Summary
Описанный здесь это протокол для полу-автоматизированной визуализации тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов рыбок данио.
Abstract
Эмбрионы рыбок данио являются мощным инструментом для крупномасштабного скрининга малых молекул. Трансгенные данио, которые выражают флуоресцентные репортер белки часто используются для выявления химических веществ, которые модулируют экспрессию генов. Химические экраны, которые анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования для скрининга высокое содержание. Мы описываем процедуру с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскоп с моторизованным этапе для автоматической изображения эмбрионов данио рерио и выявления тканеспецифической флуоресценции. Использование трансгенных данио, что отчет о деятельности рецептора эстрогена через выражение GFP, мы разработали процедуру полуавтоматического для выявления рецептора эстрогена лигандов, активирующих репортеру в тканеспецифического образом. В этом видео мы описываем процедуры выстроив эмбрионов данио рерио в 24-48 часов после оплодотворения (ФВЧ) в 96-луночный планшет и добавляя небольшие молекулы, которые связывают рецепторы эстрогена. В 72-96 часов после оплодотворения, образы каждую лунку отвся пластина автоматически собираются и вручную проверять на тканеспецифической флуоресценции. Этот протокол демонстрирует способность обнаруживать эстрогены, которые активируют рецепторы в сердечных клапанов, но не в печени.
Introduction
Трансгенные данио были разработаны, которые позволяют прямой визуализации активности в пути, такие как роста фибробластов факторы 1, ретиноевой кислоты 2 и эстрогены 3, в живых эмбрионов сигнализации. Такие инструменты позволяют скрининг для химических веществ, которые возмущают сигнальных путей (анализировали, как изменение интенсивности флуоресценции) или химических веществ, которые модулируют сигнализации в ткане-специфическим образом (изменение локализации флуоресценции) 4. Автоматизированный ввод изображений увеличивает пропускную способность химических экранов резко 5,6. Экраны, которые автоматически анализа флуоресценции в живом рыбок данио часто полагаются на дорогой, специализированного оборудования. Так называемый скрининг высокого содержания обеспечивает преимущества высокого разрешения, количественного изображений, но за счет использования специализированных читателей пластины оборудованные для конфокальной микроскопии 7,8. Цель этого метода состоит в автоматическом анализе тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рериов 96-луночный планшет с использованием стандартного эпифлюорисцентной микроскопа. Тканеспецифическая флуоресценции можно отличить с помощью этой техники и может быть разумным подходом для лабораторий, которые не имеют доступа к специализированным читателей пластины или высокой-контент оборудования для досмотра.
В этом протоколе, мы используем автоматизированную изображений для обнаружения тканеспецифической рецептора эстрогена (ER) агонисты в живом рыбок данио в 3 дней после оплодотворения (DPF). Трансгенной линии Tg (5xERE: GFP) c262/c262 содержит 5 тандем реагирования эстрогена элементов последовательности ДНК (ЭРД) вверх по течению от зеленого флуоресцентного белка (GFP) 3. В отсутствие лиганда, ERS обычно неактивны. Связывание лиганда вызывает конформационные изменения, что позволяет рецепторы для связывания ERE ДНК и регулируют транскрипцию 9. 5xERE: GFP рыба может быть использован для скрининга химических библиотек для ER модуляторов и может быть использован для скрининга образцов окружающей воды для эстрогенных загрязнений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был одобрен Университета Алабамы в Бирмингеме институционального комитета уходу и использованию животных.
1. Данио рерио Разведение и яичные Коллекции
- За три дня до начала воздействия химикатов, собрать размножения танки с разделителями в отдельных мужчин и женщин. Заполните каждый танк наполовину с системой аквакультуры воды. Использование сети, передавать Tg (5xERE: GFP) c262/c262 рыбу рыборазводных аквариумах, размещение 2 мальчика и 3 девочки в каждом баке с перегородкой. Поместите крышку на каждом баке и этикетка с указанием даты и штаммов, которые будут скрещенными.
- На следующее утро, снять все барьеры и наклона перегородки для создания мелководье на одном конце разведении танк. Разрешить данио к спариванию, сбора эмбрионов на 10-минутные интервалы для обеспечения точного постановку развития. Чистые яйца по полоскания через ситечко с помощью E3B среднего и осторожно промойте эмбрионов в чашки Петри. Вернуться взрослых рыб в постоянноетанки.
- Использование рассекает микроскопом, сортировать, рассчитывать, и удалите все неоплодотворенные, аномальные или поврежденные эмбрионы. Место эмбрионов в чашках Петри в E3B средних и дома в 28,5 ° C с 14:10 свете: темно-цикла. Плотность эмбрионов может повлиять на развитие. Поместите не более 100 эмбрионов в мм блюдо 100 х 35 и не более 50 эмбрионов в мм блюдо 60 х 15.
- К 24 часов после оплодотворения, замените носитель с E3B содержащей 200 мкм 1-фенил 2-тиомочевины (ПТУ). ПТУ предотвращает образование пигмента и держит эмбрионов данио и личинок прозрачную для улучшения четкости изображения. ВНИМАНИЕ: концентрированный ПТУ акции опасными; носить перчатки при принятии решения E3B + ПТУ.
- В 1 день после оплодотворения (DPF), вручную удалить хориона от каждого эмбриона с использованием тонких щипцов. Хорион, кажется, не влияет проникновение эстрогенов, однако удаление увеличивает четкость изображения. Там нет необходимости, чтобы удалить хорионов из средств массовой информации. ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы ручной dechorionation, партии эмбрионов может быть чечески dechorionated с использованием 1 мг / мл проназы обработку, как описано выше 11.
2. Химическая обработка эмбрионов
- За день до лечения, подготовить исходные растворы каждого химического вещества в концентрации 1,000 раза в ДМСО (или соответствующем растворителе). Например, чтобы выставить эмбрионов до 10 мкм бисфенола А (BPA), подготовить исходный раствор 10 мМ BPA в 100% ДМСО. Это обеспечивает однородную концентрацию ДМСО в каждой обработки и позволяет нетоксичный 1:1000 разбавление ДМСО в качестве контроля транспортного средства. Магазин растворы при температуре -20 ° С. Для этого протокола, эмбрионы будут подвергаться воздействию 1 мкМ и 10 мкМ БФА, 18,5 нМ и 1,85 мкМ генистеина, 367 нМ эстрадиола (положительный контроль) и транспортного средства (0,1% ДМСО, отрицательный контроль).
ВНИМАНИЕ: Химические вещества, такие как BPA и эстрадиола являются опасными и могут иметь негативное влияние на плода человека. Ручка эндокринные расстройства с осторожностью и всегда использовать средства личной защиты. - В день лечения, оттепель подготовлен фондовые химические растворы. Развести 1:1000 с помощью пипетки 1 мл E3B + ПТУ в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавляя 1 мкл складе химического раствора. Vortex энергично. Развести ДМСО 1:1000 в E3B + ПТУ в качестве контроля транспортного средства. С помощью 1 мл E3b + PTU в 1,5 мл микроцентрифужных трубки в качестве необработанного контроля.
- Использование большого отверстие пластик передачи пипетки, эмбрионы передачи из чашек Петри в каждую лунку 96-луночного планшета, 3 эмбрионов на лунку, 3 скважины в состоянии. Для предотвращения испарения в течение длительного лечения, опустить эмбрионов из внешних строк и столбцов пластины (строки А и Е, колонн 1 и 12). Внешние скважины могут быть заполнены 300 мкл E3B + ПТУ. Этикетка крышку пластины соответствующим образом.
- Удалить вложение из каждой лунки с тонкой наконечником пластиковые пипетки. Работают быстро, чтобы избежать высыхания эмбрионов.
- Добавить 200 мкл раствора для обработки в соответствующую лунку. Поместите крышку недеформированнойrneath пластину в качестве руководства для обеспечения добавление лечения в соответствующие лунки. Vortex каждая трубка до пипетки, чтобы распределить химического вещества в растворе. Визуально подтверждают друг эмбрион в обрабатывающем растворе. Если эмбрионы на стороне колодца, используйте чистую передачи пипетки, чтобы вымыть их в колодец с решением лечения.
- Место пластины в инкубатор на 28,5 ° С. Эмбрионы будут проанализированы для флуоресценции при 72 часов после оплодотворения.
3. Автоматизированная изображений эмбрионов в 96-луночных
- Обезболить эмбрионов путем добавления 10 мкл 4 мг / мл Tricaine в каждую лунку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обезболить эмбрионов до визуализации. В 24-96 часов после оплодотворения, данио демонстрируют самопроизвольное движение и ответ испуга к меняющейся источника света во время захвата изображения. Обезболивающий эмбрионов уменьшает движение во время съемки. - Место пластины 96-а в моторизованной стадии и калибровки на сцену. Использование Zeiss Zen синий 2011 программного обеспечения для микроскопии автоматизацна и контроль, выберите опцию образец носителя и выберите многоямного 96. Выберите калибровку. Следуйте пошаговой направления для калибровки на сцену.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимите кнопку плитки после этого шага. Если кнопка плитка не установлен, настройки калибровки могут быть потеряны и 96-луночный планшет необходимо будет калибровать. - Использование 10x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции соответственно для BF и GFP каналов, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру. Сосредоточьтесь на одном эмбриона и запрограммировать микроскоп, чтобы приобрести 3 всего Z-секций, одно изображение 50 мкм выше и один 50 мкм ниже текущей фокальной плоскости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку различные ткани занимают разные фокальных плоскостей, это гарантирует, что для каждого данио изображения будут захвачены с сердца и печени в центре внимания. - Установите параметры программных приобрести выложены изображения с помощью GFP и BF каналлевая сторона На вкладке приобретения, выберите дополнительные настройки. Выбор регионов плитка, то плитка. Выберите опцию круг хорошо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Черепица используется для создания изображения каждой лунки. Одно поле-обзора захватывает только небольшую часть каждую лунку. Функция плитка может автоматически захватить несколько соседних полей-обзора из каждой лунки, создавая составное изображение всего скважины. Таким образом, можно автоматически захвата 96 составных изображений на тарелку, где каждый составное изображение содержит несколько десятков отдельных изображений из одной скважины. - Выберите носитель и коэффициент заполнения 90%. Выбор коэффициент заполнения 90% будет захватить несколько изображений выбранных скважин таких, что 90% площади каждой лунки будут видны в комбинированном изображении.
ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе коэффициента заполнения, диаграмма будет отображаться представляющий область для включения в образ. Выберите процент, который будет включать в себя зону скважины, который подходит для эксперимента. - В разделе Параметры выберите величину перекрытия лучшего.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сшивая плитки для одного представительного изображения, перекрытие 5-10% обеспечивает плавный шов между изображениями. Однако, если изображение шить не является необходимым, используя 0% перекрытие сократит время обработки изображений. Использование 90% коэффициент заполнения и 5% перекрытие, составное изображение из одной скважины состоит из 59 отдельных изображений. - Начните изображений. Микроскоп автоматически получать изображения.
- Вручную проверять составные изображения каждой лунки для тканеспецифической флуоресценции (рис. 1).
- ПРИМЕЧАНИЕ: Это лучше всего начать с положительного контроля, чтобы убедиться, что химическое воздействие работал до наблюдения экспериментальных скважин лечения.
4. Руководство Image Capture эмбрионов в 96-луночный планшет
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения результатов следует использовать 20x длиннее расстояние цели в переменныйдесть более детальные изображения вручную (рис. 2).
- Использование 20x объективом и светлого (BF) установки, определить положительное управления эмбриона и установить настройки экспозиции для BF и GFP каналов соответственно, убедившись, что сигнал флуоресценции не насыщая камеру.
- Определить индивидуальные эмбрионов и снимать вручную.
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как параметры экспозиции были отобраны, положительного контроля эмбриона, не изменить настройки. Это позволяет сравнение интенсивности флуоресценции как каждом снимке на единообразных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана составных изображений из отдельных скважин 96-луночный планшет с. Каждый составное изображение состоит из 59 отдельных изображений с 5%-ым перекрытием изображения. Обратите внимание, что в прямом эфире данио ориентированы случайным образом в каждой лунке, но мы в состоянии отличить флуоресценцию в сердце из печени. Светлопольные изображения могут использоваться в качестве ссылок для оценки данио ориентацию и визуализировать морфологические аномалии (рис. 1А и 1С). Автоматизированная визуализации с использованием 10-кратным цели используют для скрининга химических веществ и определить, какие гарантирует ручной оценку с большим увеличением. Рисунок 2 показывает изображения, снятые с 20x длиннее расстояние объектива для более детального анализа. Эти снимки были сделаны сразу после автоматизированной проверки, изображенной на рисунке 1, не снимая пластинку из столике микроскопа. Использование 20x цели, флуоресценция в сердце может быть точно локализованы в сердца валVES (рис. 2C-2F). Иногда, ориентация эмбрионов может быть неоптимальной для захвата изображений и может привести к неоднозначным результатам. Размещение 3 данио на лунку и выполнения каждого обращения в трех экземплярах (протокол шаг 2.3) предоставляет многочисленные возможности для визуализации флуоресценции точно.
. Рисунок 1 Автоматизированная композитный изображений показывает тканеспецифической флуоресценцию в сердечных клапанов и печени Светлое (А, С) и люминесцентных (B, DH) изображения Tg (5xERE: GFP). Эмбрионы c262/c262 обработанные с указанными химическими веществами на 2 дня сообщение оплодотворение (DPF) и отображаемого на 3 денье. Каждая панель показывает составного изображения одной скважины (в составе 59 отдельных изображений с 5%перекрытие) из 96-луночный планшет. А и Б, Эмбрионы инкубировали в 0,1% ДМСО (контроль) транспортного средства являются GFP-отрицательный. CH, Эмбрионы инкубировали с 100 нг / мл 17β-эстрадиола (Е2), 1,85 мкМ генистеина (GEN) , или 10 мкМ BPA экспонат флуоресценции в сердечных клапанов (стрелки) и печени (наконечники стрел), эмбрионы, обработанные 18,5 нМ поколения или 1 мкМ BPA выставочная флуоресценции в сердечных клапанов, но не печени. В ', цифровой увеличенное изображение одной личинки из штучной упаковке региона в панели Б. D', цифровой увеличенного изображения от коробочной области панели D, и так далее. Шкала бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает прямой метод, автоматически изображений тканеспецифичным флуоресценции у эмбрионов данио рерио. Протокол был разработан с использованием Zeiss Axio Observer. Z1 с дзен Синий 2011 программного обеспечения, однако методика может быть адаптирована с помощью любого инвертированного микроскопа с моторизованным стадии и программного обеспечения управления микроскопом, который может выполнять плитки для создания составных изображений. Оснащение инвертированного микроскопа с моторизованным этапе может обеспечить практическое, менее дорогой альтернативой покупке специального оборудования для высокопроизводительного скрининга содержимому. Моторные этапы варьируются от нескольких тысяч до десятков тысяч долларов США, в зависимости от марки и модели микроскопа и качества сцене.
Есть несколько важных шагов в протоколе. Некоторые химические вещества являются светочувствительными, таким образом, это может быть выгодно для инкубации эмбрионов в темноте во время лечения. Эмбрионы рыбок данио чувствительны к высыханию. Таким образом, для химикокал воздействия продолжительностью более одного дня очень важно, чтобы заполнить скважин вдоль краев 96-луночный планшет со средствами массовой информации, чтобы ограничить испарение (протокол шаг 2.3).
Важно также, чтобы гарантировать, что этап тщательно откалиброваны (шаг протокола 3.2). Одна из распространенных ошибок является размещение пластину на сцену без обеспечения пластину полностью. В этом случае положение пластины в на сцене может измениться, когда сцена движется, что может привести некоторые скважины для включения в образ частично или вовсе нет. При визуализации несколько тарелок подряд, это не является абсолютно необходимым, чтобы откалибровать почву для каждой пластины, при условии, что пластины от того же производителя, и все они размещены в сцене в одинаковых направлениях.
При установке автоматизированных параметры облицовочных изображений (протокол шаг 3.5), убедитесь, что большинство каждую лунку будет образ. В 3 денье и старше, данио личинки, как правило, позиционируют себя вблизи краев колодцал, поэтому 90% коэффициент заполнения рекомендуется для того, чтобы края каждой лунки будет визуализирована. Однако, тем больше коэффициент больше заполнить время для получения изображения.
Это можно выполнить алгоритм швы на составных изображений, чтобы улучшить качество изображения. Если алгоритм шить должна быть выполнена, а затем установите параметры плитки для включать 5-10% перекрытие изображения (протокол шаг 3.6). Чем выше перекрытия, тем выше производительность алгоритма сшивания. В некоторых случаях, 10% перекрытие может позволить шить для получения информативного изображения для анализа, который не требует дальнейшего визуализацию с использованием лупы с большим увеличением цели. Тем не менее, больше перекрытие больше захвата изображений состоится, как фотографов будут захвачены на лунку. Перекрытие 0% могут быть использованы для уменьшения времени получения изображений и свести к минимуму воздействие флуоресцентного света и фотообесцвечивания. В этом случае, захват более детальное изображение некоторых скважин с использованием 20x ObjectIве (рис. 2).
Изображение время захвата для этого протокола будет зависеть от параметров эксперимента. Получение изображений с использованием параметров в этом протоколе (90% коэффициент заполнения, 5% перекрытие, три Z-срезов на захваченном изображении и время экспозиции 50 мс для GFP канала и 1 мс для светлого канал) занимает три минуты и пятьдесят секунд на лунку. Таким образом, можно экранировать 60 скважин в трех часов и пятьдесят минут. Вполне возможно, экран 180 скважин в сутки, или 60 уникальных соединений в трех экземплярах.
Этот протокол позволяет автоматизированной визуализации для конкретного флуоресценции ткани, но имеет ряд ограничений. Флуоресцентных изображений Широкоугольный хватает разрешение конфокальной микроскопии используется во многих методов скрининга высокого содержания. Кроме того, количественное флуоресценции затруднено из-за высокой изменчивости в ориентации каждого данио в скважине. Это можно было бы избежать с помощью получения изображения данио под униформеусловия ориентации, например, с помощью пресс-форм или микропланшеты с колодцами, которые вынуждают данио эмбрионов в единых ориентаций 5,10. Время получения изображения ограничивает количество скважин, которые могут быть экранированных в день до 180. Скрининг 180 скважин в день является значительным улучшением по сравнению с ручной изображений. Однако типичные методы высокой пропускной может экранировать в среднем 10 000 скважин в день, но требуют сложных и дорогостоящих рабочих станций.
Этот протокол представляет собой практический, менее дорогой альтернативой скрининга высокого содержания, которые могут быть легко адаптированы лабораторий с перевернутой флуоресцентного Widefield микроскопом. Метод визуализации, описанный здесь позволяет для анализа тканеспецифической флуоресценции у эмбрионов, которые не были тщательно смонтированного или ориентированной, что резко повышает скорость и простоту подготовки образца. Композитные изображения можно архивировать для справки. Этот протокол был разработан, чтобы позволить высокопроизводительного скрининга Oе лиганды рецептора эстрогена тканеспецифические из химических библиотек и образцов окружающей воды. Кроме того, этот протокол визуализации могут быть использованы для скрининга любой флуоресцентного репортера для ткане-специфической активности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Мы благодарим Сьюзен Фармер и коллектив ЗАО данио научно-исследовательский центр для рыбок данио помощи. Финансовые средства, предоставленные пуско-наладочные средств с кафедрой фармакологии и токсикологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
- Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
- Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
- Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
- Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).
