Summary
私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。
Abstract
植物の開花では、体への生殖細胞の運命遷移は大人の植物の花器官における胞子母細胞（SMC）の仕様でマークされています。女性のSMC（大胞子母細胞、MMC）は胚珠原基に区別し、減数分裂を受ける。選択された一倍体大胞子は、その後一緒にアクセサリー細胞と、配偶子を生じるであろう多雌性配偶体、卵細胞と中央のセルを形成するために、有糸分裂を受ける。胚珠内部MMC、減数分裂細胞と雌性配偶体の限られたアクセス性細胞学的および細胞遺伝学的ための技術的に困難である単一細胞レベルで分析する。特に、携帯電話または核エピトープの直接的または間接的な免疫が植物細胞および単一細胞イメージング内部の試薬の貧弱な浸透によって損なわれては、ホールマウント組織における光学的透明性の欠如によってdemisedされる。
そこで、NUCLを分析する効率的な方法を開発したホールマウント組み込みシロイヌナズナ胚珠内の単一のセルの高解像度で耳の組織とクロマチン修飾。これは、顕微鏡スライド上のアクリルアミドゲルの薄層内の固定胚珠の解剖と埋め込みに基づいています。埋め込まれた胚珠は、免疫染色試薬、組織の透明度および透過性を向上させることを目指した化学的および酵素的処理に供される。これらの治療は、細胞のクロマチン組織、DNAおよびタンパク質のエピトープを保持します。サンプルは、クロマチン免疫染色、in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光 、およびヘテロクロマチンの解析のためのDNA染色を含む種々の下流の細胞学的分析のために使用することができる。 3D再構成に続いて、高解像度の共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）イメージングは、単細胞の解像度で定量的な測定を可能にする。
Introduction
顕花植物では、生殖系統の確立は、SMCの分化、女性MMCおよび男性の胞子母細胞から始まります。 MMCは胚珠原基の遠位先端のサブ表皮珠心細胞から発達し、小胞子母細胞は、深い花器官1の内部に配置されている葯房に胞子形成組織から開発しています。平滑筋細胞は、その後、有糸分裂の際に配偶体を生じる一倍体胞子を生成する減数分裂を受ける。雌性配偶体、または胚嚢は、1卵細胞、1中央のセル、2助細胞と3 antipodalsで構成されています。雄性配偶体または花粉は一つの栄養細胞二つ精子細胞から構成されている。雄性配偶体は、比較的アクセス可能なオブジェクト·オブ·研究したまま雌性配偶体が胚珠内に埋め込まれ、それ自体が花の心皮で囲まれ、したがって、分子·細胞学的分析に固有の課題を提起する。しかし、近年、レーザ支援マイクロダイセクションは、トランスクリプトームは、MMCと女性の配偶体細胞2-4で分析することができ、エレガントなソリューションを提供しました。候補遺伝子の発現に加えてin situハイブリダイゼーションまたはレポーター遺伝子アッセイにおいて、例えば RNAを用いて、分析において、細胞学的分析は、特定の直接的な細胞染色または間接的な免疫染色を用いて内因性の細胞成分の動態を調査することができる。特に、一緒にクロマチンの修正やクロマチンの構成要素の免疫染色で、魚やDNAの染色を用いて細胞遺伝学的染色は、 シロイヌナズナ 5クロマチン動態と核組織を解明するための中心的なアプローチである。一般的に、減数分裂がよく、植物の雄減数母細胞6,7で検討されている特定の染色体動態を伴う。おそらく動的なエピジェネティックなリプログラミングを反映し、さらに大規模、細胞特異的なクロマチン再編成は、花粉の発達8月10日の間に記載されている。これとは対照的に、原因女性の減数分裂細胞と配偶体の相対的な到達不能に、これらの調査は、適用が技術的に困難で残っており、多くの場合（下記参照）切片または手動切開および酵素消化を必要とする。また、全体のマウントで光学的透明度の欠如は、優勢無傷胚珠の生殖細胞の高分解能撮像の障害となる。
ホールマウント胚珠における染色体組織の細胞学的分析のための古典的な方法は、フォイルゲン染色の11から13を使用しています。これは、タンパク質の変性をもたらすので、クロマチン構造の破壊を引き起こすDNAの（次亜塩素酸を用いて）酸加水分解を含む。代わりに、女性の減数母細胞と配偶体細胞における染色体組織が （例えば14〜18を参照）は、半薄切片または解剖し、胚嚢とMMCにDAPI染色および免疫染色を用いて観察することができます。明らかに、しかし、手動の解剖と分割は、労働集約的であることができ、クロマチンエピトープの多数の定性的および定量的分析に妨げる。
ここでは、全体のマウントの下流細胞学的染色に適した種々のシロイヌナズナ胚珠を多数準備するために効率的なプロトコルを提供する。簡単に説明すると、花芽が固定液中でインキュベートされる、胚珠の行は心皮から解剖され、花粉減数母細胞19,20のために行ったように、スライドにアクリルアミドに包埋した。埋め込まれた胚珠は、さらに細胞壁消化および透過化の前に、メタノール、エタノール、キシレン中でクリアされ、固定されている。これらのステップの可能なバリエーションが議論されている。次いで、試料をDNA染色、免疫染色およびFISHのために使用することができる。準備モードは、効率的で、並列実験設備（最大16のスライドが異なる下流の解析のために一日に製造することができる）が可能になります。記載され治療は、ホールマウントで均質なイネーブル信号を、よく組織学的、細胞の保存生殖細胞および細胞型の間の定性的および定量的な比較に利益をもたらす、周囲の珠心細胞および核の組織。校正され、3次元再構成に続いて、CLSMベースの高分解能イメージング、蛍光シグナルの意味のある定量的な測定を可能にします。我々が正常に差別MMC 21にクロマチン動態を解析するために、この手順を使用し、雌性配偶体22を開発。ここではホールマウント胚珠内のヘテロクロマチン解析、クロマチン免疫染色、GFP免疫染色およびFISHの代表的な結果を提示する。今後も我々のプロトコルは、他の植物組織および種に適していると考えています。
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Protocol
手順は、 図1のワークフローに記載されており、組織の切開および埋め込 みのためのセットアップを図2に示す。
1。組織固定
- 氷の上で焼きたてのBVO固定液緩衝液を含むマイクロチューブに、20〜30心皮を集める。
- 穏やかに室温で振とうしながら組織30分を修正します。
- 400×gで卓上マイクロ遠心1分で固定液に心皮を含むチューブを回転。
- 慎重に固定液緩衝液を除去し、PBTの1ミリリットルを加え、氷上にチューブを置きます。
2。解剖と埋め込み
- 新たに作製した、5％アクリルアミドミックスのそれぞれ200μlで5エッペンドルフチューブを準備します。
- 5スーパーフロストを70％エタノールで前洗浄し、鉛筆で標識摺動調製する。
- 20％APSと氷上で20％のNaPSをそれぞれの1アリコートを解凍。
- カットエンドチップで行われ4-5の心皮を取るきれいなスライド上に、液体の過剰を取り除く。
- 細い針で縦カットを行い、 図2に示すように胚珠の行を解放する心皮の壁を切り離し、PBS（10μL以下で）で覆うことにより、乾燥を避ける。
- すぐに、200μlのアクリルアミドミックスのアリコートと12μLのAPSを12μlのNAPを追加し、混合する。
- 解剖した胚珠に活性化したアクリルアミドの30を添加する。
- 20×20ミリメートルのカバーガラスで覆い、室温、45〜60分で重合してみましょう。
- カミソリの刃を使用してカバーガラスを取り外します。この段階で、サンプルはPBSを含むコプリンジャー中で4℃で一晩維持することができる。
3。組織処理
注：3.2.1、3.2.3、3.3.2および3.4.3を除くすべてのステップは室温での化学ボンネットの下に80ミリリットル溶液をコプリンジャーに行われている。スライドはフラットチップピンセットで転送されます。
- 組織の明確化と固定：
- メタノール中で5分間インキュベートする。
- エタノールに5分間インキュベート。
- エタノール中で30分間インキュベートする：キシレン（1:1）。
- エタノールに5分間インキュベート。
- メタノール中で5分間インキュベートする。
- 2.5％ホルムアルデヒドで補完、メタノールおよびPBT（1:1）中で15分間インキュベートする。
- PBTで2×10分を洗浄します。この段階で、スライドを4℃で一晩保持することができる
- 細胞壁消化：
- 氷上で細胞壁消化混合物のアリコートを解凍する。
- コプリンジャーからスライドを取り、ペーパータオルの上に垂直に配置することによって、液体の過剰を排出。
- アクリルアミドパッド上で細胞壁の消化ミックスを100μlを加え、23 X 46ミリメートルのカバースリップでカバーしています。他のスライドについて、この手順を繰り返します。 （材料に記載されている）湿ったチャンバー内で37℃で2時間インキュベートする。
- PBTのスライド2×5分を洗ってください。
- 治療をRNアーゼ：
- コプリンジャーからスライドを取り、目のドレイン前のような液体のE過剰。
- 湿ったチャンバー内で37℃で1時間、1％のTween-20を含むPBS中の100μg/ mlでのRNaseA100μlで各スライドをインキュベートします。
- PBTで2×5分間スライドを洗浄します。
- ポスト固定および透過：
- 新たに作成したPBT-Fでの20分間のポスト修正。
- PBTで10分間スライドを洗浄します。
- 4℃で2％のTween-20を含むPBS中で2時間透過化
- PBTで2×5分間スライドを洗浄します。
4。免疫染色
注：このステップでは、一次抗体の最適濃度は、抗体の異なる希釈（1:200、1:500、1:1000）を用いて試験されなければならない。
- 4℃で12〜24時間、0.2％のTween-20を含むPBSで希釈した一次抗体100μlで各スライドをインキュベート
- 穏やかに振とう下、室温で2〜4時間、PBTでスライドを洗浄します。
- 適用するPBS +0.2％のTween-20で24時間、4℃で、二次抗体1:200
- 穏やかに振とう下、室温で1時間、PBTでスライドを洗浄します。
- 15分間、PBS中10μg/ mlのヨウ化と対比染色後、室温で、穏やかに振盪下にPBS中で15分をすすぐ。
- 退色防止液体封入内のマウントは、10μg/ mlのヨウ化を補った。封入剤は、CLSMで画像を取得する前に、1時間硬化させてみましょう。
5。定量的イメージング
- 画像収集：
- 理想的には、より良好な長期のイメージング23を超える蛍光シグナルの保存、および63Xグリセロール浸レンズを可能にする共振型走査モードを使用して、CLSMを用いた高解像度の画像を取得する。
- 厳密に従うことを通して、標準的な取得手順を定義するためにこのような実験の開始時レーザー強度、利得、ピンホール、ボクセルサイズとズーム倍率として取得パラメータをテスト一貫性の定量的測定のためのすべてのスライド。
- 蛍光色素間のクロストークが存在しないことを確認してください。存在する場合、シーケンシャルスキャンを設定します。同時に、別々に透過画像を取得していない。
- xとyの次元で可能な限り高い分解能でかつZ次元（ナイキストの法則）での2倍のオーバーサンプリングをシリアル、3次元画像取得を実行します。
- 画像処理：
- 商用またはオープンソースのソフトウェアを使用して3次元的に連続画像を再構成する。
- 3Dへの関心のそれぞれの核（またはセル）の周囲に輪郭面を定義します。
- 各オブジェクト内の画素強度の和として、各チャンネルで蛍光を定量する。
- 統計分析のためにデータをExcelにエクスポートします。 例えば、DNA染色信号に対する抗体シグナルを正規化する。
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Representative Results
我々は全体のマウント中の細胞学的染色に適しシロイヌナズナ胚珠の大規模調製および処理のための堅牢なプロトコルを提供する。埋め込 みのおかげで、胚珠が3次元構造（ 図3）を保持する。さらに、光の明確化など、組織処理は、高解像度で細胞内構造を画像化することができます。 図4は、ヘテロクロマチンが明るく表示され、明確に定義された目立つ巣（何デコンボリューションは、この絵のために使用されなかった）ホールマウント胚珠原基でDNA染色を示している。これらの画像は、MMCと珠心（ 図4）21ヘテロクロマチン含量を分析するために使用した。
加えて、我々は成功して定量的に大胞子母細胞、機能的大胞子、開発、女性配偶体および初期胚21、22〜24で免疫染色によりクロマチン動態を解析するために、このプロトコルを使用していました。 図5のシロイヌナズナ胚珠に免疫染色ホールマウントの代表的な結果を示している。 図5（a）は、ユークロマチン関連許容マーク（H3K4me3と）の大胞子母細胞、およびヘテロクロマチン関連抑圧的なマークを含む、胚珠原基で免疫検出の例を示してい（H3K27me1）。 図5Bは （この場合、プロトコルはわずかに（説明を参照）GFPブースター抗体を使用するために改変した胚嚢を含む、成熟胚珠におけるGFP免疫検出の一例を示している。また、例えば、天然のクロマチンタンパク質を検出したH3およびH1 21手順はクロマチンタンパク質のエピトープを保持していることを示している。手順は、細胞型（ 例えば 、生殖対体細胞、周囲の細胞）21との間の比較を可能にする再現性の定量化を可能にします。
最後に、我々はまた、首尾よく魚を実施するために、この手順を適用ホールマウント胚珠Pに分析し、rimordia。一例が図6は、45SのrDNAに対してプローブを用いたFISH信号を示す示す核小体組織化領域25を画定繰り返す。 DNAプローブを直接FISHタグ26を用いてアレクサ488で標識した我々のプロトコルに記載のようにDNA対比が行われたが、若干の変更を加え27に記載のように、ハイブリダイゼーションは、本質的に行った。
シロイヌナズナ胚珠内のin situハイブリダイゼーション 、免疫染色、DNA染色と蛍光の図1。ワークフロー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
切開およびスライド上の心皮の埋め込 みについては、図2。セットアップ。心皮の壁を取り除き、心皮（ステップ3で近く解剖し胚珠から参照）胚珠の行を解放するために、スライド上に解剖された後、解剖し心皮が埋め込 まれている活性化したアクリルアミドミックスで、20×20ミリメートルのカバーガラスでカバー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図3プロトコルは、光学的透明度、均一な染色を可能にしながら、3次元構造を維持可能にする。画像が示されているようのxy、xz平面とyz平面軸における3D映像の分割断面図を示す。画像データによって取得されている共焦点レーザー走査顕微鏡とIMARISソフトウェアを使用して3次元で再構築された。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図4。胚珠primodiaにおけるヨウ化プロピジウムによるDNA染色をホールマウントは正確なヘテロクロマチンの定量化が可能になります。左の画像は、胚珠原基全体でホールマウントDNA染色を示している。 MMCの核は赤で白の輪郭と珠心核でマークされています。 3D再構成核の投影が右側に表示されます。組織の透明度は、その中に蛍光シグナルの黄色い輪郭および定量でマークヘテロクロマチン病巣の高分解能イメージングを可能にします。グラフは、相対heterochrを表示分数21 omatin。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図5。 シロイヌナズナ胚珠内のホールマウント免疫染色の代表的な結果。 A）ユークロマチン（H3K4me3と）およびヘテロクロマチン（H3K27me1）を検出若い胚珠原基におけるクロマチン修飾の免疫染色。抗体シグナルは赤で、ヨウ化プロピジウムで対比するDNA緑色です。蛍光シグナルの重ね合わせは、微分干渉コントラスト（グレー）を使用して、透過光で画像と共に示されている。 MMCは白い輪郭で示されている。 MMCの核のクローズアップは、上のパネルの挿入図として示している。画像は、単一の共焦点セクションです。成熟した胚珠におけるGFPのB）の免疫検出。GFPは、GFP-ブースター抗体を用いて免疫染色したし、胚珠をDAPIで対比した。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図6。 シロイヌナズナ胚珠内のin situハイブリダイゼーションホールマウント蛍光。胚珠原基は、45S rDNAのリピート遺伝子座に特異的なDNAプローブとハイブリダイズおよびFISHタグ技術を使用してアレクサ488で標識し、DAPI 26で対比した。 DAPIおよび（灰色）透過光路で取得された画像との45S rDNAのオーバーレイも示されている。 MMCの核のクローズアップが挿入図として示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。URE。
全体のマウント胚珠内のDNAシグナルに対する固定、消化と染色手順の図7に影響のA）中高年胚珠どちらか4％パラホルムアルデヒドやBVO固定液で30分間固定し、酵素ミックスを消化、細胞壁との30分または1時間に処理ヨウ化プロピジウムでDNA染色の前に。所与のバッチについては、より長いインキュベーションはBVOよりもパラホルムアルデヒドで固定したDNA染色の胚珠の具体的な負に影響する。B）ホールマウントDNA染色を必要な酸加水分解28以下、または次のヨウ化プロピジウムを用いたフォイルゲン試薬を用いて非本文中に記載されているプロトコルを変性させること。上のパネルは、下部パネルは、明らかの変更を示す中央の細胞核上倍率を提示し、胚嚢を介して単一の平面部を示すフォイルゲン染色した胚珠内のクロマチンの組織。 CCN、中央の細胞核、ECN、卵細胞核、SYN、の助核。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
顕花植物では、女性の生殖細胞系列は、このように技術的に困難なホールマウントで細胞学的染色をレンダリング、珠心や胚珠外皮を含むいくつかの細胞層に囲まれています。ここでは、このような全体マウントでのin situハイブリダイゼーション 、免疫染色、DNA染色および蛍光として細胞学的染色に適し胚珠多数の製造および加工を可能に効率的なプロトコルを提示する。我々が正常にシロイヌナズナ 21,22における女性の生殖生殖細胞の分析のためにそれを使用していました。複数のスライドは、異なる染色のために並列に処理することができるように、この方法は非常に効率的である。また、堅牢でかつ均一な信号分布を与え、再現性のある定量分析が可能になります。このようなクロマチン構造の変性を伴うフォイルゲン染色などの古典的な方法とは対照的に、我々のプロトコルは、クロマチン組織と核エピトープを保持します。アプリケーションの追加ition、組織の明確化は、単一細胞レベルでの高解像度の信号を撮像可能にする。
花ではなくBVOバッファー（1.1）の4％パラホルムアルデヒド（PBS +1％Tween中）で修正されていた場合、このプロトコルは、3.1で説明した手順を省略することで迅速ことができます。この短い手順では、22〜24の免疫染色、いくつかのための機能を証明しながら、我々はそれが（下記参照）のサンプルは、抗体および細胞壁消化酵素ミックスのバッチ間で染色の堅牢性を減弱させることがわかった。さらに我々は、この短い手順でFISHハイブリダイゼーションに成功しなかった。ここに記載されるように、図5B、同様のプロトコルを示すように、GFPのブースター分子を用いた免疫検出のために、ステップ1および3にわずかな変更を加えて使用した：心皮で45分（1.1）、組織処理の最初のステップのために、2.5％ホルムアルデヒドで固定した2％のBで30分（ブロッキング工程が導入された、5〜10分間のメタノール処理（3.1）に短縮した説明したように、一晩のアプリケーションを抗体に先立って、PBS中のSA）。二次抗体は、ブースターを行う必要はありません。
我々はいくつかの重要なステップの下に説明します。
組織固定、解剖と埋め込み。
免疫染色やDNA染色シグナルは一貫して、より堅牢であり、組織が（土壌中の苗の移転に続いて）未満5週齢の植物から採取されたときに均質に分布。おそらく、我々の成長条件において、培養長時間は、順番に、組織処理の効率に影響を細胞壁の生化学的組成の変化を伴ってもよい。したがって、私たちは、比較的若い植物から採取組織をお勧めします。また、組織はPBS過剰の操作に挑戦しながら（他の組織学的変化および染色シグナルの非存在に至る）解剖の際の乾燥を防止すべきである;ゾルの過剰の優しい排水スライド上に堆積された組織の周りの先端がutionは、このようにお勧めします。さらに、気泡がアクリルアミド混合物中およびカバーガラスで覆いながら避けるべきである。彼らは組織およびアクリルアミドの接着のための他の人よりも優れて表示される最後に、スーパーフロストプラススライドが強く、十分なアクリルアミドの付着（私たちの手の中に脆弱で不安定なパッドに標準的な品質のリード）をお勧めします。
固定、透過処理および細胞壁消化。
細胞壁消化は、組織処理の重要なステップである。なお、この工程は、均質植物組織全体に染色試薬の良好な浸透を促進すると考えられている。我々は、消化時間及び酵素活性に依存して（組織の一部のみで、無信号、信号、100％の組織染色の範囲）染色均一性の変動を経験した（バッチ固有のプロバイダによって記載されている）。これは、ストック溶液を大量に生産することが推奨される酵素ミックス（ 例えば 100ミリリットル）の、-20℃で1ミリリットルのアリコートを維持各原液を最初に大規模に使用する前に1〜2スライド上でテストする必要があります。組織で固定しながら、4％パラホルムアルデヒドで固定し胚珠を負に、細胞壁消化混合物との長時間のインキュベーションにより影響を受けた：さらに、我々は、固定液の種類がダイジェスト細胞壁に対して異なる処理時間との組み合わせでDNA染色の効率に影響を与えることを経験BVOソリューションは、長い消化時間に耐性であったし、より良いDNA染色（ 図7A）を許可された。それはまた、RNA分子に結合するように、組織は、ヨウ化プロピジウムで対比されている場合に加えて、リボヌクレアーゼ（DNアーゼフリー）処置は厳密には必要である。我々は、他のフルオロフォアと重複その広い蛍光発光スペクトルではなく、チャネルシフト補正ポスト取込みを必要色消しの収差を4 '、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）を用いてに対して助言する。我々も特に胚嚢（ 図7B）でクロマチンの変性につながる組織処理28の間に、酸加水分解を必要とフォイルゲン染色に対してお勧めします。代替的DNA色素はまた、29を用いることができるが、その効率は、ここでテストされていない。
免疫染色。
クロマチン修飾の免疫染色のために、我々はオープンソースのデータベース内の一次抗体の特異性を確認することをお勧めhttp://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1いくつかの市販の抗体が交差反応のために示したように、30その他の修正。下流の定量分析のためには、エピトープと線形関係で信号を測定するための抗体濃度およびインキュベーション時間を較正することが重要である。我々は、抗体希塩酸を用いた抗体希釈および検出時間を較正することをお勧め1:200、1:500、1:1000の12〜24時間のインキュベーションからutionシリーズは、それぞれ、堅牢かつ均質なシグナルを与える条件を識別します。再現性のある信号を定量分析に使用されるべき許容最高希釈と最短インキュベーション時間。一次抗体なしのコントロールには、特異性をテストするために実行する必要があります。免疫染色は、非特異的染色を生成する場合には、一次抗体を適用する前に、4℃で2時間PBS中5％のBSA +0.1％Tweenでブロックすることをお勧めします。抗体シグナルは、実験の成功を確認するためにDNA対比前にスライドに確認することができる。私たちの手で、一次抗体とのインキュベーション後2-4時間後、二次抗体の後に1時間のPBTでの洗浄でもブロックせずに、低バックグラウンドシグナルが可能になります。
最後に、このプロトコルは、他の植物組織（ 例えば根、葉の断片で、花の分裂組織）に適用される可能性があり、おそらく他の植物種に、プロである解剖にいくつかの調整をviding、細胞壁を消化し、透過処理。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
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