Abstract
Исследования, проведенные в Дрозофилы эмбрионов и личинок обеспечивают решающую понимание процессов развития, таких как спецификации клеточных судеб и органогенеза. Иммуноокрашивание позволяет для визуализации развития тканей и органов. Тем не менее, защитная кутикула, что образует в конце эмбриогенеза предотвращает проникновение антител в эмбрионы поздней стадии и личинок. В то время как рассечение до иммунной регулярно используется для анализа дрозофилы личинок тканей, это доказывает, неэффективны для некоторых анализов, потому что маленькие ткани может быть трудно локализовать и изолировать. Озвучивание предоставляет альтернативу вскрытия в личиночной иммуноокрашивания протоколов дрозофилы. Это позволяет быстро, одновременной обработки большого количества зародышей на поздней стадии и личинок и поддерживает на месте морфологии. После фиксации в формальдегид, образец обрабатывают ультразвуком. Образец затем подвергают иммунным окрашиванием с антиген-специфического первичного муравьевibodies и флуоресцентно меченных вторичные антитела визуализировать типы клетки-мишени и специфических белков с помощью флуоресцентной микроскопии. В процессе обработки ультразвуком, правильное размещение ультразвуковую зонда над образцом, а также от длительности и интенсивности ультразвука, имеет решающее значение. ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ незначительные модификации стандартных протоколов иммуноокрашивания могут потребоваться для высоких пятен качества. Для антител с низким отношением сигнал-шум, более длительное время инкубации, как правило, необходимо. Как доказательство концепции для этого протокола обработки ультразвуком при содействии, мы показываем immunostains трех типов тканей (яичках, яичниках и нервной ткани) в диапазоне стадиях развития.
Introduction
Эмбрионы дрозофилы и личинки предоставит прекрасную модель для изучения процессов развития во многих органах и тканях. Визуализация отдельных клеток часто необходимо в этих исследованиях для выяснения сложных условий, в которых клетки развиваются. Визуализация клеток в тканях может быть достигнуто через иммунной окраски. Ну описанных иммуноокрашивания протоколы касаются эмбриональных тканей Drosophila <17 ч после откладки яиц (AEL) 1-3. Тем не менее, защитные кутикулы формы к концу эмбриогенеза, предотвращая эффективное проникновение антител. Таким образом, эти Иммуноокрашивание протоколы неэффективны при анализе тканей у эмбрионов поздней стадии и на последующих этапах развития личинок (1-й возрастной стадии (L1), 2-й возрастной стадии (L2), и 3-й возрастной стадии (L3)). Эта неэффективность накладывает барьер для нашего понимания динамических процессов, которые происходят в течение этого длительного периода развития 4. Tissие рассечение является широко применяется методика, чтобы обойти этот барьер 5-7. Однако, рассечение может оказаться неэффективным. Добыча может быть обременены трудностями в поиске или выделения эмбриональных и личиночных тканей. Кроме того, физическое удаление ткани-мишени может привести к повреждению путем разрыва их или будучи не в состоянии извлечь их во всей их полноте.
Озвучивание это метод, который использует звуковые волны, чтобы нарушить межмолекулярных взаимодействий. Он был использован нарушить целостность кутикулы личинок Drosophila, чтобы immunostain разработке нейронных типов клеток 6. Этот протокол был адаптирован для immunostain поздней стадии эмбрионального и личинок половые железы, которые могут быть как малые, как 50 мкм в диаметре 8-10. С помощью таких исследований, процесс мужской зародышевой линии стволовых клеток (ГСК) формирование ниши был охарактеризован в конце стадии эмбрионов Drosophila 8-10 и механизмы, регулирующие развитие стволовых клеток и DIFференциации в поздней стадии эмбриональных половых желез и личинок были выяснены 9-12. Таким образом, обработка ультразвуком обеспечивает эффективную альтернативу рассечения тканей, что может быть трудно, потому что от размера ткани. Кроме того, это позволяет иммунным окрашиванием тканей Drosophila в месте, в результате чего клетки в контексте всего организма и сохранение морфологии на месте. Здесь мы описываем шаг за шагом протокол для флуоресценции иммуноокрашивания поздней стадии эмбрионального через начале / середине L3 тканей в месте. Анализ Drosophila гонадного и нервной ткани показано в Представитель Результаты чтобы продемонстрировать эффективность этого протокола. Кроме того, этот протокол иммунное окрашивание может быть приспособлен для анализа других тканей Drosophila, а также ткани в других организмах с наружным кутикулы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Подготовка Collection Кейджем
- Обезболить молодых, плодородные мух с CO 2. Трансфер наркотизированных мух в клетку. Для получения оптимального выхода, используйте 100-120 взрослых мух, начиная от 2-7 дневного возраста в соотношении 4: 1 самок и самцов. Разрешить летит соответствующий период акклиматизации, ~ 24 ч до получения образца для фиксации. Если клетка была создана с девственными женщин в паре с мужчинами, применение 36 - 48 ч акклиматизации период.
- На открытом конце клетки, поместить предварительно подготовленную яблочный сок агаром с одной дозы размера капли дрожжевого теста в центре над открытием клетке. Тогда, закрепите ленту. Уплотнение стыка между яблочного сока агаром и клетку с парафильмом.
- Поместите клетку во вторичной емкости яблочный сок с агаром в качестве основы и позволяют мухи, чтобы воспроизвести при определенной температуре в течение определенного периода времени, как определено в эксперименте.
Примечание: раз взятия пробы Wiбуду меняться. Например, при сборе поздних эмбрионов на стадии ранней / L1 личинок (17 - 24 ч), чтобы мухи, чтобы отложить яйца на яблочный сок чашки с агаром в течение 7 ч при 25 ° С до старения образца в течение 17 ч при 25 ° С. Аналогично, для коллекции середине-конце первого возрастной стадии личинок (36 - 48 ч) позволяют мухи откладывают яйца в течение 12 ч при 25 ° С до старения образца в течение 36 ч при 25 ° С. - После того, как период времени будет завершена, нажмите клетку на стол так, что мухи упасть от яблочного сока агаром без анестезии. Быстро заменить используемую пластину на свежую, содержащую каплю дрожжевого теста. Закрепите новую тарелку с лентой и парафильмом и хранить клетку с яблочного сока агаром в качестве основания.
- Осторожно снимите падение дрожжей от используемого пластины с металлическим шпателем. Место крышка от используемого яблочного сока пластины и позволяют положил эмбрионов возраста, если экспериментально необходимости.
Примечание: В то время как старение образцы, плиты можно хранить при 25 ° С, если более высокие температуры не ExperimentaLLY требуется. Примеры того, как стареют эмбрионов для коллекции, описанной выше (примечание для шага 1,3). Удаление дрожжей пасты предварительного пробовать старение выполняется для предотвращения личинок от ползания в дрожжах и разбивая агар под. Остальные яблочный сок агар и дрожжи пасты остаток обеспечивают питательными веществами роста личинок. В то время как эмбрионы, установленные непосредственно в дрожжевой пастой теряются за счет удаления дрожжи пасты, эта потеря предпочтительнее дрожжей и агар остатка в образце, что позволяет уменьшить окрашивания эффективность. Если один выбор, чтобы не удалить дрожжевую пасту, дрожжи могут быть сжиженного фосфатным буфером Triton X-100 (PBTx), смешивают с кистью, а затем удаляют из образца с ячейки сетчатого фильтра до фиксации.
2 Фиксация
- После того, как эмбрионы, установленные на яблочный сок агаром постарели в нужную точку времени, используйте маленькую кисть, смоченную раствором фосфатного буфера Тритон Х-100 (PBTx) тщательно удалить образец из йэ пластины.
Примечание: Позднее личинки подвижны и могут ползать на внутренней стороне крышки. Этот пример может быть собран аналогично путем удаления с кистью. - Протрите образца-Ладена кисть против внутренней стороне хребта ячейки сетчатого фильтра. Тогда, промойте стены сито и кисть с шприц бутылку, содержащую решение PBTx. Поставьте Петри крышку блюдо под сито, чтобы захватить решение PBTx.
- Ведь образец был передан в сито, влить достаточно PBTx в сито, чтобы поднять образец от сетки. Затем поднимите фильтр и вылейте содержимое чашки Петри на жидкую контейнер для отходов.
- Повторите шаг 2,3 три раза, чтобы удалить дрожжи и летать отходов, которые могут быть переданы вместе с образца.
- Налейте достаточно 50% отбеливателя (NaOCl) / воды (DDh 2 O) решение в сито, чтобы поднять личинок от сетки. Разрешить личинки, чтобы сидеть в растворе в течение 5 мин. Затем поднимите фильтр и вылейте тОн содержимое чашек Петри в жидкой контейнер для отходов.
Примечание: Отбеливатель требуется только в эмбриональных образцов в возрасте от 0 - 22 ч, с тем, чтобы удалить хорионический мембрану. Применение хлорной извести на старых образцов может быть опущен, но его включение не наносит ущерба. Если упущение желательно, заменить отбеливатель на этом этапе с PBTx. Слабым раствором хлорки следует использовать в течение 24 часов подготовки раствора. - Вымойте образец в ситечко с PBTx путем заливки достаточно PBTx в сито, чтобы поднять образец от сетки. Разрешить образца, чтобы сидеть в растворе в течение 3 мин. Затем поднимите фильтр и вылейте содержимое чашки Петри на жидкую контейнер для отходов.
- Повторите шаг 2,6 пять раз.
- Dab дно ячейки фильтра сухой, а затем перенести образец в сцинтилляционный флакон, содержащий 1,75 мл раствора PEMS с помощью кисти.
- Работа в вентилируемом вытяжном шкафу, добавьте 250 мкл 37% формальдегида и 8 мл гептана, содержащую реагенты в сцинтилляционный флакон.
- Разрешить флакон встряхнуть при 200 оборотах в минуту или аналогичного умеренной скоростью в течение 20 мин.
- Добавьте 10 мл метанола в сцинтилляционный флакон, не удаляя предыдущую водную фазу и позволить, чтобы флакон энергично встряхивают при 500 оборотах в минуту в течение 1 мин.
Примечание: Метанол является опасным. Продолжайте работать в вентилируемом вытяжном шкафу и носить соответствующую перчатки. - Удалить флакон от шейкере и сразу разлить содержимое в ячейки сетчатого фильтра над контейнером жидких отходов в капюшоне. Добавить дополнительный метанол в ампулу и проходить через сито клеток по мере необходимости, чтобы гарантировать, что все образцы были удалены.
Примечание: Сотовые фильтры могут слить медленно. Чтобы исправить это, прикоснуться лабораторную салфетку, чтобы в нижней части ячейки фильтра, чтобы привлечь раствор через сито быстрее. Метанол, формальдегид, и гептан должны бытьне хранятся в специальных контейнерах с отходами до надлежащей утилизации как за ведомственным руководящим принципам. - Сухой нижней части ячейки сетчатого фильтра с помощью лабораторной ткани, затем с помощью кисти, чтобы передать образец захваченного в сито в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 0,5 мл метанола.
Примечание: Если несколько сцинтилляционных флаконов в использовании, выполните шаги 2,12 и 2,13 один флакон в то время, чтобы предотвратить образец от высыхания на сотовые фильтров. - После того, как образец был добавлен в микроцентрифужных трубки, удаления метанола при помощи пипетки. Убедитесь, образец осела на дно пробирки.
- Промыть образец в микроцентрифужных трубки путем добавления приблизительно 0,5 мл метанола на трубе. Подождите образца урегулирования затем удаления метанола с помощью пипетки.
- Повторите шаг 15 в три раза.
- Добавить 0,5 мл метанола к трубе, а затем сохранить в -20 ° C морозильник для последующего использования.
3 Регидратация и Получение образца для Иммуноокрашивание
- Удаления метанола из трубки микроцентрифужных с помощью пипетки, в результате чего образец в трубке. Магазин метанол отходы в соответствующий контейнер для отходов до момента надлежащей утилизации.
Примечание: Для повышения эффективности обработки ультразвуком, использовать не более 3 мм образца не поселился в нижней части 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Избыток образца могут быть переданы в отдельную пробирку с помощью пипетки перед началом стадии регидратации выше. Режущий наконечник пипетки с чистым лезвием бритвы может быть использован для предотвращения засорения наконечника пипетки. - Добавить 1,0 мл 50% метанол / фосфатный буфер Твин (PBTw) раствора в пробирку и рок в течение 3 мин.
- Удалить раствора метанола в надлежащем контейнер для отходов и промыть 1,0 мкл PBTw дважды. После каждого полоскания, позволяют образец урегулировать, прежде чем делать от PBTw с помощью пипетки.
- Добавить 1,0 мл бычьего сывороточного альбумина / фосфатным буферным Tween (BBTw) смешивают в ампулу и породы. Через 3 мин на рокера, позволяют SAMPле урегулировать и снимите BBTw с пипеткой.
- Повторите шаг 3,4 два раза, заботящиеся чтобы удалить как можно больше BBTw как можно, не теряя образец после последней стирки.
- Добавить 0,5 мл BBTw к трубе и поместите трубку на льду.
4 Озвучивание образца
- Установите ультразвукового до 10% максимальной амплитуды и назначить время работы 2 сек постоянной ультразвуком.
Примечание: Эти настройки являются специфическими для обработки ультразвуком указывается в материалах и оборудования таблице и может потребовать оптимизации для различных sonicators. - Перед обработкой ультразвуком образца, очистить ультразвукового зонда, помещая наконечник зонда в 50 мл коническую пробирку, заполненную деионизированной воды и выполнения обработки ультразвуком для очистки зонда. Сухой ультразвукового зонда с лабораторным ткани после запуска.
- Погрузите зонд в микроцентрифужных пробирку, содержащую образец таким образом, чтобы она располагалась примерно от 3 до 4 мм выше образца и начать ультразвуком.
- Снимите мicrocentrifuge трубки и поместить его на льду в течение по крайней мере 30 секунд, чтобы рассеивать тепло от ультразвуком и позволяют образец, чтобы поселиться в нижней части трубки микроцентрифужных.
- Повторите шаги 4.3 и 4.4 мере необходимости, исходя от возраста образца обрабатывается.
Примечание: Для оптимального объема образца ультразвуком, эмбрионов моложе 17 ч не требуют ультразвуком, но те, между 17 и 24 часами (этап 17 / раннего L1) требуют двух sonications. Личинки между 24 - 36 (в начале / середине L1), 36 - 48 (СЧ / поздно-L1), 48 - 60 (в начале / середине L2), 60 - 72 (СЧ / поздно-L2), 72 - 84 ( рано-L3), 84 - 96 (в начале / середине L3), 96 - 108 (середина / поздно-L3) ч требуют 5, 9, 11, 13, 15, 18, и 22 sonications соответственно. Смотреть обсуждение дальнейшей разработки на время обработки ультразвуком. - Промыть 1,0 мл BBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать до отвода BBTw с помощью пипетки.
- Добавить 1,0 мл BBTw во флакон и рок. Через 3 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и снимите BBTw с пипеткой. </ LI>
- Повторите шаг 4.7 в два раза.
5 Иммуноокрашивание
- Блок образец путем добавления 5% нормальной сыворотки разбавленный в BBTw в микроцентрифужных трубки. Удалить блок после качалки в течение 1 часа.
Примечание: Используйте нормальную сыворотку от вида, в котором генерируются вторичные антитела. - Развести первичных антител к соответствующим рабочей концентрации в 5% нормальной сыворотки решения / BBTw.
- Рок образца в начальной O раствора антител / N при 4 ° С или, по крайней мере, 3 часа при комнатной температуре (примерно 22 ° C.
Примечание: антитела время инкубации и температуры могут различаться. O / N. инкубации при 4 ° С или 3 ч при комнатной температуре, как правило, достаточно. Тем не менее, в течение двух дней инкубационного периода может повысить окрашивания качество, особенно в старых образцов или при низкоаффинные первичные антитела используются. Более длинные инкубации, как правило, проводили при 4 ° С. Аналогичные соображения должны быть сделаны при использовании вторичных антител (см 5,10). - Разрешить образец оседают наДно пробирке. Откачать первичных антител с пипеткой. Сохранить антитела для повторного использования при желании.
- Промыть 1,0 мл BBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать до отвода BBTw с помощью пипетки.
- Добавить 1,0 мл BBTw во флакон и рок. Через 3 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и удалить BBTw с пипеткой.
- Повторите шаг 5,6 пять раз.
- Блок выборки добавлением 5% нормальной сыворотке решение / BBTw в микроцентрифужных трубки. Удалить блок после качалки в течение 30 мин до 1 часа.
Примечание: Этот дополнительный этап блокировки не требуется, но может улучшить качество окрашивания для специфических антител. - Развести вторичные антитела к соответствующим рабочей концентрации в 5% нормальной сыворотки решения / BBTw.
- Оберните микроцентрифужную пробирку алюминиевой фольгой для уменьшения обесцвечивания под действием светового излучения. Рок образца в средней раствора антител в течение 12 с 48 ч при 4 ° С или, по крайней мере, 3 часа при комнатной температуре (примерно 22 ° С.
- Разрешить образец оседают на дне пробирке. Откачать вторичные антитела с пипеткой.
- Промыть 1,0 мл PBTw дважды. После каждого полоскания позволяют образец урегулировать, прежде чем делать от PBTw с помощью пипетки.
- Добавить 1,0 мл PBTw во флакон и рок. Через 5 мин на рокера, позволяют образец урегулировать и снимите PBTw с пипеткой.
- Повторите шаг 5,13 три раза.
- ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Добавить DAPI разбавляют 1: 1000 в PBTw. Рок образца заворачивали в алюминиевую фольгу в течение 3 мин; затем снимите DAPI решение с помощью пипетки. Промыть пять раз с 1,0 мл PBTw, позволяя образец урегулировать, прежде чем снимать PBTw с пипеткой.
- Добавить 80 - 100 мкл 1,4-диазабицикло [2.2.2] октан раствора (DABCO) в микроцентрифужных трубки и хранить при температуре -20 ° C.
Примечание: Другой глицерина на основе анти-Fade агент может быть заменен на.
6 Анализ
- Перед установкой образца на слайды, добавить дополнительный 5 - 10 мкл DABCO / р-фенylenediamine (PPD) Antifade решение микроцентрифужных трубки.
Примечание: Образец может быть добавлен к слайдов без вскрытия. Объем пробы добавляли к ползуна изменяется в зависимости от размера покровным стеклом. Когда пипеткой образец на слайде, пипетки могут быть обрезаны, используя лезвие, чтобы предотвратить образец стрижку. Часто бывает полезно, чтобы выровнять образец в строках для легкого анализа. Добавление PPD в качестве дополнительного агента Antifade может не потребоваться, но может предотвратить фотообесцвечиванию, если образцы хранятся в долгосрочной перспективе. - Аккуратно поместите стекло крышки скольжения над образца. Тогда, безопасный покровное на месте с помощью лака для ногтей.
- Посмотреть установлен образец с помощью флуоресцентной микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для демонстрации эффективности обработки ультразвуком на основе иммуноокрашивания в анализе поздней стадии эмбрионального и тканей личинки в месте, эмбрионы дикого типа и личинки были обработаны для иммуноокрашивания яичек, яичников и нервной ткани. Образцы были обследованы с помощью конфокальной микроскопии и представительства Результаты показаны (рисунок 1 и рисунок 2). Результаты показывают, что описано протокол вступает в силу для визуализации морфологических особенностей, а также отдельные клетки в месте во позднего эмбрионального через начала / середины-L3 стадиях развития Drosophila.
Результаты яичка Immunostain:
Развитие Яичко является особенно хорошим система для иллюстрации протокола эффективность, так как яички созревание является динамическим всей личиночной стадии. Взрослый Drosophila яички образуют спиральную трубку с одного слепого конца, где зародышевой линии стволовых клеток (GSC) ниша находится (см 13,14 для обзоров). В этой нише, GSCs облеченные вокруг жесткой кластера без митоза соматических клеток, называемых хаб. GSCs пройти асимметричное деление, чтобы произвести один GSC, что остается на месте, к концентратору и дочь gonialblast, который смещен от ниши стволовых клеток. Как gonialblast делит полностью, цитоплазматические расширения называется fusomes форму, соединяющий клетки в сперматогоний. После 4 последовательных делений, сперматогоний инициирует мейоза, образуя сперму.
Формирование Яичко начинается с объединения первичных половых клеток (ПЗК) и соматических половых клеток-предшественников (холдинговая) во время эмбриогенеза (см 15,16 для обзоров). Это объединение приводит к образованию функционального GSC нише в конце эмбриогенеза 8-10. К середине L1, асимметричные GSC раскол в нише GSC привести к дифференциации сперматогоний с разветвленными fusomes 9. Асимметричное деление GSC продолжается в течение личиночнойразвитие, в результате чего производство дополнительного сперматогониев и постепенного увеличения размера гонад. Типичные изображения конце эмбрионального и раннего яичек / середине L1, L2 и L3, иммуноокрашиванию для половых клеток, ступиц клеток, и fusomes, показаны (рисунок 1А-D). Эти изображения иллюстрируют динамические изменения в размере гонад и дифференциации зародышевых клеток, наблюдаемые в яичках в течение долгого времени.
Результаты яичников Immunostain:
Взрослый Drosophila яичники состоят из 16-20 отдельных яиц производству элементов, называемых овариол (см 17,18 для обзоров). На одном конце каждого ovariole, структура называется гермарии содержит стволовых клеток нишу. Ovariole ниша состоит из недифференцированных GSCs и двух популяций соматических клеток: CAP клеток и терминальных накаливания клеток (TFS). Как и в яичках, GSCs пройти асимметричное деление, чтобы произвести один GSC, который остается по соседству с капитализацией клеток и дифференцирующим дочерней клетки, Называется cystoblast, который оттолкнулся от ниши. Cystoblast впоследствии подвергается 4 раундов деления клеток с образованием зародышевых киста, взаимосвязанную с разветвленной fusome. Каждый зародышевой линии, киста затем окружен фолликулярных клеток, чтобы произвести яйцо камеру, которая продолжает развиваться, как она движется вниз по длине ovariole.
Как яичек, яичников сначала формируется в процессе эмбриогенеза 16,18. Несколько овариол возникают из одного эмбрионального гонад, состоящей из PGCs и холдинговая. К середине L3, холдинговая порождают TF прекурсоров в яичнике передней, в то время как половые клетки локализуются в яичнике задней и ассоциированной с ПМГ-полученных приобщенных клеток (ИС) 19-22. К концу-L3, TF клетки дифференцируются и организовать в штабеля, найденных в взрослых ниши стволовых клеток, GSCs и крышка клетки устанавливаются, и зародышевой линии киста дифференциация наблюдается 19,20,23. Типичные изображения поздней стадии эмбрионального и раннего / среднего L3 яичников, immunostaматизируются для половых клеток, холдинговая, МПС, TF прекурсоров, а fusomes, показаны (Рисунок 1E, F). Эти изображения показывают нормальную морфологию и эволюционного развития для их возраста.
Результаты Neural Immunostain:
Drosophila центральной нервной системы (ЦНС) происходит от нервных стволовых клеток, называемых нейробласты (НБС), которые возникают из эмбриональных нейроэпителия (см 24,25 для обзоров). NBs в эмбрионов и личинок делятся асимметрично, чтобы произвести ганглий материнские клетки (GMC), что, в свою очередь, генерируют нейроны и глиальные клетки, найденные во взрослом мозге и брюшной нервной. Поскольку личинки NBs порождают большинства взрослых нейронов и можно отличить на основе их положения в головном мозге, личинки мозги стали важной моделью для изучения NB поведение и нервную дифференциацию.
L3 мозг состоит из двух долей и расположенный в центре брюшной нервной 24.Типичные изображения мозги среднего L3 иммуноокрашиванию для ВТ, ГМО, недифференцированных нейронов, незрелых и первичных нейронов и глиальных клеток показаны (Рисунок 2A-C) 26-30. Эти изображения показывают сильное окрашивание в различных паттернов экспрессии в пределах долей головного мозга и брюшной нервной. В зависимости от монтажного положения, изображения позволяет мозговой ткани визуализации с дорсальной поверхности (фиг.2А), вентральной поверхности (фиг.2В), или в сагиттальной сечения (фиг.2С).
Окрашивание эффективность:
Наши репрезентативные результаты показывают, что процедура обработки ультразвуком иммунное окрашивание на основе является универсальным. Не только он может быть использован, чтобы идентифицировать определенные типы клеток, но также может быть использован, чтобы указывать на присутствие специфических белков и органелл. Тем не менее, неоднозначные результаты могут быть обусловлены ожидаемым изменением окрашивания эффективности. Например, анти-васа окрашивали по крайней мере один гонадув 73,2% всех личинок исследовали (п = 781) в то время как анти-Elav окрашивали мозги в 86% личинок (п = 115). Кроме того, заметим, что окрашивание эффективность примерно обратно пропорциональна стадии развития. У эмбрионов поздней стадии, анти-васа окрашенных 89,8% половых желез (п = 206), в то время как окрашивания присутствовал только в 59,8% и 46,9% от личинок L2 и середине L3, соответственно (п = 132 и 49). Кроме того, результаты обработки ультразвуком в потере образца. Когда количество эмбрионов и личинок, присутствующих в оптимальном объеме образца ультразвуком подсчитывали до и после ультразвуковой обработки, в среднем 41,0% от образца определяли непригодны для анализа (N = 1165). Чтобы максимизировать эффективность окрашивания, протоколы должны быть оптимизированы для специфических антител путем изменения опубликованных концентрации антитела или антитела раз инкубации.
Рис.1 я. mmunostain из Drosophila половых желез в месте (AD) Изображения яичек в месте в эмбрионов поздней стадии (стадия 17 / раннего L1) через начала / середины-L3 личинки иммуноокрашиванию с анти-Васа (AD, красный; Х-D ' один), чтобы обнаружить зародышевые клетки, анти-Fasicilin III (ФАС III) и анти-1B1 (AD, зеленый, A '' - D '' в одиночку) для обнаружения концентратора клеток и fusomes соответственно, и DAPI (AD, синий; ' '' -d '' 'в одиночку) для обнаружения ядра. (А) Стадия 17 / рано L1 яичка показана новая объединились ступицу и сферические fusomes в недифференцированных половых клеток. (B) В начале / середине L1 яичка показывает сферические fusomes в GSCs локализованные около центра и в некотором задней зародышевые клетки удлиненные fusomes указывающие начале сперматогониальные дифференциации. (С) начала / середины-L2 и
Рисунок 2 Immunostain из Drosophila нервных тканях на месте. Начала / середины-L3 личинки иммуноокрашиванию с анти-Elav (
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол обеспечивает метод успешно immunostain целевому Drosophila эмбрионального и тканей личинки на месте, тем самым устраняя необходимость для вскрытия. По ранее протоколов для окрашивания ранних эмбрионов 1,2,3, хорионический мембрану удаляют с помощью 50% отбеливателя (NaOCl). Образцы фиксировали в формальдегид и метанол. Поскольку личиночной кутикулы приводит старую образец плавать, весь образец затем проходит через клетки-фильтра, чтобы обеспечить сохранение личинок. Пример сохраняется, если это желательно, в области химического класса метанола. После регидратации, должным образом реализован процесс обработки ультразвуком нарушает целостность кутикулы личинок. Это очень важно, после формирования кутикулы, чтобы обеспечить достаточное проникновение антител, необходимых для иммунной окраски. Перед применением антител, раскачивая образца в 5% нормальной сыворотки / решение BBTw предотвращает связывание чрезмерное неспецифические антитела. Первичные антитела затем добавляют для обнаружения специфических белков ExpresSED в ткани-мишени. После промывания для удаления несвязанных первичных антител, вторичные антитела, связанные с флуорофорами используются для определения места связанных первичных антител. Анализ может быть выполнена с эпифлуоресцентной или конфокальной микроскопии.
Некоторые могут потребоваться изменения для оптимизации результатов в индивидуальных обстоятельств. В частности, обработка ультразвуком мощность и число выполненных sonications может потребовать корректировки в зависимости от используемого для обработки ультразвуком. Адаптация к высоте ультразвукового зонда над образцом, а также объема раствора может также потребоваться для различных sonicators или если достаточное количество образца не могут быть получены. Повышение мутности раствора может быть использована в качестве индикатора ткани лизиса и, следовательно, обеспечивает датчик для обработки ультразвуком при слишком тяжелыми. Если раствор становится высокой мутности, экспериментатор должен учитывать уменьшение количества выполненных sonications, увеличивая объем раствора, в результате чего высоту sonicatoR зонда над образцом, и / или уменьшения мощности ультразвукового.
Изменения также могут потребоваться в протоколе иммуноокрашивания для повышения качества изображения. Как и в большинстве процедур иммуноокрашивания отношение сигнал-шум может быть изменена путем модификации антител разбавления, времени и температуры инкубации антитела с образцом, и / или блокирование используемых реагентов. В то время как каждое антитело должны рассматриваться независимо, особенно в отношении разведения антител, мы находим, что инкубация при 4 ° С в течение более длительных периодов времени может повысить окрашивания качества после обработки ультразвуком, особенно для антител с низкой сигнал-шум и, когда старше личинки рассматриваются. В этих случаях, качество окрашивания может также извлечь выгоду из небольшого снижения разбавления вторичного антитела. В этом протоколе, мы включают в себя как БСА и сыворотку, как блокирующих реагентов, и образец повторно заблокирован перед добавлением вторичных антител для того, чтобы повысить качество окрашивания. В зависимости от антитела использоватьд, повторное блокирование и включение обоих блокирующих реагентов может или не может потребоваться, чтобы добавлять окрашивание. Если повторно блокирования шаг опущен, более длинные и более моет полоскания может привести к более чистые изображения. И, наконец, предварительно поглощающие поликлональные антитела могут увеличить отношение сигнал-шум. Предварительно поглощения осуществляется путем инкубации желаемое антитело с регидратированных эмбрионов или личинок до использования в immunostain 1.
Как показано в наших представительств результатов, обработка ультразвуком позволяет четкой визуализации тканей-мишеней в месте и таким образом обеспечивает разумную альтернативу рассечения тканей в протоколах иммуноокрашивания. Вскрытие может быть громоздким в эмбрионах дрозофилы и личинок в связи с трудностями в поиске, изолируя и извлечения неповрежденные ткани-мишени. В качестве альтернативы ультразвуком позволяет ткани, чтобы оставаться в контексте всего организма. Потому ультразвуком позволяет избежать добычи и монтажные тканей между предметным и покровным SLIр, это более точно сохраняет на месте морфологии. Практически, большое количество образца может быть обработан быстрее для последующего анализа, так как многие организмы могут быть ультразвуком одновременно.
Хотя ультразвуком обеспечивает хорошую альтернативу вскрытия, он имеет свои ограничения, которые необходимо учитывать. Озвучивание благотворно нарушает целостность личиночной кутикулы, но разрушает некоторый образец в процессе (см Представитель Результаты). Промывка для удаления биологического мусора требуется после процесса обработки ультразвуком, которые могут еще больше снизить объем выборки. Кроме того, целые иммунного окрашивания эмбрионов и личинок выходит из интересующей ткани, встроенного в окружающие ткани. Эти окружающие ткани могут испачкать положительно или показать неспецифического связывания антител, что снижает качество конечного изображения. Наконец, окрашивания эффективность может быть переменной. Эта изменчивость может зависеть от возраста образца, обработка ультразвуком, эффективности и специфичности антител. В результате, для обработки ультразвуком-баСЭД иммуноокрашивание целом монтажа ткани не всегда может быть предпочтительным. В частности, рассечение на основе иммунное окрашивание может быть более эффективным при изучении больших ткани в конце-L3 личинок. Кроме того, обработка ультразвуком может стричь начале и середине-сценические эмбрионов. Несмотря на эти ограничения, ультразвуком основе иммуноокрашивание является высокоэффективным методом, который хорошо подходит для анализа развития различных тканей у эмбрионов поздней стадии до начала / середины L3 личинок. В нашей лаборатории, мы регулярно используют этот протокол для изучения гонад морфогенез у зародышей дрозофилы и личинок 9,10. Кроме того, мы ожидаем, что реализация этого протокола будет доказать не менее плодотворно в изучении развития других тканях дрозофилы и у других организмов с защитным кутикулы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарны Рут Lehman и Dorthea GoDT который любезно поставляемой Vasa и Traffic Jam антитела. Мы хотели бы признать со Center Блумингтон в Университете Индианы для поддержания предоставленные запасов и развития Studies гибридомные банк, разработанные в рамках эгидой NICHD и ведет университете штата Айова. Мы благодарим всех членов лаборатории Wawersik за их советы и поддержку. Эта работа финансировалась Монро Ученые грантовой программы (для ФП и LB) и NSF предоставить IOS0823151 (к МВт).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and Buffers | |||
| Phosphate buffer Triton X-100 (PBTx) | For 5 L: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton 10%. Store at RT. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1 L in dH2O: 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Add components and fill to appropriate volume. Store at 4 °C. | ||
| Triton 10% | For 50 ml: 5 ml of Triton, 5 ml of PBS 10X, 45 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| PEMS | 0.1 M Pipes (pH 6.9), 2.0 mM MgSO4, 1.0 mM EGTA. Store at RT. | ||
| Pipes | For a 400 ml of a 0.25 M solution (pH 6.9): 30.24 g Pipes dH20 NaOH. Dissolve Pipes in 300 ml dH2O and then adjust to pH 6.9 with NaOH. Bring the total volume to 400 ml with dH2O and autoclave. Store at RT. | ||
| Formaldehyde | 37% formaldehyde by weight in methanol. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | ||
| Heptane | CAS 142-82-5 | n-Heptane. Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Methanol | CAS 67-56-1 | Store at RT. Store formaldehyde, heptane, and methanol waste mixture in a tightly sealed container in fume hood before disposal as per institutional guidelines. | |
| Phosphate buffer Tween (PBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%. Filter sterilize after adding all components. Store at 4 °C. | ||
| Tween 10% | For 50 ml: 5 ml Tween, 5 ml of PBS 10X, 40 ml of ddH2O. Rock to mix. Store at RT. | ||
| Bovine serum albumin/phosphate buffer Tween (BBTw) | To make 1 L: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween 10%, 1 g Bovine Serum Albumin (BSA). Add BSA then sterilize using a 0.2 μm vacuum filter unit. Store at 4 °C. | ||
| Normal goat serum (NGS) | ackson ImmunoResearch Laboratories | 005-000-121 | To make 10 ml: Normal goat serum 10 ml ddH2O. Add ddH2O to vial of NGS and sterilize using a 0.2 μm syrninge filter. Store aliquots at -20 °C. |
| 1,4-diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO) | CAS: 281-57-9 | To make 100 ml: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g of DABCO solid, 3.5 ml 6N HCl, 250 μl 10N NaOH, 70 ml glycerol. In 250 ml beaker with stir bar, add ddH2O, Tris HCl and DABCO. Stir and then add 6N HCl, 10 N NaOH, and glycerol. Then add 10N NaOH dropwise until solution reaches pH 7.5. Aliquot. Store aliquots at -20 °C. | |
| DABCO + p-phenylenediamine (PPD) solution | 1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). Dissolve PPD in NaHCO3 and NaCO3 solution. Add 60 μl of PPD solution to 500 μl of DABCO. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Apple juice plates | To make ~200 plates: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g granulated sugar (store bought), 500 ml apple juice (store bought), 15 ml Tegosept 10%, 1.5 ml ddH2O. Add agar to ddH2O in 4 L flask then autoclave for 30 min. Mix apple juice and sugar on heated stir plate. Gradually add apple juice mixture to autoclaved agar. Mix on heated stir plate then aliquot 10 ml volumes into 35 mm petri dishes and let stand at RT to solidify. Store at 4 °C. | ||
| Tegosept 10% | To make 100 ml: 10 g Tegosept, 100 ml ethanol. Store aliquots at -20 °C. | ||
| Yeast paste | ~50 g dry active yeast. Gradually add ddH2O to beaker containing yeast while stirring until paste-like consistency reached. Store at 4 °C. | ||
| Table 2: Staining Materials | |||
| DAPI | Invitrogen | D3571 | 1:1000, stock at 5 mg/ml. |
| Rabbit anti-Vasa | 1:250, a gift from Ruth Lehmann. | ||
| Mouse anti-Fasciclin III | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7G10 | 1:10 |
| Mouse anti-1B1 | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | 1:4 |
| Guniea pig anti-Traffic Jam | 1:2500, a gift from Dorthea Godt (Li et al, 2003). | ||
| Mouse anti-Prospero | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Prospero MR1A | 1:10 |
| Rat anti-Elav | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 7EBA10 | 1:30 |
| mouse anti-Repo | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 8D12 | 1:10 |
| Goat anti-rabbit Alexa546 | Invitrogen | A11010 | 1:500 |
| Goat anti-mouse Alexa488 | Invitrogen | A11029 | 1:500 |
| Goat anti-guniea pig Alexa633 | Invitrogen | A21105 | 1:500 |
| Goat anti-rat Alexa488 | Invitrogen | A11006 | 1:500 |
| Table 3: Materials and Equipment | |||
| Fly Cages | Hand-made; Genesee Scientific Corporation | Not applicable; Bottles: 32-130; Pre-made cage: 59-101 | Made by cutting clear cast acrylic tubing (1 3/4 inch in diameter) into 4 inch tall segments with a compound miter saw at 400 rpm. Ultrafine stainless steel screening (was attached to one end of the tub with acrylic compund glue. An alternate method using an empty fly food bottle can be found in Drosophila Protocols ISBN 0-87969-584-4. Cages may also be purchased from the Genesee Scientific Corporation. |
| Sonicator: Branson 250 Digital Sonifier | Branson | Model: Branson Digital Sonifier 250 | |
| Sonicator probe | Branson | Model #: 102C (CE) | EDP: 101-135-066; S/N: OBU06064658 |
| Syringe filter | Nalgene | 190-25-20 | 0.2 μm cellulose, acetate membrane filter |
| Imaging system: Spinning disc confocal microscope with multichromatic light source, digital CCD camera, and imaging software | Microscope: Olympus, Light source: Lumen Dynamics, Camera: Q-Imaging, Imaging Software: Intelligent Imaging Inc. | Microscope: BX51 equipped with DSU spinning disc, Light source: X-Cite 120Q, Camera: RETIGA-SRV, Imaging Software: Slidebook 5.0 | |
| Vacuum filter unit | Nalgene | 450-0020 | 0.2 μm cellulose nitrate membrane filter |
References
- Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila. Development. 125, 667-678 (1998).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).
- Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis. Development. 130, 4417-4426 (2003).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).
- Blair, S. S. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J Vis Exp. , (2011).
- Le Bras, S., Van Doren, M. Development of the male germline stem cell niche in Drosophila. Dev Biol. 294, 92-103 (2006).
- Sheng, X. R., et al. Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis. Dev Biol. 334, 335-344 (2009).
- Sinden, D., et al. Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis. Dev Biol. 372, 5-16 (2012).
- DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad. Dev Cell. 14, 275-286 (2008).
- Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis. Dev Biol. 367, 114-125 (2012).
- Fuller, M. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).
- Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
- Williamson, A., Lehmann, R. Germ cell development in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).
- Jemc, J. C. Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline. Genesis. 49, 753-775 (2011).
- Spradling, A. C. The Development of Drosophila melanogaster. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).
- Eliazer, S., Buszczak, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2, 45 (2011).
- Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process. Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac. Development. 121, 173-187 (1995).
- Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling. PLoS Biol. 9, e1001202 (2011).
- Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary. Mech Dev. 130, 241-253 (2013).
- Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296, 1855-1857 (2002).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. BioEssays. 26, 739-751 (2004).
- Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila. Development. 133, 2639-2648 (2006).
- Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal. Dev Cell. 10, 441-449 (2006).
- Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells. Cell. 124, 1241-1253 (2006).
- Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila. Dev Biol. 283, 191-203 (2005).
- Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila. Neural Dev. 7, 14 (2012).
