Abstract
Studier utförda i Drosophila melanogaster embryon och larver ger viktig inblick i utvecklingsprocesser såsom cell öde specifikation och organogenesen. Immunfärgning möjliggör visualisering av att utveckla vävnader och organ. Men en skyddande nagelband som bildas i slutet av embryogenes förhindrar genomträngning av antikroppar i embryon sen fas och larver. Medan dissektion före immunfärgning används regelbundet för att analysera Drosophila larver vävnader, visar sig ineffektivt för vissa analyser eftersom små vävnaderna kan vara svår att hitta och isolera. Sonikering ger ett alternativ till dissektion i larv Drosophila immunfärgning protokoll. Det möjliggör en snabb, samtidig bearbetning av ett stort antal embryon sen fas och larver och håller in situ morfologi. Efter fixering i formaldehyd, är ett prov sonikeras. Prov utsattes därefter för immunfärgning med antigen-specifik primär myraibodies och fluorescerande sekundära antikroppar att visualisera typer målcellen och specifika proteiner via fluorescensmikroskopi. Under processen att ultraljudsbehandling, är korrekt placering av en ultraljudsond över provet, samt varaktighet och intensitet ultraljudsbehandling, kritisk. Tilläggsupplysningar smärre modifieringar av standardimmunfärgning protokoll kan krävas för högkvalitativa fläckar. För antikroppar med låg signal-brusförhållande och längre inkubationstider är vanligtvis nödvändigt. Som ett bevis på konceptet för denna ultraljudsbehandling-underlättas protokoll visar vi immunostains av tre vävnadstyper (testiklar, äggstockar och neurala vävnader) vid en rad utvecklingsstadier.
Introduction
Drosophila embryon och larver utgör en utmärkt modell för att studera utvecklingsprocesser i många organ och vävnader. Avbildning av enskilda celler är ofta nödvändigt i dessa studier för att fastställa de komplexa miljöer där celler utvecklas. Visualisering av celler i vävnader kan åstadkommas genom immunfärgning. Väl beskrivna immunfärgning protokoll finns för embryonala Drosophila vävnader <17 h efter äggläggning (AEL) 1-3. Men en skyddande nagelband former mot slutet av embryogenes, för effektiv antikroppsträngning. Således är dessa immunfärgning protokoll är ineffektiva i analysen av vävnader i embryon sen fas och i senare stadier av larvutveckling (1 st stadiet (L1), 2: a stadiet (L2), och 3: e stadiet (L3)). Denna ineffektivitet innebär ett hinder för vår förståelse av dynamiska processer som sker under denna förlängda utvecklingsperiod 4. Tissue dissektion är en allmänt anställd teknik för att kringgå detta hinder 5-7. Däremot kan dissektion visa sig ineffektiv. Extraktion kan belastas av svårigheter att lokalisera eller isolera embryonala och larv vävnader. Vidare kan avlägsnas fysiskt målvävnader skada genom att brista dem eller genom att inte packa upp dem i sin helhet.
Sonikering är ett förfarande som använder ljudvågor för att störa intermolekylära interaktioner. Det har använts för att störa integriteten hos Drosophila larver ytterhud för att immunostain utvecklar neurala celltyper 6. Detta protokoll har anpassats för att immunostain sent skede embryonala och larvkönskörtlar, som kan vara så små som 50 pm i diameter 8-10. Genom sådana studier har processen av manliga könsceller stamceller (GSC) nischbildning karaktäriserats i sen Drosophila embryon 8-10 och mekanismer som reglerar stamcellsutveckling och difpassad undervisning i sen utvecklingsfas embryonala könskörtlar och larver har klarlagts 9-12. Således ger ultraljudsbehandling ett effektivt alternativ till vävnads dissektion som kan vara svårt på grund av vävnadsstorleken. Vidare möjliggör den immunofärgning av Drosophila vävnader in situ, vilket lämnar celler inom ramen för hela organismen och bibehålla in situ morfologi. Här beskriver vi en steg-för-steg-protokoll för fluorescens immunfärgning av sent stadium embryonala genom tidig / mitten L3 vävnader in situ. Analys av Drosophila gonadal och nervvävnad visas i Representativa resultat för att visa effekten av detta protokoll. Vidare kan denna immunfärgning protokoll anpassas för att analysera andra Drosophila vävnader samt vävnader i andra organismer med en yttre ytterhud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Beredning av en samling Cage
- Bedöva unga, fertila flugor med CO2. Överför sövda flugor till en bur. För att få optimalt utbyte, använd 100-120 vuxna flugor som sträcker sig från 2-7 dagar gamla vid en 4: 1 förhållandet mellan honor till hanar. Tillåt flugor en lämplig acklimatiseringsperiod, ~ 24 timmar innan man erhållit prov för fixering. Om buren inrättades med jungfru honor paras med hanar, en användning a 36-48 timmar acklimatiseringsperiod.
- På den öppna änden av buren, lägga en förhands förberedd äppeljuice agarplatta med en krona stor droppe jäst pasta i mitten över öppningen av buren. Sedan, fast med tejp. Täta skarven mellan äppeljuice agarplatta och buren med Parafilm.
- Placera buren i en sekundär behållare med äppeljuice agarplatta som bas och låta flugorna att reproducera vid en definierad temperatur under en lämplig tidsperiod som bestäms av experimentet.
Obs: Provsamlingstider will variera. Till exempel, när du samlar scen embryon / tidig L1 larver sent (17 - 24 tim), tillåter flugor att lägga ägg på äppeljuice agarplattor för 7 timmar vid 25 ° C före åldring av provet under 17 timmar vid 25 ° C. Likaså för en samling av mitten-slutet första stadiet larver (36-48 timmar) tillåter flugor att lägga ägg i 12 h vid 25 ° C före åldring av provet för 36 timmar vid 25 ° C. - När tidsperioden är klar trycker du på buren på ett bord så att flugor falla bort från äppeljuice agarplatta utan bedövning. Snabbt ersätta den använda plattan med ett färskt innehåller en droppe av jäst pasta. Fäst den färska plattan med tejp och parafilm och lagra buren med äppeljuice agarplatta som bas.
- Ta försiktigt bort jästen droppe från den använda plattan med en metallspatel. Placera locket på begagnade äppeljuice plattan och tillåta lade embryon till ålder om experimentellt nödvändigt.
OBS: Medan åldrandet prover, kan plattorna förvaras vid 25 ° C, om inte högre temperaturer är Experimentally krävs. Exempel på hur man åldras embryon för insamling beskrivs ovan (se not för steg 1.3). Borttagning av jäst pasta före prov åldring utförs för att hindra larver från krypa in i jäst och bryta upp ägarn under. Resterande äppeljuice agar och jäst pastarester ger näring för larv tillväxt. Medan embryon som direkt i jäst pasta går förlorade genom jäst pasta tas bort, är denna förlust föredra framför jäst och agar rester i provet som kan minska missfärgning effektivitet. Skulle en välja att inte ta bort jäst pasta, kan jäst göras flytande med fosfatbuffert Triton X-100 (PBTx), blandades med en pensel, och avlägsnas därefter från provet med ett cellfilter före fixering.
2. Fixering
- När embryon som på äppeljuice agarplatta har åldrats till önskad tidpunkt, använda en liten pensel fuktad med fosfatbuffert Triton X-100 (PBTx) lösning för att försiktigt ta bort prov från the platta.
Anm: Äldre larver är mobila och kan krypa på insidan av locket. Detta prov kan samlas på liknande sätt genom borttagning med en pensel. - Torka provladdade pensel mot interiören vända ås av en cell sil. Därefter skölj väggarna i silen och pensel med en sprutflaska innehållande PBTx lösning. Placera en petriskål lock under sil för att fånga PBTx lösningen.
- När allt provet har överförts till silen, häll nog PBTx i silen för att höja provet utanför nätet. Lyft sedan silen och häll innehållet i petriskål i en behållare flytande avfall.
- Upprepa steg 2.3 tre gånger för att ta bort jäst och flyga avfall som kan ha överförts tillsammans med provet.
- Häll nog 50% blekmedel (NaOCl) / vatten (DDH 2 O) lösning i sil för att ta upp larverna av mesh. Låt larver sitta i lösning i 5 min. Lyft sedan silen och häll ut than innehållet i petriskålen i en behållare av flytande avfall.
Obs: Bleach krävs endast i embryonala prover i åldern 0 - 22 timmar för att ta bort chorionic membranet. Tillämpningen av blekmedel till äldre prover kan utelämnas, men dess införande inte är skadligt. Om underlåtenhet önskas, byt blekmedel i detta steg med PBTx. Blekmedel Utspädd bör användas inom 24 timmar lösning beredning. - Tvätta provet i silen med PBTx genom att hälla tillräckligt PBTx i silen för att höja provet utanför nätet. Tillåt provet att sitta i lösningen under 3 min. Lyft sedan silen och häll innehållet i petriskål i en behållare flytande avfall.
- Upprepa steg 2.6 five gånger.
- Dab botten av cellfilter torr, sedan överföra provet i en scintillationsflaska innehållande 1,75 ml av PEMS-lösning med användning av en pensel.
- Att arbeta i ett ventilerat dragskåp, tillsätt 250 | il av 37% formaldehyd och 8 ml av reagenskvalitet heptan till scintillationsflaska.
- Låt flaskan skaka vid 200 varv per minut eller en liknande måttlig hastighet under 20 min.
- Lägg 10 ml metanol till scintillationsflaska utan att ta bort det tidigare vattenhaltiga fasen och låt flaskan skaka kraftigt vid 500 rpm under 1 min.
OBS: Metanol är farligt. Fortsätta att arbeta i ett ventilerat dragskåp och slitage lämpliga handskar. - Ta bort injektionsflaskan från shaker och häll innehållet i en cell sil över en behållare flytande avfall i huven. Lägg extra metanol till flaskan och kör igenom cellfilter vid behov så att alla prov har tagits bort.
Obs: Cell silar kan rinna långsamt. För att åtgärda detta, röra ett laboratorium vävnad till botten av cellfilter för att dra lösningen genom silen snabbare. Metanol bör formaldehyd och heptan varaförvaras i lämpliga avfallsbehållare tills korrekt avfallshantering enligt institutionens riktlinjer. - Torr ned i cell sil med hjälp av en laboratorievävnad, sedan använda en pensel för att överföra provet fångas i silen till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 0,5 ml metanol.
OBS: Om flera scintillationsflaskor är i bruk, för att slutföra steg 2.12 och 2.13 en flaska i taget hindrar prov torkar på cell silar. - När provet har lagts till i mikrocentrifugrör, avlägsna metanol med pipett. Se till provet har lagt sig på botten av röret.
- Skölj provet i mikrocentrifugrör genom att ca 0,5 ml metanol till röret. Vänta prov att bosätta sedan bort metanol med pipett.
- Upprepa steg 15 tre gånger.
- Lägg 0,5 ml metanol till röret, och sedan lagra i en -20 ° C frys för senare användning.
3 Rehydrering och Beredning av prov för Immunofärgning
- Avlägsna metanol från mikrocentrifugrör med en pipett, som lämnar provet i röret. Affär metanol avfall till lämplig avfallsbehållare förrän vid korrekt avfallshantering.
OBS: För att öka effektiviteten ultraljudsbehandling, använd inte mer än 3 mm av provet fast i botten på 1,5 ml mikrocentrifugrör. Överskott prov kan överföras till ett separat rör med en pipett innan du påbörjar rehydrering steg över. Skära av pipettspetsen med ett rent rakblad kan användas för att förhindra igensättning av pipettspetsen. - Lägg 1,0 ml av en 50% metanol / fosfatbuffert Tween (PBTw) lösning till röret och rock för 3 min.
- Ta metanollösning till rätt avfallsbehållaren och skölj med 1,0 l av PBTw två gånger. Efter varje sköljning, tillåta provet att sedimentera före dragning utanför PBTw med en pipett.
- Lägg 1,0 ml bovint serumalbumin / Fosfatbuffrad Tween (BBTw) Blanda till flaskan och rock. Efter 3 min på en rocker, tillåta sample att bosätta sig och ta bort BBTw med pipett.
- Upprepa steg 3.4 två gånger som tar hand för att ta bort så mycket BBTw som möjligt utan att förlora prov efter den sista tvätten.
- Lägg 0,5 ml BBTw till röret och placera röret på is.
4 Sonikering av prov
- Ställ sonicator till 10% maximal amplitud och utse en körtid på 2 sek konstant ultraljudsbehandling.
Anm: Dessa inställningar är specifika för sonicator anges i Material och utrustning Bord och kan kräva optimering för olika sonicators. - Före ultraljudsbehandling av prov, rengör ultraljudssonden genom att placera proben i en 50 ml koniskt rör fyllt med avjoniserat vatten och kör sonicator att rengöra sonden. Torr sonicator sond med laboratorievävnad efter loppet.
- Sänk ner sonden i mikrocentrifugrör innehåller provet så att den är placerad ungefär 3-4 mm över provet och börja ultraljudsbehandling.
- Avlägsna microcentrifuge röret och placera den på is under åtminstone 30 sek för att avleda värme från sonikering och tillåta provet att sedimentera på botten av mikrocentrifugrör.
- Upprepa steg 4.3 och 4.4 efter behov utifrån ålder prov som bearbetas.
Obs: För optimal ultraljudsbehandling provvolym, embryon yngre än 17 timmar kräver inte ultraljudsbehandling, men de mellan 17 och 24 timmar (etapp 17 / tidig L1) kräver två sonications. Larver mellan 24-36 (början / mitten-L1), 36-48 (mitten / slutet-L1), 48-60 (början / mitten-L2), 60-72 (mitten / slutet-L2), 72-84 ( tidigt-L3), 84-96 (början / mitten-L3), 96-108 (mitten / slutet-L3) hr kräver 5, 9, 11, 13, 15, 18 och 22 sonications respektive. Se diskussionen om ytterligare utveckling på sonication tider. - Skölj med 1,0 ml BBTw två gånger. Efter varje sköljning låta provet sedimentera innan avtappningen BBTw med en pipett.
- Lägg 1,0 ml BBTw till flaskan och rock. Efter 3 min på rocker, låta provet sedimentera och avlägsna BBTw med pipett. </ Li>
- Upprepa steg 4,7 två gånger.
5. Immunofärgning
- Blockera provet genom tillsats av 5% normalt serum utspätt i BBTw till mikrocentrifugrör. Ta bort block efter gunga under 1 timme.
Obs: Använd normalt serum från de arter där de sekundära antikropparna genereras. - Späd primära antikroppar till lämpliga arbetskoncentration i 5% normalt serum / BBTw lösning.
- Rock provet i primär antikroppslösning O / N vid 4 ° C eller under åtminstone 3 h vid RT (cirka 22 ° C.
Obs: Antikropps inkubationstider och temperaturer kan variera. O / N-inkubering vid 4 ° C eller 3 timmar vid rumstemperatur är vanligen tillräckliga. Emellertid kan en tvådagars inkubationstid höja färgning kvalitet, speciellt med äldre prover eller när låg affinitet primära antikroppar används. Längre inkubationer utförs typiskt vid 4 ° C. Liknande överväganden måste göras vid användning av sekundära antikroppar (se 5.10). - Låt provet sedimentera tillbotten av mikrofugrör. Rita av primära antikroppar med pipett. Spara antikroppar för återanvändning om så önskas.
- Skölj med 1.0 ml BBTw två gånger. Efter varje sköljning tillåta provet att sedimentera innan avtappningen BBTw med en pipett.
- Lägg 1,0 ml BBTw till flaskan och rock. Efter 3 min på rocker, låta provet för att bosätta sig och ta bort BBTw med pipett.
- Upprepa steg 5.6 five gånger.
- Blockera prov genom tillsats av 5% normalt serum / BBTw lösning på mikrocentrifugrör. Avlägsna blocket efter gungande under 30 min till 1 tim.
OBS: Denna ytterligare blockering steg krävs inte, men kan förbättra färgning kvalitet för specifika antikroppar. - Späd sekundära antikroppar till lämpliga arbetskoncentration i 5% normalt serum / BBTw lösning.
- Wrap mikrocentrifugrör i aluminiumfolie för att minska blekning på grund av ljusexponering. Rock provet i sekundär antikroppslösning till 12-48 h vid 4 ° C eller under åtminstone 3 h vid RT (cirka 22 ° C.
- Tillåt provet att sedimentera till botten av mikrofugrör. Rita av sekundära antikroppar med pipett.
- Skölj med 1.0 ml PBTw två gånger. Efter varje sköljning tillåta provet att sedimentera före dragning utanför PBTw med en pipett.
- Lägg 1,0 ml PBTw till flaskan och rock. Efter 5 minuter på rocker, låta provet sedimentera och avlägsna PBTw med pipett.
- Upprepa steg 5.13 tre gånger.
- EXTRA: Lägg DAPI utspädd 1: 1000 i PBTw. Rock prov in i aluminiumfolie för 3 min; sedan bort DAPI-lösning med en pipett. Skölj fem gånger med 1.0 ml PBTw, vilket gör provet sedimentera innan du tar bort PBTw med pipett.
- Lägg 80-100 pl av 1,4-diazabicyklo [2.2.2] oktan (DABCO) lösning till mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C.
Anm: Ett annat glycerol baserade anti-fade medel kan ersätta.
6. Analys
- Innan du monterar provet på objektglas, lägga till en extra 5-10 il DABCO / p-fenylendiamin (PPD) antifade lösning till mikrocentrifugrör.
Obs: Prov kan läggas till diabilder utan dissektion. Provvolym lagt till en bild varierar med täckglas storlek. När pipettering provet på objektglaset kan pipettspetsen skäras bort med ett rakblad för att förhindra prov klippning. Det är ofta bra att rada provet upp i rader för enkel analys. Tillsatsen av PPD som ytterligare antifade medel kan inte krävas, men kan förhindra fotoblekning om prover förvaras långsiktigt. - Placera försiktigt täckglas över provet. Sedan säker täckglas på plats med nagellack.
- Visa monterad prov med hjälp av fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visa effekten av ultraljudsbehandling baserade immunfärgning i analys av sent stadium embryon och larver vävnader in situ, var vildtyp embryon och larver behandlas för immunfärgning av testiklar, äggstockar, och nervvävnad. Prover avbildade via konfokalmikroskopi och representativa resultat visas (Figur 1 och Figur 2). Resultaten visar att den beskrivna protokollet är effektivt för att visualisera morfologiska egenskaper samt enskilda celler i situ under sena-embryonala genom tidig / mitten L3 stadier av Drosophila utveckling.
Resultat från Testikel Immunostain:
Testikel utveckling är ett särskilt bra system för att illustrera protokoll-effekt eftersom testiklarna mognad är dynamisk under larvutveckling. Vuxen Drosophila testiklar bildar ett spiralformat rör med ett blint änden, där könsceller stamceller (GSC) nisch är belägen (se 13,14 omdömen om). I denna nisch är GSCs uppradade runt en tät klunga av icke-mitotiska somatiska celler som kallas navet. GSCs genomgår asymmetrisk delning för att producera en GSC som förblir förankrade till navet och en dotter gonialblast som förskjuts bort från stamcellsnischen. Såsom gonialblast skiljer ofullständigt, cytoplasmiska förlängningar kallas fusomes form ansluter cellerna inom spermatogonium. Efter fyra på varandra följande divisioner, initierar spermatogonium meios att bilda spermier.
Testikel bildningen börjar med föreningen för primordiala könsceller (PGCs) och somatiska gonadala prekursorceller (SGPS) under embryogenes (se 15,16 för recensioner). Denna förening resulterar i bildningen av ett funktionellt GSC nisch i slutet av embryogenes 8-10. I mitten av L1, asymmetriska generalsekretariatets avdelningar inom den nisch GSC ger upphov till differentiering spermatogonier med grenade fusomes 9. Asymmetrisk division GSC fortsätter hela larverutveckling, vilket resulterar i produktion av ytterligare spermatogonier och en progressiv ökning av gonadstorlek. Representativa bilder av sena embryonala och tidiga / mitten av L1, L2 och L3 testiklar, immunostained för könsceller, nav celler och fusomes, visas (Figur 1A-D). Dessa bilder illustrerar de dynamiska förändringar i gonadstorlek och könscellsdifferentiering observerats i testiklarna över tiden.
Resultat från Äggstock Immunostain:
Vuxen Drosophila äggstockar består av 16-20 enskilda ägg producerande enheter som kallas ovarioles (se 17,18 för recensioner). Vid en ände av varje ovariole, kallas en struktur i germarium innehåller en stamcell nisch. Den ovariole nisch består av odifferentierade GSCs och två populationer av somatiska celler: cap celler och terminalfilamentceller (TFS). I likhet med testiklarna, GSCs genomgå asymmetrisk delning för att producera en GSC som förblir intill cap cellerna och en differentieringsdottercell, Kallas en cystoblast, som trycks bort från nischen. Den cystoblast därefter genomgår fyra omgångar av celldelning för att bilda en grodd-line cysta, sammankopplade med en förgrenad fusome. Varje bakterielinje-cysta är därefter omgivet av follikelceller att producera ett ägg kammare som fortsätter att mogna när den rör sig nedåt längden av ovariole.
Liksom testiklar, äggstockar är först bildas under fosterutvecklingen 16,18. Flera ovarioles uppstår från en enda embryonala gonad består av PGCs och SGPS. I mitten av L3, SGPS ger upphov till TF prekursorer vid äggstocken främre, medan könsceller lokalisera till äggstocken bakre och umgås med SGP-härledda samsas celler (IC) 19-22. I slutet-L3, TF-celler differentierar och organisera in i högar som finns i vuxna stamceller nisch är GSCs och mössa celler etablerade och bakterie line cysta differentiering observeras 19,20,23. Representativa bilder av sent skede embryonala och tidig / mitten L3 äggstockar, immunostagranskat om könsceller, SGPS, IC, TF prekursorer och fusomes, visas (Figur 1E, F). Dessa bilder visar normal morfologi och utvecklings progression för sin ålder.
Resultat från Neural Immunostain:
Drosophila centrala nervsystemet (CNS) är härledd från neurala stamceller, som kallas neuroblaster (NBS), som uppstår från embryonala neuroepitelet (se 24,25 för kommentarer). NBs med embryon och larver klyftan asymmetriskt producera ganglion moderceller (GMC) som i sin tur genererar neuroner och gliaceller som finns i den vuxna hjärnan och ventrala nerv sladd. Eftersom larv NBs ger upphov till de flesta vuxna nervceller och kan särskiljas utifrån deras position i hjärnan, har larver hjärnor blivit en viktig modell för att studera NB beteende och neural differentiering.
Den L3 Hjärnan består av två lober och en centralt belägen ventralt nerv sladd 24.Representativa bilder av mid-L3 hjärnor immunostained för NBs, GMC, odifferentierade neuroner, omogna och primära neuroner och gliaceller visas (Figur 2A-C) 26-30. Dessa bilder visar stark färgning i olika uttrycksmönster i hjärnan lober och den ventrala nerv sladd. Beroende på monteringsriktning, möjliggör avbildning av hjärnvävnad visualisering från den dorsala ytan (Figur 2A), ventrala ytan (figur 2B), eller sagittal tvärsnitt (figur 2C).
Färgning effektivitet:
Våra representativa resultat visar att en ultraljudsbehandling baserad immunförfarande är mångsidig. Inte bara kan den användas för att identifiera specifika celltyper, men också kan användas för att indikera närvaron av specifika proteiner och organeller. Emellertid kan tvetydiga resultat bero på förväntade variation i färgnings effektivitet. Exempelvis anti väsa färgades minst ett gonadi 73,2% av alla larver sökte (n = 781), medan anti-elav färgade hjärnor i 86% av larver (n = 115). Dessutom är vi konstatera att färgning effektiviteten är ungefär omvänt proportionell mot utvecklingsstadiet. I embryon sen fas, anti-vasa färgade 89,8% av könskörtlar (n = 206), medan färgning förekom i endast 59,8% och 46,9% av larver vid L2 och mid-L3, respektive (n = 132 och 49). Dessutom sonication resultat i provförlust. När antalet embryon och larver närvarande i en optimal ultraljudsprovvolym räknades före och efter ultraljudsbehandling, var i genomsnitt 41,0% av provet bestämt olämplig för analys (n = 1165). För att maximera färgning effektivitet bör protokoll optimeras för specifika antikroppar genom att ändra publicerade antikroppskoncentrationer eller antikropps inkubationstider.
Figur 1 I. mmunostain av Drosophila könskörtlar på plats (AD) Bilder av testiklarna på plats i embryon sen fas (stadium 17 / tidig L1) genom tidig / mitten L3 larver immun med anti-Vasa (AD, röd, A'-D ' enbart) för att upptäcka könsceller, anti-Fasicilin III (Fas III) och anti-1B1 (AD, grön, A '' - D '' enbart) för att upptäcka nav celler och fusomes respektive, och DAPI (AD, blå, A ' '' D '' 'enbart) för att upptäcka kärnor. (A) Steg 17 / början L1 testis visar den nyligen smält samman navet och sfäriska fusomes i odifferentierade könsceller. (B) Tidig / mid-L1 testis visar sfäriska fusomes i GSCs lokaliserade nära navet och i vissa bakre könsceller avlånga fusomes indikerar tidig spermatogoniala differentiering. (C) Tidig / mitten av L2 och
Figur 2 Immunostain av Drosophila neurala vävnader in situ. Tidig / mitten L3 larver immun med anti-elav (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en metod för att framgångsrikt immunostain rikta Drosophila embryonala och larv vävnader på plats, vilket eliminerar behovet av dissektion. Per tidigare protokoll för färgning tidiga embryon 1,2,3 är chorionic membranet avlägsnas med hjälp av 50% blekmedel (NaOCl). Proverna fixerades i formaldehyd och metanol. Eftersom larv ytterhud orsakar äldre prov att flyta, är hela provet sedan passera genom ett cellfilter för att säkerställa larv retention. Prov lagras, om så önskas, i kemisk-grade metanol. Efter rehydrering, ett korrekt sätt ultraljudsbehandling process stör integritet larver nagelbanden. Detta är kritiskt efter nagelband formation för att möjliggöra tillräcklig genomträngning av antikroppar som krävs för immunfärgning. Innan ansökan antikroppar, gunga provet i en 5% normalt serum / BBTw lösning förhindrar alltför ospecifik antikroppsbindning. Primära antikroppar tillsätts sedan för att detektera specifika proteiner expressed i målvävnaden. Efter tvättning för att avlägsna obundna primära antikroppar, är sekundära antikroppar bundna till fluoroforer som används för att markera platsen för bundna primära antikroppar. Analys kan sedan utföras med epifluorescence eller konfokalmikroskopi.
Vissa ändringar kan behövas för att optimera resultat i individuella omständigheter. I synnerhet kan ultraljudsbehandling effekt och antalet sonications utförda behöva justeras beroende på sonicator används. Anpassningar till höjden av ultraljudssonden ovanför provet samt lösningsvolym kan också krävas för olika sonicators eller om tillräckliga prov kan inte erhållas. Ökad lösning grumlighet kan användas som en indikator på vävnads lys och ger därför en mätare när ultraljudsbehandling är för svår. Om lösningen grumlighet blir hög, bör försöksledaren överväga att minska antalet sonications utförda, ökar lösningsvolym, öka höjden på sonicator sonden ovanför provet, och / eller minska sonicator makten.
Ändringar kan också krävas i immunfärgning protokoll för att förbättra bildkvaliteten. Som med de flesta immunfärgning förfaranden signal-brusförhållande kan ändras genom att modifiera antikroppsutspädning, tid och temperatur för antikropp inkubation med provet, och / eller blockerande reagens som används. Medan varje antikropp måste beaktas självständigt, särskilt med avseende på utspädnings antikropp, finner vi att inkubation vid 4 ° C under längre tidsperioder kan förbättra färgningskvaliteten efter ultraljudsbehandling, särskilt för antikroppar med låg signal till brusförhållanden och när äldre larver undersöks. I dessa fall kan färgning kvalitet också dra nytta av en liten minskning av sekundär antikropp utspädning. I detta protokoll inkluderar vi både BSA och serum som blockerande reagens och provet åter blockerad före tillsats av sekundära antikroppar för att öka färgning kvalitet. Beroende på antikropparna använderd, re-blockering och inkludera både blockeringsreagens kan eller inte åläggas att förbättra färgning. Om re-blockerande steg utelämnas kan längre tvättar och flera sköljningar producerar renare bilder. Slutligen kan pre-absorberande polyklonala antikroppar öka signal-brusförhållandet. Pre-absorption utförs genom inkubering den önskade antikroppen med rehydrerade embryon eller larver före användning i en immunostain 1.
Som visats i våra representativa resultat, gör ultraljudsbehandling för tydlig visualisering av målvävnader på plats och på så sätt ger ett rimligt alternativ till vävnads dissektion i immunfärgning protokoll. Dissektion kan vara betungande i Drosophila embryon och larver på grund av svårigheter att lokalisera, isolera och extrahera oskadade målvävnader. Alternativt ultraljudsbehandling gör vävnader förbli inom ramen för hela organismen. Eftersom ultraljudsbehandling undviker utvinna och monterings vävnad mellan en bild och en täck slip, det mer exakt bevarar på plats morfologi. Praktiskt, kan stora mängder prov behandlas snabbare för framtida analys, eftersom många organismer kan sonikeras samtidigt.
Även ultraljudsbehandling ger ett bra alternativ till dissekering, den har begränsningar som måste beaktas. Sonikering fördel stör integritet larver nagelband, men förstör en del prov i processen (se Representativa resultat). Sköljning att avlägsna biologiska skräp krävs efter ultraljudsbehandling processen, vilket ytterligare kan minska provstorlek. Dessutom immunofärgning hela embryon och larver lämnar vävnaden av intresse inbäddad i omgivande vävnader. Dessa omgivande vävnader kan få fläckar positivt eller visa icke-specifik antikroppsbindning, vilket minskar slutliga bildkvalitet. Slutligen kan färgning effektiviteten vara variabel. Denna variation kan bero på ålder prov, ultraljudsbehandling effektivitet, och antikroppsspecificitet. Som ett resultat, sonikering-based immunfärgning av hel-mount vävnad kan inte alltid vara att föredra. I synnerhet kan dissektion baserad immun bli effektivare när man studerar stora vävnader i sen-L3 larver. Dessutom kan ultraljudsbehandling skeva tidiga och mellanstegs embryon. Trots dessa begränsningar är ultraljudsbehandling baserad immunfärgning en mycket effektiv teknik som är väl lämpad för att analysera utvecklingen av olika vävnader i embryon slutskedet genom tidig / mitten L3 larver. I vårt labb använder vi regelbundet detta protokoll för att studera gonad morfogenes i Drosophila embryon och larver 9,10. Dessutom räknar vi med att genomföra detta protokoll kommer att visa sig vara lika givande att studera utvecklingen av andra vävnader i Drosophila och andra organismer med en skyddande nagelband.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Ruth Lehman och Dorthea Godt som vänligt tillhanda Vasa och trafik Jam antikroppar. Vi vill tacka för den Bloomington Stock Center vid Indiana University för att upprätthålla de som aktier och utvecklingsstudier Hybridoma Bank utvecklats under ledning av NICHD och underhålls av University of Iowa. Vi tackar alla medlemmar i Wawersik lab för deras råd och stöd. Detta arbete har finansierats av Monroe Scholars Program Grant (till AF och LB) och NSF bevilja IOS0823151 (till MW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
