Semi-automatiske Imaging af Vævsspecifik Fluorescens i zebrafisk embryoner

Summary

Beskrevet her er en protokol til halvautomatisk billeddannelse af væv-specifik fluorescens i zebrafisk embryoner.

Abstract

Zebrafisk embryoner er et kraftfuldt værktøj til storstilet screening af små molekyler. Transgene zebrafisk, der udtrykker fluorescerende reporter proteiner der ofte bruges til at identificere kemikalier, der modulerer genekspression. Kemiske skærme, assay fluorescens i levende zebrafisk ofte afhængige dyrt, specialudstyr til højt indhold screening. Vi beskriver en procedure ved hjælp af en standard epifluorescensmikroskop med en motoriseret scene til automatisk billed zebrafisk embryoner og opdage vævs-specifik fluorescens. Brug transgene zebrafisk der rapporterer østrogen receptor aktivitet via udtryk af GFP, har vi udviklet en semi-automatiseret procedure for at screene for østrogen-receptor-ligander, der aktiverer reporter i et væv-specifik måde. I denne video beskrives procedurer for gruppering zebrafisk embryoer ved 24-48 timer efter befrugtning (HPF) i en 96-brønds plade og tilsætning af små molekyler, der binder østrogenreceptorer. Ved 72-96 HPF, billeder af hver brønd frahele pladen automatisk opsamles og undersøges manuelt for vævs-specifik fluorescens. Denne protokol demonstrerer evnen til at opdage østrogener, der aktiverer receptorer i hjerteklapper, men ikke i leveren.

Introduction

Transgen zebrafisk er blevet udviklet, som giver mulighed for direkte visualisering af aktivitet i signalveje, såsom fibroblastvækstfaktorer ¹ retinsyre ² og østrogener ^3, i levende embryoer. Sådanne værktøjer muliggør screening for kemikalier, der forstyrrer signalveje (analyseret som ændringer i fluorescensintensitet) eller kemikalier, som modulerer signalering en vævsspecifik måde (ændring i fluorescens lokalisering) ^4.. Automatiseret billedoptagelse øger throughput af kemiske skærme dramatisk ^5,6. Skærme, der automatisk assay fluorescens i levende zebrafisk ofte afhængige af dyre, specialiseret udstyr. Såkaldte højt indhold screening giver fordelen ved høj opløsning, kvantitativ billeddannelse men på bekostning af hjælp af specialiserede pladelæsere udstyret til konfokal mikroskopi ^7,8. Målet med denne metode er at automatisk assay vævsspecifik fluorescens i zebrafisk embryoneri en 96-brønds plade ved anvendelse af en standard epifluorescensmikroskop. Tissue-specifik fluorescens kan skelnes ved hjælp af denne teknik, og kan være en fornuftig tilgang til laboratorier, der mangler adgang til specialiserede pladelæsere eller high-content screening udstyr.

I denne protokol, vi bruger automatiseret billeddannelse til at opdage vævsspecifik østrogen receptor (ER)-agonister i levende zebrafisk ved 3 dage efter befrugtning (DPF). De transgene linje Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 indeholder 5 tandem østrogenresponselementer element DNA-sekvenser (EBS) opstrøms for grønt fluorescerende protein (GFP) ^3. I fravær af ligand, ERS normalt inaktive. Ligandbinding udløser en konformationsændring, så receptorer til at binde ERE DNA og således regulere transkription ^9. 5xERE: GFP fisk kan anvendes til screening af kemiske biblioteker for ER-modulatorer og kan anvendes til at screene miljømæssige vandprøver til østrogene stoffer.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol blev godkendt af University of Alabama i Birmingham Institutional Animal Care og brug Udvalg.

1.. Zebrafisk Forædling og Egg Samlinger

1. Tre dage før du begynder kemiske eksponeringer, samle avl tanke med skillevægge til separate hanner og hunner. Fyld hver tank halvvejs med akvakultursystemet vand. Ved hjælp af et net, overføre Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 fisk til avl tanke, at placere 2 hanner og 3 hunner i hver tank adskilt af en skillevæg. Sæt låg på hver tank og mærke med dato og stammer skal krydses.
2. Den følgende morgen, fjerne alle hindringer og vippe forbløffer at skabe et lavvandet område i den ene ende af akvariet. Tillad zebrafisk til at parre sig, indsamle embryoner ved 10 min intervaller for at sikre præcis udviklingsmæssige iscenesættelse. Rene æg ved at skylle gennem en tesi hjælp E3B medium og skyl forsigtigt embryoner i petriskåle. Retur voksne fisk til permanenttanke.
3. Ved hjælp af et dissektionsmikroskop, sortere, tælle, og fjern eventuelle ubefrugtede, unormal eller beskadigede embryoner. Placer embryoner i petriskåle i E3B medium og hus ved 28,5 ° C med en 14:10 lys: mørke cyklus. Embryo tæthed kan påvirke udvikling. Placer ikke mere end 100 embryoner i en 100 x 35 mm skål og ikke mere end 50 embryoner i en 60 x 15 mm skål.
4. Ved 24 HPF, udskifte medier med E3B indeholdende 200 uM 1-phenyl 2-thiourinstof (PTU). PTU forebygger pigment dannelse og holder zebrafisk embryoner og larver gennemskuelig for forbedret image klarhed. ADVARSEL: koncentreret PTU bestand er farligt; bære handsker, når de foretager E3B + PTU løsning.
5. Ved 1 dag efter befrugtning (DPF), manuelt fjerne chorion fra hvert foster ved hjælp af fine tænger. Chorion synes ikke at påvirke penetration af østrogener, men fjernelse forbedrer billedets klarhed. Der er ingen grund til at fjerne chorions fra medierne. BEMÆRK: Som alternativ til manuel dechorionation, partier af embryoner kan chemisk dechorionated anvendelse af 1 mg / ml pronase behandling, som tidligere beskrevet ^11.

2.. Kemisk behandling af embryoner

1. Dagen før behandlingen, forberede stamopløsninger af hvert kemikalie ved 1.000-fold koncentration i DMSO (eller passende opløsningsmiddel). For eksempel, at udsætte embryoner til 10 uM bisphenol A (BPA) fremstilles en 10 mM BPA stamopløsning i 100% DMSO. Dette sikrer ensartet DMSO-koncentration i hver behandlingsgruppe og tillader en ikke-toksisk 1:1.000 fortynding af DMSO til at tjene som en vehikelkontrol. Store stamopløsninger ved -20 ° C. Til denne protokol, vil fostre udsættes for 1 uM og 10 uM BPA, 18,5 nM og 1,85 uM genistein, 367 nM østradiol (positiv kontrol) og køretøj (0,1% DMSO, negativ kontrol).
   ADVARSEL: Kemikalier såsom BPA og østradiol er farligt og kan have skadelige virkninger på den menneskelige foster. Håndtag hormonforstyrrende stoffer med omhu og altid bruge en ordentlig personlige værnemidler.
2. På dagen for behandlingen, tø forberedt lager kemiske opløsninger. Fortyndes 1:1000 ved pipettering af 1 ml E3B + PTU i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og tilsætning af 1 ml af stock kemisk opløsning. Vortex kraftigt. Fortyndet DMSO 1:1000 i E3B + PTU som et køretøj kontrol. Brug 1 ml E3B + PTU i et 1,5 ml mikrocentrifugerør som en ubehandlet kontrol.
3. Ved hjælp af en stor boring plast overførselspipetten, overføre embryoner fra petriskåle i hver brønd på en 96-brønds plade, 3 embryoner pr godt, 3 brønde pr tilstand. For at forhindre fordampning under langvarig behandling, udelade embryoner fra ydre rækker og kolonner af pladen (rækker A og E, kolonne 1 og 12). Ydre brønde kan fyldes med 300 pi E3B + PTU. Mærk pladelåget korrekt.
4. Fjern medier fra hver brønd med en fin tippet plast overførselspipetten. Arbejde hurtigt for at undgå udtørring embryoner.
5. Tilsæt 200 pi af behandlingsopløsning til tilsvarende godt. Sæt låget underneath pladen som en guide til at sikre tilsætning af behandlinger ind i de brønde. Vortex hvert rør før pipettering at distribuere kemikaliet i opløsning. Visuelt bekræfte hvert foster er i behandlingen løsning. Hvis embryoner er på siden af ​​brønden, skal du bruge en ren overførsel pipette til at vaske dem i godt med behandlingen løsning.
6. Pladen anbringes i inkubatoren ved 28,5 ° C. Embryoner vil blive analyseret for fluorescens ved 72 HPF.

3.. Automated Imaging af embryoner i 96-brønds plader

1. Bedøver embryoner ved tilsætning af 10 pi af 4 mg / ml tricaine til hver brønd.
   BEMÆRK: Bedøver embryoner før billeddannelse. Ved 24-96 HPF, zebrafisk udstille spontan bevægelse og en startle reaktion på den ændrede lyskilde under billedoptagelse. Bedøve embryoner reducerer bevægelse under billedbehandling.
2. Anbring 96-brønds plade i motoriseret trin og kalibrere scenen. Brug Zeiss Zen Blå 2011 software til mikroskopi automatiskpå og kontrol, skal du vælge prøven carrier, og vælg brønde 96. Vælg Kalibrer. Følg den trinvise retninger at kalibrere scenen.
   BEMÆRK: Du må ikke fjerne markeringen knappen fliser efter dette trin. Hvis knappen fliser er markeret, kan indstillingerne for kalibrering tabt, og 96 brønde skal blive justeret.
3. Ved hjælp af en 10x objektiv og lysfelt (BF) om, at identificere en positiv kontrol foster og indstille eksponering indstillinger passende til BF og GFP-kanaler, og sørg for, at fluorescens signalet ikke mætte kameraet. Fokusere på et enkelt foster og programmere mikroskop til at erhverve 3 af total Z-sektioner, et billede 50 mM ovenfor, og en 50 um under det aktuelle fokalplan.
   BEMÆRK: Fordi forskellige væv besætte forskellige fokusplaner, vil det sikre, at der for hver zebrafisk billeder er taget med hjertet og leveren i fokus.
4. Indstille softwaren parametre for at erhverve en flisebelagt billede ved hjælp af GFP og BF Channels. Under fanen erhvervelse, skal du vælge avanceret setup. Vælg fliser regioner, så fliser. Vælg cirklen godt mulighed.
   BEMÆRK: Fliser bruges til at skabe et sammensat billede af hver brønd. En enkelt field-of-view indfanger kun en lille del af hver brønd. Fliselægning funktionen kan automatisk fange flere tilstødende marker-of-view fra hver brønd, at skabe et sammensat billede af hele godt. Det er derfor muligt at automatisk at fange 96 sammensatte billeder per plade, hvor hver sammensat billede indeholder flere dusin individuelle billeder fra en enkelt brønd.
5. Vælg transportør og fyld faktor 90%. Valg af en fyldningsfaktor på 90% vil fange flere billeder af de udvalgte boringer, således at 90% af arealet af hver brønd vil være synlig i det sammensatte billede.
   BEMÆRK: Når der vælges fyldningsfaktor vil et diagram vises repræsenterer det område, der skal afbildes. Vælg en procentdel, der vil omfatte det område af brøndensom er passende for eksperimentet.
6. Under indstillinger, skal du vælge den ønskede mængde overlap.
   BEMÆRK: Når sammenstrikke fliser til en enkelt repræsentant billede, et overlap på 5-10% giver mulighed for en jævn søm mellem billeder. Men hvis billedet syning er unødvendig anvendelse af en 0% overlapning vil reducere afbildningstiden. Brug 90% fyldningsfaktor og 5% overlap, et sammensat billede af en enkelt brønd består af 59 individuelle billeder.
7. Start billeddannelse. Mikroskopet vil automatisk hente billeder.
8. Manuelt inspicere sammensatte billeder af hver beholder for vævs-specifik fluorescens (figur 1).
9. BEMÆRK: Det er bedst at starte med den positive kontrol for at bekræfte, at den kemiske eksponering arbejdede før observere eksperimentel behandling brønde.

4.. Manuel Billedoverførsel af embryoner i 96-brønds plade

BEMÆRK: For at bekræfte resultater ved at bruge en objektiv 20x lang arbejdsafstand til acdarder kræver mere detaljerede billeder manuelt (figur 2).

1. Ved hjælp af en 20x objektiv og lysfelt (BF) om, at identificere en positiv kontrol foster og indstille eksponering indstillinger for BF og GFP-kanaler korrekt, og sørg for at fluorescens signalet ikke mætte kameraet.
2. Identificere individuelle embryoner og tage billeder manuelt.
   Bemærk: Når indstillingerne eksponering er blevet udvalgt til den positive kontrol embryo, ændrer ikke indstillingerne. Dette giver mulighed for en sammenligning af fluorescens intensitet som hvert billede er taget til fange under ensartede betingelser.

Representative Results

Figur 1 viser sammensatte billeder fra individuelle brønde i en 96-brønds plade. Hver sammensatte billede består af 59 individuelle billeder med 5% billede overlap. Bemærk, at de levende zebrafisk er orienteret tilfældigt inden for hver brønd, men vi er i stand til at skelne fluorescens i hjertet fra leveren. Lysfelt billeder er nyttige som henvisninger til at vurdere zebrafisk orientering og visualisere morfologiske abnormiteter (figur 1A og 1C). Automatiseret billedbehandling ved hjælp af en 10x objektiv bruges til at screene kemikalier, og afgøre, hvilke berettiger manuel evaluering på et højere forstørrelse. Figur 2 viser billeder taget med et 20x lang arbejdsafstand mål for mere detaljeret analyse. Disse billeder blev taget umiddelbart efter den automatiske scanning er afbildet i figur 1 uden at fjerne pladen fra mikroskop scenen. Ved hjælp af en 20x objektiv, kan fluorescens i hjertet præcist lokaliseret til hjerte valves (figur 2C-2F). Indimellem kan orienteringen af ​​embryonerne være optimale for at optage billeder og kan føre til tvetydige resultater. Placering 3 zebrafisk per brønd og udfører hver behandling i tre eksemplarer (protokol trin 2.3) giver flere muligheder for at visualisere fluorescens præcist.

. Figur 1. Automatiseret sammensatte billeddannelse afslører vævsspecifik fluorescens i hjerteklapper og lever Brightfield (A, C) og fluorescerende (B, DH) billeder af Tg (5xERE: GFP). ^C262/c262 embryoer behandlet med angivne kemikalier på 2 dage efter befrugtning (DPF) og filmede ved 3 dpf. Hvert panel viser et sammensat billede af et enkelt godt (bestående af 59 individuelle billeder med 5%overlap) fra en 96-brønds plade. A og B, embryoner inkuberet i 0,1% DMSO (vehikelkontrol) er GFP-negative. CH, Embryoner inkuberet med 100 ng / ml 17β-østradiol (E2), 1,85 uM genistein (gen) , eller 10 uM BPA udviser fluorescens i hjerteklapperne (pile) og leveren (pilespidser), embryoner behandlet med 18,5 nM gen eller 1 uM BPA udviser fluorescens i hjerteklapper, men ikke lever. B ', digitalt forstørret billede af et enkelt larve det indrammede område i panel B. D', digitalt forstørrede billede fra boxed region panel D, og ​​så videre. Skala bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

.. g> Figur 2 Detaljeret visualisering af GFP-positive hjerteklapper Tg (5xERE: GFP) ^c262/c262 embryoner udsættes for angivne kemikalier i 96-brønds plade (se figur 1) blev afbildet manuelt ved højere forstørrelse, tillader visualisering af GFP i de atrieventrikelklapperne (pile) og aorta ventiler (pilespidser) af hjertet. B, D fluorescens og lysfelt billeder sammen. Alle billeder er lateral anterior til venstre dorsale til toppen. Skala bar = 50 mM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Denne protokol beskriver en enkel metode til automatisk billede vævsspecifik fluorescens i zebrafisk embryoner. Protokollen blev udviklet ved hjælp af et Zeiss Axio Observer. Z1 Zen Blå 2011 software, men teknikken kan tilpasses ved hjælp af en inverteret mikroskop med en motoriseret trin og mikroskop control software, der kan udføre flisebelægning at skabe sammensatte billeder. Udstyre et inverteret mikroskop med en motoriseret scene kan give en praktisk, billigere alternativ til at købe specialudstyr til high-content screening. Motoriserede etaper spænder fra flere tusinde til titusindvis af dollars, afhængigt af mærke og model af mikroskopet og kvaliteten af ​​scenen.

Der er flere kritiske trin i protokollen. Nogle kemikalier er lysfølsomme, hvorfor det kan være en fordel at inkubere embryoner i mørke under behandlingen. Zebrafisk embryoner er følsomme over for udtørring. Derfor, for kemical engagementer, der varer mere end én dag er det vigtigt at fylde brøndene langs kanterne af 96-brønds plade med medierne for at begrænse fordampning (protokol trin 2.3).

Det er også vigtigt at sikre, at trin omhyggeligt kalibreret (protokol trin 3.2). En almindelig fejl er at placere pladen på scenen uden at sikre pladen helt. I dette tilfælde kan pladens position på scenen ændre sig, når scenen bevæger sig, hvilket kan forårsage nogle brønde, der skal afbildes delvist eller slet ikke. Når billeddannelse flere plader i træk, er det ikke absolut nødvendigt at kalibrere scenen for hver plade, så længe pladerne er fra samme producent og er alle placeret i den fase i identiske orienteringer.

Ved indstilling af automatiserede billede flisebelægning parametre (protokol trin 3.5), sikre, at et flertal af hver vil vel blive afbildet. Ved 3 dpf og ældre, zebrafisk larver tendens til at placere sig nær kanterne af well, derfor anbefales en 90% fyld faktor til at sikre, at kanterne af hver brønd vil blive visualiseret. Men jo større fyldningsfaktor længere tid til billedoptagelse.

Det er muligt at udføre en syning algoritme på sammensatte billeder for at forbedre opløsningen. Hvis en syning algoritme skal udføres, derefter indstille flisebelægning parametre til at omfatte et billede overlap 5-10% (protokol trin 3.6). Jo højere overlapning, jo bedre resultater af sømmen algoritme. I nogle tilfælde kan en 10% overlapning tillader syning til at producere en informativ billede til analyse, som ikke kræver yderligere visualisering under anvendelse af et højere mål forstørrelse. Men jo større overlapning længere erhvervelse billedet tager, som flere billeder vil blive fanget per brønd. Et overlap på 0% kan anvendes til at reducere billede erhvervelse tid og for at minimere fluorescerende lys eksponering og fotoblegning. I dette tilfælde skal fange mere detaljerede billeder af udvalgte brønde ved hjælp af en 20x FORMÅLETve (figur 2).

Billedoptagelse tid til denne protokol vil afhænge af eksperimentets parametre. Billede købet ved hjælp af parametre i denne protokol (90% fill faktor, 5% overlap, tre z-sektioner pr optagne billede og en eksponeringstid på 50 msek for GFP kanal og 1 msek for brightfield kanal) tager tre minutter og 50 sekunder brønd. Derfor er det muligt at screene 60 brønde på tre timer og 50 minutter. Det er muligt at screene 180 brønde pr dag eller 60 unikke forbindelser i tre eksemplarer.

Denne protokol tillader automatiseret billeddannelse til vævs specifik fluorescens, men har flere begrænsninger. Widefield fluorescensimagografi mangler opløsningen af ​​konfokal billeddannelse anvendes i mange high-content screening teknikker. Derudover er vanskelig på grund af den høje variabilitet i orienteringen af ​​hver zebrafisk i en veldefineret fluorescens kvantificering. Dette kunne undgås ved imaging zebrafisk under uniformorientering betingelser, for eksempel ved hjælp af forme eller mikroplader med brønde, der tvinger zebrafisk embryoner i ensartede retningslinjer ^5,10. Billedet købet tid begrænser antallet af brønde, der kan screenes per dag til 180. Screening 180 brønde pr dag er en betydelig forbedring i forhold til manuel billedbehandling. Dog kan de typiske high throughput metoder screene et gennemsnit på 10.000 brønde pr dag, men kræver komplekse og dyre arbejdsstationer.

Denne protokol udgør en praktisk, billigere alternativ til high-content screening, som let kan tilpasses af laboratorier med et inverteret Widefield fluorescens mikroskop. Den her beskrevne billedbehandling metode giver mulighed for analyse af væv-specifik fluorescens i embryoner, der ikke er omhyggeligt monteret eller orienteret, der drastisk forbedrer den hastighed og brugervenlighed til forberedelse af prøven. Sammensatte billeder kan arkiveres for reference. Denne protokol blev udviklet for at muliggøre højkapacitetsscreening of vævsspecifikke østrogen-receptor-ligander fra kemiske biblioteker og miljømæssig vandprøver. Alternativt kunne denne billeddannelse protokol anvendes til at screene noget fluorescerende reporter for vævsspecifik aktivitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore	Fisher	13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip	Fisher	13-711-26
96-well, round, flat bottom plates	Fisher	21-377-203
100 x 35 mm plates	Fisher	08-757-100D
35 x 60 mm plates	Fisher	08-757-100B
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate	Sigma Aldrich	A5040-25G	see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63)
1-phenyl 2-thiourea (PTU)	Sigma Aldrich	P7629-10G	Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss		Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective	Carl Zeiss		We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera	Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software	Carl Zeiss		Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue	Sigma Aldrich	MB-1; 25 grams	make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B			60X E3 SOLUTION: NaCl                    - 17.2 grams KCl                       - 0.76 grams CaCl2-2H2O     - 2.9 grams MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3      150 ml 2% methylene blue     100 μl  Bring to 9 liters with Milli-Q water