Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen

Published: May 17, 2014 doi: 10.3791/51533

Summary

Hier beschrieben ist ein Protokoll zur halbautomatischen Bilderzeugungsgewebespezifischer Fluoreszenz in Zebrafischembryos.

Abstract

Zebrafisch-Embryonen sind ein mächtiges Werkzeug für große Screening kleiner Moleküle. Transgene Zebrafisch, die fluoreszierende Reporter-Proteine ​​exprimieren, werden häufig verwendet, um Chemikalien, die die Genexpression modulieren. Chemische Bildschirme, die Fluoreszenz-in-Live Zebrabärblingtest verlassen sich oft auf teure Spezialausrüstung für High Content Screening. Wir beschreiben ein Verfahren, mit einem Standard-Epifluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Bühne, um automatisch Bildzebrafischembryonen und erkennen Gewebe-spezifische Fluoreszenz. Mit transgenen Zebrafisch, die Östrogen-Rezeptor-Aktivität berichten über die Expression von GFP, entwickelten wir eine semi-automatische Verfahren für Östrogen-Rezeptor-Liganden, die die Reporter in einem Gewebe-spezifisch aktivieren screenen. In diesem Video beschreiben wir Verfahren zum Ordnen von Zebrafisch-Embryonen von 24-48 Stunden nach der Befruchtung (hpf) in einer 96-Well-Platte und das Hinzufügen von kleinen Molekülen, die Östrogen-Rezeptoren binden. Bei 72-96 hpf, Bilder von jedem gut ausdie gesamte Platte, werden automatisch gesammelt und manuell für Gewebe-spezifischen Fluoreszenz untersucht. Dieses Protokoll zeigt die Fähigkeit, Östrogen-Rezeptoren, die in Herzklappen zu aktivieren, aber nicht in der Leber zu erkennen.

Introduction

Transgene Zebrafisch entwickelt worden, die zur direkten Visualisierung der Aktivität in Signalwege, wie beispielsweise Fibroblasten-Wachstumsfaktoren 1, 2 Retinsäure und Östrogene 3, lebenden Embryos zu ermöglichen. Solche Werkzeuge ermöglichen Screening für Chemikalien, die Signalwege zu stören (wie Änderung der Fluoreszenzintensität analysiert wurde) oder Chemikalien, die Signalgebung modulieren in einer gewebespezifischen Art und Weise (Änderung der Fluoreszenzlokalisierungs) 4. Automatisierte Bildaufnahme erhöht den Durchsatz der chemischen Bildschirme dramatisch 5,6. Bildschirme, die automatisch im Live-Test Fluoreszenz Zebrafisch verlassen sich oft auf teure Spezialgeräte. High-Content-Screening sogenannte bietet den Vorteil hoher Auflösung, quantitative Bildgebung, aber auf Kosten der Verwendung von spezialisierten Plattenleser für die konfokale Mikroskopie 7,8 ausgestattet. Das Ziel dieser Methode ist es, automatisch Assay gewebespezifische Fluoreszenz in Zebrafischembryonenin einer 96-Well-Platte unter Verwendung eines Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop. Gewebespezifische Fluoreszenz kann mit dieser Technik unterschieden werden und kann ein vernünftiger Ansatz für die Laboratorien, die den Zugang zu spezialisierten Plattenleser oder High-Content-Screening-Geräte fehlt sein.

In diesem Protokoll verwenden wir automatisierte Bildgebung von Gewebe-spezifischen Östrogen-Rezeptor (ER)-Agonisten in lebenden Zebrafisch nach 3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) zu erfassen. Die transgene Linie Tg (5xERE: GFP) c262/c262 enthält 5 Tandem Östrogen-Response-Element-DNA-Sequenzen (ERE) stromaufwärts des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 3. In der Abwesenheit von Liganden, ERs sind normalerweise inaktiv. Ligandenbindung löst eine Konformationsänderung, wodurch Rezeptoren binden ERE DNA und regulieren die Transkription 9. 5xERE: GFP Fische verwendet werden, um Substanzbibliotheken für ER-Modulatoren zu screenen und kann verwendet werden, um Umweltwasserproben für östrogene Verunreinigungen zu screenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

HINWEIS: Dieses Protokoll wurde von der Universität von Alabama in Birmingham Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Zebrafisch-Zucht-und Ei-Sammlungen

  1. Drei Tage vor Beginn der Einwirkung von Chemikalien, montieren Zuchtbecken mit Unterteilungen, getrennte Männer und Frauen. Füllen Sie jeden Tank zur Hälfte mit Wasser Aquakulturanlage. Mit einem Netz, übertragen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 Fisch Zuchtbecken, indem zwei Männer und 3 Frauen in jedem Tank durch einen Teiler getrennt. Legen Sie einen Deckel auf jedem Behälter und Etikett mit Datum und Stämme gekreuzt werden.
  2. Am folgenden Morgen, entfernen Sie alle Hindernisse und Neigungs verblüfft einen flachen Bereich an einem Ende der Zuchtbecken zu schaffen. Lassen Zebrafisch zu paaren, sammeln Embryonen im 10-Minuten-Intervallen, präzise Inszenierung Entwicklungs gewährleisten. Saubere Eier durch Spülen durch ein Teesieb mit E3B Medium und sanft bündig Embryonen in Petrischalen. Zurück erwachsenen Fischen zu dauerhaftenTanks.
  3. Mit einem Binokular, sortieren, zählen, und entfernen Sie alle unbefruchtet, abnormale oder beschädigte Embryonen. Platz Embryonen in Petrischalen in E3B Medium und Haus bei 28,5 ° C mit einer 14.10 Licht: Dunkel-Zyklus. Embryo Dichte Entwicklung beeinflussen. Legen nicht mehr als 100 Embryonen in einer 100 x 35 mm-Schale und nicht mehr als 50 Embryonen in einem 60 x 15 mm-Schale.
  4. Nach 24 hpf, ersetzen Sie Medien mit E3B, die 200 uM 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU). PTU verhindert Pigmentbildung und hält Zebrafisch-Embryonen und Larven für eine verbesserte Bildqualität transparent. ACHTUNG: konzentriert PTU Lager ist gefährlich; Handschuhe tragen, wenn Sie E3B + PTU Lösung.
  5. Am 1. Tag nach der Befruchtung (DPF), manuell das Chorion von jedem Embryo mit feinen Pinzette entfernen. Das Chorion nicht erscheint, um das Eindringen der Östrogene beeinflussen, jedoch die Entfernung verbessert die Bildklarheit. Es gibt keine Notwendigkeit, Chorion aus den Medien zu entfernen. HINWEIS: Als Alternative zur manuellen dechorionation, Chargen von Embryonen che werdenmisch dechorionated mit 1 mg / ml Pronase-Behandlung, wie zuvor beschrieben 11.

2. Chemische Behandlung von Embryonen

  1. Der Tag vor der Behandlung, die Stammlösungen jeder Chemikalie bei 1000-facher Konzentration in DMSO (oder geeigneten Lösungsmittel). Zum Beispiel, um Embryonen zu 10 uM Bisphenol A (BPA) ausgesetzt werden, bereiten eine 10 mM Stammlösung BPA in 100% DMSO. Dies sichert eine gleichmäßige DMSO-Konzentration in jeder Behandlung und ermöglicht eine ungiftige 1:1000 Verdünnung von DMSO als Vehikelkontrolle dienen. Shop-Stammlösungen bei -20 ° C Für dieses Protokoll, wird Embryonen bis 1 um und 10 um BPA, 18,5 nM und 1,85 &mgr; M Genistein, 367 nM Östradiol (positive Kontrolle) und Vehikel (0,1% DMSO, negative Kontrolle) ausgesetzt.
    VORSICHT: Chemikalien wie BPA und Östradiol sind gefährlich und können nachteilige Wirkungen auf den menschlichen Fötus. Griff endokrine Disruptoren mit Sorgfalt und verwenden Sie immer die richtige persönliche Schutzausrüstung.
  2. Am Tag der Behandlung, Tauwetter vorbereitet Lager chemische Lösungen. 1:1000 verdünnt durch Pipettieren von 1 ml E3B + PTU in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zugabe von 1 ul Lager chemische Lösung. Vortex kräftig. DMSO verdünnt 1:1000 in E3B + PTU als Fahrzeugkontrolle. Verwenden Sie 1 mL E3B + PTU in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen als unbehandelte Kontrolle.
  3. Mit einer großen Bohrung Kunststoff Transferpipette, Transfer-Embryonen aus Petrischalen in jedes Well einer 96-Well-Platte, 3 Embryonen pro Well, 3 Wells pro Zustand. Verdunstung während längerer Behandlung zu verhindern, lassen Embryonen von äußeren Reihen und Spalten der Platte (Zeilen A und E, Spalten 1 und 12). Außenbrunnen mit 300 pl E3B + PTU gefüllt werden. Beschriften Sie die Platte Deckel entsprechend.
  4. Entfernen Sie das Medium aus jedem Well mit einem spitzen, dünnen Kunststofftransferpipette. Arbeiten Sie schnell, um ein Austrocknen zu vermeiden, die Embryonen.
  5. Geben Sie 200 ul der Behandlungslösung in entsprechende gut. Setzen Sie den Deckel underneath die Platte als Leitfaden für die Zugabe von Behandlungen in die richtigen Brunnen zu gewährleisten. Vortex jedes Rohr vor dem Pipettieren, um die Chemikalie in Lösung zu verteilen. Optisch bestätigen jeder Embryo ist in der Behandlungslösung. Wenn Embryonen sind auf der Seite der gut mit einem sauberen Transferpipette, um sie in den Brunnen mit der Behandlungslösung zu waschen.
  6. Die Platte wird in den Brutschrank bei 28,5 ° C. Die Embryonen werden für die Fluoreszenz bei 72 hpf analysiert werden.

3. Mated Imaging von Embryonen in 96-Well-Platten

  1. Betäuben Embryonen durch Zugabe von 10 ul von 4 mg / ml in jede Vertiefung Tricaine.
    HINWEIS: Anesthetize Embryonen vor der Bilderzeugung. Bei 24-96 hpf, Zebrafisch zeigen spontane Bewegung und eine Schreckreaktion auf die veränderte Lichtquelle während der Bildaufnahme. Anästhesie Embryonen reduziert Bewegung während der Bildgebung.
  2. Legen Sie die 96-Well-Platte in der Motortisch und kalibrieren die Bühne. Mit Zeiss Zen Blau-2011-Software automatisch für die Mikroskopieauf und Kontrolle, wählen Sie den Probenträger Option und Multiwell-96. Wählen Sie Kalibrieren. Folgen Sie den schrittweisen Anweisungen auf die Bühne zu kalibrieren.
    HINWEIS: Nach diesem Schritt deaktivieren Sie das Fliesen-Taste. Wenn die Fliesen-Taste deaktiviert ist, können Kalibrierungseinstellungen verloren gehen und die 96-Well-Platte muss neu kalibriert werden.
  3. Mit einem 10-fach Objektiv und die Hell (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen entsprechend für BF-und GFP-Kanäle, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera. Konzentrieren Sie sich auf einen einzigen Embryo und programmieren das Mikroskop bis 3 Gesamt Z-Profile, ein Bild um 50 oben und 50 um unter der aktuellen Brennebene zu erwerben.
    HINWEIS: Da die verschiedenen Gewebe besetzen unterschiedliche Brennebenen, wird dadurch sichergestellt, dass für jeden Zebrafisch-Bilder sind mit Herz und Leber im Fokus gefangen genommen.
  4. Stellen Sie die Software-Parameter, um ein Bild mit Fliesen GFP und BF channe erwerbenls. Unter der Registerkarte Erwerb, wählen Sie Advanced Setup. Wählen Fliesen Regionen, dann Fliesen. Wählen Sie die Option Kreis auch.
    HINWEIS: Fliesen verwendet wird, um ein zusammengesetztes Bild von jeder Vertiefung zu schaffen. Ein einzelnes Feld-of-view erfasst nur einen kleinen Teil der Vertiefungen. Die Fliesen-Funktion kann automatisch zu erfassen mehrere benachbarte Felder-of-view aus jeder Vertiefung, wodurch ein zusammengesetztes Bild des gesamten gut. Es ist daher möglich, automatisch zu erfassen 96 zusammengesetzte Bilder pro Platte, wobei jede zusammengesetzte Bild enthält mehrere Dutzend Einzelbilder aus einem einzigen gut.
  5. Wählen Träger und Füllfaktor 90%. Auswählen einen Füllfaktor von 90% werden zu erfassen mehrere Bilder der ausgewählten Vertiefungen, so dass 90% der Fläche von jeder Vertiefung in dem zusammengesetzten Bild sichtbar sein.
    HINWEIS: Bei der Auswahl der Füllfaktor wird ein Diagramm angezeigt werden, die den abzubildenden Bereich. Wählen Sie einen Prozentsatz, der den Bereich der gut umfassen wirddas ist für den Versuch geeignet.
  6. Unter Optionen, wählen Sie die gewünschte Menge an Überschneidungen.
    HINWEIS: Beim Zusammennähen Fliesen für ein einzelnes repräsentatives Bild, eine Überdeckung von 5-10% ermöglicht eine glatte Naht zwischen den Bildern. Allerdings, wenn Stitching ist unnötig, mit einer Überlappung 0% wird Belichtungszeit zu reduzieren. Unter Verwendung von 90% Füllfaktor und 5% überlappen, ein zusammengesetztes Bild von einem einzigen Bohrloch besteht aus 59 Einzelbildern.
  7. Starten Bildgebung. Das Mikroskop wird automatisch Bilder zu erwerben.
  8. Manuell inspizieren zusammengesetzte Bilder von jeder Vertiefung zur gewebespezifischen Fluoreszenz (Abb. 1).
  9. HINWEIS: Es ist am besten, mit der positiven Kontrolle beginnen, um zu bestätigen, dass die chemische Exposition vor Beobachtung experimentelle Behandlung Brunnen gearbeitet.

4. Manuelle Bildaufnahme von Embryonen in 96-Well-Platte

HINWEIS: Um die Ergebnisse zu bestätigen, verwenden Sie ein 20x Arbeitsabstand Ziel, acerfordern detaillierte Bilder manuell (Bild 2).

  1. Mit einem 20x-Objektiv und das Hellfeld (BF) Einstellung, identifizieren eine positive Kontrolle Embryo und die Belichtung Einstellungen für BF und GFP Kanäle richtig, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal nicht Sättigung der Kamera.
  2. Identifizieren einzelner Embryonen und die Aufnahmen manuell.
    HINWEIS: Wenn die Belichtungseinstellungen für die positive Kontrolle Embryo ausgewählt wurde, werden die Einstellungen nicht verändern. Dies ermöglicht einen Vergleich der Fluoreszenzintensität jedes Bild unter einheitlichen Bedingungen erfasst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fig. 1 zusammengesetzte Bilder aus einzelnen Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Jedes zusammengesetzte Bild wird von 59 Einzelbildern mit 5% Bildüberlappung besteht. Beachten Sie, dass die Live-Zebrafisch sind zufällig in jedem gut orientiert, aber wir sind in der Lage, um die Fluoreszenz im Herzen von der Leber zu unterscheiden. Hell Bilder sind als Verweise auf Zebrafisch-Orientierung zu beurteilen und zu visualisieren, morphologische Veränderungen (1A und 1C). Automated Imaging mit einem 10x-Objektiv verwendet, um Chemikalien zu screenen und zu bestimmen, welche die manuelle Auswertung mit einer höheren Vergrößerung zu rechtfertigen. Abbildung 2 zeigt Bilder mit einer 20x Arbeitsabstand Ziel für genauere Analyse erfasst. Diese Bilder wurden direkt nach der automatischen Abtastung in Figur 1 dargestellt, ohne die Platte aus dem Mikroskoptisch entnommen. Mit einem 20x-Objektiv kann die Fluoreszenz im Herzen genau auf Herz val lokalisiert werdenves (2C-2F). Gelegentlich kann die Orientierung der Embryonen suboptimalen zum Erfassen von Bildern und kann zu mehrdeutigen Ergebnissen führen. Platzieren 3 Zebrafisch pro Vertiefung und Durchführung jeder Behandlung in dreifacher Ausfertigung (Protokollschritt 2.3) bietet mehrere Möglichkeiten, um die Fluoreszenz genau visualisieren.

Figur 1
. Abbildung 1 Automatisierte Composite-Bildgebung zeigt, Gewebe-spezifische Fluoreszenz in Herzklappen-und Leberhell (A, C) und Leuchtstofflampen (B, DH) Bilder von Tg (5xERE: GFP). C262/c262 Embryonen mit der angegebenen Chemikalien bei 2 Tage behandelt Post Fertilisation (dpf) und 3 dpf abgebildet. Jede Tafel zeigt eine zusammengesetzte Bild von einem einzigen gut (von 59 Einzelbildern mit 5% zusammengesetztÜberlappung) von einer 96-Well-Platte. A und B, Embryonen in 0,1% DMSO (MFK) inkubiert sind GFP-negative. CH, Embryonen inkubiert mit 100 ng / ml 17β-Östradiol (E2), 1,85 &mgr; M Genistein (GEN) oder 10 &mgr; M BPA Fluoreszenz zeigen in der Herzklappen (Pfeile) und der Leber (Pfeilspitzen), Embryonen mit 18,5 nM oder 1 &mgr; M Gen BPA Fluoreszenz zeigen in Herzklappen, aber nicht in der Leber behandelt. B ', digital vergrößerte Bild einer einzigen Larve aus der Region boxed in Feld B D', digital vergrößerten Bild von boxed Region Panel D, und so weiter. Maßstabsbalken = 500 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
.. g> Abbildung 2 Detaillierte Visualisierung von GFP-positiven Herzklappen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 Embryonen angegeben Chemikalien in 96-Well-Platte ausgesetzt sind (siehe Abbildung 1) wurden manuell bei höherer Vergrößerung abgebildet, so dass die Visualisierung von GFP in die Segelklappen (Pfeile) und die Aortenklappe (Pfeilspitzen) des Herzens. B, D Fluoreszenz-und Hell Bilder verschmolzen. Alle Bilder sind lateral, anterior der linken dorsalen nach oben. Maßstabsbalken = 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode, um automatisch Bild Gewebe-spezifischen Fluoreszenz in Zebrafischembryonen. Das Protokoll wurde mit einem Zeiss Axio Observer entwickelt. Z1 mit Zen-Blau-2011-Software, aber die Technik kann mit jedem inversen Mikroskop mit einem motorisierten Mikroskop Bühne und Steuerungssoftware, die Fliesen durchführen, um zusammengesetzte Bilder erstellen angepasst werden. Das Ausrüsten eines inversen Mikroskops mit einem motorisierten Stufe kann eine praktische, preiswerte Alternative zum Kauf von Spezialgeräten für High-Content-Screening bieten. Motorisierte Stufen reichen von einigen Tausend bis Zehntausende von US-Dollar, je nach Marke und Modell des Mikroskops und die Qualität der Bühne.

Es gibt mehrere wichtige Schritte im Protokoll. Einige Chemikalien sind lichtempfindlich, so kann es vorteilhaft sein, Embryonen in der Dunkelheit während der Behandlung inkubieren. Zebrafisch-Embryonen sind empfindlich gegen Austrocknung. Daher ist für chemischschen Forderungen, die länger als einen Tag ist es wichtig, die Brunnen entlang der Ränder der 96-Well-Platte mit den Medien zu füllen, um Verdampfung (Protokollschritt 2.3) zu begrenzen.

Es ist auch wichtig, um sicherzustellen, dass die Bühne sorgfältig kalibriert (Protokollschritt 3.2). Ein häufiger Fehler ist es, die Platte auf die Bühne zu platzieren, ohne die Sicherung der Platte vollständig. In diesem Fall kann die Position der Platte auf der Bühne zu ändern, wenn die Bühne bewegt, die dazu führen könnten einige Brunnen, teilweise oder gar nicht abgebildet werden. Beim Abbilden mehrerer Platten nacheinander, ist es nicht unbedingt notwendig, die Stufe für jede Platte kalibrieren, solange die Platten vom selben Hersteller und sind alle in der gleichen Phase in Ausrichtung gebracht.

Bei der Einstellung der automatischen Bild Fliesen Parameter (Protokoll Schritt 3.5), stellen Sie sicher, dass eine Mehrheit von jeweils gut abgebildet werden. Bei 3 dpf und älter, Zebrabärblingembryonen neigen dazu, sich in der Nähe der Ränder des wel positionierenl, also einer 90%-Füllfaktor wird empfohlen, um sicherzustellen, dass die Ränder jeder Vertiefung wird visualisiert werden. Je größer jedoch der Füllfaktor je länger die Zeit für die Bildaufnahme.

Es ist möglich, einen Algorithmus auf Nähte zusammengesetzte Bilder durchführen, um die Auflösung zu verbessern. Wenn ein Heft Algorithmus durchgeführt werden soll, dann Fliesen Parameter eingestellt, um eine 5-10% Bildüberlappung (Protokoll Schritt 3.6) enthalten. Je höher die Überlappung, desto besser die Leistung des Zusammenfüge-Algorithmus. In einigen Fällen kann eine Überdeckung von 10% erlauben Nähte, eine informative Bild für die Analyse, das keine weiteren Visualisierung mit einer höheren Vergrößerung Ziel zu produzieren. Je größer jedoch die Überlappung der Bildaufnahme wird länger dauern, da mehrere Bilder werden pro Vertiefung eingefangen werden. Eine Überlappung von 0% verwendet werden, um Bildaufnahmezeit zu reduzieren und die Fluoreszenzlicht-Exposition und Photobleaching zu minimieren. In diesem Fall erfassen mehr detaillierte Bilder von ausgewählten Brunnen mit einem 20x ObjektivierungVE (Fig. 2).

Bildaufnahmezeit für dieses Protokoll wird von den Experimentparameter abhängen. Bildaufnahme unter Verwendung der Parameter in diesem Protokoll (90% Füllfaktor, 5% überlappen, drei z-Sektionen pro aufgenommenen Bildes und einer Belichtungszeit von 50 ms für das GFP-Kanal und 1 msec für die Hellfeldkanals) hat drei Minuten und 50 Sekunden pro Vertiefung. Daher ist es möglich, Vertiefungen 60 in drei Stunden und 50 Minuten zu screenen. Es ist möglich, 180 Vertiefungen pro Tag oder 60 einzigartige Verbindungen, in dreifacher Ausfertigung zu screenen.

Dieses Protokoll ermöglicht automatisierte Bildgebung für die Gewebe-spezifische Fluoreszenz, hat aber einige Einschränkungen. Weitfeld-Fluoreszenz-Bildgebung fehlt die Auflösung der konfokalen Bildgebung in vielen High-Content-Screening-Verfahren eingesetzt. Zusätzlich ist die Fluoreszenz-Quantifizierung schwierig aufgrund der hohen Variabilität bei der Ausrichtung jedes Zebrafisch in einem Bohrloch. Dies könnte durch Abbildung Zebrafisch unter einheitlicher vermieden werdenOrientierungsbedingungen, beispielsweise durch Verwendung von Formen oder Mikrotiterplatten mit Brunnen, die Zebrafisch-Embryonen in einheitliche Orientierungen 5,10 erzwingen. Die Bildaufnahmezeit begrenzt die Anzahl von Vertiefungen, die pro Tag bis 180 gescreent werden können. Screening 180 Vertiefungen pro Tag ist eine signifikante Verbesserung gegenüber der manuellen Bildgebung. Allerdings können typische Hochdurchsatzmethoden im Durchschnitt 10.000 Wells pro Tag zu testen, sondern erfordern komplexe und teure Workstations.

Dieses Protokoll stellt eine praktische, kostengünstigere Alternative zu High-Content-Screening, die leicht von Labors mit einem umgekehrten Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop angepasst werden kann. Die hier beschriebenen Abbildungsverfahren ermöglicht die Analyse von Gewebe-spezifischen Fluoreszenz in Embryonen, die nicht sorgfältig montiert oder orientiert sind, die die Geschwindigkeit und Leichtigkeit der Probenvorbereitung drastisch verbessert. Composite-Bilder können als Referenz archiviert werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um High-Throughput-Screening o erlaubenf Gewebe-spezifische Östrogen-Rezeptor-Liganden aus chemischen Bibliotheken und Umweltwasserproben. Alternativ könnten diese bildgebenden Protokoll verwendet, um jede fluoreszierende Reporter für gewebespezifische Aktivität zu screenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir danken Susan Farmer und die Mitarbeiter der UAB Zebrafisch-Forschungseinrichtung für Zebrafisch-Pflege. Finanzierung von Start-up-Fonds von der Abteilung für Pharmakologie und Toxikologie zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore Fisher 13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip Fisher 13-711-26
96-well, round, flat bottom plates Fisher 21-377-203
100 x 35 mm plates Fisher 08-757-100D
35 x 60 mm plates Fisher 08-757-100B
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20 tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich A5040-25G see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) 
1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629-10G Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B 
Zeiss Axio Observer Z1 Carl Zeiss Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective Carl Zeiss We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software Carl Zeiss Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue Sigma Aldrich MB-1; 25 grams make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B 60X E3 SOLUTION:
NaCl                    - 17.2 grams
KCl                       - 0.76 grams
CaCl2-2H2O     - 2.9 grams
MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams
Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle.

1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH:
60X E3      150 ml
2% methylene blue     100 μl 
Bring to 9 liters with Milli-Q water
 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
  2. Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
  3. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
  4. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
  5. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
  6. Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
  7. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
  8. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
  9. Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
  10. Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
  11. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).

Tags

Entwicklungsbiologie Zebrafisch- Imaging-Fluoreszenz-Mikroskopie Östrogen Entwicklungsbiologie endokrin wirksame Stoffe
Semi-Automated Imaging von Gewebespezifische Fluoreszenz-in Zebrafischembryonen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romano, S. N., Gorelick, D. A.More

Romano, S. N., Gorelick, D. A. Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (87), e51533, doi:10.3791/51533 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter