Summary
Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.
Abstract
En las plantas con flores, la transición destino de la célula somática-a-reproductiva está marcada por la especificación de las células madre de esporas (CML) en los órganos florales de la planta adulta. El SMC macho (célula madre megaspore, MMC) diferencia en el primordio óvulo y sufre meiosis. El megáspora haploide seleccionado a continuación, se somete a la mitosis para formar el gametofito multicelular hembra, lo que dará lugar a los gametos, la célula del huevo y célula central, junto con las células accesorias. La accesibilidad limitada de la MMC, meiocyte y gametofito femenino dentro del óvulo es técnicamente difícil para citológico y citogenético analiza a nivel de células individuales. En particular, la inmunodetección directa o indirecta de los epítopos celulares o nucleares se deteriora por la falta de penetración de los reactivos dentro de la imagen de células de plantas y de una sola célula es arrendada por la falta de claridad óptica en todo el montaje en los tejidos.
Por lo tanto, hemos desarrollado un método eficiente para analizar los nuclorganización del oído y la modificación de la cromatina en alta resolución de una de las células de todo el montaje óvulos Arabidopsis embebidos. Se basa en la disección y la incrustación de óvulos fijos en una capa delgada de gel de acrilamida en un portaobjetos de microscopio. Los óvulos incrustados son sometidos a los tratamientos químicos y enzimáticos destinados a mejorar la claridad del tejido y la permeabilidad a los reactivos de inmunotinción. Esos tratamientos preservar la organización, de ADN y de proteínas epítopos celulares y la cromatina. Las muestras se pueden utilizar para diferentes análisis citológicos aguas abajo, incluyendo la inmunotinción de la cromatina, hibridación in situ fluorescente (FISH), y la tinción de ADN para el análisis de la heterocromatina. Microscopía láser confocal (CLSM) de imágenes con alta resolución, seguida de reconstrucción 3D permite mediciones cuantitativas en la resolución de una sola célula.
Introduction
En las plantas con flores, el establecimiento de linajes reproductiva comienza con la diferenciación de las SMC, MMC hembra y de células madre de microsporas masculino. El MMC se desarrolla a partir de una célula nucellar sub-epidérmica en el extremo distal del primordio óvulo y la célula madre de microsporas se desarrolla a partir de tejido esporógena en la antera lóculo, que se encuentran en el interior de los órganos florales 1. CML sufren meiosis para producir esporas haploides, que luego dan lugar a los gametofitos sobre la mitosis. El gametofito femenino o saco embrionario, se compone de un óvulo, una célula central, dos y tres sinérgidas antípodas. El gametofito masculino, o el polen, se compone de una célula vegetal y dos espermatozoides. Mientras que el gametofito masculino sigue siendo un objeto de estudio-de-relativamente accesible, el gametofito femenino está incrustado dentro del óvulo, en sí encerrado en el carpelo flor, y por lo tanto plantea retos específicos para los análisis moleculares y citológicos. Recientemente, sin embargo, con ayuda de lásermicrodisección ofrece una solución elegante que permite transcriptómica analiza en el MMC y células gametofítico femeninos 2-4. Además de la expresión del gen candidato análisis, usando, por ejemplo ARN hibridación in situ o ensayos de gen reportero, análisis citológicos permite la investigación de la dinámica de los componentes celulares endógenos utilizando tinción celular directo específico o inmunotinción indirecta. En particular, la tinción citogenético mediante FISH y la tinción de ADN, junto con la inmunotinción de modificaciones de la cromatina o componentes de la cromatina son los enfoques centrales para dilucidar la dinámica de la cromatina y la organización nuclear de Arabidopsis 5. Habitualmente, la meiosis implica dinámica de los cromosomas específicos que ha sido bien investigados en planta macho meiocytes 6,7; además de gran escala, la reorganización de la cromatina de células específicos, reflejando probablemente la reprogramación epigenética dinámica ha sido descrita durante el desarrollo del polen 8-10. Por el contrario, debidoa la relativa inaccesibilidad de la meiocyte hembra y gametofito, estas investigaciones siguen siendo técnicamente difíciles de aplicar, y a menudo requieren la disección de seccionamiento o manual y la digestión enzimática (ver más abajo). Además, la frecuente falta de claridad óptica en todo el montaje es un obstáculo para imágenes de alta resolución de las células reproductoras en óvulos intactos.
Un método clásico para el análisis citológico de organización de los cromosomas en óvulos de todo el montaje utiliza la tinción de Feulgen 11-13. Se trata de la hidrólisis ácida (usando ácido hipocloroso) del ADN que resulta en desnaturalización de la proteína y por lo tanto causa la destrucción de la estructura de la cromatina. Alternativamente, organización de los cromosomas en meiocytes femeninas y células gametofítico se puede observar mediante DAPI y la inmunotinción de las secciones semi-delgadas o sacos embrionarios disecados y MMC (por ejemplo, ver 14-18). Claramente, sin embargo, la disección manual y de corte pueden ser mano de obra intensiva yimpide en el análisis cualitativo y cuantitativo de un gran número de epítopos de la cromatina.
Aquí les ofrecemos un protocolo eficiente para preparar un gran número de óvulos Arabidopsis adecuados para una variedad de tinción citológica aguas abajo en todo el montaje. En breve, los brotes de flor se incuban en una solución de fijación, las filas de óvulos se disecan de la carpelo y embebidos en acrilamida en la diapositiva como se hizo para meiocitos polen 19,20. Los óvulos incrustados se borrarán y se fijaron en metanol, etanol, y xileno antes de la digestión de la pared celular y permeabilización. Se discuten las posibles variaciones de estos pasos. Las muestras luego se pueden utilizar para la tinción de ADN, inmunotinción, y FISH. El modo de preparación es eficiente y permite paralelo experimental (hasta 16 diapositivas se pueden preparar en un día diferente para el análisis de aguas abajo). Los tratamientos descritos permiten señales homogéneas en todo el montaje e histológico, celular bien conservados,y la organización nuclear en las células reproductoras y las células circundantes que se benefician nucelar comparaciones cualitativas y cuantitativas entre los tipos de células. Calibrado, imágenes basadas en CLSM de alta resolución seguida de reconstrucción en 3 dimensiones permite mediciones cuantitativas significativas de señales fluorescentes. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para analizar la dinámica de la cromatina en el MMC diferenciador 21 y desarrollando gametofito femenino 22; Presentamos aquí los resultados representativos de análisis heterocromatina, inmunotinción cromatina, la inmunotinción GFP y FISH en todo el montaje óvulos. Además, creemos que nuestro protocolo será adecuado para otros tejidos y especies de plantas.
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Protocol
El procedimiento se describe en el flujo de trabajo en la Figura 1, y la configuración para la disección y la incrustación de tejidos se presentan en la Figura 2.
1. Fijación del tejido
- Recoger 20-30 carpelos en un tubo de microcentrífuga que contiene recién hecho tampón fijador BVO en hielo.
- Fijar el tejido 30 min con agitación suave a temperatura ambiente.
- Haga girar los tubos que contienen los carpelos en fijador en una microcentrífuga de sobremesa 1 min a 400 x g.
- Retire con cuidado el tampón fijador y agregar 1 ml de PBT, coloque los tubos en hielo.
2. Disección e incrustación
- Preparar cinco tubos Eppendorf con cada 200 l de una recién hecha, 5% de mezcla de acrilamida.
- Preparar cinco portaobjetos Superfrost pre-limpiados con etanol al 70% y se marcaron con un lápiz.
- Descongelar una alícuota de 20% y 20% de APS NaPS cada uno, en el hielo.
- Tome 4-5 carpelos con una punta de corte final, el lugarsobre una lámina limpia, eliminar el exceso de líquido.
- Haga cortes longitudinales con una aguja fina y separar las paredes carpelo para liberar filas de óvulos como se muestra la Figura 2, evitar el secado, cubriendo con PBS (no más de 10 l).
- Añadir rápidamente y mezclar 12 NaPS mu l, 12 APS mu l con una alícuota de 200 l de mezcla de acrilamida.
- Añadir 30 l de la acrilamida activado en los óvulos disecados.
- Tapar con un cubreobjetos mm 20 x 20, por no polimeriza a temperatura ambiente, 45 a 60 min.
- Retire el cubreobjetos usando una cuchilla de afeitar. En esta etapa, las muestras se pueden mantener durante la noche a 4 ° C en un vaso de Coplin que contenía PBS.
3. Procesamiento de tejido
NOTA: Todos los pasos, excepto 3.2.1, 3.2.3, 3.3.2 y 3.4.3 se llevan a cabo en frascos de Coplin con 80 ml de solución bajo el capó química a temperatura ambiente. Las diapositivas se transfieren con una pinza de punta plana.
- Clarificación de tejidos yfijación:
- Incubar 5 min en metanol.
- Incubar 5 min en etanol.
- Incubar 30 min en etanol: xileno (1:1).
- Incubar 5 min en etanol.
- Incubar 5 min en metanol.
- Incubar 15 min en metanol y PBT (01:01), complementado con 2,5% de formaldehído.
- Enjuague 2 x 10 min en PBT. En esta etapa, las diapositivas se pueden mantener durante la noche a 4 ° C.
- La digestión de la pared celular:
- Descongelar una alícuota de la mezcla de la digestión de la pared celular en hielo.
- Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drenar el exceso de líquido, colocándolo en posición vertical sobre una toalla de papel.
- Añadir 100 l de mezcla de digestión de la pared celular sobre la almohadilla de acrilamida y cubrir con un cubreobjetos 23 mm x 46. Repita el procedimiento para las otras diapositivas. Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una cámara húmeda (se describe en Materiales).
- Lavar el portaobjetos 2 x 5 min en PBT.
- RNasa A de tratamiento:
- Tome un portaobjetos del frasco de Coplin, drene ªe exceso de líquido como antes.
- Incubar cada portaobjetos con 100 l de ARNasa A a 100 g / ml en PBS con 1% de Tween-20 durante 1 hora a 37 ° C en una cámara húmeda.
- Lavar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT.
- Posteriores a la fijación y permeabilización:
- Post-fijar durante 20 minutos en recién hecha PBT-F.
- Enjuagar los portaobjetos durante 10 minutos en PBT.
- Permeabilizar durante 2 horas en PBS con 2% de Tween-20 a 4 ° C.
- Enjuagar los portaobjetos durante 2 x 5 min en PBT.
4. Inmunotinción
NOTA: Para este paso, la concentración óptima del anticuerpo primario tiene que ser probado mediante el uso de diferentes diluciones (1:200, 1:500, 1:1000) de los anticuerpos.
- Incubar cada portaobjetos con 100 l de anticuerpo primario diluido en PBS con 0,2% de Tween-20 durante 12-24 horas a 4 ° C.
- Lavar los portaobjetos en PBT durante 2-4 horas a temperatura ambiente bajo agitación suave.
- Aplicar la1:200 de anticuerpo secundario en PBS + 0,2% de Tween-20 durante 24 horas a 4 ° C.
- Lavar los portaobjetos en PBT durante 1 hora a temperatura ambiente bajo agitación suave.
- Contratinción con 10 g / ml de yoduro de propidio en PBS durante 15 min, luego enjuague 15 min en PBS bajo agitación suave, a temperatura ambiente.
- Monte en anti-fading medio de montaje líquido suplementado con 10 mg / ml de yoduro de propidio. Deje que el medio de montaje se endurezca durante 1 hora antes de la adquisición de imágenes por CLSM.
5. Imagen Cuantitativa
- La adquisición de imágenes:
- Adquirir imágenes de alta resolución utilizando CLSM, idealmente utilizando un modo de escaneo de resonancia, lo que permite una mejor conservación de las señales fluorescentes más prolongado de formación de imágenes 23, y una lente de inmersión 63X glicerol.
- Compruebe los parámetros de adquisición, tales como la intensidad del láser, la ganancia, pinhole, tamaño de voxel y el factor de zoom al inicio del experimento para definir un procedimiento de adquisición estándar a seguir estrictamente lo largotodas las diapositivas para las mediciones cuantitativas consistentes.
- Verificar la ausencia de interferencia entre fluorocromos. Si está presente, establecer una exploración secuencial. Adquirir imágenes de transmisión por separado y no simultáneamente.
- Lleve a cabo la adquisición de imágenes en serie, en tres dimensiones con la resolución más alta posible en las dimensiones X e Y, y con sobremuestreo 2x en la dimensión z (la regla de Nyquist).
- Tratamiento de la imagen:
- Reconstruir imágenes en serie en tres dimensiones utilizando software comercial o de código abierto.
- Definir las superficies de contorno alrededor de cada núcleo (o célula) de interés en 3D.
- Cuantificar la fluorescencia en cada canal como la suma de intensidades de los píxeles en cada objeto.
- Exportar los datos a Excel para su análisis estadístico. Normalizar las señales de anticuerpos contra las señales de tinción por ejemplo ADN.
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Representative Results
Proporcionamos un protocolo robusto para la preparación a gran escala y el procesamiento de óvulos Arabidopsis adecuados para la tinción citológica en todo el montaje. Gracias a la incrustación, los óvulos conservan una estructura de 3 dimensiones (Figura 3). Además, el procesamiento de tejido incluyendo la clarificación óptica permite estructuras subcelulares de formación de imágenes en alta resolución. Figura 4 muestra la tinción de ADN en primordios óvulo todo el montaje donde la heterocromatina aparece como brillante, focos visible bien definido (sin deconvolución se utilizó para esta imagen). Estas imágenes fueron utilizadas para el análisis de contenido de la heterocromatina en la MMC y nucelo (Figura 4) 21.
Además, hemos utilizado con éxito este protocolo para analizar cuantitativamente la dinámica de la cromatina mediante inmunotinción de células madre megaspore, megaspore funcional, desarrollo gametofitos femeninos y embrión temprano 21, 22-24. En la Figura 5 de Arabidopsis. Figura 5A muestra un ejemplo de inmunodetección en primordios óvulo, incluyendo la célula madre megaespora, de una marca permisiva eucromatina-asociado (H3K4me3) y una marca represiva heterocromatina asociada (H3K27me1). Figura 5B muestra un ejemplo de la inmunodetección de GFP en un óvulo maduro, incluyendo el saco embrionario (en este caso, el protocolo se modificó ligeramente para usar el anticuerpo de refuerzo de GFP (véase la discusión). También se detectaron proteínas de la cromatina nativos tales como H3 y H1 21 muestra que el procedimiento conserva epítopos de proteínas de la cromatina. El procedimiento también permite cuantificaciones reproducibles que permitan la comparación entre los tipos de células (por ejemplo reproductiva vs somáticas, células circundantes) 21.
Por último, también se aplica con éxito este procedimiento para llevar a cabo los análisis FISH en todo el montaje óvulo primordia. Un ejemplo se muestra la figura 6, que muestra señales de FISH utilizando una sonda contra el 45S rDNA repite la definición de las regiones organizadoras nucleolares 25. La sonda de ADN se marcó directamente con Alexa 488 mediante FISH-Tag 26, la hibridación se llevó a cabo esencialmente como se ha descrito 27, con modificaciones menores, mientras que la contratinción de ADN se llevó a cabo como se describe en el protocolo.
Figura 1. Flujo de trabajo de la inmunotinción, la tinción de ADN y la hibridación in situ fluorescente en óvulos de Arabidopsis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Configuración para la disección y la incrustación de carpelos en la diapositiva. Se retira la pared carpelo y el carpelo es disecado en la diapositiva para liberar filas de óvulos (ver primer plano de óvulos disecados en el paso 3), y luego el carpelo diseccionado está incrustado en la mezcla de acrilamida activado, cubierto por 20 x 20 mm cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. El protocolo permite la preservación de la estructura de 3 dimensiones al tiempo que permite la claridad óptica y tinción homogénea. Las imágenes muestran una vista en sección de división de la imagen en 3D en xy, xz y yz eje como se indica. Los datos de imagen han sido adquiridos pormicroscopía láser confocal y reconstruida en 3 dimensiones utilizando el software Imaris. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Todo el montaje tinción de ADN por yoduro de propidio en primodia óvulo permite la cuantificación precisa de la heterocromatina. La imagen de la izquierda muestra la tinción de ADN todo el montaje a lo largo de un primordios óvulo. Un núcleo MMC está marcada por un contorno blanco y un núcleo nucellar en rojo. Las proyecciones de los núcleos reconstruidos-3D se muestran a la derecha. La claridad del tejido permite una alta resolución de imagen de los focos de heterocromatina marcados por un contorno amarillo y cuantificación de las señales fluorescentes en el mismo. Los gráficos muestran la relación heterochromatin fracción 21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Los resultados representativos de todo el montaje inmunoticción en óvulos de Arabidopsis. A) La inmunotinción de modificaciones de la cromatina en pequeños primordios óvulo detección eucromatina (H3K4me3) y heterocromatina (H3K27me1). La señal de anticuerpos es de color verde, un contraste al ADN de yoduro de propidio en rojo. Una superposición de las señales fluorescentes se muestra junto con una imagen de la luz de transmisión utilizando el contraste de interferencia diferencial (gris). MMCs se indican con contornos blancos. Un primer plano del núcleo MMC se muestra como la inserción en el panel superior. Las imágenes son individuales confocal sección. B) La inmunodetección de las buenas prácticas agrarias en un óvulo maduro.La GFP se immunostained utilizando anticuerpos GFP-booster y el óvulo se counterstained con DAPI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Todo el montaje hibridación in situ fluorescente en óvulos de Arabidopsis. El primordio óvulo se hibridó con una sonda de ADN específica a 45S ADNr loci de repetición y etiquetados con Alexa 488 utilizando la tecnología FISH-Tag, y contratinción con DAPI 26. También se muestra la superposición de 45S rDNA con DAPI y la imagen adquirida en el canal de transmisión de luz (gris). Un primer plano del núcleo MMC se muestra como la inserción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figuraUre.
Figura 7. Influencia de la fijación, la digestión y procedimiento de tinción en las señales de ADN en óvulos de todo el montaje. Óvulos A) maduros se fijaron 30 min ya sea con 4% de paraformaldehído o BVO fijador y se procesaron 30 min o 1 hora con pared celular digerir mezcla de enzimas antes de la tinción del ADN con yoduro de propidio. Para un lote dado, más largo de incubación afecta más negativamente a los óvulos de tinción de ADN que se fijaron con paraformaldehído que con BVO. B) tinción Todo el montaje de ADN utilizando el reactivo Feulgen después de una hidrólisis ácida requerida 28 o el uso de yoduro de propidio a raíz de la no- protocolo de desnaturalización describe en el texto. El panel superior muestra un único plano de sección a través del saco embrionario, el panel inferior presenta un aumento en el núcleo de la célula central que mostraba claramente la alteración deorganización de la cromatina en óvulos teñidas con Feulgen. CCN, núcleo de la célula central, ECN, núcleo de la célula huevo, syn, núcleo synergid. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En las plantas con flores, el linaje reproductivo femenino está rodeado por varias capas de células incluyendo la nucela y los tegumentos de óvulos, haciendo así la tinción citológica en todo el montaje técnicamente difícil. Aquí presentamos un protocolo eficiente que permite la preparación y elaboración de un gran número de óvulos adecuados para la tinción citológica como inmunotinción, la tinción de ADN y la hibridación fluorescente in situ en todo el montaje. Se utilizó con éxito para el análisis de la línea germinal reproductor femenino en Arabidopsis 21,22. Este método es altamente eficiente como varias diapositivas pueden ser tratados en paralelo para diferentes tinción. También es robusto y da la distribución de señal homogénea y permite análisis cuantitativos reproducibles. Por contraste con el método clásico, tales como la tinción de Feulgen que implica la desnaturalización de la estructura de la cromatina, nuestro protocolo conserva organización de la cromatina y epítopos nucleares. En complementoition, clarificación de tejidos permite obtener imágenes de las señales en alta resolución a nivel de una sola célula.
Este protocolo se puede acelerar al omitir los pasos descritos en el punto 3.1 si las flores se han fijado en el 4% de paraformaldehído (en PBS + 1% de Tween) en lugar de tampón BVO (1.1). Si bien este procedimiento más corto resultó funcional para varios inmunotinción 22-24, se encontró que se atenúa la robustez de la tinción de anticuerpos a través de muestras, y lote de la pared celular de mezcla de enzima de digestión (ver más abajo). Además no tuvimos éxito para la hibridación FISH con este breve procedimiento. Para la inmunodetección de GFP del uso de las moléculas de refuerzo como se muestra la figura 5B, un protocolo similar al descrito aquí se utilizó con ligeras modificaciones en el paso 1 y 3: carpelos se fijaron en 2,5% de formaldehído durante 45 min (1,1), el primer paso de procesamiento de tejido fue acortado a 5-10 min de tratamiento metanol (3.1), se introdujo una etapa de bloqueo (30 min en 2% de BSA en PBS) antes de la aplicación de anticuerpo durante la noche como se describe. No se anticuerpo secundario es necesario con la dosis de refuerzo.
A continuación presentamos algunos pasos críticos:
La fijación del tejido, la disección y la inclusión.
Señales de inmunotinción y tinción de ADN fueron consistentemente más robusto y homogéneamente distribuidos cuando el tejido se tomaron muestras de las plantas de menos de 5 semanas de edad (después de la transferencia de la plántula en el suelo). Posiblemente, en nuestras condiciones de crecimiento, un período prolongado de cultivo puede estar acompañada por cambios en la composición bioquímica de la pared celular, que influyen a su vez la eficiencia de procesamiento de tejido. Por lo tanto se recomienda el muestreo de tejido de plantas relativamente jóvenes. Además, el tejido se debe impedir que se seque durante la disección (líder de otro modo a la alteración histológica y la ausencia de señales de tinción), mientras que un exceso de PBS desafía la manipulación; un drenaje suave del exceso de solpor lo tanto se recomienda lución con la punta alrededor del tejido depositado en la diapositiva. Además, las burbujas deben evitarse en la mezcla de acrilamida y al tiempo que cubre con un cubreobjetos. Por último, las diapositivas Superfrost Plus se recomiendan para la adhesión acrilamida adecuado (cable estándar de calidad a las almohadillas frágiles e inestables en nuestras manos), tal y como aparecen superior a los demás para el tejido y la adherencia de la acrilamida.
La fijación, permeabilización y la digestión de la pared celular.
La digestión de la pared celular es un paso crítico de procesamiento de tejidos. Se piensa que este paso facilita una buena penetración de los reactivos de tinción homogéneamente en todo el tejido de la planta. Hemos experimentado la variabilidad en la tinción de homogeneidad (que van desde ninguna señal, la señal en sólo una parte del tejido, para la tinción de tejidos 100%) dependiendo del tiempo de la digestión y la actividad enzimática (-lote específico, descrito por el proveedor). Se recomienda para producir una gran cantidad de solución madrede la mezcla de enzimas (por ejemplo, 100 ml) y mantener alícuotas de 1 ml a -20 ° C. Cada solución stock primero debe ser probado en 1-2 diapositivas antes de utilizar a gran escala. Además, hemos experimentado que el tipo de fijador influye en la eficiencia de la tinción de ADN en combinación con diferente tiempo de procesamiento para digerir la pared celular: óvulos fijos en 4% de paraformaldehído se vieron afectados negativamente por la incubación prolongada con la combinación de la digestión de la pared celular, mientras que el tejido fijado con la solución BVO eran tolerantes a los tiempos de digestión más largo y permite una mejor tinción de ADN (Figura 7). Además, un tratamiento con ARNasa (libre de ADNasa) es estrictamente necesario si el tejido se contratiñeron con yoduro de propidio, ya que también se une a las moléculas de ARN. No se aconseja el uso de 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI), debido a sus amplios espectros de emisión fluorescente se solapan con otros fluoróforos, sino también a las aberraciones acromáticas que requieren correcciones de desplazamiento de canal posterior a la adquisición. Tambiénrecomendar contra la tinción de Feulgen que requiere una hidrólisis ácida durante el procesamiento de tejido 28 que conduce a la desnaturalización de la cromatina en particular en el saco embrionario (Figura 7B). Colorantes de ADN alternativas también se pueden usar 29, pero su eficacia no ha sido probado aquí.
La inmunotinción.
Para la inmunotinción de modificaciones de la cromatina, se recomienda comprobar la especificidad del anticuerpo primario en la base de datos de código abierto http://compbio.med.harvard.edu/antibodies/projects/1 30, ya que algunos anticuerpos disponibles comercialmente mostraron reacciones cruzadas para otras modificaciones. Para los análisis de cuantificación de aguas abajo, es importante para calibrar la concentración de anticuerpos y tiempo de incubación para medir las señales en una relación lineal con el epítopo. Se recomienda calibrar la dilución de anticuerpos y detección de tiempo usando un anticuerpo dilserie lución de 1:200, 1:500, 1:1.000 y 12-24 h de incubación, respectivamente, para identificar las condiciones que dan señales sólidas y homogéneas. La mayor dilución y menor tiempo de incubación permitiendo que las señales reproducibles deben ser utilizados para los análisis cuantitativos. Los controles sin anticuerpo primario se deben realizar para comprobar la especificidad. Si inmunotinción produce la tinción inespecífica, se aconseja para bloquear con BSA al 5% + 0,1% de Tween en PBS durante 2 horas a 4 ° C antes de aplicar el anticuerpo primario. Señales de anticuerpos pueden ser revisados en la diapositiva antes counterstaining ADN para verificar el éxito del experimento. En nuestras manos, lavado en PBT durante 2-4 horas después de la incubación con el anticuerpo primario, y 1 hora después de la anticuerpo secundario permite para señales de baja de fondo incluso sin bloquear.
Finalmente, este protocolo también es probable aplicable a otros tejidos de la planta (por ejemplo, la raíz, el fragmento de la hoja, de meristemos florales) y probablemente a otras especies de plantas, proViding algún ajuste en la disección, la pared celular de digerir y permeabilización.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2 mM EGTA, pH 7.5, 1% (v/v) formaldehyde, 10% DMSO, 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1x PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1x PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3 g acrylamide, 0.33 g bisacrylamide, 1x PBS (prepare 10 ml, store at 4 °C) | ||
| 200 ml 5% acrylamide mix in PBS | 34 ml 30% acrylamide:bisacrylamide, 166 ml 1x PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2 g ammoniumpersulfte, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2 g sodium sulfite, 1 ml sterile water (prepare aliquots with 1 ml and store at -20 °C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
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