Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל doi: 10.3791/51528 Published: August 14, 2014
* These authors contributed equally

Abstract

מחקרים שבוצעו בתסיסנית עוברים וזחלים מספקים תובנה חיונית לתהליכים התפתחותיים כגון מפרט גורל התא וorganogenesis. Immunostaining מאפשר ההדמיה של פיתוח רקמות ואיברים. עם זאת, לציפורן הגנה שיוצרת בסופו של עובר מונעת חלחול של נוגדנים לעוברי בשלב מאוחר וזחלים. בעוד לנתיחה לפני immunostaining משמשת באופן קבוע לנתח רקמות זחל דרוזופילה, זה מוכיח לא יעיל עבור חלק ניתוחים בגלל רקמות קטנות עשויות להיות קשות לאתר ולבודד. Sonication מספק חלופה לנתיחה בפרוטוקולי immunostaining דרוזופילה זחל. זה מאפשר עיבוד מהיר, בו זמני של מספר הגדול של עוברים בשלב מאוחר וזחלים ושומר במורפולוגיה באתר. לאחר הקיבוע בפורמלין, מדגם sonicated. לדוגמא נתונה אז immunostaining עם נמלה העיקרית אנטיגן ספציפיibodies ונוגדנים משני שכותרתו fluorescently לדמיין סוגי תאי היעד וחלבונים ספציפיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. במהלך התהליך של sonication, מיקום נכון של בדיקה sonicating מעל המדגם, כמו גם את המשך ועוצמת sonication, הוא קריטי. שינויים קלים additonal לפרוטוקולי immunostaining סטנדרטיים עשויים להידרש לכתמים באיכות גבוהות. לנוגדנים עם אות נמוכה יחס רעש, פעמים דגירה ארוכות יותר הן בדרך כלל צורך בכך. כהוכחה של קונספט לפרוטוקול הקל sonication זה, אנו מראים immunostains של שלושה סוגי רקמות (אשכים, השחלות, ורקמות עצביות) בטווח של שלבי התפתחות.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עוברי דרוזופילה וזחלים מספקים מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים באיברים ורקמות רבים. הדמיה של תאים בודדים היא לעתים קרובות יש צורך במחקרים אלה על מנת לוודא הסביבות המורכבות שבו תאים לפתח. ויזואליזציה של תאים ברקמות יכולה להיות מושג באמצעות immunostaining. ובכן תיאר immunostaining פרוטוקולים קיימים לרקמות עוברי דרוזופילה <17 שעות לאחר הטלת ביצים (AEL) 1-3. עם זאת, צורות מגן ציפורן לקראת הסוף של עובר, מניעת חלחול נוגדן יעיל. לפיכך, פרוטוקולי immunostaining אלה אינם יעילים בניתוח של רקמות בעוברים בשלב מאוחר ובשלבים מאוחרים יותר של התפתחות זחל (instar 1 st (L1), instar 2 nd (L2), ו3 instar rd (L3)). חוסר יעילות זה מטיל מחסום להבנה של תהליכים דינמיים המתרחשים בתקופה התפתחותית מורחבת זה 4. Tissנתיחת ue היא טכניקה מועסק נרחב לעקוף מכשול זה 5-7. עם זאת, לנתיחה יכולה להוכיח לא יעילה. חילוץ ניתן לשעבוד על ידי קושי באיתור או בידוד עוברי ורקמות זחל. יתר על כן, ההסרה הפיסית של רקמות היעד עלולה לגרום נזק על ידי פקיעתם או בכך שלא לחלץ אותם בשלמותם.

Sonication הוא שיטה שמעסיקה גלי קול להפריע אינטראקציות מולקולאריים. זה כבר נעשה שימוש כדי לשבש את שלמות ציפורן זחל תסיסנית כדי immunostain פיתוח סוגי תאים עצביים 6. פרוטוקול זה הותאם לimmunostain עוברי בשלב מאוחר ובלוטות מין זחל, אשר יכול להיות קטנה כמו 50μm בקוטר 8-10. באמצעות מחקרים כאלה, התהליך של תאי גזע בתאי מין היווצרות נישה גברית (GSC) התאפיין בשלב מאוחר עוברי דרוזופילה 8-10 ומנגנוני ויסות התפתחות תאי גזע וDIFferentiation בבלוטות מין עוברי בשלב מאוחר וזחלים כבר הובהר 9-12. לפיכך, sonication מספק אלטרנטיבה יעילה לנתיחת רקמות שעלולות להיות קשה בגלל גודל של רקמה. יתר על כן, היא מאפשרת immunostaining של רקמות דרוזופילה באתר, עוזב תאים בהקשר של הגוף כולו ושמירה במורפולוגיה באתר. כאן, אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד לimmunostaining הקרינה של עוברי בשלב מאוחר עד תחילת / רקמות אמצע-L3 באתר. ניתוח של רקמת אשכים ועצביים דרוזופילה מוצג בנציג התוצאות כדי להדגים את היעילות של פרוטוקול זה. יתר על כן, פרוטוקול immunostaining זה עשוי להיות מותאם לנתח רקמות אחרות דרוזופילה, כמו גם רקמות באורגניזמים אחרים עם עור מת חיצוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

.1 הכנת קייג אוסף

  1. הרדימי זבובים צעירים, פורה עם CO 2. העבר את הזבובים מורדמים לכלוב. כדי להשיג תשואה אופטימלית, להשתמש 100-120 זבובים בוגרים נעים בין 2-7 ימים של גיל ב4: 1 יחס של נקבות לזכרים. לאפשר זבובי תקופת הסתגלות מתאימה, ~ 24 שעות לפני קבלת מדגם לקיבעון. אם הכלוב הוקם עם נקבות בתולי הזדווגו לגברים, שימוש 36 - תקופת הסתגלות שעה 48.
  2. בקצה הפתוח של הכלוב, להציב צלחת אגר מיץ תפוחים מוכן מראש עם ירידה בגודל מטבע של שמרים להדביק במרכז על הפתיחה של הכלוב. ואז, בטוח עם קלטת. לאטום את הצומת בין הצלחת אגר מיץ תפוחים והכלוב עם Parafilm.
  3. מניחים את הכלוב במכל המשני עם צלחת אגר מיץ תפוחים כבסיס ולאפשר הזבובים להתרבות בטמפרטורה מוגדרת לתקופה מתאימה של זמן, כפי שנקבעו על ידי הניסוי.
    wi פעמים אוסף לדוגמא: הערהיהיה להשתנות. לדוגמא, בעת האיסוף עובר שלב מאוחר / מוקדם זחלי L1 (17 - 24 hr), לאפשר זבובים להטיל ביצים על צלחות אגר מיץ תפוחים במשך 7 שעות ב25 מעלות לפני ההזדקנות של מדגם ל17 שעה 25 מעלות צלזיוס. באופן דומה, לאוסף של זחלי אמצע סוף המאה הראשונים instar (36 - 48 hr) לאפשר זבובים להטיל ביצים במשך שעה 12 25 מעלות צלזיוס לפני ההזדקנות של מדגם ל36 שעה 25 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר תקופת הזמן היא מלאה, הקש על הכלוב על שולחן, כדי שזבובים לרדת מהצלחת אגר מיץ תפוחים ללא הרדמה. במהירות להחליף את הצלחת בשימוש עם אחד טרי המכיל טיפה של שמרים להדביק. אבטח את הצלחת הטרי עם קלטת וparafilm ולאחסן את הכלוב עם צלחת אגר מיץ תפוחים כבסיס.
  5. מוציא בזהירות את טיפת שמרים מהצלחת המשומשת עם מרית מתכת. מכסה מניח על צלחת מיץ תפוחים משמש ומאפשר הניח עוברים לגיל אם בניסוי נחוץ.
    שים לב: בעוד הזדקנות דגימות, צלחות עשויות להיות מאוחסנות ב25 ° C אלא אם כן טמפרטורות גבוהות יותר הן experimentally הנדרש. דוגמאות של איך מזדקן עובר לגבייה שתוארה לעיל (ראה הערה לצעד 1.3). ההסרה של שמרים להדביק לפני לדגום הזדקנות מבוצעת כדי למנוע זחלים מזוחל לתוך השמרים והפירוק אגר מתחת. שאריות אגר מיץ תפוחים ושמרי ממרח שנותרו לספק חומרים מזינים לצמיחת זחל. בעוד עוברים הניחו ישירות בשמרים להדביק הולכים לאיבוד דרך הסרת שמרים להדביק, הפסד זה עדיף על שמרים ושאריות אגר במדגם שיכול להפחית את יעילות כתמים. צריך אחד לבחור שלא להסיר את השמרים להדביק, שמרים יכולים להיות מעובה עם פוספט הצפת טריטון X-100 (PBTx), מעורבב עם מברשת צבע, ולאחר מכן הוסרו מהמדגם עם מסננת תא לפני הקיבוע.

2 קיבוע

  1. ברגע שהעוברים הניחו על הצלחת אגר מיץ התפוחים הזדקנו עד לנקודת הזמן הרצויה, להשתמש במכחול קטן רטוב עם פוספט הצפת טריטון X-100 פתרון (PBTx) כדי להסיר בזהירות מדגם מהצלחת דואר.
    הערה: זחלים מבוגרים ניידים ויכולים לזחול על החלק הפנימי של המכסה. מדגם זה עשוי להיות שנאסף באופן דומה על ידי ההסרה עם מכחול.
  2. נגב את המדגם עמוס המכחול נגד הרכס הפונה הפנימי של מסננת תא. לאחר מכן, יש לשטוף את הקירות של המסננת ומכחול עם בקבוק להשפריץ מכיל פתרון PBTx. מניחים כיסוי צלחת פטרי מתחת למסננת כדי ללכוד את פתרון PBTx.
  3. , אחרי הכל המדגם הועבר למסננת לשפוך מספיק PBTx לתוך המסננת כדי להעלות את המדגם מהרשת. לאחר מכן, הרם את המסננת ושופך את תכולת צלחת פטרי לתוך מיכל פסולת נוזלי.
  4. 2.3 שלוש פעמים חזר על שלב כדי להסיר שמרים ולעוף פסולת שייתכן שהועברה יחד עם המדגם.
  5. יוצקים מספיק אקונומיקה 50% (NaOCl) / מים (DDH 2 O) פתרון למסננת כדי להעלות את זחלי הרשת. לאפשר זחלים לשבת בפתרון למשך 5 דקות. לאחר מכן, הרם את המסננת ולשפוך את tהוא התוכן של צלחת פטרי במכל פסולת נוזלית.
    הערה: Bleach נדרש רק בדגימות עוברית בגילים 0-22 שעה כדי להסיר את קרום כוריוני. היישום של אקונומיקה לדגימות מבוגרות יכול להיות מושמט, אך הכללתה היא לא מזיקה. אם המחדל הוא רצוי, להחליף את אקונומיקה בשלב זה עם PBTx. יש להשתמש באקונומיקה מדולל בתוך 24 שעות של הכנת פתרון.
  6. לשטוף מדגם במסננת עם PBTx על ידי שפיכה מספיק PBTx לתוך המסננת כדי להעלות את המדגם מהרשת. לאפשר מדגם לשבת בפתרון במשך 3 דקות. לאחר מכן, הרם את המסננת ושופך את תכולת צלחת פטרי לתוך מיכל פסולת נוזלי.
  7. חזור על שלב 2.6 חמש פעמים.
  8. להספיג תחתית יבשה מסננת תא, ולאחר מכן להעביר מדגם לתוך בקבוקון המכיל נצנץ 1.75 מ"ל של תמיסת PEMS באמצעות מכחול.
  9. עובד במנדף מאוורר, להוסיף 250 μl של פורמלדהיד 37% ו -8 מ"ל של heptane כיתה מגיב לבקבוקון הנצנץ.
  10. לאפשר הבקבוקון ללחוץ ב200 סל"ד או מהירות בינונית דומה ל20 דקות.
  11. הוסף 10 מ"ל של מתנול לבקבוקון נצנץ מבלי להסיר את השלב מימיים הקודם ולאפשר את הבקבוקון ללנער במרץ ב500 סל"ד דקות 1.
    הערה: מתנול הוא מסוכן. תמשיך לעבוד במנדף מאוורר וללבוש כפפות מתאימות.
  12. הסר בקבוקון מייקר ומייד יוצק תוכן לתוך מסננת תא מעל מיכל פסולת נוזלי בשכונה. הוספת מתנול נוסף לבקבוקון ולרוץ דרך מסננת התא כנדרשת כדי להבטיח את כל המדגם הוסר.
    הערה: מסננות סלולארי עשויות לגרום באיטיות. כדי לתקן את זה, לגעת רקמות מעבדה לתחתית מסננת התא כדי לצייר את הפתרון דרך המסננת במהירות רבה יותר. מתנול, פורמלין, וheptane צריך להיותמאוחסן במיכלים פסולת מתאימים עד לסילוק נאות בהתאם להנחיות מוסדיות.
  13. תחתית יבש של מסננת תא באמצעות רקמות במעבדה, ולאחר מכן להשתמש במכחול להעביר מדגם שנתפס במסננת לצינור 1.5 מ"ל מכיל microcentrifuge 0.5 מ"ל של מתנול.
    הערה: אם בקבוקוני נצנץ מרובים נמצאים בשימוש, בצעו את השלבים 2.12 ו2.13 אחד בקבוקון בכל פעם כדי למנוע מדגם מהתייבשות על מסננות תא.
  14. לאחר המדגם נוסף לצינור microcentrifuge, להסיר מתנול עם טפטפת. מדגם להבטיח יש התיישב לחלק התחתון של הצינור.
  15. יש לשטוף את המדגם בצינור microcentrifuge על ידי הוספה כ 0.5 מ"ל של מתנול לצינור. חכה למדגם להתיישב ולאחר מכן להסיר מתנול עם טפטפת.
  16. חזור על שלב 15 שלוש פעמים.
  17. הוסף 0.5 מ"ל של מתנול לצינור, ולאחר מכן לאחסן ב-20 ° C במקפיא לשימוש מאוחר יותר.

.3 Rehydration והכנת לדוגמא עבור Immunostaining

  1. הסר מתנול מצינור microcentrifuge עם טפטפת, שעזב את המדגם בצינור. פסולת חנות מתנול למכל הפסולת המתאימה עד מועד הסילוק נאות.
    הערה: כדי לשפר את יעילות sonication, להשתמש לא יותר מ 3 מ"מ של מדגם התיישב בחלק התחתון של צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. מדגם עודף עשוי להיות מועבר לצינור נפרד עם טפטפת לפני תחילת הצעד להחזרת הנוזלים מעל. חיתוך קצה פיפטה בסכין גילוח נקי יכול לשמש כדי למנוע סתימה של קצה פיפטה.
  2. הוספת 1.0 מ"ל של מתנול פתרון 50% / פוספט הצפת Tween (PBTw) לצינור והרוק במשך 3 דקות.
  3. הסר פתרון מתנול למכל הפסולת המתאים ולשטוף עם 1.0 מיקרוליטר של PBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה, לאפשר המדגם להתיישב לפני הציור את PBTw עם טפטפת.
  4. הוספת 1.0 מ"ל של שור הסרום אלבומין / פוספט שנאגרו Tween (BBTw) לערבב לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על כיסא נדנדה, לאפשר sample להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
  5. חזור על שלב 3.4 שתי פעמים מקפידים להסיר כמה שיותר BBTw ככל האפשר מבלי לאבד דגימה לאחר השטיפה האחרונה.
  6. הוסף 0.5 מ"ל של BBTw לצינור ומניח את הצינור על קרח.

.4 Sonication של דוגמא

  1. הגדר את sonicator 10% משרעת המרבית ולייעד זמן ריצה של sonication הקבוע 2 שניות.
    הערה: הגדרות אלה הן ספציפיות לsonicator מצויינים בחומרים וציוד בלוח ועשויה לדרוש אופטימיזציה לsonicators שונה.
  2. לפני sonication של מדגם, לנקות את חללית sonicator על ידי הצבת את הקצה החללית לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל מלא sonicator מים ולרוץ ללא יונים כדי לנקות את הבדיקה. בדיקה sonicator יבש עם רקמה במעבדה אחרי הריצה.
  3. להטביע את הבדיקה לתוך הצינור המכיל microcentrifuge מדגם, כך שהוא נמצא בעמדת 3 עד 4 כ מ"מ מעל המדגם ולהתחיל sonication.
  4. הסר את mצינור icrocentrifuge ולמקם אותו על קרח לפחות 30 שניות כדי לפזר חום מsonication ולאפשר מדגם להתיישב בחלק התחתון של צינור microcentrifuge.
  5. חזור על שלבים 4.3 ו4.4 לפי צורך בהתבסס על גיל של מדגם בטיפול.
    הערה: לקבלת sonication אופטימלי נפח דגימה, עוברים צעירים מן 17 שעה אינו דורש sonication, אבל אלה בין 17 ו24 שעה (שלב 17 / מוקדם-L1) דורש שתי sonications. זחלים בין 24 - 36 (מוקדם / אמצע L1), 36 - 48 (מאוחר-L1 האמצע /), 48 - 60 (מוקדם / אמצע L2), 60-72 (אמצע / סוף-L2), 72-84 ( מוקדם-L3), 84-96 (מוקדם / אמצע L3), 96-108 שעה (אמצע / סוף-L3) דורשים 5, 9, 11, 13, 15, 18, ו22 sonications בהתאמה. ראה דיון לפרטים נוספים בפעמי sonication.
  6. לשטוף עם 1.0 מ"ל BBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר המדגם להתיישב לפני הציור את BBTw עם טפטפת.
  7. הוספת 1.0 מ"ל של BBTw לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על הנדנדה, לאפשר המדגם להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה. </ Li>
  8. חזור על שלב 4.7 שתי פעמים.

.5 Immunostaining

  1. לחסום מדגם ידי הוספת 5% בסרום נורמלי מדולל בBBTw ​​לצינור microcentrifuge. תסיר את החסימה לאחר הנדנדה עבור שעה 1.
    הערה: השתמש בסרום נורמלי מהמין שבו הנוגדנים משני נוצרים.
  2. לדלל נוגדנים ראשוניים לנכס את העבודה ריכוז בפתרון 5% / BBTw סרום נורמלי.
  3. מדגם רוק בO פתרון נוגדן הראשוני / N ב 4 מעלות צלזיוס או לפחות 3 שעות ב RT (כ 22 ° C.
    הערה: פעמים דגירה נוגדן וטמפרטורות עשויות להשתנות. O / N דגירה על 4 מעלות צלזיוס או 3 שעות ב RT הוא בדרך כלל מספיק. עם זאת, תקופת דגירה של יומיים עשויה לשפר את איכות צביעה, במיוחד עם דגימות מבוגרות או כאשר נוגדנים ראשוניים נמוך זיקה משמשים. incubations יותר מבוצע בדרך כלל על 4 מעלות צלזיוס. שיקולים דומים צריכים להיעשות בעת שימוש בנוגדנים משני (ראה 5.10).
  4. לאפשר מדגם להתיישב לחלק תחתון של צינור microfuge. לצייר את נוגדנים ראשוניים עם פיפטה. להציל את הנוגדנים לשימוש חוזר אם תרצה בכך.
  5. לשטוף עם 1.0 מ"ל של BBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר מדגם להתיישב לפני הציור את BBTw עם טפטפת.
  6. הוספת 1.0 מ"ל של BBTw לבקבוקון והרוק. לאחר 3 דקות על הנדנדה, לאפשר מדגם להתיישב ולהסיר BBTw עם פיפטה.
  7. חזור על שלב 5.6 חמש פעמים.
  8. מדגם בלוק על ידי הוספת 5% בסרום נורמלי פתרון / BBTw לצינור microcentrifuge. תסיר את החסימה לאחר הנדנדה ל30 דקות לשעה 1.
    הערה: צעד חסימה נוסף זו אינה הכרחית, אבל עשויה לשפר את איכות צביעה לנוגדנים ספציפיים.
  9. לדלל נוגדנים משני לנכס את העבודה ריכוז בפתרון 5% / BBTw סרום נורמלי.
  10. לעטוף צינור microcentrifuge בנייר אלומיניום כדי להפחית את הדהיה כתוצאה מחשיפה לאור. מדגם רוק בפתרון נוגדנים משני במשך 12 עד 48 שעות על 4 מעלות צלזיוס או לפחות 3 שעות ב RT (כ 22 C °.
  11. לאפשר מדגם להתיישב לתחתית צינור microfuge. לצייר את נוגדנים משני עם פיפטה.
  12. לשטוף עם 1.0 מ"ל של PBTw פעמיים. לאחר כל שטיפה לאפשר מדגם להתיישב לפני הציור את PBTw עם טפטפת.
  13. הוספת 1.0 מ"ל של PBTw לבקבוקון והרוק. אחרי 5 דקות על הנדנדה, לאפשר המדגם להתיישב ולהסיר PBTw עם פיפטה.
  14. חזור על שלב 5.13 שלוש פעמים.
  15. אופציונאלי: הוסף DAPI מדולל 1: 1,000 בPBTw. מדגם רוק עטוף בנייר אלומיניום למשך 3 דקות; לאחר מכן להסיר את פתרון DAPI עם טפטפת. יש לשטוף חמש פעמים עם 1.0 מ"ל של PBTw, המאפשר דגימה להתיישב לפני הסרת PBTw עם פיפטה.
  16. הוספת 80 - 100 μl של 1,4-diazabicyclo [2.2.2] אוקטן פתרון (DABCO) לצינור microcentrifuge ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: סוכן אנטי לדעוך מבוסס גליצרול נוסף עשוי להיות תחליף ל.

.6 ניתוח

  1. לפני ההרכבה מדגם על גבי שקופיות, להוסיף תוספת 5 - 10 μl של DABCO / p-phenylenediamine (PPD) antifade פתרון לצינור microcentrifuge.
    הערה: לדוגמא ניתן להוסיף לשקופיות ללא נתיחה. לדוגמא הוסיף לשקופית נפח משתנה עם גודל להחליק לכסות. כאשר pipetting מדגם על שקופית, קצה פיפטה עלול להתנתק באמצעות סכין גילוח כדי למנוע גז מדגם. זה בדרך כלל שימושי בשורה המדגם בשורות לניתוח קל. התוספת של PPD כסוכן antifade נוסף לא ייתכן שתידרש, אבל יכולה למנוע photobleaching אם דגימות נשמרות לטווח ארוך.
  2. מניח בעדינות כיסוי הזכוכית להחליק על מדגם. ואז, להחליק את המכסה מאובטח במקום באמצעות לק.
  3. צפה ברכוב מדגם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי להדגים את היעילות של immunostaining מבוסס sonication בניתוח עוברי בשלב מאוחר וברקמות זחל באתר, עוברי wild-type וזחלים עובדו לimmunostaining של אשכים, השחלות, ורקמה עצבית. דגימות הם צילמו באמצעות מיקרוסקופיה confocal ותוצאות נציג מוצגות (איור 1 ואיור 2). תוצאות עולות כי הפרוטוקול המתואר הוא יעיל המאפשר הדמיה תכונות מורפולוגיות, כמו גם תאים בודדים באתר במהלך שלבי התפתחות דרוזופילה מאוחר עובריים דרך מוקדם / אמצע L3.

תוצאות מהאשך Immunostain:
פיתוח אשך הוא מערכת טובה במיוחד הלממחיש את יעילות פרוטוקול מאז התבגרות אשכים היא דינמית לאורך התפתחות זחל. האשכים דרוזופילה מבוגרים מהווים צינור מפותל עם סוף עיוור אחד, שבו תאי גזע בתאי מין הנישה (GSC) ממוקמת (ראו 13,14 לביקורות). בנישה זו, GSCs מפוזר סביב אשכול הדוק של תאים סומטיים שאינם המיטוטי נקרא הרכזת. GSCs לעבור חלוקה סימטרית לייצר GSC אחד שנותר מעוגן לרכזת ובת gonialblast שנעקרה מהנישה של תאי גזע. כgonialblast מחלק חלקי, הרחבות cytoplasmic נקראות טופס fusomes, חיבור התאים בתוך spermatogonium. לאחר 4 חטיבות רצופות, spermatogonium יוזם מיוזה ליצירת תאי זרע.

היווצרות אשך מתחילה עם העמותה של תאים קדמוניים נבט (PGCs) ותאים מבשר אשכים סומטיות (SGPs) במהלך embryogenesis (ראה 15,16 לביקורות). קשר זה גורם להיווצרות של נישה GSC פונקציונלית עד הסוף של העובר 8-10. באמצע L1, חטיבות GSC סימטריות בתוך הנישה GSC להצמיח הבחנה spermatogonia עם fusomes מסועף 9. חלוקת GSC סימטרית ממשיכה לאורך זחלפיתוח, וכתוצאה מכך הייצור של spermatogonia נוסף ועלייה הדרגתית בגודל בלוטת מין. נציג תמונות של אשכים / אמצע L1, L2, L3 ומאוחר עובריים ומוקדמים, immunostained לתאי נבט, תאי רכזת, וfusomes, מוצגות (1A-D איור). תמונות אלו ממחישות את השינויים הדינמיים בגודל אשך והתמיינות תאי נבט שנצפו באשכים לאורך זמן.

תוצאות מImmunostain שחלה:
השחלות דרוזופילה מבוגרים מורכבות מ16-20 יחידות מניבים ביצה בודדות נקראות ovarioles (ראה 17,18 לביקורות). בקצה אחד של כל ovariole, מבנה המכונה germarium מכיל נישה תאי גזע. הנישה ovariole מורכבת מGSCs מובחן ושתי אוכלוסיות של תאים סומטיים: תאי כובע ותאי מסוף נימה (TFS). דומה לאשך, GSCs לעבור החלוקה סימטרית לייצר GSC אחד שנשאר בסמוך לתאי הכובע ותאי בת הבחנה, נקרא cystoblast, אשר דחף מהנישה. Cystoblast לאחר מכן עובר 4 סיבובים של חלוקת תא כדי ליצור ציסטה חיידק אונליין, מחוברת על ידי fusome מסועף. כל germline-ציסטה מוקפת לאחר מכן על ידי תאי זקיק לייצר תא ביצה שממשיך בשלה כפי שהוא נע לאורך ovariole.

כמו אשכים, השחלות נוצרות ראשונה בעובר 16,18. ovarioles מרובה נובע מבלוטת מין עוברית בודדת המורכב מPGCs וSGPs. באמצע L3, SGPs להצמיח מבשרי TF בקדמי השחלה, ואילו בתאי נבט בתרגום לאחורי השחלה ולקשר עם נגזר SGP תאים התערבבו (מעגלים משולבים) 19-22. בשלהי-L3, תאי TF להבדיל ולארגן לערימות מצאו בנישה של תאי גזע הבוגרים, GSCs ותאי כובע מבוססים, ובידול ציסטה נבט אונליין הוא ציין 19,20,23. נציג תמונות של עוברי בשלב מאוחר ו / השחלות אמצע L3 מוקדמות, immunostaאינם עומד לתאי נבט, SGPs, שבבים, מבשרי TF, וfusomes, מוצג (איור 1E, F). תמונות אלה מראות מורפולוגיה נורמלית והתקדמות התפתחותית לגילם.

תוצאות מהעצביות Immunostain:
מערכת דרוזופילה העצבים המרכזית (CNS) נגזרת מתאי גזע עצביים, neuroblasts נקראת (NBS), הנובעות מneuroepithelium העוברי (ראה 24,25 לביקורות). NBS בעוברים ומתחלקים זחלים סימטרי לייצר תאי אמא של גנגליון (GMC) ש, בתורו, ליצור תאי עצב ותאי גליה מצאו במוח הבוגר וחוט עצב הגחון. בגלל NBS הזחל להצמיח רוב תאי עצב בוגרים וניתן להבחין על בסיס מיקומם בתוך המוח, המוח של זחל הפך מודל חשוב ללימוד התנהגות NB ובידול עצבי.

מוח L3 מורכב משתי אונות וחוט עצב הגחון במיקום מרכזי 24.נציג תמונות של המוח של אמצע L3 immunostained לNBS, GMCs, תאי עצב לא עברו התמיינות, תאי עצב לא בוגרים ויסודי ותאי גלייה מוצגות (איור 2A-C) 26-30. תמונות אלה מראים כתמים חזקים בדפוסי ביטוי ייחודיים בתוך אונות המוח וחוט עצב הגחון. בהתאם להרכבת אורינטציה, הדמיה מאפשרת להדמיה של רקמות המוח מפני שטח הגבי (איור 2 א), משטח הגחון (איור 2), או בחתך הסגיטלי (איור 2 ג).

יעילות כתמים:
תוצאות הנציג שלנו מראות כי הליך immunostaining מבוסס sonication הוא תכליתי. לא רק זה יכול לשמש כדי לזהות את סוגי תאים מסוימים, אלא גם יכול לשמש כדי לציין את נוכחותם של חלבונים ואברונים ספציפיים. עם זאת, תוצאות מעורפלות יכולות לנבוע משינוי צפוי ביעילות כתמים. לדוגמא, אנטי Vasa מוכתם אשך אחד לפחותב73.2% מכל הזחלים שנבדק (n = 781) ואילו אנטי Elav מוכתם מוח ב86% מזחלים (n = 115). יתר על כן, אנו צופים שמכתימים את היעילות הוא בערך ביחס הפוך לשלב ההתפתחותי. בעוברים בשלב מאוחר, אנטי Vasa מוכתם 89.8% מבלוטות מין (n = 206), תוך הכתמה הייתה נוכחת רק ב59.8% ו46.9% מזחלים בL2 ואמצע L3, בהתאמה (n = 132 ו49). בנוסף, תוצאות sonication באובדן מדגם. כאשר מספר העוברים ובהווה זחלים באופטימלי מדגם sonication נפח נספר לפני ואחרי sonication, ממוצע של 41.0% ממדגם נקבע אינו מתאים לניתוח (n = 1165). על מנת למקסם את היעילות מכתימה, פרוטוקולים צריכים להיות מותאמים לנוגדנים ספציפיים על ידי שינוי ריכוזי נוגדן שפורסמו או פעמים דגירה נוגדנים.

איור 1
אני 1 איור. Mmunostain של בלוטות מין דרוזופילה באתרו (לספירה) תמונות של אשכים באתר בעוברים בשלב מאוחר (שלב 17 / מוקדם-L1) עד תחילת / אמצע זחלים-L3 immunostained עם אנטי Vasa (AD, אדום; A'-D ' לבד) כדי לזהות תאי נבט, אנטי Fasicilin III (Fas III) ואנטי 1B1 (AD, ירוק; '' - ד '' לבדו) כדי לזהות תאי רכזת וfusomes בהתאמה, וDAPI (AD, כחול; ' '' -d '' 'לבדו) כדי לזהות גרעינים. (שלב) 17 / אשך L1 מוקדם מראה את הרכזת התגבשה לאחרונה וfusomes הכדורי בתאי נבט שלא עברו התמיינות. (ב) בתחילת / אמצע L1 אשך תערוכות fusomes הכדורי בGSCs מקומי ליד הרכזת ובחלק אחורי תאי נבט מוארכים fusomes מעיד על בידול spermatogonial המוקדם. (C) מוקדם / אמצע L2 ו (EF) של השחלות באתר בעוברים בשלב מאוחר וזחלי אמצע L3 immunostained עם אנטי Vasa (EF, אדום;. E'-F " לבד) כדי לזהות תאי נבט, אנטי 1B1 (EF, ירוק; E '- ו' 'לבדו) כדי לזהות fusomes וקרום תא סומטי בL3, ונגד פקק תנועה (TJ) (EF, כחול; E' " "-F '' לבדו) כדי לזהות תאים סומטיים השחלות. (E) שלב 17 / השחלה L1 מוקדמת מראה כי תאים סומטיים מופצים ברחבי בלוטת המין ויש לי שתאי הנבט fusomes כדורי. (F) מוקדם / אמצע-L3השחלה מוגדלת מעט וביטוי קרום הקשורים 1B-1 מעיד על פיתוח אב TF הוא זוהה בתאים סומטיים קדמי. תאי נבט באמצע L3 ממוקמים באחורי אשכים, להראות fusomes הכדורי, ולקשר עם TJ חיובי / 1B1 לעמעם שבבים סומטיים. כל התמונות הן Z-תחזיות של 4 פרוסות confocal רצופות עם קדמי בלוטת המין מכוון לשמאל. בלוטות מין מפורטים והרכזת מצויינים עם חץ צהוב באשכים. סרגל קנה מידה הוא 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2 Immunostain של רקמות עצביות דרוזופילה באתר. זחלים מוקדם / אמצע L3 immunostained עם אנטי Elav ( '' לבדו) כדי לזהות גרעינים של תאי עצב לא בוגרים ויסודי, וגם אנטי פרוספרו (Pros) (, ירוק; 'לבדו) כדי לזהות גרעינים בGMCs והנוירונים מובחנים או קוטביות אנטי הפוכה ( Repo) (BC, ירוק; B'-C 'לבדו) כדי לזהות תאי גליה. גרעינים וDAPI (AC, כחול; '' לבד) שימשו כדי לזהות את כל גרעין התא. את כל התמונות עם אוריינטציה הקדמית עד. סעיף sagittal בכיוון עם הגחון לשמאל. () סעיף הגבי תערוכות צביעה חזקה ליתרונות וElav באזורי פריפריה של אונת המוח (BL) ולאורך קו האמצע והפריפריה של חוט הגחון העצב (VNC). הבלעה בפנל מציגה יתרונות וצביעת Elav בגרעינים שונים לאורך קו האמצע VNC. (B) חתך הגחון מראה ביטוי על בסיס רחב של wi תאי גלייה החיובי ריפוה מכתימה חזק לאורך קו האמצע VNC והפריפריה. סעיף sagittal (C) מראה העשרה של מכתים ריפו על הפנים הגחון של VNC. כל התמונות הן סעיפי confocal יחידים. סרגל קנה מידה הוא 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מספק שיטה להצלחת immunostain למקד דרוזופילה עוברית ורקמות זחל באתר, ובכך מבטל את הצורך בנתיחה. לפי פרוטוקולים לפני מכתים עוברים המוקדמים 1,2,3, קרום כוריוני מוסר באמצעות אקונומיקה 50% (NaOCl). דגימות קבועות בפורמלין ומתנול. בגלל ציפורן הזחל גורמת מדגם ישן יותר לצוף, המדגם כולו מועבר דרך תא מסננת, כדי להבטיח שמירת זחל. מדגם מאוחסן, אם תרצה בכך, במתנול כיתה כימית. לאחר התייבשות, תהליך sonication מיושם כהלכה משבש את שלמות ציפורן הזחל. זה קריטי לאחר היווצרות ציפורן כדי לאפשר חלחול מספיק של נוגדנים הנדרשים לimmunostaining. לפני יישום נוגדנים, הנדנדה המדגם ב5% בסרום נורמלי / פתרון BBTw מונע נוגדן ספציפי מופרז מחייב. נוגדנים עיקריים מתווספים אז לזהות Expres חלבונים הספציפיsed ברקמת המטרה. לאחר שטיפה כדי להסיר נוגדנים מאוגדים עיקריים, נוגדנים משני חייבים fluorophores משמשים כדי לסמן את המיקום של נוגדנים עיקריים קשורים. ניתוח אז ניתן לבצע עם epifluorescence או confocal.

שינויים מסוימים עשויים להידרש כדי לייעל את התוצאות בנסיבות אישיות. בפרט, כוח sonication ומספר sonications ביצע עשויים לדרוש התאמה בהתאם לsonicator משמש. עיבודים לגובה של חללית sonicator מעל המדגם כמו גם לפתרון נפח עשויים גם להידרש לsonicators שונה או אם לא ניתן להשיג מדגם מספיק. עכירות פתרון מוגברות יכולות לשמש כמדד לתמוגה רקמה, ולכן, מספק מד לכאשר sonication הוא חמור מדי. אם עכירות פתרון הופכת להיות גבוהה, הנסיין צריך לשקול צמצום מספר sonications ביצע, הגדלת נפח פתרון, להעלות את הגובה של sonicatoבדיקה r מעל המדגם, ו / או הפחתת כוח sonicator.

שינויים גם ייתכן שיהיו הצורך בפרוטוקול immunostaining כדי לשפר את איכות תמונה. כמו במרבית הליכי immunostaining יחס האות לרעש ניתן לשנות על ידי שינוי דילול נוגדן, זמן וטמפרטורה של דגירה נוגדנים עם מדגם, ו / או חסימה של חומרים כימיים המשמשים. למרות שכל נוגדן יש לקחת בחשבון באופן עצמאי, ובמיוחד בהתייחס לדילול נוגדן, אנו מוצאים כי דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך תקופות זמן ארוכות יותר יכולה לשפר את איכות צביעה לאחר sonication, במיוחד עבור נוגדנים עם אות נמוכה יחסי רעש וכאשר זחלים מבוגרים נבחנים. במקרים אלה, איכות צביעה יכולה ליהנות גם מירידה קלה בדילול נוגדנים משני. בפרוטוקול זה, אנו כוללים שני BSA וסרום כריאגנטים חסימה, והמדגם הוא מחדש נחסם לפני תוספת של נוגדנים משני על מנת להגביר את איכות צביעה. בהתאם לנוגדנים להשתמשד, מחדש חסימה והכללה של שני חומרים כימיים החסימה עשויה או לא עשויות להיות נדרשות על מנת לשפר את הצביעה. אם צעד החסימה מחדש מושמט, שטיפות ועוד שטיפות כבר יכולים להפיק תמונות נקיות יותר. לבסוף, נוגדני polyclonal מראש הקולטים עשויים להגדיל את יחס האות לרעש. טרום קליטה מתבצעת על ידי דוגרים הנוגדן הרצוי עם עוברים או זחלים לפני השימוש בimmunostain 1 rehydrated.

כפי שהודגם בתוצאות הנציג שלנו, sonication מאפשר ראיה ברורה של רקמות יעד באתר ובכך מספק חלופה סבירה לנתיחת רקמות בפרוטוקולי immunostaining. נתיחה יכולה להיות מסורבלת בעוברי דרוזופילה וזחלים בשל קשיים באיתור, בידוד, וחילוץ רקמות יעד שלא נפגעו. sonication לחלופין מאפשר רקמות להישאר בהקשר של האורגניזם כולו. בגלל sonication ימנע חילוץ ורקמות הרכבה בין שקופיות וSLI כיסויעמ ', זה בצורה מדויקת יותר משמר במורפולוגיה באתר. למעשה, כמויות גדולות של מדגם יכולות להיות מעובד במהירות רבה יותר לניתוח בעתיד, שכן יכולים להיות sonicated אורגניזמים רבים בו זמנית.

למרות sonication מספק אלטרנטיבה מצוינת לנתיחה, יש לו מגבלות שיש לקחת בחשבון. Sonication טובה משבש את שלמות ציפורן הזחל אבל הורס חלק מדגם בתהליך (ראה תוצאות נציג). שטיפה כדי להסיר ביולוגית פסולת נדרש בעקבות תהליך sonication, אשר עוד יכול להקטין את גודל מדגם. בנוסף, immunostaining עוברים וזחלים שלמים עוזב את הרקמות של העניין המוטבע ברקמות הסובבות. רקמות הסובבות אלה עלולים להכתים באופן חיובי או להראות נוגדן הלא ספציפי מחייב, ובכך להקטין את איכות תמונה סופית. לבסוף, מכתים את היעילות יכולה להיות משתנה. השתנות זו יכולה להיות תלויה בגיל של מדגם, יעילות sonication, וספציפיות של נוגדנים. כתוצאה מכך, sonication-baimmunostaining SED של כל הר רקמות לא תמיד יהיה עדיף. בפרט, immunostaining מבוסס נתיחה עשוי להיות יעיל יותר כאשר לומדים רקמות גדולות בסוף-L3 זחלים. יתר על כן, sonication יכול גזירה מוקדמת, ואמצע שלב עוברים. למרות מגבלות אלה, immunostaining מבוסס sonication היא טכניקה יעילה ביותר שהוא גם מתאים לניתוח פיתוח של מגוון רחב של רקמות בעוברים בשלב מאוחר עד תחילת / אמצע זחלים-L3. במעבדה שלנו, אנו משתמשים באופן קבוע בפרוטוקול זה כדי ללמוד המורפוגנזה בלוטת מין בעוברי דרוזופילה ו9,10 זחלים. יתר על כן, אנו צופים כי ליישום פרוטוקול זה יוכיח פורה באותה מידה בלימודי פיתוח של רקמות אחרות בדרוזופילה ובאורגניזמים אחרים עם ציפורן מגן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו אסירי תודה לרות ליהמן וDorthea Godt שעושים חסד סיפק נוגדנים ושה ופקק התנועה. ברצוננו להודות למרכז מניות Bloomington באוניברסיטת אינדיאנה לשמירה על מניות ובלבד ובנק Hybridoma מחקרים התפתחותיים שפותח בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה. אנו מודים לכל החברים במעבדה Wawersik לייעוץ והתמיכה שלהם. עבודה זו מומנה על ידי מונרו חוקרי גרנט התכנית (לAF וLB) וNSF להעניק IOS0823151 (לMW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1: Reagents and Buffers
Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT.
Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C.
Triton 10% For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
PEMS 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT.
Pipes For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT.
Formaldehyde 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Heptane CAS 142-82-5 n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Methanol CAS 67-56-1 Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines.
Phosphate buffer Tween (PBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C.
Tween 10% For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT.
Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C.
Normal goat serum (NGS) ackson ImmunoResearch Laboratories 005-000-121 To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C.
1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) CAS: 281-57-9 To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C.
DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C.
Apple juice plates To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C.
Tegosept 10% To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C.
Yeast paste ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C.
Table 2: Staining Materials
DAPI Invitrogen D3571 1:1000, stock at 5 mg/ml.
Rabbit anti-Vasa 1:250, a gift from Ruth Lehmann.
Mouse anti-Fasciclin III Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7G10 1:10
Mouse anti-1B1 Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1 1:4
Guniea pig anti-Traffic Jam 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003).
Mouse anti-Prospero Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Prospero MR1A 1:10
Rat anti-Elav Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 7EBA10 1:30
mouse anti-Repo Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 8D12 1:10
Goat anti-rabbit Alexa546 Invitrogen A11010 1:500
Goat anti-mouse Alexa488 Invitrogen A11029 1:500
Goat anti-guniea pig Alexa633 Invitrogen A21105 1:500
Goat anti-rat Alexa488 Invitrogen A11006 1:500
Table 3: Materials and Equipment
Fly Cages Hand-made; Genesee Scientific Corporation Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation.
Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier Branson Model: Branson Digital Sonifier 250
Sonicator probe Branson Model #: 102C (CE) EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658
Syringe filter Nalgene 190-25-20 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter
Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0
Vacuum filter unit Nalgene 450-0020 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
  2. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
  3. Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
  4. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
  5. Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
  6. Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
  7. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. (2011).
  8. Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
  9. Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
  10. Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
  11. DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
  12. Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
  13. Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
  14. Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  15. Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
  16. Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
  17. Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
  18. Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
  19. Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
  20. Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
  21. Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
  22. Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
  23. Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
  24. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  25. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
  26. Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
  27. Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
  28. Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
  29. Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
  30. Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
הקל Sonication Immunofluorescence הכתמה של שלב מאוחר עוברי וזחל<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות<em&gt; באתר</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ. J. Vis. Exp. (90), e51528, doi:10.3791/51528 (2014).More

Fidler, A., Boulay, L., Wawersik, M. Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ. J. Vis. Exp. (90), e51528, doi:10.3791/51528 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter