændigt cytoplasmatiske udvidelser kaldet fusomes form forbinder cellerne i spermatogonium. Efter 4 på hinanden følgende divisioner, indleder spermatogonium meiose at danne sædceller.
Testis dannelse begynder med sammenslutningen af primordiale kønsceller (PGC'er) og somatiske gonadale prækursorceller (SGPS) under embryogenese (se 15,16 til anmeldelser). Denne forening resulterer i dannelsen af en funktionel GSC niche ved udgangen af embryogenese 8-10. I midten af L1, asymmetriske GSR divisioner i generalsekretariatet niche giver anledning til at differentiere spermatogonier med forgrenede fusomes 9. Asymmetrisk GSC division fortsætter hele larvestadietudvikling, hvilket resulterer i produktion af ekstra spermatogonier og en gradvis stigning i gonade størrelse. Repræsentative billeder af sene embryonale og tidlige / medio L1, L2 og L3 testikler, immunofarvede til kønsceller, hub celler og fusomes, er vist (figur 1A-D). Disse billeder illustrerer de dynamiske ændringer i gonade størrelse og kim celledifferentiering observeret i testiklerne over tid.
Resultater fra Æggestok IMMUNOFARVNING:
Voksen Drosophila æggestokke er sammensat af 16-20 individuelle æg-producerende enheder kaldet ovarioles (se 17,18 til anmeldelser). Ved den ene ende af hver ovariole, en struktur, der kaldes germarium indeholder en stamcelle niche. Den ovariole niche er sammensat af udifferentierede GSCS og to populationer af somatiske celler: cap celler og terminale endeløse celler (TFS). Svarende til testiklerne, GSCS gennemgå asymmetrisk division til at producere en generalsekretariatet, der forbliver støder op til cap celler og en differentierende datter celle, Kaldet en cystoblast, som skubbes væk fra niche. Den cystoblast efterfølgende gennemgår 4 runder celledeling til at danne en kim-line cyste, indbyrdes forbundet af et forgrenet fusome. Hver kimcellelinje-cyste derefter omgivet af follicle celler til at producere et æg kammer, der fortsætter med at modnes som den bevæger sig ned af længden af ovariole.
Ligesom testiklerne, er ovarier først dannes under embryogenese 16,18. Flere ovarioles opstår fra en enkelt embryonale gonade består af PGC'er og SVP'er. I midten af L3, SVP'er give anledning til TF forstadier på æggestokkene forreste, mens kønsceller lokalisere til æggestokkene bageste og omgås SGP-afledte sammenblandede celler (ICs) 19-22. Ved sen-L3, TF celler differentiere og organisere sig i stakkene fundet i voksne stamceller niche, er GSCS og cap celler etableret, og kim-line cyste differentiering observeres 19,20,23. Repræsentative billeder af sen-fase embryonale og tidlig / midt-L3 æggestokke, immunostained til kønsceller, SVP'er, IC'er, TF forstadier og fusomes, er vist (figur 1E, F). Disse billeder viser normal morfologi og udviklingsmæssige progression for deres alder.
Resultater fra Neural IMMUNOFARVNING:
Drosophila centralnervesystemet (CNS) er afledt fra neurale stamceller, kaldet neuroblaster (NBS), der opstår fra embryonale neuroepithelium (se 24,25 til anmeldelser). NBs i embryoner og larver kløft asymmetrisk at producere ganglion mor celler (GMC), som til gengæld generere neuroner og gliaceller findes i den voksne hjerne og ventrale nerve ledning. Fordi larval NBs giver anledning til de fleste voksne neuroner og kan skelnes ud fra deres placering i hjernen, er larvernes hjerner blevet en vigtig model til at studere NB adfærd og neurale differentiering.
L3 hjerne består af to kamre, og en centralt placeret ventrale nerve ledning 24.Repræsentative billeder af medio L3 hjerner immunofarvede til bemyndigede organer, GMC, udifferentierede neuroner, umodne og primære neuroner og gliaceller er vist (figur 2A-C) 26-30. Disse billeder viser en stærk farvning i distinkte ekspressionsmønstre i hjernen lapper og ventrale nerve ledningen. Afhængig af montering orientering, billeddannelse tillader hjernevæv visualisering fra den dorsale overflade (figur 2A), ventrale overflade (figur 2B) eller i sagittal tværsnit (figur 2C).
Farvning effektivitet:
Vores repræsentative resultater viser, at en lydbehandling baseret immunfarvning procedure er alsidig. Ikke alene kan det bruges til at identificere specifikke celletyper, men også kan bruges til at indikere tilstedeværelsen af specifikke proteiner og organeller. Kan imidlertid tvetydige resultater skyldes forventede variation i farvning effektivitet. For eksempel anti-vasa farves mindst én gonadei 73,2% af alle larver undersøgt (n = 781), mens anti-Elav farves hjerner i 86% af larverne (n = 115). Desuden observerer vi, at farvning effektivitet er omtrent omvendt proportional med udviklingsstadiet. I sene fostre, anti-Vasa farvet 89,8% af gonader (n = 206), mens farvning var kun til stede i 59,8% og 46,9% af larver på L2 og medio L3 henholdsvis (n = 132 og 49). Desuden sonikering resulterer i prøven tab. Når antallet af embryoner og larver til stede i en optimal sonikering prøvevolumen blev talt før og efter sonikering, blev et gennemsnit på 41,0% af prøven bestemmes uegnet til analyse (n = 1.165). For at maksimere farvning effektivitet bør protokoller optimeres til specifikke antistoffer ved at ændre offentliggjorte antistofkoncentrationer eller antistof inkubationstider.
Figur 1. I. mmunostain af Drosophila gonader in situ (AD) Billeder af testikler på stedet i sene embryoner (stadie 17 / tidlig-L1) gennem tidlig / midt-L3 larver immunfarvet med anti-Vasa (AD, rød; A'-D ' alene) til påvisning af kønsceller, anti-Fasicilin III (FAS III) og anti-1B1 (AD, grøn, A '- D' alene) for at påvise hub celler og fusomes henholdsvis og DAPI (AD, blå, A ' '' D '' 'alene) for at påvise kerner. (A) Trin 17 / tidlig L1 testikel viser den nyligt coalesced nav og sfæriske fusomes i udifferentierede kønsceller. (B) Tidlig / mid-L1 testikel viser sfæriske fusomes i GSCS lokaliseret nær navet og i nogle bageste kønsceller aflange fusomes indikative for tidlig spermatogontesten differentiering. (C) Tidlig / mid-L2 og
Figur 2. IMMUNOFARVNING af Drosophila neurale væv in situ. Tidlig / medio L3 larver immunfarvet med anti-Elav (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en metode til succes immunofarvningsprocedure målrette Drosophila embryonale og larvernes væv in situ, hvilket eliminerer behovet for dissektion. Som pr tidligere protokoller til farvning tidlige embryoner 1,2,3 er chorion membran fjernes ved hjælp af 50% blegemiddel (NaOCI). Prøverne er fastsat i formaldehyd og methanol. Fordi larvestadiet kutikula forårsager ældre prøve at flyde, er hele prøven derefter ledt gennem en celle-si at sikre larvernes tilbageholdelse. Prøven opbevares, hvis det ønskes, i kemisk-grade methanol. Efter rehydrering en korrekt gennemført lydbehandlingsprocessen forstyrrer integriteten af larve kutikula. Dette er kritisk efter kutikula formationen for at muliggøre en tilstrækkelig gennemtrængning af antistoffer, der kræves for immunfarvning. Før du anvender antistoffer, vuggende prøven i en normal serum 5% / BBTw løsning forhindrer overdreven uspecifik antistof binding. Primære antistoffer tilsættes derefter til påvisning af specifikke proteiner expressed i målvævet. Efter vask for at fjerne ubundne primære antistoffer er sekundære antistoffer bundet til fluoroforer anvendes til at markere placeringen af bundne primære antistoffer. Analyse kan derefter udføres med epifluorescens eller konfokal mikroskopi.
Nogle ændringer kan være nødvendigt at optimere resultater i individuelle omstændigheder. Især kan sonikering strøm og antallet af sonications udføres kræve justering afhængig sonikator anvendes. Kan også være påkrævet tilpasninger til højden af sonikatoren sonden over prøven samt løsning volumen for forskellige sonicators eller hvis der er tilstrækkelig prøve kan ikke opnås. Øget turbiditeten kan anvendes som en indikator for væv lysering, og tilvejebringer derfor en måler, når sonikering er også svær. Hvis opløsning uklarhed bliver høj, bør forsøgslederen overveje at reducere antallet af sonications udførte stigende løsning volumen, øge højden af sonicator sonde over prøven, og / eller reduktion sonikator magt.
Ændringer kan også være påkrævet i immunfarvning protokollen til at forbedre billedkvaliteten. Som med de fleste immunfarvning procedurer signal-støj-forholdet kan ændres ved at ændre antistoffortynding, tid og temperatur af antistof inkubering med prøve, og / eller blokering reagenser. Mens hvert antistof skal betragtes uafhængigt af hinanden, navnlig med hensyn til antistoffortynding, finder vi, at inkubation ved 4 ° C i længere perioder kan forbedre farvning kvalitet efter lydbehandling, især for antistoffer med lavt signal til støj-forhold, og når ældre larver undersøges. I disse tilfælde kan farvning kvalitet også nyde godt af et lille fald i sekundært antistof fortynding. I denne protokol, inkluderer vi både BSA og serum som blokerende reagenser, og prøven igen blokeret før tilsætning af sekundære antistoffer for at øge farvning kvalitet. Afhængigt af antistofferne brugerd, re-blokering og inddragelse af både blokerende reagenser kan eller ikke kan være forpligtet til at forbedre farvning. Hvis re-blokerende trin er udeladt, kan længere vasker og flere skylninger producere renere billeder. Endelig kan præ-absorberende polyklonale antistoffer øge signal-støj-forholdet. Pre-absorption udføres ved at inkubere det ønskede antistof med rehydrerede embryoner eller larver før anvendelse i en immunofarvningsprocedure 1.
Som påvist i vores repræsentative resultater, lydbehandling giver mulighed for en klar visualisering af målvæv in situ og dermed giver et fornuftigt alternativ til væv dissektion i immunfarvning protokoller. Dissektion kan være besværligt i Drosophila embryoner og larver grund af vanskeligheder med at finde, isolere og udvinde ubeskadigede målvæv. Alternativt lydbehandling tillader væv at forblive i forbindelse med hele organismen. Fordi lydbehandling undgår udvinder og montering væv mellem et dias og et dæksel SLIp, det mere præcist bevarer in situ morfologi. Praktisk, kan store mængder af prøven behandles hurtigere til fremtidig analyse, da mange organismer kan sonicated samtidigt.
Selv lydbehandling giver et godt alternativ til dissektion, det har sine begrænsninger, der skal overvejes. Sonikering gunstig forstyrrer integriteten af larvestadiet neglebånd men ødelægger nogle eksempler i processen (se Repræsentative resultater). Skylning at fjerne biologisk affald er påkrævet efter lydbehandlingsprocessen, hvilket yderligere kan reducere stikprøve. Desuden immunfarvning hele embryoner og larver forlader vævet af interesse indlejret i omgivende væv. Disse omgivende væv kan plette positivt eller vise ikke-specifikt antistof binding, og dermed reducere den endelige billedkvalitet. Endelig kan farvning effektivitet være variabel. Denne variabilitet kan afhænge af alder af prøve, lydbehandling effektivitet, og antistof-specificitet. Som et resultat, lydbehandling-based immunfarvning af hel-mount væv kan ikke altid være at foretrække. Især kan dissektion-baserede immunfarvning være mere effektive, når de studerer store væv i slutningen af L3 larver. Desuden kan lydbehandling snitte tidlige og midt-embryoer. På trods af disse begrænsninger, lydbehandling-baserede immunfarvning er en yderst effektiv teknik, der er velegnet til at analysere udviklingen af en række forskellige væv i sene embryoner gennem tidlig / midt-L3 larver. I vores laboratorium, vi regelmæssigt bruger denne protokol til at studere gonade morfogenese i Drosophila embryoner og larver 9,10. Endvidere forventer vi, at gennemførelsen af denne protokol vil vise sig lige så frugtbar i at studere udviklingen af andre væv i Drosophila og andre organismer med en beskyttende neglebånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Ruth Lehman og Dorthea Godt som venligt leveret Vasa og Trafikprop antistoffer. Vi vil gerne anerkende den Bloomington Stock Center på Indiana University for at opretholde de leverede bestande og den Developmental Studies Hybridom Bank udviklet i regi af den NICHD og vedligeholdes af University of Iowa. Vi takker alle medlemmer af Wawersik laboratorium for deres rådgivning og støtte. Dette arbejde blev finansieret af Monroe akademikere program Grant (til AF og LB) og NSF indrømme IOS0823151 (til MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
