Summary
Zebrafish भ्रूण में ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति की अर्द्ध स्वचालित इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल यहाँ है वर्णित है.
Abstract
Zebrafish भ्रूण छोटे अणुओं की बड़े पैमाने पर प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक zebrafish अक्सर जीन अभिव्यक्ति मिलाना कि रसायन की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है. लाइव zebrafish में प्रतिदीप्ति परख कि रासायनिक स्क्रीन अक्सर उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए महंगा, विशेष उपकरणों पर भरोसा करते हैं. हम एक मोटर चालित चरण स्वतः छवि zebrafish भ्रूण के साथ एक मानक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक प्रक्रिया का वर्णन है और ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति का पता लगाने. GFP की अभिव्यक्ति के माध्यम से एस्ट्रोजन रिसेप्टर गतिविधि की रिपोर्ट है कि ट्रांसजेनिक zebrafish का उपयोग करना, हम एक ऊतक विशेष ढंग से रिपोर्टर को सक्रिय कि एस्ट्रोजन रिसेप्टर ligands के लिए स्क्रीन के लिए एक अर्द्ध स्वचालित प्रक्रिया विकसित की है. इस वीडियो में हम एक 96 अच्छी तरह से थाली में 24-48 घंटे के बाद निषेचन (HPF) पर zebrafish भ्रूण arraying और एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स कि बाँध छोटे अणुओं को जोड़ने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है. 72-96 HPF में, प्रत्येक की छवियों को अच्छी तरह सेपूरी थाली स्वचालित रूप से एकत्र और मैन्युअल ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति के लिए निरीक्षण कर रहे हैं. इस प्रोटोकॉल नहीं बल्कि जिगर में हृदय वाल्व में रिसेप्टर्स को सक्रिय कि एस्ट्रोजेन का पता लगाने की क्षमता को दर्शाता है.
Introduction
ट्रांसजेनिक zebrafish ऐसे fibroblast वृद्धि 1, retinoic एसिड 2 कारकों और जीने भ्रूण में, 3 एस्ट्रोजेन के रूप में रास्ते संकेतन में गतिविधि के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देते हैं कि विकसित किया गया है. इस तरह के उपकरण (प्रतिदीप्ति तीव्रता में परिवर्तन के रूप में assayed) संकेत दे रास्ते उपद्रव कि रसायनों के लिए या एक ऊतक विशेष ढंग से 4 (प्रतिदीप्ति स्थानीयकरण में परिवर्तन) में संकेत मिलाना कि रसायनों के लिए स्क्रीनिंग सक्षम. स्वचालित छवि पर कब्जा नाटकीय रूप से 5,6 रासायनिक स्क्रीन के throughput बढ़ जाती है. लाइव zebrafish में स्वचालित रूप से परख प्रतिदीप्ति अक्सर महंगा, विशेष उपकरणों पर निर्भर है कि स्क्रीन. तथाकथित उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उच्च संकल्प, मात्रात्मक इमेजिंग लेकिन confocal माइक्रोस्कोपी 7,8 के लिए सुसज्जित विशेष थाली पाठकों के उपयोग की लागत में से लाभ प्रदान करता है. इस पद्धति का लक्ष्य zebrafish भ्रूण में स्वचालित रूप से परख ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति हैएक मानक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग कर एक 96 अच्छी तरह से थाली में. ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति इस तकनीक का उपयोग प्रतिष्ठित किया जा सकता है और विशेष थाली पाठकों या उच्च सामग्री स्क्रीनिंग उपकरणों के लिए उपयोग की कमी है कि प्रयोगशालाओं के लिए एक उचित दृष्टिकोण हो सकता है.
इस प्रोटोकॉल में, हम 3 दिनों के बाद निषेचन (DPF) में ऊतक विशेष एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) रहते zebrafish में एगोनिस्ट पता लगाने के लिए स्वचालित इमेजिंग का उपयोग करें. ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (5xERE: GFP) c262/c262 हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के अपस्ट्रीम 5 मिलकर एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्व डीएनए अनुक्रम (ERE) शामिल 3. Ligand के अभाव में, नेताओं सामान्य रूप से निष्क्रिय हैं. Ligand बाध्यकारी रिसेप्टर्स ERE डीएनए बाँध और प्रतिलेखन 9 को विनियमित करने की इजाजत दी, एक गठनात्मक परिवर्तन हो सके. 5xERE: GFP मछली ईआर modulators के लिए रासायनिक पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और estrogenic contaminants के लिए पर्यावरण के पानी के नमूनों की छानबीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Protocol
नोट: इस प्रोटोकॉल बर्मिंघम संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति में अलबामा के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था.
1. Zebrafish प्रजनन और अंडे संग्रह
- तीन दिन रासायनिक जोखिम की शुरुआत से पहले, अलग पुरुषों और महिलाओं के लिए डिवाइडर से प्रजनन टैंक को इकट्ठा करो. एक्वाकल्चर प्रणाली पानी के साथ प्रत्येक टैंक आधे रास्ते भरें. एक विभक्त द्वारा अलग प्रत्येक टैंक में 2 पुरुषों और 3 महिलाओं रखकर, प्रजनन टैंक को c262/c262 मछली: एक नेट का प्रयोग, टीजी (GFP 5xERE) हस्तांतरण. प्रत्येक टैंक पर ढक्कन प्लेस और तारीख और पार करने के लिए उपभेदों के साथ लेबल.
- अगली सुबह, सभी बाधाओं को दूर करने और झुकाव प्रजनन टैंक के एक छोर पर एक उथले क्षेत्र बनाने के लिए चकरा. Zebrafish सटीक विकासात्मक मचान सुनिश्चित करने के लिए 10 मिनट के अंतराल पर भ्रूण का संग्रह, दोस्त के लिए अनुमति देते हैं. पेट्री डिश में E3B मध्यम और धीरे फ्लश भ्रूण का उपयोग एक चाय का झरनी के माध्यम से rinsing द्वारा स्वच्छ अंडे. स्थायी करने के लिए वयस्क मछली लौटेंटैंक.
- एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग, प्रकार, गिनती, और किसी भी, unfertilized असामान्य या क्षतिग्रस्त भ्रूण को हटा दें. अंधेरे चक्र: एक 14:10 प्रकाश के साथ 28.5 डिग्री सेल्सियस पर E3B मध्यम और घर में पेट्री डिश में रखें भ्रूण. भ्रूण घनत्व के विकास को प्रभावित कर सकते हैं. एक 60 x 15 मिमी पकवान में एक 100 x 35 मिमी डिश में ज्यादा से ज्यादा 100 भ्रूण और कोई 50 से अधिक भ्रूण रखें.
- 24 HPF से, 200 माइक्रोन 1-फिनाइल 2 Thiourea (पी टी यू) युक्त E3B साथ मीडिया की जगह. पी टी यू वर्णक गठन से बचाता है और zebrafish भ्रूण और बेहतर छवि स्पष्टता के लिए पारदर्शी लार्वा रहता है. चेतावनी: ध्यान केंद्रित पी.टी.यू. शेयर खतरनाक है; E3B + पी टी यू समाधान करते समय दस्ताने पहनते हैं.
- 1 दिन बाद निषेचन में (DPF), मैन्युअल रूप से ठीक संदंश का उपयोग कर प्रत्येक भ्रूण से जरायु हटा दें. जरायु एस्ट्रोजेन के प्रवेश को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है, लेकिन हटाने छवि स्पष्टता बढ़ाता है. मीडिया से chorions को दूर करने की कोई जरूरत नहीं है. नोट: मैनुअल dechorionation के लिए एक विकल्प के रूप में, भ्रूण के बैच चे हो सकता हैपहले 11 के रूप में वर्णित mically, 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर pronase उपचार का उपयोग dechorionated.
भ्रूण की 2. रासायनिक उपचार
- इलाज से पहले दिन, 1,000 गुना DMSO में एकाग्रता (या उपयुक्त विलायक) में प्रत्येक रसायन के शेयर समाधान तैयार करते हैं. उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोन Bisphenol एक (BPA) के लिए भ्रूण को बेनकाब 100% DMSO में एक 10 मिमी BPA शेयर समाधान तैयार करने के लिए. यह प्रत्येक उपचार में वर्दी DMSO एकाग्रता सुनिश्चित करता है और DMSO के एक गैर विषैले 1:1,000 कमजोर पड़ने एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए अनुमति देता है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान इस प्रोटोकॉल के लिए, भ्रूण 1 माइक्रोन और 10 माइक्रोन BPA, 18.5 एनएम और 1.85 माइक्रोन genistein, 367 एनएम estradiol (सकारात्मक नियंत्रण) और वाहन (0.1% DMSO, नकारात्मक नियंत्रण) को उजागर किया जाएगा.
सावधानी: इस तरह के BPA और estradiol के रूप में रसायन खतरनाक हैं और मानव भ्रूण पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है. देखभाल के साथ endocrine disruptors संभाल और हमेशा उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण का उपयोग करें. - उपचार के दिन, पिघलना शेयर रासायनिक समाधान तैयार. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 1 मिलीलीटर E3B + पी टी यू pipetting और स्टॉक रासायनिक समाधान के 1 μl जोड़कर 1:1,000 पतला. भंवर सख्ती. एक वाहन पर नियंत्रण के रूप में E3B + पी.टी.यू. में DMSO 1:1,000 पतला. एक अनुपचारित नियंत्रण के रूप में एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में 1 एमएल E3B + पी टी यू प्रयोग करें.
- एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में एक बड़े बोर प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक, पेट्री डिश से स्थानांतरण भ्रूण का उपयोग, प्रति 3 भ्रूण खैर, हालत प्रति 3 कुओं. लंबे समय तक इलाज के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए, थाली के बाहरी पंक्तियाँ और स्तंभ (पंक्तियों ए और ई, कॉलम 1 और 12) से भ्रूण न आना. आउटर कुओं E3B + पी टी यू के 300 μl के साथ भरा जा सकता है. उचित प्लेट ढक्कन लेबल.
- एक ठीक इत्तला दे दी प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया निकालें. भ्रूण बाहर सुखाने से बचने के लिए जल्दी से काम करते हैं.
- अच्छी तरह इसी में उपचार समाधान के 200 μl जोड़ें. Unde ढक्कन रखेंउचित कुओं में उपचार के अलावा यह सुनिश्चित करने के लिए एक गाइड के रूप में थाली rneath. भंवर प्रत्येक ट्यूब समाधान में रासायनिक वितरित करने के लिए pipetting के लिए पहले. दिखने में प्रत्येक भ्रूण उपचार समाधान में है की पुष्टि करें. भ्रूण अच्छी तरह के पक्ष में हैं, तो इलाज के समाधान के साथ अच्छी तरह से उन्हें धोने के लिए एक साफ हस्तांतरण pipet का उपयोग करें.
- 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में थाली प्लेस भ्रूण 72 HPF पर प्रतिदीप्ति के लिए विश्लेषण किया जाएगा.
96 अच्छी तरह प्लेटें में भ्रूण की 3. स्वचालित इमेजिंग
- प्रत्येक अच्छी तरह से 4 मिलीग्राम / एमएल tricaine के 10 μl जोड़कर भ्रूण anesthetize.
नोट: इमेजिंग के लिए पहले भ्रूण anesthetize. 24-96 HPF में, zebrafish सहज आंदोलन और छवि को पकड़ने के दौरान बदलते प्रकाश स्रोत के लिए एक डराना प्रतिक्रिया दिखा रहे हैं. भ्रूण anesthetizing इमेजिंग के दौरान आंदोलन को कम करता है. - मोटरयुक्त चरण में 96 अच्छी तरह से थाली प्लेस और मंच जांचना. जीस जेन ब्लू माइक्रोस्कोपी अपने आप के लिए 2011 सॉफ्टवेयर का प्रयोगपर और नियंत्रण, नमूना वाहक विकल्प का चयन करें और multiwell 96 का चयन करें. जांचना का चयन करें. चरण जांचना stepwise निर्देशों का पालन करें.
नोट: इस कदम के बाद टाइल बटन अचयनित मत करो. टाइल्स बटन अनियंत्रित है, तो अंशांकन सेटिंग्स खो दिया जा सकता है और 96 अच्छी तरह से थाली recalibrated करने की आवश्यकता होगी. - सेटिंग (बीएफ) एक 10x उद्देश्य और brightfield का प्रयोग, एक सकारात्मक नियंत्रण भ्रूण की पहचान और प्रतिदीप्ति संकेत कैमरा saturating नहीं है, यकीन है कि बीएफ और GFP चैनलों के लिए उचित प्रदर्शन सेटिंग्स निर्धारित किया है. एक एकल भ्रूण पर ध्यान दें और 3 कुल जेड वर्गों, ऊपर एक छवि 50 माइक्रोन और वर्तमान फोकल हवाई जहाज़ से नीचे एक 50 माइक्रोन प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप कार्यक्रम.
नोट: विभिन्न ऊतकों अलग फोकल विमानों पर कब्जा क्योंकि प्रत्येक zebrafish छवियों को ध्यान में हृदय और जिगर के साथ कब्जा कर रहे हैं के लिए, यह सुनिश्चित करेंगे कि. - GFP और बीएफ channe का उपयोग कर एक टाइलों छवि प्राप्त करने के लिए सॉफ्टवेयर मानकों सेटरास. अधिग्रहण टैब के तहत, उन्नत सेटअप का चयन करें. चयन टाइल क्षेत्रों, तो टाइल. सर्कल में अच्छी तरह से विकल्प चुनें.
नोट: टाइलिंग अच्छी तरह से प्रत्येक के एक समग्र छवि बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक ही क्षेत्र का दृश्य अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए केवल एक छोटा सा हिस्सा लिया गया. टाइलिंग समारोह स्वतः ही पूरे अच्छी तरह का एक समग्र छवि बनाने के लिए, खेतों का दृश्य हर अच्छी तरह से कई आसन्न कब्जा कर सकते हैं. यह प्रत्येक समग्र छवि एक भी अच्छी तरह से कई दर्जन व्यक्ति चित्र शामिल हैं, जहां स्वचालित रूप से, प्रति प्लेट 96 समग्र छवियों पर कब्जा करने के लिए इसलिए संभव है. - कैरियर चुनें और कारक 90% भरने. 90% का भरण कारक का चयन इस तरह के प्रत्येक अच्छी तरह से क्षेत्र की 90% समग्र छवि में दिखाई जाएगी कि चयनित कुओं की एकाधिक छवियों पर कब्जा करेगा.
नोट: भरण कारक का चयन करते हैं, तो एक चित्र imaged किया जा क्षेत्र का प्रतिनिधित्व प्रदर्शित किया जाएगा. अच्छी तरह से क्षेत्र शामिल होंगे कि एक प्रतिशत का चयन करेंउस प्रयोग के लिए उपयुक्त है. - विकल्प के तहत, इच्छित ओवरलैप की राशि का चयन करें.
नोट: एक भी प्रतिनिधि छवि के लिए एक साथ टाइल्स की सिलाई करते हैं, 5-10% की एक ओवरलैप छवियों के बीच एक चिकनी सीवन के लिए अनुमति देता है. छवि सिलाई अनावश्यक है हालांकि, अगर एक 0% ओवरलैप का उपयोग इमेजिंग समय कम हो जाएगा. 90% भरने के कारक और 5% ओवरलैप का उपयोग करना, एक भी अच्छी तरह से एक समग्र छवि 59 व्यक्ति छवियों के होते हैं. - इमेजिंग प्रारंभ करें. माइक्रोस्कोप स्वचालित रूप से छवियों को प्राप्त होगा.
- मैन्युअल ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के समग्र चित्र (चित्रा 1) का निरीक्षण किया.
- नोट: यह रासायनिक जोखिम पूर्व प्रयोगात्मक उपचार कुओं का अवलोकन करने के लिए काम किया है कि इस बात की पुष्टि करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के साथ शुरू करने के लिए सबसे अच्छा है.
96 अच्छी तरह से थाली में भ्रूण के 4. मैनुअल छवि कैद
नोट:, परिणामों की पुष्टि एसी के लिए एक 20x लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य का उपयोग करने के लिएगायकगण अधिक विस्तृत चित्र स्वयं (चित्रा 2).
- सेटिंग (बीएफ) एक 20x उद्देश्य और brightfield का प्रयोग, एक सकारात्मक नियंत्रण भ्रूण की पहचान और प्रतिदीप्ति संकेत कैमरा saturating नहीं है, यकीन है कि उचित बीएफ और GFP चैनलों के लिए प्रदर्शन सेटिंग्स निर्धारित किया है.
- मैन्युअल रूप से व्यक्तिगत भ्रूण और छवियों पर कब्जा पहचानें.
नोट: प्रदर्शन सेटिंग्स सकारात्मक नियंत्रण भ्रूण के लिए चयनित किया गया है एक बार, सेटिंग को बदल नहीं है. प्रत्येक छवि वर्दी परिस्थितियों में कब्जा कर लिया है क्योंकि यह प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना की अनुमति देता है.
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Representative Results
चित्रा 1 एक 96 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं से समग्र चित्र से पता चलता है. प्रत्येक समग्र छवि 5% छवि ओवरलैप के साथ 59 व्यक्ति छवियों से बना है. रहते zebrafish अच्छी तरह से प्रत्येक के भीतर बेतरतीब ढंग से उन्मुख, अभी तक हम जिगर से दिल में प्रतिदीप्ति भेद करने में सक्षम हैं संभव है. Brightfield छवियों zebrafish अभिविन्यास का आकलन और रूपात्मक असामान्यताएं (आंकड़े 1 ए और 1 सी) कल्पना करने के लिए संदर्भ के रूप में उपयोगी होते हैं. एक 10x उद्देश्य का उपयोग कर स्वचालित इमेजिंग रसायन स्क्रीन और एक उच्च बढ़ाई पुस्तिका मूल्यांकन वारंट जो निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 2 आंकड़ा और अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए एक 20x लंबे समय तक काम दूरी उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया छवियों से पता चलता है. इन छवियों खुर्दबीन मंच से थाली हटाने के बिना चित्र 1 में दर्शाया स्वचालित स्कैन के बाद सीधे ले जाया गया. एक 20x उद्देश्य का उपयोग कर, दिल में प्रतिदीप्ति ठीक दिल वैल के लिए स्थानीयकृत किया जा सकता हैves (आंकड़े -2 सी 2 एफ). कभी कभी, भ्रूण के उन्मुखीकरण छवियों पर कब्जा करने के लिए उप इष्टतम हो सकता है और अस्पष्ट परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अच्छी तरह से प्रति 3 zebrafish रखकर और तीन प्रतियों में प्रत्येक उपचार (प्रोटोकॉल 2.3 कदम) के प्रदर्शन को सही प्रतिदीप्ति कल्पना करने के लिए कई अवसर प्रदान करता है.
.. चित्रा 1 स्वचालित समग्र इमेजिंग हृदय वाल्व और जिगर Brightfield (ए, सी) और फ्लोरोसेंट में ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति पता चलता है (बी, डीएच) टीजी की छवियों (5xERE: GFP) के 2 दिनों में संकेत दिया रसायनों के साथ इलाज c262/c262 भ्रूण पोस्ट निषेचन (DPF) और 3 DPF पर imaged. प्रत्येक पैनल 5% के साथ 59 व्यक्ति छवियों से बना एक भी अच्छी तरह से (के एक समग्र छवि से पता चलता हैएक 96 अच्छी तरह से थाली से ओवरलैप). ए और बी, 0.1% DMSO (वाहन नियंत्रण) में incubated भ्रूण GFP नकारात्मक हैं. CH, भ्रूण 100 एनजी / एमएल 17β-estradiol (E2), 1.85 माइक्रोन genistein (जनरल) के साथ incubated , या हृदय वाल्व (तीर) और जिगर (तीर) में 10 माइक्रोन BPA प्रदर्शनी प्रतिदीप्ति, 18.5 एनएम जनरल या 1 माइक्रोन BPA प्रदर्शनी हृदय वाल्व में प्रतिदीप्ति लेकिन नहीं जिगर के साथ इलाज भ्रूण. बी ', एक पैनल बी डी में बॉक्सिंग क्षेत्र से एकल लार्वा का डिजिटल रूप से बढ़ाया छवि' इतने पर, पैनल डी की बॉक्सिंग क्षेत्र से डिजिटल रूप से बढ़ाया छवि, और. = 500 माइक्रोन स्केल बार. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण में स्वतः छवि ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति के लिए एक सरल विधि का वर्णन. प्रोटोकॉल एक Zeiss Axio प्रेक्षक का उपयोग कर विकसित किया गया था. Z1 जेन ब्लू 2011 सॉफ्टवेयर के साथ, लेकिन तकनीक समग्र चित्र बनाने के लिए टाइलिंग प्रदर्शन कर सकते हैं कि एक मोटर चालित मंच और माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ किसी भी उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अनुकूलित किया जा सकता. एक मोटर चालित मंच के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप लैस उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए विशेष उपकरणों की खरीद के लिए एक व्यावहारिक, कम महंगा विकल्प प्रदान कर सकते हैं. मोटर चालित चरणों चरण की खुर्दबीन और गुणवत्ता का बनाने और मॉडल के आधार पर, कई हजार से अमरीकी डॉलर के हजारों करने के लिए सीमा होती है.
प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. कुछ रसायन इस प्रकार यह उपचार के दौरान अंधेरे में भ्रूण सेते के लिए फायदेमंद हो सकता है, प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं. Zebrafish भ्रूण सुखाना के प्रति संवेदनशील हैं. इसलिए, chemi के लिएसीएएल जोखिम एक दिन से अधिक समय तक चलने वाले यह वाष्पीकरण (प्रोटोकॉल 2.3 कदम) को सीमित करने के लिए मीडिया के साथ 96 अच्छी तरह से थाली के किनारों के साथ कुओं को भरने के लिए महत्वपूर्ण है.
यह चरण ध्यान से (प्रोटोकॉल 3.2 कदम) calibrated है कि यह सुनिश्चित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. एक आम गलती पूरी तरह से थाली हासिल करने के बिना मंच पर थाली जगह है. मंच चलता है जब इस मामले में, मंच पर थाली की स्थिति कुछ कुओं में सभी आंशिक रूप से या नहीं हो imaged का कारण बन सकता है, जो बदल सकते हैं. उत्तराधिकार में कई प्लेटें जब इमेजिंग, यह रूप में लंबे समय प्लेटें एक ही निर्माता से कर रहे हैं और सभी समान झुकाव में मंच में रखा जाता है, के रूप में एक थाली के लिए मंच recalibrate बिल्कुल आवश्यक नहीं है.
स्वचालित छवि टाइलिंग मानकों (प्रोटोकॉल 3.5 कदम) की स्थापना, प्रत्येक के बहुमत अच्छी तरह से imaged किया जाएगा कि यह सुनिश्चित. 3 DPF और बड़ी उम्र में zebrafish लार्वा wel के किनारों के निकट खुद को स्थिति के लिए करते हैंएल, इसलिए एक 90% भरने के कारक प्रत्येक कुएं के किनारों से कल्पना की जाएगी कि यह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है. हालांकि, भरण कारक अब छवि अधिग्रहण के लिए समय अधिक से अधिक.
यह संकल्प में सुधार करने के लिए समग्र छवियों पर एक सिलाई एल्गोरिथ्म प्रदर्शन करने के लिए संभव है. एक सिलाई एल्गोरिथ्म प्रदर्शन किया जा रहा है, तो एक 5-10% छवि ओवरलैप (प्रोटोकॉल 3.6 कदम) शामिल करने के लिए टाइलिंग मानकों सेट. ओवरलैप उच्च, सिलाई एल्गोरिथ्म के प्रदर्शन को बेहतर. कुछ मामलों में, एक 10% ओवरलैप सिलाई एक उच्च बढ़ाई उद्देश्य का उपयोग आगे दृश्य की आवश्यकता नहीं है कि विश्लेषण के लिए एक जानकारीपूर्ण छवि का निर्माण करने के लिए अनुमति दे सकता है. हालांकि, अधिक से अधिक लंबे समय तक छवि अधिग्रहण अधिक छवियों के रूप में, ले जाएगा ओवरलैप प्रति अच्छी तरह से कब्जा कर लिया जाएगा. 0% की एक ओवरलैप छवि अधिग्रहण के समय को कम करने के लिए और फ्लोरोसेंट प्रकाश जोखिम और photobleaching कम से कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में, एक 20x objecti का उपयोग कर चयन करें कुओं के अधिक विस्तृत चित्र पर कब्जाve (चित्रा 2).
इस प्रोटोकॉल के लिए छवि पर कब्जा समय प्रयोग पैरामीटर पर निर्भर करेगा. इस प्रोटोकॉल में मापदंडों का उपयोग कर छवि प्राप्ति (90% भरने के कारक, 5% ओवरलैप, तीन पर कब्जा कर लिया छवि प्रति Z-वर्गों और GFP चैनल के लिए 50 मिसे और brightfield चैनल के लिए 1 मिसे के एक जोखिम समय) तीन मिनट और पचास सेकंड लेता है अच्छी तरह से प्रति. इसलिए, यह तीन घंटे और पचास मिनट में 60 कुओं की छानबीन के लिए संभव है. यह प्रति दिन 180 कुओं, या तीन प्रतियों में 60 अद्वितीय यौगिकों स्क्रीन करने के लिए संभव है.
इस प्रोटोकॉल ऊतक विशिष्ट प्रतिदीप्ति के लिए स्वचालित इमेजिंग की अनुमति देता है, लेकिन कई सीमाएं हैं. Widefield प्रतिदीप्ति इमेजिंग कई उच्च सामग्री स्क्रीनिंग तकनीक में इस्तेमाल confocal इमेजिंग के संकल्प का अभाव है. इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति quantitation वजह से एक अच्छी तरह से भीतर प्रत्येक zebrafish के अभिविन्यास में उच्च परिवर्तनशीलता के लिए मुश्किल है. यह वर्दी के तहत zebrafish इमेजिंग से बचा जा सकता हैउन्मुखीकरण की स्थिति, नए नए साँचे उपयोग कर या microplates वर्दी झुकाव 5,10 में zebrafish भ्रूण कि सेना कुओं के साथ द्वारा उदाहरण के लिए. छवि अधिग्रहण के समय 180 में प्रति दिन जांच की जा सकती है कि कुओं की संख्या. प्रति दिन 180 कुओं स्क्रीनिंग पुस्तिका इमेजिंग पर एक महत्वपूर्ण सुधार है सीमा. हालांकि, ठेठ उच्च तरीकों प्रति दिन 10,000 कुओं के एक औसत स्क्रीन, लेकिन जटिल और महंगा कार्यस्थानों की आवश्यकता होती है सकते हैं.
इस प्रोटोकॉल तत्काल एक औंधा widefield प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा रूपांतरित किया जा सकता है कि उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए एक व्यावहारिक, कम महंगा विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है. यहाँ वर्णित इमेजिंग विधि काफी नमूना तैयार करने की गति और आसानी बेहतर बनाता है जो ध्यान से घुड़सवार या उन्मुख नहीं किया गया है कि भ्रूण में ऊतक विशेष प्रतिदीप्ति का विश्लेषण, के लिए अनुमति देता है. समग्र चित्र संदर्भ के लिए संग्रहीत किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल उच्च throughput स्क्रीनिंग ओ अनुमति देने के लिए विकसित किया गया थारासायनिक पुस्तकालयों और पर्यावरण के पानी के नमूनों से च ऊतक विशेष एस्ट्रोजन रिसेप्टर ligands. वैकल्पिक रूप से, इस इमेजिंग प्रोटोकॉल ऊतक विशेष गतिविधि के लिए किसी भी फ्लोरोसेंट संवाददाता स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
हम सुसान किसान और zebrafish देखभाल के लिए UAB zebrafish अनुसंधान सुविधा के कर्मचारियों को धन्यवाद. औषध विज्ञान और विष विज्ञान विभाग की ओर से शुरू हुआ धन द्वारा प्रदान की धन.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
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