Semi-automatisk avbildning av vävnad-specifika fluorescens i Zebrafish embryon

Summary

Beskrivet här är ett protokoll för halvautomatiserad avbildning av vävnadsspecifik fluorescens i zebrafiskembryon.

Abstract

Zebrafiskembryon är ett kraftfullt verktyg för storskalig screening av små molekyler. Transgen zebrafisk som uttrycker fluorescerande reporterproteiner används ofta för att identifiera kemikalier som modulerar genexpression. Kemiska skärmar som analys fluorescens i levande zebrafisk är ofta beroende dyra, specialutrustning för hög halt screening. Vi beskriver ett förfarande med en vanlig epifluorescensmikroskop med en motoriserad scen till automatiskt bildzebrafisk embryon och upptäcka vävnadsspecifik fluorescens. Med hjälp av transgena zebrafisk som rapporterar östrogenreceptoraktivitet via uttryck av GFP, utvecklade vi en halvautomatisk förfarande för att screena för östrogenreceptorligander som aktiverar reportern i ett vävnadsspecifikt sätt. I denna video beskriver vi förfaranden för grupperande zebrafiskembryon vid 24-48 timmar efter befruktning (HPF) i en 96-brunnsplatta och tillsats av små molekyler som binder östrogenreceptorer. Vid 72-96 HPF, bilder av varje brunn frånhela plattan automatiskt samlas in och manuellt inspekteras för vävnadsspecifik fluorescens. Detta protokoll demonstrerar förmågan att detektera östrogener som aktiverar receptorer i hjärtklaffar, men inte i lever.

Introduction

Transgen zebrafisk har utvecklats som gör det möjligt att direkt visualisering av aktivitet i signalvägar, exempelvis fibroblasttillväxtfaktörer ^1, retinoinsyra ² och östrogener ^3, i levande embryon. Sådana verktyg möjliggör screening för kemikalier som stör signalvägar (analyserade som förändring i fluorescensintensiteten) eller för kemikalier som modulerar signalering i ett vävnadsspecifikt sätt (förändring i fluorescens lokalisering) ^4. Automatisk bildtagning ökar genomströmningen av kemiska skärmar dramatiskt ^5,6. Skärmar som automatiskt analys fluorescens i levande zebrafisk litar ofta på dyra, specialutrustning. Så kallade high-halt screening ger fördelen med hög upplösning, kvantitativ avbildning men till priset av att använda specialiserade plattläsare utrustade för konfokalmikroskopi ^7,8. Målet med denna metod är att automatiskt analysvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryoni en 96-brunnars platta med användning av en standard-epifluorescensmikroskop. Tissue-specifik fluorescens kan urskiljas med hjälp av denna teknik och kan vara en rimlig strategi för laboratorier som saknar tillgång till specialiserade plattläsare eller hög halt screening utrustning.

I detta protokoll använder vi automatiserad bildbehandling för att upptäcka vävnadsspecifik östrogenreceptorn (ER) agonister i levande zebrafisk på 3 dagar efter befruktningen (DPF). Den transgena linje Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 innehåller fem tandemöstrogenresponselement-DNA-sekvenser (ERE) uppströms från grönt fluorescerande protein (GFP) ^3. I frånvaro av ligand, ER är normalt inaktiva. Ligandbindning utlöser en konformationsförändring, vilket gör receptorer att binda ERE DNA och reglerar transkriptionen ^9. 5xERE: GFP fisk kan användas för att screena kemiska bibliotek för ER-modulatorer och kan användas för att screena prover omgivningsvatten för östrogena föroreningar.

Protocol

OBS: Detta protokoll godkändes av University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care och användning kommittén.

1. Zebrafish Avel och ägg samlingar

1. Tre dagar innan kemisk exponering, montera avelstankar med avdelare till separata män och kvinnor. Fyll varje tank halvvägs med vattenbruk systemet vatten. Med hjälp av ett nät, överföra Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 fisk till avelstankar, placera 2 hanar och 3 honor i varje tank åtskilda av en avdelare. Sätt ett lock på varje tank och etikett med datum och stammar som ska korsas.
2. Följande morgon, ta bort alla hinder och tiltmellanväggar för att skapa ett grunt område i ena änden av avelstanken. Låt zebrafisk att para sig, samla embryon vid 10 minuters intervall för att säkerställa exakt utvecklings iscensättning. Rena ägg genom att skölja genom en tesil med hjälp E3B medium och försiktigt spola embryon i petriskålar. Återgå vuxen fisk till permanenttankar.
3. Med hjälp av en dissekera mikroskop, sortera, räkna och ta bort eventuella obefruktade, onormala eller skadade embryon. Placera embryon i petriskålar i E3B medium och hus vid 28,5 ° C med en 14:10 ljus: mörker-cykel. Embryo tätheten kan påverka utvecklingen. Placera inte mer än 100 embryon i en 100 x 35 mm skålen och inte mer än 50 embryon i en 60 x 15 mm skålen.
4. Av 24 HPF, byt media med E3B innehållande 200 ^ M 1-fenyl-2-tiourea (PTU). PTU bygger pigmentbildning och håller zebrafisk embryon och larver transparent för förbättrad bildskärpa. VARNING: koncentrerad PTU lager är farligt; använda handskar när du gör E3B + PTU lösning.
5. Vid 1 dag efter befruktning (DPF), manuellt ta bort chorion från varje embryo med fin pincett. Chorion tycks inte påverka penetration av östrogener, men borttagning förbättrar bildskärpa. Det finns inget behov av att avlägsna chorions från media. NOTERA: Som ett alternativ till manuell dechorionation, partier av embryon kan chenomiskt dechorionated användning av 1 mg / ml pronas behandling, såsom tidigare beskrivits ^11.

2. Kemisk Behandling av embryon

1. Dagen före behandlingen, bereda stamlösningar av varje kemikalie vid 1000-faldig koncentration i DMSO (eller lämpligt lösningsmedel). Till exempel, för att exponera embryon till 10 | iM av bisfenol A (BPA), framställning av en 10 mM BPA stamlösning i 100% DMSO. Detta säkerställer jämn DMSO-koncentrationen i varje behandling och tillåter en giftfri 1:1000 utspädning av DMSO att fungera som en fordonskontroll. Butiksstamlösningar vid -20 ° C. För detta protokoll kommer embryon utsättas för en pM och 10 pM BPA, 18,5 nM och 1,85 | iM genistein, 367 nM estradiol (positiv kontroll) och vehikel (0,1% DMSO, negativ kontroll).
   VARNING: Kemikalier, som BPA och östradiol är farligt och kan ha skadliga effekter på människofoster. Handtag hormonstörande ämnen med omsorg och använd alltid lämplig personlig skyddsutrustning.
2. På dagen för behandling, framställd tö stock kemiska lösningar. Späd 1:1000 genom att pipettera 1 ml E3B + PTU i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätta 1 l av lager kemisk lösning. Vortex kraftfullt. Späd DMSO 1:1000 in E3B + PTU som fordonsstyrning. Använd 1 ml E3B + PTU i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör såsom en obehandlad kontroll.
3. Med hjälp av en stor borrning plast överföringspipett, överföra embryon från petriskålar i varje brunn på en 96-brunnar, 3 embryon per brunn, 3 brunnar per tillstånd. För att förhindra avdunstning under långvarig behandling, utelämna embryon från yttre rader och kolumner i plattan (raderna A och E, kolumn 1 och 12). Outer brunnar kan fyllas med 300 | il av E3B + PTU. Märk locket plattan på lämpligt sätt.
4. Ta ut mediet från varje brunn med en fin spets plast överföringspipett. Arbeta snabbt för att undvika uttorkning embryona.
5. Addera 200 ul av behandlingslösningen in i motsvarande brunn. Placera locket underneath plattan som en guide för att säkerställa tillsatsen av behandlingarna i de korrekta brunnarna. Vortex varje rör före pipettering distribuera kemikalien i lösningen. Bekräfta visuellt varje embryo är i behandlingslösningen. Om embryon finns på sidan av brunnen, använd en ren överföring pipett för att tvätta dem i brunnen med behandlingslösningen.
6. Placera plattan i inkubatorn vid 28,5 ° C. Embryon kommer att analyseras för fluorescens vid 72 HPF.

3. Automatiserad bildbehandling av embryon i 96-brunnsplattor

1. Bedöva embryon genom tillsättning av 10 pl av 4 mg / ml tricaine till varje brunn.
   OBS: Bedöva embryon före avbildning. Vid 24-96 HPF, zebrafisk uppvisar spontan rörelse och en reaktion på plötsliga ljud till förändrade ljuskällan när du tar bilder. Anesthetizing embryon minskar rörelser under avbildning.
2. Placera 96-brunnar i den motordrivna skede och kalibrera scenen. Använda Zeiss Zen Blå 2011 programvara för mikroskopi automatisktpå och kontroll, väljer provbäraren och aktivera multispot 96. Välj kalibrera. Följ de stegvisa riktningar för att kalibrera skede.
   OBS: inte avmarkera knappen plattor efter detta steg. Om knappen kakel är avmarkerad kan kalibreringsinställningar förloras och den 96-brunnar måste kalibreras.
3. Med hjälp av ett 10x objektiv och ljusfält (BF) inställning, identifiera en positiv kontroll embryo och ange exponeringsinställningarna på lämpligt sätt för BF-och GFP-kanaler, se till att fluorescenssignal inte mättar kameran. Fokusera på en enda embryo och programmera mikroskop för att förvärva 3 totalt Z-profiler, en bild 50 pm ovan och en 50 pm under den aktuella fokalplanet.
   OBS: Eftersom olika vävnader ockupera olika fokalplan, kommer detta att garantera att för varje zebrafisk bilder är tagna med hjärta och lever i fokus.
4. Ställ programparametrarna för att förvärva ett kaklat bild med hjälp av GFP och BF channels. Under fliken förvärvet väljer avancerade inställningar. Välj kakel regioner, då kakel. Välj alternativet cirkeln också.
   OBS: Tegelpannor används för att skapa en sammansatt bild av varje brunn. En enda field-of-view fångar endast en liten del av varje brunn. Den plattsättning-funktionen kan automatiskt fånga flera intilliggande fält-of-view från varje brunn, skapar en sammansatt bild av det hela också. Det är därför möjligt att automatiskt fånga 96 sammansatta bilder per platta, där var och en sammansatt bild innehåller flera dussin enskilda bilder från en enda väl.
5. Välj bärare och fyllnadsgrad 90%. Välja en fyllnadsgrad på 90% kommer att ta flera bilder av de utvalda brunnar sådana att 90% av arean av varje brunn kommer att synas i den sammansatta bilden.
   ANMÄRKNING: När man väljer fyllfaktor, kommer ett diagram som visas representerar den yta som skall avbildas. Välj ett procenttal som kommer att omfatta området av brunnensom är lämpligt för experimentet.
6. Enligt alternativ väljer mängden överlappning önskas.
   OBS: När du syr ihop plattorna för en enda representativ bild, en överlappning på 5-10% möjliggör en smidig söm mellan bilderna. Men om bildsammanfogning är onödigt, med hjälp av en 0% överlappning kommer att reducera avbildningstiden. Med hjälp av 90% fyllnadsgrad och 5% överlappning, en sammansatt bild av en enda väl består av 59 enskilda bilder.
7. Börja avbildning. Mikroskopet kommer automatiskt att få bilder.
8. Inspektera manuellt sammansatta bilder av varje brunn för vävnadsspecifik fluorescens (Figur 1).
9. OBS: Det är bäst att börja med den positiva kontrollen för att bekräfta att den kemiska exponeringen arbetade innan observera experimentella behandlingsbrunnar.

4. Manuell Bildinsamling av embryon i 96-brunnar

OBS: För att bekräfta resultaten, använd en 20x långa arbetsavstånd mål att aclägget mer detaljerade bilder manuellt (Figur 2).

1. Med hjälp av ett 20x objektiv och ljusfält (BF) inställning, identifiera en positiv kontroll embryo och ställ exponeringsinställningar för BF-och GFP-kanaler på lämpligt sätt, och se till att fluorescenssignal inte mättar kameran.
2. Identifiera individuella embryon och ta bilder manuellt.
   OBS: När exponeringsinställningarna har valts ut för den positiva kontrollen embryo, inte ändra inställningarna. Detta möjliggör en jämförelse av fluorescensintensiteten som varje bild tas på enhetliga villkor.

Representative Results

Fig. 1 visar sammansatta bilder från enskilda brunnar i en 96-brunnsplatta. Varje sammansatt bild är sammansatt av 59 enskilda bilder med 5% bild överlappning. Observera att levande zebrafisk är orienterade slumpmässigt inom varje brunn, men vi kan urskilja fluorescens i hjärtat från levern. Brightfield bilder är användbara som referenser för att bedöma zebrafisk orientering och visualisera morfologiska abnormiteter (figurerna 1A och 1C). Automatiserad avbildning med en 10x mål används för att screena kemikalier och bestämma vilka motiverar manuell utvärdering på en högre förstoring. Figur 2 visar bilder som tagits med en 20x långa arbetsavstånd mål för mer detaljerad analys. Dessa bilder togs direkt efter den automatiska skanningen visas i figur 1 utan att ta bort plattan från mikroskop scenen. Med hjälp av en 20x mål, kan fluorescensen i hjärtat exakt lokaliserad till hjärt valves (figurerna 2C-2F). Emellanåt kan orienteringen av embryona vara suboptimala för att fånga bilder och kan leda till tvetydiga resultat. Placering 3 zebrafisk per brunn och genomför varje behandling i tre exemplar (protokollsteg 2.3) ger flera möjligheter att visualisera fluorescens korrekt.

. Figur 1 Automatiserad sammansatt avbildning avslöjar vävnadsspecifik fluorescens i hjärtklaffar och lever Ljusfält (A, C) och fluorescerande (B, DH) bilder av Tg (5xERE: GFP). Embryon ^c262/c262 behandlats med angivna kemikalier vid 2 dagar efter befruktning (DPF) och röntgas 3 dpf. Varje panel visar en sammansatt bild av en enda väl (som består av 59 enskilda bilder med 5%överlappning) från en 96-brunnsplatta. A och B, Embryon inkuberats i 0,1% DMSO (vehikelkontroll) är GFP-negativa. CH, Embryon inkuberades med 100 ng / ml 17β-östradiol (E2), 1,85 pM genistein (gen) , eller 10 ^ M BPA uppvisar fluorescens i hjärtklaffarna (pilar) och lever (pilspetsar), embryon som behandlats med 18,5 nM gen eller 1 ^ M BPA uppvisar fluorescens i hjärtklaffar, men inte lever. B ', digitalt förstorad bild av en enda larv från den inramade området i panel B. D', digitalt förstorade bilden från boxed regionen i panel D, och så vidare. Skala bar = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

.. g.> Figur 2 Detaljerad visualisering av GFP-positiva hjärtklaffar Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 embryon utsätts för angivna kemikalier i 96-brunnar (se figur 1) avbildades manuellt vid högre förstoring, vilket gör visualisering av GFP i atrioventrikulärt ventiler (pilar) och aortaventiler (pilspetsar) i hjärtat. B, D fluorescens och bright bilder samman. Alla bilder är lateral vy, främre till vänster, rygg till toppen. Skala bar = 50 um. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll beskriver en enkel metod för att automatiskt bildvävnadsspecifika fluorescens i zebrafisk embryon. Det protokoll som har utvecklats med hjälp av en Zeiss Axio Observer. Z1 med Zen Blue 2011 programvara, men den teknik som kan anpassas för användning av någon inverterat mikroskop med en motoriserad scen och programvara mikroskop kontroll som kan utföra plattsättning för att skapa sammansatta bilder. Att utrusta ett inverterat mikroskop med en motoriserad skede kan ge en praktisk, billigare alternativ till att köpa specialiserad utrustning för hög halt screening. Motordrivna stadier allt från flera tusen till tiotusentals dollar, beroende på märke och modell av mikroskop och kvalitet på scenen.

Det finns flera viktiga steg i protokollet. Vissa kemikalier är ljuskänsliga och därmed kan det vara fördelaktigt att inkubera embryona i mörkret under behandlingen. Zebrafisk embryon är känsliga för uttorkning. Därför, för kemiskcal exponeringar som varar mer än en dag är det viktigt att fylla brunnarna längs kanterna på den 96-brunnar med media för att begränsa avdunstning (protokollsteg 2.3).

Det är också viktigt att säkerställa att det stadium är noggrant kalibrerad (protokoll steg 3,2). Ett vanligt misstag är att placera plattan på scenen utan att säkra plattan helt. I detta fall kan plattans position på scenen ändras när scenen rör sig, vilket kan leda till vissa brunnar som ska avbildas delvis eller inte alls. När avbildning flera plattor i rad, är det inte absolut nödvändigt att kalibrera om scenen för varje platta, så länge plattorna är från samma tillverkare och är alla placerade på scenen i identiska riktningar.

Vid inställning av automatiserade bildplattsättning parametrar (protokoll steg 3,5), se till att en majoritet av varje brunn kommer att avbildas. Vid 3 dpf och äldre, zebrafisk larver tenderar att positionera sig nära kanterna på well, alltså en 90% fyllnadsgrad rekommenderas att se till att kanterna på varje brunn ska visualiseras. Ju större fyllfaktorn desto längre tid för bildinhämtning.

Det är möjligt att utföra en söm algoritmen på sammansatta bilder för att förbättra upplösningen. Om en sy algoritm skall utföras, då satt kakel parametrar att inkludera en 5-10% bild överlappning (protokollsteg 3.6). Ju större överlappning, desto bättre prestanda av sömmen algoritm. I vissa fall kan en 10% överlappning låta sy för att producera en informativ bild för analys som inte kräver ytterligare visualisering med hjälp av en högre förstoring mål. Ju större överlappningen på längre bilden förvärvet kommer att ta, eftersom fler bilder kommer att fångas per brunn. En överlappning av 0% kan användas för att minska bildförvärvstiden och minimera fluorescerande ljus exponering och fotoblekning. I så fall ta mer detaljerade bilder av utvalda brunnar med hjälp av en 20x SYFTEve (Figur 2).

Bildfångst tid för detta protokoll kommer att bero på experimentparametrar. Bild förvärv med hjälp av parametrarna i detta protokoll (90% fyllnadsgrad, 5% överlappning, tre z-sektioner per tagna bilden och en exponeringstid på 50 msek för GFP-kanal och en ms för brightkanalen) tar tre minuter och femtio sekunder per brunn. Därför är det möjligt att screena 60 brunnar i tre timmar och femtio minuter. Det är möjligt att screena 180 brunnar per dag, eller 60 unika föreningar i triplikat.

Detta protokoll möjliggör automatiserad bildbehandling för vävnadsspecifik fluorescens men har flera begränsningar. Widefield fluorescens avbildning saknar upplösning konfokala avbildning används i många high-innehåll screening tekniker. Dessutom är det svårt på grund av den stora variationen i orienteringen av varje zebrafisk inuti en brunn fluorescens kvantifiering. Detta skulle kunna undvikas genom avbildning zebrafisk i uniformorienteringsförhållanden, till exempel genom att använda formar eller mikroplattor med brunnar som tvingar zebrafisk embryon till enhetliga riktlinjer ^5,10. Bilden förvärvstiden begränsar antalet brunnar som kan screenas per dag till 180. Screening 180 brunnar per dag är en betydande förbättring jämfört med manuell avbildning. Däremot kan typiska high throughput metoder screena ett genomsnitt på 10.000 brunnar per dag men kräver komplexa och dyra arbetsstationer.

Detta protokoll utgör ett praktiskt, billigare alternativ till high-content screening som lätt kan anpassas av laboratorier med ett inverterat widefield fluorescensmikroskop. Den avbildning metod som beskrivs här gör det möjligt att analysera vävnadsspecifika fluorescens i embryon som inte har omsorgsfullt monterade eller orienterade, vilket drastiskt förbättrar hastigheten och enkel provberedning. Sammansatta bilder kan arkiveras som referens. Detta protokoll har utvecklats för att möjliggöra hög throughput screening of vävnadsspecifika östrogenreceptorligander från kemiska bibliotek och miljö vattenprover. Alternativt kan denna bildprotokoll användas för att screena varje fluorescerande reporter för vävnadsspecifik aktivitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water