Abstract
Studier utført i Drosophila melanogaster embryo og larver gi avgjørende innsikt i utviklingsprosesser som celle skjebne spesifikasjon og organogenesis. Immunostaining tillater visualisering av utvikling av vev og organer. Imidlertid er en beskyttende hårstråene som dannes ved enden av embryogenesen hindrer gjennomtrengning av antistoffer i sene stadier av befruktede egg og larver. Mens disseksjon før farging blir jevnlig brukt til å analysere Drosophila larver vev, beviser det ineffektivt for noen analyser fordi små vev kan være vanskelig å lokalisere og isolere. Sonikering gir et alternativ til disseksjon i larve Drosophila farging protokoller. Det gir mulighet for rask, samtidig behandling av et stort antall sene stadier av befruktede egg og larver og vedlikeholder in situ morfologi. Etter fiksering i formaldehyd, er et eksempel sonikert. Prøven blir deretter utsatt for farging med antigen-spesifikke primære mauribodies og fluorescensmerkede sekundære antistoff for å visualisere target celletyper og spesifikke proteiner via fluorescens mikroskopi. Under prosessen med sonikering, er passende plassering av en sonisk sonde over prøven, så vel som varigheten og intensiteten av sonikering, kritisk. Kan være nødvendig Ytterligere mindre modifikasjoner til standard farging protokoller for høy kvalitet flekker. For antistoffer med lav signal til støyforhold, lengre inkubasjonstid er vanligvis nødvendig. Som et bevis på konseptet for denne sonication-tilrettelagt protokollen, viser vi immunostains av tre vevstyper (testikler, eggstokker, og nervevev) på en rekke utviklingsstadier.
Introduction
Drosophila embryo og larver gir en utmerket modell for å studere utviklingsprosesser i mange organer og vev. Avbildning av individuelle celler er ofte nødvendig i disse studiene for å fastslå de komplekse miljøer der cellene utvikler. Visualisering av celler i vev kan oppnås ved farging. Godt beskrevet farging protokoller finnes for embryonale Drosophila vev <17 timer etter egglegging (AEL) 1-3. Imidlertid en beskyttende cuticle former mot slutten av embryogenesen, hindrer effektivt antistoff gjennomtrengning. Dermed disse Immunostaining protokollene er ineffektive i analysen av vev i sene stadier av embryoer og i senere stadier av larveutvikling (1 st instar (L1), 2. instar (L2), og 3. instar (L3)). Dette ineffektivitet pålegger en barriere til vår forståelse av dynamiske prosesser som oppstår under denne utvidede utviklingsperioden fire. Tissue disseksjon er en mye brukt teknikk for å omgå denne barrieren 5-7. Kan imidlertid vise seg å være ineffektiv disseksjon. Utvinning kan være beheftet med problemer med å finne eller isolere embryonale og larve vev. Videre kan den fysiske fjerning av målvev forårsake skade ved å sprekker dem eller ved å unnlate å pakke dem i sin helhet.
Sonikering er en metode som benytter lydbølger å forstyrre intermolekylære interaksjoner. Det har blitt benyttet for å forstyrre integriteten til Drosophila larve hårstråene for å utvikle immunostain nevrale celletyper 6. Denne protokollen er tilpasset immunostain sent stadium embryonale og larve gonader, som kan være så liten som 50 ym i diameter 8-10. Gjennom slike studier, har prosessen med mannlige germline stamcelle (GSC) nisje dannelse vært preget i sent stadium Drosophila embryoer 8-10 og mekanismer som regulerer stamcelle utvikling og differentiation i sent stadium embryonale gonader og larver har blitt belyst 9-12. Således gir sonikering et effektivt alternativ til vev disseksjon som kan være vanskelig på grunn av vev størrelse. Videre muliggjør den farging av Drosophila vev in situ, slik at cellene innenfor rammen av hele organismen og opprettholde in situ morfologi. Her beskriver vi en steg-for-steg-protokollen for fluorescens farging av sent stadium embryonale gjennom tidlig / midten av L3 vev i situ. Analyse av Drosophila gonadal og nervevev er vist i de representative resultater for å demonstrere effekten av denne protokollen. Videre kan denne farging protokollen kan tilpasses for å analysere andre Drosophila vev, så vel som vev i andre organismer med en ytre hårstråene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av en opphenting Cage
- Anesthetize unge, fruktfluer med CO 2. Overfør bedøvede fluer til et bur. For å oppnå optimal avkastning, bruker 100-120 voksne fluer som strekker seg fra 2-7 dager gammel på et 4: 1-forhold av kvinner til menn. Tillat fluer en passende akklimatiseringsperiode, ~ 24 timer før prøven for å oppnå fiksering. Hvis buret ble satt opp med jomfruelige kvinner parret til menn, en bruk en 36 - 48 timers akklimatiseringsperiode.
- På den åpne enden av buret, plassere en pre-forberedt eplejuice agarplate med en krone-størrelse dråpe gjærpasta midt over åpningen i buret. Deretter festes med tape. Tett krysset mellom eplejuice agar plate og buret med Parafilm.
- Plasser buret i en sekundær beholder med eplejuice agarplate som base og tillate fluene til å gjengi ved en definert temperatur i et passende tidsrom som bestemt av eksperimentet.
Merk: prøvetaking ganger will variere. For eksempel, når du samler sent stadium embryo / tidlig L1 larver (17. - 24. time), la fluene til å legge egg på eplejuice agar plater for 7 timer ved 25 ° C før aldring av prøven for 17 timer ved 25 ° C. Tilsvarende, for en samling av mid-sen første stadiums larver (36 - 48 timer) lar fluer for å legge egg i 12 timer ved 25 ° C før aldring av prøven etter 36 timer ved 25 ° C. - Når perioden er ferdig, trykk buret på et bord, slik at fluer slippe unna eplejuice agar plate uten bedøvelse. Raskt erstatte brukte plate med en ny en som inneholder en dråpe gjærpasta. Fest fersk plate med tape og parafilm og lagre buret med eplejuice agar plate som base.
- Fjern forsiktig gjær slipp fra brukte plate med en metallspatel. Plasser lokket på brukte eplejuice plate og la lagt embryoer til alder hvis eksperimentelt nødvendig.
Merk: Når aldringsprøver, kan platene lagres ved 25 ° C med mindre høyere temperaturer er Experimentally nødvendig. Eksempler på hvordan å alder embryoer for samlingen er beskrevet ovenfor (se merknad for trinn 1.3). Fjerning av gjærpasta før prøve aldring er utført for å hindre larver kryper inn i gjær og bryte opp agar under. De resterende eplejuice agar og gjær lim rester gi næringsstoffer for larve vekst. Mens embryoer legges direkte i gjærpasta blir tapt gjennom gjærpasta fjerning, er dette tapet foretrekke å gjær og agar residuet i prøven som kan redusere fargingseffektivitet. Skulle man velge å ikke fjernes gjærpasta, kan gjær være flytende med fosfatbuffer Triton X-100 (PBTx), blandet med en pensel, og deretter fjernet fra prøven med en celle sil før fiksering.
2. Fixation
- Når embryoer lagt ut på eplejuice agar plate har alderen til ønsket tidspunkt, bruke en liten pensel fuktet med fosfatbuffer Triton X-100 (PBTx) løsning for å forsiktig fjerne prøve fra the plate.
Merk: Eldre larver er mobilt og kan krype inn på innsiden av lokket. Denne prøven kan hentes på samme måte, ved å fjerne med en pensel. - Tørk prøven-laden pensel mot det indre-vendt ryggen av en celle sil. Deretter skyller veggene i sil og pensel med en skvett flaske inneholder PBTx løsning. Plasser en petriskål deksel under sil for å fange PBTx løsning.
- Etter at alle prøven har blitt overført til silen, helles nok PBTx inn i sil for å heve prøven av nettingen. Deretter løfter silen og helle ut innholdet i petriskålen til et flytende avfallsbeholder.
- Gjenta trinn 2.3 tre ganger for å fjerne gjær og fly avfall som kan ha blitt overført sammen med prøven.
- Hell nok 50% blekemiddel (NaOCl) / vann (DDH 2 O) løsning i sil for å heve larver av nettingen. Tillat larver til å sitte i oppløsningen i 5 minutter. Deretter løfter silen og helle ut tHan innholdet i petriskål i en flytende avfallsbeholder.
Merk: Bleach er nødvendig bare i embryonale prøver i alderen 0-22 timer for å fjerne chorionic membran. Anvendelse av blekemiddel til eldre prøver kan bli utelatt, men inkludering dens ikke er skadelig. Dersom unnlatelse er ønskelig, erstatte blekemiddel i dette trinnet med PBTx. Fortynnet blekemiddel skal brukes i løpet av 24 timer av løsningspreparat. - Vask prøven i silen med PBTx ved å helle nok PBTx inn i sil for å øke utvalget av mesh. Tillat prøven å sitte i løsningen i 3 min. Deretter løfter silen og helle ut innholdet i petriskålen til et flytende avfallsbeholder.
- Gjenta trinn 2.6 fem ganger.
- DAB bunnen av cellen sil tørt, og deretter overføre prøven til et scintillasjonsglass inneholdende 1,75 ml av PEMS løsning ved hjelp av en pensel.
- Å arbeide i et ventilert avtrekksskap, tilsett 250 pl av 37% formaldehyd og 8 ml reagenskvalitet heptan til scintillasjonsglass.
- La hetteglasset til å riste ved 200 opm eller et lignende middels hastighet i 20 min.
- Tilsett 10 ml metanol til scintillasjonskyvette uten å fjerne den tidligere vandige fasen og tillater flasken for å riste kraftig ved 500 opm i 1 min.
Merk: Metanol er farlig. Fortsett å jobbe i et ventilert avtrekkshette og slitasje egnede hansker. - Fjern hetteglasset fra shaker og umiddelbart hell innholdet i en celle sil over en flytende avfallsbeholder i panseret. Legg ekstra metanol til ampullen, og drives gjennom cellen sil som er nødvendig for å sikre at hele prøven har blitt fjernet.
Merk: Cell siler kan renne sakte. For å bøte på dette, berører en laboratorie vev til bunnen av cellen sil for å trekke oppløsningen gjennom silen raskere. Metanol, bør formaldehyd, og heptan blioppbevares i egnede avfallsbeholdere til riktig avhending som per institusjonelle retningslinjer. - Tørr bunnen av cellen ved hjelp av en laboratorie-sil vev, og deretter bruke en pensel for å overføre prøven fanget i silen til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 0,5 ml metanol.
Merk: Hvis flere scintillasjonsrør er i bruk, komplett trinn 2.12 og 2.13 ett hetteglass om gangen for å hindre prøve fra tørking på celle siler. - Når prøven er blitt lagt til mikro tube, fjerne metanol med en pipette. Sørg prøven har lagt seg på bunnen av røret.
- Skyll prøven i mikrosentrifugerør ved tilsetning av ca 0,5 ml metanol til røret. Vent på prøven for å bosette og deretter fjerne metanol med en pipette.
- Gjenta trinn 15 tre ganger.
- Tilsett 0,5 ml metanol til røret, og deretter lagres i en -20 ° C fryser for senere bruk.
3. Utvanning og Fremstilling av prøve for Immunostaining
- Fjern metanol fra mikrosentrifugerør med en pipette, slik at prøven i røret. Butikken metanol avfall til riktig avfallsbeholderen inntil tidspunktet for riktig avhending.
Bemerk: For å forbedre effektiviteten sonikering, bruke ikke mer enn 3 mm av prøven avgjort på bunnen av 1,5 ml mikrosentrifugerør. Overflødig prøven kan overføres til et eget rør med en pipette før du begynner rehydrering trinnet over. Cutting pipettespissen med et rent barberblad kan brukes til å forhindre tilstopping av pipettespissen. - Tilsett 1,0 ml av en 50% metanol / fosfatbuffer Tween (PBTw) oppløsning til røret og skjær i 3 min.
- Fjern metanolløsning til riktig avfallsbeholderen og skyll med 1,0 mL av PBTw to ganger. Etter hver skylling, la prøven avgjøre før tegning av PBTw med en pipette.
- Legg 1,0 ml Bovine Serum Albumin / Fosfatbufret Tween (BBTw) bland til hetteglasset og rock. Etter 3 min på en rocker, la SAMPle å bosette og fjerne BBTw med pipette.
- Gjenta trinn 3.4 to ganger å ta vare å fjerne så mye BBTw som mulig uten å miste prøven etter siste vask.
- Tilsett 0,5 ml BBTw til røret og legg røret på is.
4. Sonikering av Sample
- Sett sonicator til 10% maksimal amplitude og utpeke en løpetid på 2 sek konstant lydbehandling.
Merk: Disse innstillingene er spesifikke for sonicator angitt i materialer og utstyr Tabell og kan kreve optimalisering for ulike sonicators. - Før sonikering av prøven, rense sonicator sonden ved å plassere sondespissen til et 50 ml konisk rør fylt med deionisert vann, og ultralyddrevet til å rense sonden. Tørr sonicator probe med laboratorie vev etter løp.
- Senk sonden inn i mikrosentrifugerør inneholdende prøven, slik at det er plassert omtrent 3 til 4 mm over prøven og begynne sonikering.
- Fjern microcentrifuge rør og plassere den på is i minst 30 sekunder for å spre varme fra sonikering og tillate prøven å slå seg ned på bunnen av den mikrosentrifugerør.
- Gjenta trinn 4.3 og 4.4 etter behov, basert på alder av prøven blir behandlet.
Merk: For optimal sonication prøvevolum og foster yngre enn 17 hr ikke krever lydbehandling, men de mellom 17 og 24 timer (stadium 17 / tidlig-L1) krever to sonications. Larver mellom 24 - 36 (tidlig / medio-L1), 36 - 48 (midten / slutten-L1), 48 - 60 (tidlig / midten av L2), 60-72 (midten / slutten-L2), 72-84 ( tidlig-L3), 84-96 (tidlig / mid-L3), 96-108 (midten / slutten-L3) hr krever 5, 9, 11, 13, 15, 18, og 22 sonications hhv. Se diskusjonen for ytterligere utdypning på Sonikering ganger. - Skyll med 1,0 ml BBTw to ganger. Etter hver skylling La prøven avgjøre før tegning av BBTw med en pipette.
- Legg 1,0 ml BBTw til hetteglasset og rock. Etter 3 min på rocker, la prøven å bosette og fjerne BBTw med pipette. </ Li>
- Gjenta trinn 4.7 to ganger.
5. Immunostaining
- Blokkere prøven ved å tilsette 5% normal serum fortynnet i BBTw til mikrorøret. Fjern blokk etter risting i 1 time.
Merk: Bruk normalt serum fra de arter hvori den sekundære antistoffer genereres. - Fortynne primære antistoffer til egnede arbeids konsentrasjon i 5% normal serum / BBTw løsning.
- Bergartsprøve i primær antistoffløsning O / N ved 4 ° C eller i minst 3 timer ved romtemperatur (ca. 22 ° C.
Merk: Antistoff inkubasjonstider og temperaturer kan variere. O / N inkubasjon ved 4 ° C eller 3 timer ved romtemperatur er vanligvis tilstrekkelig. Imidlertid, kan en to-dagers inkuberingsperiode forbedre fargingskvalitet, særlig med store prøver eller ved lav-affinitet primære antistoffer brukes. Lengre inkubasjon blir typisk utført ved 4 ° C. Tilsvarende betraktninger må gjøres ved bruk av sekundære antistoffer (se 5.10). - Tillat prøve å bosette tilbunnen av mikro-sentrifugerør. Tegn av primære antistoffer med pipette. Lagre antistoffer for gjenbruk hvis ønskelig.
- Skyll med 1,0 ml BBTw to ganger. Etter hver skylling tillate prøve å avgjøre før tegning av BBTw med en pipette.
- Legg 1,0 ml BBTw til hetteglasset og rock. Etter 3 min på rocker, tillate prøve å bosette og fjerne BBTw med pipette.
- Gjenta trinn 5.6 fem ganger.
- Blokk prøve ved å tilsette 5% normalt serum / BBTw løsning på mikrosentrifugerør. Fjern blokk etter risting i 30 min til 1 time.
Merk: Denne ekstra blokkering trinnet er ikke nødvendig, men kan forbedre farging kvalitet for spesifikke antistoffer. - Fortynne sekundære antistoffer til egnede arbeids konsentrasjon i 5% normal serum / BBTw løsning.
- Pakk mikrosentrifugerør i aluminiumsfolie for å redusere falming på grunn av lyseksponering. Bergartsprøve i sekundær antistoffløsning i 12 til 48 timer ved 4 ° C eller i minst 3 timer ved romtemperatur (ca. 22 ° C.
- Tillat prøven å slå seg ned til bunnen av mikro-sentrifugerør. Tegn av sekundære antistoffer med pipette.
- Skyll med 1,0 ml PBTw to ganger. Etter hver skylling tillate prøve å avgjøre før tegning av PBTw med en pipette.
- Legg 1,0 ml PBTw til hetteglasset og rock. Etter 5 min på rocker, la prøven å bosette og fjerne PBTw med pipette.
- Gjenta trinn 5.13 tre ganger.
- EKSTRA: Legg DAPI fortynnet 1: 1000 i PBTw. Bergartsprøve innpakket i aluminiumsfolie i 3 min; deretter fjerne DAPI løsning med en pipette. Skyll fem ganger med 1,0 ml av PBTw, slik at prøven å avgjøre før fjerning PBTw med pipette.
- Legg 80 - 100 ul av 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan (DABCO) oppløsning til mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 ° C.
Merk: En annen glycerol-basert anti-fading middel kan anvendes istedenfor.
6. Analyse
- Før du monterer prøven på lysbilder, legge til en ekstra 5 - 10 mL av DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade løsning på mikrosentrifuge tube.
Merk: Prøve kan legges til lysbilder uten disseksjon. Prøvevolum lagt til et lysbilde varierer med dekkglass størrelse. Når pipettering prøven på lysbildet, kan pipettespissen bli kuttet av med et barberblad for å hindre sample klipping. Det er ofte nyttig å linje opp prøven i rader for enkel analyse. Tilsetningen av PPD som en ekstra antifade middel må ikke være nødvendig, men kan hindre fotobleking dersom prøvene lagres lang sikt. - Forsiktig plassere glassdekselet slip over prøven. Deretter, sikker dekkglass på plass med neglelakk.
- Vis montert prøven ved hjelp av fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å demonstrere effekten av sonikering basert farging i analyse av sent stadium av embryo og larve vev in situ, ble villtype-embryoer og larver behandlet for farging av testiklene, eggstokkene, og nervevev. Prøver ble fotografert via konfokal mikroskopi og representative resultatene er vist (figur 1 og figur 2). Resultatene viser at den beskrevne protokollen er effektivt for å visualisere morfologiske funksjoner samt individuelle celler i situ under sene-embryonale gjennom tidlig / midten av L3 stadier av Drosophila utvikling.
Resultater fra Testis Immunostain:
Testikkel utvikling er et spesielt godt system for å illustrere protocol efficacy siden testiklene modning er dynamisk gjennom larveutvikling. Voksen Drosophila testikler danne et kveilet rør med en blind ende, hvor kimlinje stamcelle (GSC) nisje ligger (se 13,14 for anmeldelser). I denne nisjen, er GSCS kledd rundt en stram klynge av ikke-mitotiske somatiske celler kalt hub. GSCS gjennomgå asymmetrisk divisjon for å produsere ett GSC som forblir forankret til hub og en datter gonialblast som er fordrevet fra stamcelle nisje. Som gonialblast deler ufullstendig, cytoplasmatiske utvidelser kalt fusomes form, kobler cellene innenfor spermatogonium. Etter 4 delin initierer spermatogonium meiose for å danne sædceller.
Testikkel dannelsen begynner med foreningen av primordial kjønnsceller (PGCs) og somatiske gonadale forløper celler (sgps) under embryogenesen (se 15,16 for anmeldelser). Denne foreningen resulterer i dannelsen av en funksjonell GSC nisje innen utgangen av embryogenesen 8-10. Ved midten av L1, asymmetriske GSC avdelinger innen GSC nisje gi opphav til differensiere spermatogonier med forgrenede fusomes ni. Asymmetrisk GSC divisjon fortsetter gjennom hele larveutvikling, noe som resulterer i produksjon av ytterligere spermatogoniene og en progressiv økning av gonade størrelse. Representative bilder av sene embryonale og tidlig / mid-L1, L2 og L3 testiklene, immunostained for kjønnsceller, hub celler, og fusomes, er vist (figur 1A-D). Disse bildene illustrerer de dynamiske endringer i gonade størrelse og bakterie celle differensiering observert i testiklene over tid.
Resultater fra eggstokk Immunostain:
Voksen Drosophila eggstokkene er sammensatt av 16-20 individuelle egg-produserende enheter kalt ovarioles (se 17,18 for anmeldelser). I den ene enden av hver ovariole, en struktur kalt germarium inneholder en stamcelle nisje. Den ovariole nisje består av udifferensierte GSCS og to populasjoner av somatiske celler: Cap celler og terminalgløde celler (TFS). Ligner på testis, GSCS gjennomgå asymmetrisk divisjon for å produsere ett GSC som gjenstår ved siden av hetten celler og en differensiere datter celle, Kalt en cystoblast, som er skjøvet vekk fra nisje. Den cystoblast senere gjennomgår fire runder med celledeling å danne en bakterie-line cyste, sammenbundet av en forgrenet fusome. Hver kimlinje-cyste blir deretter omgitt av follicle-celler til å produsere et egg kammer som fortsetter å modne som den beveger seg ned langs lengden av ovariole.
Som testiklene, er eggstokkene først dannet under embryogenesen 16,18. Flere ovarioles oppstå fra en enkelt embryonale gonade består av PGCs og sgps. Ved midten av L3, sgps gi opphav til TF forløpere på eggstokk anterior, mens kjønnsceller lokalisere til eggstokken posterior og forbinder med SGP-avledet intermingled celler (ICs) 19-22. Ved sen-L3, TF celler differensiere og organisere inn i stabler som finnes i den voksne stamcelle nisje, er GSCS og cap celler etablert, og bakterie-line cyste differensiering er observert 19,20,23. Representative bilder av sent stadium embryonale og tidlig / medio-L3 eggstokkene, immunostabestemt for kjønnsceller, sgps, ICs, TF forløpere, og fusomes blir vist (figur 1E, F). Disse bildene viser normal morfologi og utviklings progresjon for deres alder.
Resultater fra Neural Immunostain:
Drosophila sentralnervesystemet (CNS) er avledet fra nevrale stamceller, kalles neuroblasts (NBS), som oppstår fra embryonale neuroepithelium (se 24,25 for anmeldelser). NBs i embryo og larver skillet asymmetrisk å produsere ganglion mor celler (GMC) som i sin tur genererer nevroner og gliaceller som finnes i den voksne hjernen og ventral nerve ledningen. Fordi larve NBS gi opphav til de fleste voksne neuroner og kan skilles fra hverandre basert på deres posisjon i hjernen, har larve hjerner blitt en viktig modell for å studere NB oppførsel og neural differensiering.
Den L3 hjernen er sammensatt av to fliker, og en sentralt plassert ventral nerveledning 24..Representative bilder av mid-L3 hjerner immunostained for NBS, GMC, udifferensierte nevroner, umodne og primær nevroner og gliaceller blir vist (figur 2A-C) 26-30. Disse bildene viser sterk farging i distinkte uttrykk mønstre i hjernen fliker og ventral nerve ledningen. Avhengig av monteringsretningen, tillater avbildning for visualisering hjernevev fra den dorsale overflaten (figur 2A), ventral overflate (figur 2B), eller i sagittal tverrsnitt (figur 2C).
Farging effektivitet:
Våre representative resultater viser at en sonikator-basert farging fremgangsmåten er allsidig. Ikke bare kan det bli brukt for å identifisere spesifikke celletyper, men også kan brukes til å indikere tilstedeværelse av spesifikke proteiner og organeller. Imidlertid kan tvetydige resultater stammer fra forventet variasjon i fargingseffektivitet. For eksempel anti-vasa farget minst én gonadei 73,2% av alle larvene undersøkt (n = 781), mens anti-Elav farget hjerner i 86% av larvene (n = 115). Videre ser vi at flekker effektivitet er omtrent omvendt proporsjonal med utviklingsstadiet. I sene stadier av befruktede egg, farget anti-vasa 89.8% av gonadene (n = 206), mens flekker var til stede i bare 59,8% og 46,9% av larver på L2 og mid-L3, henholdsvis (n = 132 og 49). I tillegg, sonikering resulterer i tap av prøven. Når antallet befruktede egg og larver er tilstede i en optimal sonikering prøvevolum ble tellet før og etter sonikering, ble et gjennomsnitt på 41,0% av prøven bestemmes uegnet for analyse (n = 1,165). For å maksimere effektiviteten flekker, skal protokoller være optimalisert for spesifikke antistoffer ved å endre publiserte antistoffkonsentrasjoner eller antistoff inkubasjonstider.
Figur 1. Jeg. mmunostain av Drosophila gonadene i situ (AD) Bilder av testikler i situ i sene stadier av embryoer (stadium 17 / tidlig-L1) gjennom tidlig / mid-L3 larver immunostained med anti-Vasa (AD, rød; A'-D ' alene) for å oppdage kjønnsceller, anti-Fasicilin III (Fas III) og anti-1B1 (AD, grønn, A '' - D '' alene) for å oppdage hub celler og fusomes henholdsvis, og DAPI (AD, blå, A ' '' d '' 'alene) for å oppdage kjerner. (A) Stage 17 / tidlig L1 testikkel viser nylig coalesced hub og sfæriske fusomes i udifferensierte kjønnsceller. (B) Tidlig / midten av L1 testikkel viser sfæriske fusomes i GSCS lokaliserte nær sentrum og i noen posterior kjønnsceller langstrakt fusomes som tyder på tidlig spermatogonial differensiering. (C) Tidlig / midten av L2 og
Figur 2. Immunostain av Drosophila nervevev in situ. Tidlig / midten av L3 larver immunostained med anti-Elav (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en metode for å lykkes immunostain målrette Drosophila embryonale og larve vev in situ, og dermed eliminere behovet for disseksjon. Som per tidligere protokoller for farging tidlige embryoer 1,2,3, er chorionic membranen fjernes med 50% blekemiddel (NaOCl). Prøver er løst i formaldehyd og metanol. Fordi larve hårstråene forårsaker eldre prøve til å flyte, er hele prøven deretter ført gjennom en celle-sil for å sikre larve retensjon. Prøve er lagret, hvis ønskelig, i kjemisk-grad metanol. Etter utvanning, forstyrrer en riktig implementert sonikator prosess integriteten larveskjellaget. Dette er viktig etter at hårstråene formasjon for å tillate tilstrekkelig gjennomtrengelighet av antistoffer som kreves for farging. Før du søker antistoffer, rocking prøven i en 5% normal serum / BBTw løsning hindrer overdreven ikke-spesifikk binding. Primære antistoffer blir deretter tilsatt for å detektere spesifikke proteiner expressed i målvevet. Etter vasking for å fjerne ubundet primære antistoffer, er sekundære antistoffer bundet til fluoroforer som brukes til å markere plasseringen av bundne primære antistoffer. Analyse kan deretter utføres med epifluorescence eller konfokal mikroskopi.
Kan være nødvendig for enkelte modifikasjoner for å optimalisere resultatene i de enkelte tilfeller. Spesielt kan sonikering strøm og antallet sonications utført kreve justering avhengig sonicator brukes. Tilpasninger til høyden av sonicator sonden over prøven så vel som til løsningen volum kan også være nødvendig for forskjellige sonicators eller dersom tilstrekkelig prøven kan ikke oppnås. Økt løsning turbiditet kan brukes som en indikator på vev lyse og gir derfor et mål for når sonication er for alvorlig. Hvis oppløsningen turbiditet blir høy, bør den experimenter vurdere å redusere antallet sonications utføres, øker løsningsvolum, å heve høyden av sonicator sonde over prøven, og / eller redusere sonicator strøm.
Endringer kan også være nødvendig i farging protokollen for å forbedre bildekvaliteten. Som med de fleste farging prosedyrer signal-til-støy-forhold kan endres ved å modifisere antistoffet fortynning, tid og temperatur av antistoff inkubasjon med prøven, og / eller blokkering av reagenser som brukes. Mens hver antistoff må betraktes uavhengig av hverandre, spesielt med hensyn til antistoff-fortynning, finner vi at inkubasjon ved 4 ° C i lengre tidsperioder kan forbedre fargingskvalitet etter sonikering, spesielt for antistoffer med lavt signal til støyforhold og når eldre larver er undersøkt. I slike tilfeller kan flekker kvalitet også dra nytte av en svak reduksjon i sekundært antistoff fortynning. I denne protokollen inkluderer vi både BSA og serum som blokkeringsmidler, og prøven er re-blokkert før tilsetning av sekundære antistoffer for å øke fargingskvalitet. Avhengig av antistoffer bruked, re-blokkering og inkludering av både blokkeringsmidler kan eller ikke kan være nødvendig for å forbedre farging. Hvis den re-blokkerende trinn utelates, kan lengre vasker og flere skyllinger produsere renere bilder. Endelig kan pre-absorberende polyklonale antistoffer øke signal til støyforhold. Pre-absorpsjon blir utført ved inkubering av det ønskede antistoff med rehydratiserte embryoer eller larver før bruk i en immunostain 1.
Som vist i våre representative resultater, gjør lydbehandling for klar visualisering av målet vev in situ, og gir derfor et rimelig alternativ til vev disseksjon i farging protokoller. Disseksjon kan være tungvint i Drosophila embryo og larver på grunn av vanskeligheter med å lokalisere, isolere, og trekke uskadde målet vev. Alternativt sonikering tillater vev til å forbli i sammenheng med hele organismen. Fordi sonication unngår utpakking og montering vev mellom et lysbilde og en cover SLIp, det mer nøyaktig bevarer in situ morfologi. Praktisk talt, kan store mengder av prøven kan behandles raskere for fremtidig analyse, siden mange organismer kan bli sonikert samtidig.
Selv lydbehandling gir et flott alternativ til disseksjon, har det begrensninger som må vurderes. Sonikering fordelaktig forstyrrer integriteten av larve hårstråene men ødelegger noen eksempler i prosessen (se Representative resultater). Skylling å fjerne biologisk avfall er nødvendig etter sonikering prosessen, noe som ytterligere kan redusere prøvestørrelsen. I tillegg farging hele embryoer og larver forlater vev av interesse innleiret i omkringliggende vev. Disse omgivende vev kan farge positivt eller vise ikke-spesifikk antistoffbinding, og dermed redusere endelige bildekvalitet. Endelig kan fargingen effektivitet være variabel. Denne variasjonen kan avhenge av alderen av prøven, sonikering effekt, og antistoffspesifisitet. Som et resultat, sonikering-based farging av hel-mount vev kan ikke alltid være å foretrekke. Spesielt kan disseksjon basert farging være mer effektiv når man studerer store vev i slutten av L3-larver. Videre kan lydbehandling klippe tidligfase og mid-trinns embryoer. Til tross for disse begrensningene, er ultralydbasert farging en svært effektiv teknikk som er godt egnet for å analysere utviklingen av en rekke av vev i sene stadier av embryoer gjennom tidlig / mid-L3 larver. I vårt laboratorium, vi bruker jevnlig denne protokollen for å studere gonade morphogenesis i Drosophila embryo og larver 9,10. Videre forventer vi at gjennomføringen av denne protokollen vil vise seg like fruktbart i å studere utviklingen av andre vev i Drosophila og i andre organismer med en beskyttende skjellaget.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Ruth Lehman og Dorthea Godt som vennlig levert Vasa og Trafikkork antistoffer. Vi ønsker å erkjenne Bloomington Stock Center ved Indiana University for å opprettholde de angitte aksjer og utviklingsstudier Hybridom Bank utviklet i regi av den NICHD og vedlikeholdt av The University of Iowa. Vi takker alle medlemmer av Wawersik lab for deres råd og støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Monroe Scholars Program Grant (til AF og LB) og NSF gi IOS0823151 (til MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
