Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's

Published: May 17, 2014 doi: 10.3791/51533

Summary

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Abstract

Zebravis embryo's zijn een krachtig hulpmiddel voor grootschalige screening van kleine moleculen. Transgene zebravis dat fluorescente reporter eiwitten tot expressie worden vaak gebruikt om chemicaliën die genexpressie moduleren. Chemische schermen die fluorescentie assay in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur voor hoge gehalte screening. We beschrijven een procedure met behulp van een standaard epifluorescentiemicroscoop met een gemotoriseerde podium om het beeld automatisch zebravis embryo's en detecteren weefsel-specifieke fluorescentie. Met behulp van transgene zebravis dat oestrogeen receptor-activiteit via expressie van GFP melden, we een semi-geautomatiseerde procedure ontwikkeld voor het screenen op oestrogeen receptor liganden die de verslaggever in een weefsel-specifieke wijze te activeren. In deze video beschrijven we procedures arraying zebravis embryo 24-48 uur na de bevruchting (HPF) in een 96-well plaat en het toevoegen van kleine moleculen die oestrogeenreceptoren binden. Op 72-96 HPF, beelden van elk putje vande hele plaat worden automatisch verzameld en handmatig gecontroleerd op weefsel-specifieke fluorescentie. Dit protocol toont het vermogen aan oestrogenen die receptoren in hartkleppen inschakelen, lever detecteren.

Introduction

Transgene zebravis ontwikkeld die het mogelijk maken de directe visualisatie van de activiteit in signaaltransductiewegen zoals fibroblast groeifactoren 1, retinoïnezuur 2 en 3 oestrogenen, in levende embryo. Dergelijke tools kunnen screenen op stoffen die signalerende wegen verstoren (getest als verandering in de fluorescentie-intensiteit) of voor chemische stoffen die moduleren signalering in een weefsel-specifieke wijze (verandering in de fluorescentie lokalisatie) 4. Geautomatiseerde beeldopname verhoogt de doorvoer van chemische schermen dramatisch 5,6. Schermen die automatisch assay fluorescentie in levende zebravis vaak een beroep op dure, gespecialiseerde apparatuur. Zogenaamde high content levert het voordeel van hoge resolutie kwantitatieve beeldvorming maar ten koste van het gebruik van gespecialiseerde plaatlezers ingericht voor confocale microscopie 7,8. Het doel van deze methode is automatisch assay weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryoin een 96-wells plaat met een standaard epifluorescentiemicroscoop. Weefsel-specifieke fluorescentie kan worden onderscheiden met behulp van deze techniek en kan een redelijke benadering voor laboratoria die de toegang tot gespecialiseerde plaat lezers of high content apparatuur ontbreekt zijn.

In dit protocol gebruiken we geautomatiseerde beeldvorming om weefselspecifieke oestrogeenreceptor (ER) agonisten in levende zebravis detecteren 3 dagen na de bevruchting (dpf). De transgene lijn Tg (5xERE: GFP) c262/c262 bevat 5 tandem oestrogeen respons element DNA-sequenties (ERE) stroomopwaarts van groen fluorescerend eiwit (GFP) 3. Bij afwezigheid van ligand, ERs gewoonlijk inactief. Ligandbinding veroorzaakt een conformationele verandering waardoor receptoren ERE DNA te binden en transcriptie te reguleren 9. 5xERE: GFP vis kan worden gebruikt om chemische bibliotheken te screenen ER modulatoren en kan worden gebruikt om de milieu watermonsters oestrogene verontreinigingen screenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OPMERKING: Dit protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Alabama in Birmingham Institutional Animal Care en gebruik Comite.

1. Zebravis Fokkerij en Ei Collecties

  1. Drie dagen voor het begin van blootstelling aan chemische stoffen, assembleren kweekbakken met verdelers om aparte mannen en vrouwen. Vul elke tank halverwege met aquacultuur systeem water. Met behulp van een net, overdragen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 vis kweekbakken, het plaatsen van 2 reutjes en 3 teefjes in elke tank gescheiden door een scheidingswand. Leg een deksel op elke tank en label met datum en stammen worden overschreden.
  2. De volgende ochtend, verwijder alle barrières en tilt schotten tot een ondiep gebied te creëren aan de ene kant van de kweekbak. Laat zebravis om te paren, het verzamelen van embryo's in 10 min. intervallen om precies ontwikkelingsstoornissen enscenering garanderen. Clean eieren door spoelen door een theezeefje behulp E3B medium en voorzichtig spoelen embryo's in petrischalen. Terug volwassen vissen naar permanentetanks.
  3. Met behulp van een microscoop ontleden, sorteren, tellen, en verwijder eventuele onbevruchte, abnormale of beschadigde embryo's. Plaats embryo's in petrischaaltjes in E3B medium en huis bij 28,5 ° C met een 14:10 licht: donker cyclus. Embryo dichtheid kan beïnvloeden ontwikkeling. Plaats niet meer dan 100 embryo's in een 100 x 35 mm schaal en niet meer dan 50 embryo's in een 60 x 15 mm schaal.
  4. Door 24 HPF, vervang media E3B die 200 uM 1-fenyl 2-thio (PTU). PTU voorkomt pigmentvorming en houdt zebravis embryo's en larven transparant voor verbeterde beeldhelderheid. LET OP: geconcentreerde PTU voorraad is gevaarlijk; Draag handschoenen bij het maken E3B + PTU oplossing.
  5. Op 1 dag na de bevruchting (DPF), handmatig de chorion van elk embryo met behulp van fijne pincet verwijderen. De chorion lijkt geen invloed op de penetratie van oestrogenen, maar verwijdering verbetert helderheid van het beeld. Er hoeft chorions van de media te verwijderen. Opmerking: Als alternatief voor manuele dechorionation, partijen embryo kan chemisch dechorionated met 1 mg / ml pronase behandeling, zoals eerder beschreven 11.

2. Chemische behandeling van embryo's

  1. De dag vóór de behandeling, voor te bereiden voorraad oplossingen van elke chemische stof in 1000-voudige concentratie in DMSO (of geschikt oplosmiddel). Bijvoorbeeld, embryo's blootgesteld aan 10 uM bisfenol A (BPA), bereid in 10 mM BPA voorraadoplossing in 100% DMSO. Dit garandeert een gelijkmatige DMSO-concentratie in elke behandeling en kan een niet-toxisch 1:1000 verdunning van DMSO om te dienen als vehikel controle. Fokvee oplossingen bij -20 ° C. Voor dit protocol, zal embryo's worden blootgesteld aan 1 uM en 10 uM BPA, 18,5 nM en 1,85 uM genisteïne, 367 nM estradiol (positieve controle) en het voertuig (0,1% DMSO, negatieve controle).
    WAARSCHUWING: Chemicaliën zoals BPA en estradiol gevaarlijk en kan schadelijke effecten op de menselijke foetus. Handvat endocriene verstoorders met zorg en gebruik altijd de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen.
  2. Op de dag van de behandeling, dooi voorbereid voorraad chemische oplossingen. Verdun 1:1000 pipetteren 1 ml E3B + PTU in een 1,5 ml microcentrifugebuis en toevoegen van 1 pl voorraad chemische oplossing. Vortex krachtig. Verdunnen DMSO 1:1.000 in E3B + PTU als een voertuig controle. Gebruik 1 ml E3B + PTE in een 1,5 ml microcentrifuge buis als onbehandelde controle.
  3. Met behulp van een grote diameter plastic overdracht pipet embryo's uit petrischaaltjes in elk putje van een 96-well plaat, 3 embryo's per well, 3 putten per conditie. Verdamping bij langdurige behandeling te voorkomen, weg te laten embryo vanuit de rijen en kolommen van de plaat (rij A en E, kolommen 1 en 12). Buitenste putjes worden gevuld met 300 ul E3B + PTU. Label de plaat deksel op de juiste wijze.
  4. Verwijder het medium uit elk putje met een fijne getipt plastic overdracht pipet. Werk snel om te voorkomen uitdroging van de embryo's.
  5. Voeg 200 ul van de behandeling oplossing in goed overeenkomt. Plaats het deksel underneath de plaat als een leidraad voor toevoeging van behandelingen zorgen in de juiste putten. Vortex elke buis voorafgaand aan het pipetteren om de stof in de oplossing te verdelen. Bevestig visueel elk embryo is in de behandeling oplossing. Als embryo's zijn aan de kant van de put, gebruik dan een schone overdracht pipet om ze te wassen in de put met de behandeling oplossing.
  6. Plaats de plaat in de incubator bij 28.5 ° C. Embryo's worden geanalyseerd op fluorescentie bij 72 hpf.

3. Automatische beeldvorming van embryo's in 96-well platen

  1. Verdoven embryo door 10 gl 4 mg / ml tricaïne aan elk putje.
    OPMERKING: Verdoven embryo's voorafgaand aan de beeldvorming. Op 24-96 HPF, zebravis vertonen spontane beweging en een schrikreactie op de veranderende lichtbron tijdens de beeldopname. Verlamming van embryo's vermindert beweging tijdens de beeldvorming.
  2. Plaats de plaat met 96 putjes in de gemotoriseerde fase en kalibreer het podium. Met behulp van Zeiss Zen Blauw 2011 software voor microscopie automatischop en controle, selecteer de optie steekproef vervoerder en selecteer multiwell 96. Selecteer kalibreren. Volg de stapsgewijze aanwijzingen om het podium te kalibreren.
    OPMERKING: vink de knop tegels na deze stap. Als de knop tegels is uitgeschakeld, kan kalibratie-instellingen verloren gaan en de 96-well plaat zal moeten worden gekalibreerd.
  3. Met behulp van een 10x objectief en de helderveld (BF) instellen, identificeren van een positieve controle embryo en de belichting instellingen adequaat voor BF en GFP-kanalen, en zorg ervoor dat fluorescentie-signaal niet de camera is het verzadigen. Focus op een enkel embryo en programmeer de microscoop om 3 totale Z-profielen, een afbeelding 50 pm boven en een 50 urn onder de huidige focal plane verwerven.
    OPMERKING: Omdat verschillende weefsels bezetten verschillende brandpunten vliegtuigen, zal dit ervoor zorgen dat voor elk zebravis beelden worden vastgelegd met het hart en de lever in focus.
  4. Stel de software parameters om een ​​betegelde beeld met behulp van GFP en BF channe verwervenls. Selecteer op het tabblad overname geavanceerde instellingen. Select tegel regio's, dan tegels. Kies de optie cirkel ook.
    OPMERKING: Tegels wordt gebruikt om een ​​samengesteld beeld van elke creëren ook. Een field-of-view betreffen slechts een klein gedeelte van elk putje. De tegels functie kan automatisch vastleggen meerdere aangrenzende velden-of-view uit elk putje, het creëren van een samengesteld beeld van het gehele goed. Het is derhalve mogelijk om automatisch vastleggen 96 samengestelde afbeeldingen per plaat, waarbij elke samengestelde beeld omvat tientallen afzonderlijke afbeeldingen in een enkel putje.
  5. Selecteer vervoerder en vul factor 90%. Een vulfactor van 90% selecteren vastlegt meervoudige afbeeldingen van de geselecteerde putjes zodanig dat 90% van het oppervlak van elk putje wordt zichtbaar in het samengestelde beeld.
    OPMERKING: Bij het selecteren vulfactor wordt een diagram weergegeven die de ruimte af te beelden. Selecteer een percentage dat onder de oppervlakte van de putdat geschikt is voor het experiment.
  6. Onder opties, selecteer de hoeveelheid overlapping gewenst.
    OPMERKING: Bij het aan elkaar plakken van tegels voor een enkel beeld vertegenwoordiger, een overlap van 5-10% zorgt voor een gladde naad tussen de beelden. Echter, als het stiksel is niet nodig, met behulp van een 0% overlap zal beeldvorming verkorten. Met behulp van 90% vulfactor en 5% overlap, een samengesteld beeld van een enkele put bestaat uit 59 afzonderlijke beelden.
  7. Start beeldvorming. De microscoop zal automatisch beelden te verwerven.
  8. Handmatig inspecteren samengestelde beelden van elk putje voor weefsel-specifieke fluorescentie (figuur 1).
  9. OPMERKING: Het is het beste om te beginnen met de positieve controle om te bevestigen dat de blootstelling aan chemische stoffen werkten voorafgaand aan het observeren experimentele behandeling putten.

4. Handmatig Fotolader van embryo's in 96-well plaat

OPMERKING: Om resultaten te bevestigen, gebruik dan een objectief 20x lange werkafstand te ackatern meer gedetailleerde beelden handmatig (figuur 2).

  1. Met behulp van een 20x objectief en de helderveld (BF) instellen, identificeren van een positieve controle embryo en stel belichtingsinstellingen voor BF en GFP-kanalen adequaat, en zorg ervoor dat fluorescentie-signaal niet de camera is het verzadigen.
  2. Identificeer de individuele embryo's en foto's maken met de hand.
    OPMERKING: Nadat de belichtingsinstellingen zijn geselecteerd voor de positieve controle embryo, de instellingen niet wijzigen. Dit maakt een vergelijking van de fluorescentie-intensiteit als elke opname wordt gemaakt onder gelijke voorwaarden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont samengestelde beelden van afzonderlijke putjes van een 96-wells plaat. Elk beeld composiet bestaat uit 59 afzonderlijke foto's met 5% afbeelding overlap. Merk op dat de levende zebravis willekeurig georiënteerd zijn in elk putje, maar we kunnen onderscheiden fluorescentie in het hart van de lever. Helderveld beelden zijn bruikbaar als verwijzingen naar de zebravis oriëntatie te beoordelen en te visualiseren morfologische afwijkingen (figuren 1A en 1C). Geautomatiseerde beeldvorming met behulp van een 10x objectief wordt gebruikt om chemicaliën te screenen en te bepalen welke handmatige beoordeling garandeert bij een sterkere vergroting. Figuur 2 toont beelden die met een 20x lange werkafstand doelstelling voor meer gedetailleerde analyse. Deze beelden werden direct na de automatische scan in figuur 1 zonder de plaat uit de microscoop stadium genomen. Met behulp van een 20x objectief, kan de fluorescentie in het hart nauwkeurig worden gelokaliseerd op hart valves (Figuren 2C-2F). Soms kan de oriëntatie van de embryo suboptimale om foto's en kan leiden tot dubbelzinnige resultaten. Het plaatsen van 3 zebravis per putje en het uitvoeren van elke behandeling in drievoud (protocol stap 2.3) biedt meerdere mogelijkheden om fluorescentie nauwkeurig te visualiseren.

Figuur 1
. Figuur 1 Geautomatiseerde samengestelde beeldvorming onthult weefsel-specifieke fluorescentie in hartkleppen en de lever Brightfield (A, C) en fluorescerende (B, DH) beelden van Tg (5xERE: GFP). C262/c262 embryo's behandeld met chemicaliën aangegeven op 2 dagen na bevruchting (DPF) en afgebeeld op 3 dpf. Elk paneel toont een samengesteld beeld van een goed (bestaande uit 59 afzonderlijke foto's met 5%overlap) van een 96-wells plaat. A en B, embryo's geïncubeerd in 0,1% DMSO (controle voertuig) GFP-negatief. CH, Embryo geïncubeerd met 100 ng / ml 17β-oestradiol (E2), 1,85 pM genisteïne (gen) , of 10 uM BPA vertonen fluorescentie in de hartkleppen (pijlen) en de lever (pijlpunten), embryo's behandeld met 18,5 nM gen of 1 uM BPA vertonen fluorescentie in hartkleppen, maar niet in de lever. B ', digitaal vergrote beeld van een larve van de boxed regio in paneel B. D', digitaal vergrote beeld van boxed regio paneel D, en ga zo maar door. Schaal bar = 500 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
.. G> Figuur 2 Gedetailleerde visualisatie van GFP-positieve hartkleppen Tg (5xERE: GFP) c262/c262 embryo blootgesteld aan chemicaliën aangegeven in 96-well plaat (zie figuur 1) werden handmatig afgebeeld bij een grotere vergroting, waardoor visualisatie van GFP de atrioventriculaire kleppen (pijlen) en de aortaklep (pijlpunten) van het hart. B, D fluorescentie en helderveld beelden samengevoegd. Alle beelden zijn zijaanzicht, juist voor de linker-, rug naar de top. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om het beeld automatisch weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's. Het protocol is ontwikkeld met behulp van een Zeiss Axio Observer. Z1 met Zen Blue 2011-software, maar de techniek kan worden aangepast met behulp van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium en microscoop controle software die tegels kunnen voeren maken van samengestelde afbeeldingen. Het uitrusten van een omgekeerde microscoop met een gemotoriseerde podium kan een praktische, minder duur alternatief te bieden voor de aankoop van gespecialiseerde apparatuur voor high content. Gemotoriseerde etappes variëren van enkele duizenden tot tienduizenden dollars, afhankelijk van het merk en model van de microscoop en de kwaliteit van het podium.

Er zijn een aantal cruciale stappen in het protocol. Sommige chemicaliën zijn lichtgevoelig, dus kan het nuttig zijn om embryo's in het donker incuberen tijdens de behandeling zijn. Zebravis embryo's zijn gevoelig voor uitdroging. Daarom is voor chemischecal vorderingen langer dan een dag is het essentieel om de putjes langs de randen van de 96-well plaat vullen met media om verdamping (protocol stap 2.3) beperken.

Het is ook belangrijk dat de fase nauwkeurig wordt gekalibreerd (protocol stap 3.2). Een veel voorkomende fout is om de plaat te plaatsen op het podium zonder vastzetten van de plaat volledig. In dit geval kan de positie van de plaat op het podium veranderen wanneer het stadium beweegt, wat kan leiden tot een aantal putten gedeeltelijk of niet worden afgebeeld op alle. Bij beeldvorming meerdere platen elkaar, is het niet absoluut noodzakelijk dat het podium herkalibreren voor elke plaat, mits de platen zijn van dezelfde fabrikant en zijn allemaal geplaatst in de fase in identieke oriëntaties.

Bij het instellen van de geautomatiseerde afbeelding tegels parameters (protocol stap 3.5), ervoor zorgen dat een meerderheid van elk zal goed worden afgebeeld. Op 3 dpf en ouder, zebravis larven neiging om positie nabij de randen van de WELl, dus een 90% vulfactor wordt aanbevolen zodat de randen van elk putje wordt gevisualiseerd. Hoe groter de vulfactor langere tijd voor beeldacquisitie.

Het is mogelijk om een ​​stiksels algoritme uitvoeren op samengestelde afbeeldingen om de resolutie te verbeteren. Als een stiksels algoritme moet worden uitgevoerd, stel tegels parameters om een ​​5-10% afbeelding overlap (protocol stap 3.6) bevatten. Hoe hoger de overlapping, hoe beter de prestatie van het stiksel algoritme. In sommige gevallen kan een 10% overlap laten steken een informatieve voor verdere analyse visualisatie niet vereist gebruik van hogere objectiefvergroting produceren. Hoe groter de overlap langere beeldacquisitie zal, naarmate meer beelden wordt per putje. Een overlap van 0% kan worden gebruikt voor het verminderen beeldverwerving tijd en fluorescerend licht belichting en fotobleking minimaliseren. In dit geval, vast te leggen meer gedetailleerde beelden van geselecteerde putten met behulp van een 20x objectiveringve (figuur 2).

Beeldopslag voor dit protocol zal afhangen van het experiment parameters. Afbeelding acquisitie met behulp van de parameters in dit protocol (90% vulfactor, 5% overlap, drie z-secties per opname en een belichtingstijd van 50 msec voor het GFP-kanaal en 1 msec voor de helderveld kanaal) duurt drie minuten en vijftig seconden per putje. Daarom is het mogelijk om 60 putjes drie uur en vijftig minuten screenen. Het is mogelijk om 180 putjes per dag, of 60 unieke verbindingen in drievoud screenen.

Dit protocol maakt geautomatiseerde beeldvorming voor weefsel-specifieke fluorescentie, maar heeft een aantal beperkingen. Groothoek fluorescentie beeldvorming mist de resolutie van confocale beeldvorming gebruikt in vele high content technieken. Bovendien fluorescentie kwantificatie is moeilijk vanwege de grote variabiliteit in de oriëntatie van elke zebravis binnen een put. Dit kan worden vermeden door beeldvorming zebravis onder uniformeoriëntatieomstandigheden, bijvoorbeeld door vormen of microtiterplaten met putjes die zebravisembryo dwingen uniform oriëntaties 5,10. Het beeld acquisitie tijd beperkt het aantal putten die per dag kunnen worden gescreend op 180. Screening 180 putten per dag is een significante verbetering ten opzichte van handmatige beeldvorming. Echter, kunnen typische high throughput methoden een gemiddelde van 10.000 putten per dag te screenen, maar vereisen complexe en dure werkstations.

Dit protocol is een praktische, goedkoper alternatief voor high content die gemakkelijk kan worden aangepast laboratoria met een omgekeerde groothoek fluorescentiemicroscoop. De weergavemethode beschreven maakt de analyse van weefsel-specifieke fluorescentie in embryo's die niet zorgvuldig zijn aangebracht of georiënteerd, drastisch verbetert de snelheid en het gemak van monstervoorbereiding. Samengestelde beelden kunnen worden gearchiveerd voor verwijzing. Dit protocol is ontwikkeld voor high-throughput screening o toestaanf weefsel-specifieke oestrogeen receptor liganden van chemische bibliotheken en milieu watermonsters. Alternatief zou dit beeldprotocol worden gebruikt om fluorescerende reporter voor weefsel-specifieke activiteit te screenen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Wij danken Susan Farmer en het personeel van de UAB zebravis onderzoeksfaciliteit voor zebravis zorg. Financiering verstrekt door start-up fondsen van de afdeling Farmacologie en Toxicologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic transfer pipettes; wide bore Fisher 13-711-23
Plastic transfer pipettes; fine tip Fisher 13-711-26
96-well, round, flat bottom plates Fisher 21-377-203
100 x 35 mm plates Fisher 08-757-100D
35 x 60 mm plates Fisher 08-757-100B
Dumont #5 fine forceps Fine Science Tools 11254-20 tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos
Tricaine methanesulfonate Sigma Aldrich A5040-25G see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) 
1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629-10G Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B 
Zeiss Axio Observer Z1 Carl Zeiss Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage
20x long working distance objective Carl Zeiss We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance
Axiocam HRm digital camera Carl Zeiss
ZenBlue 2011 microscope control software Carl Zeiss Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage
Methylene Blue Sigma Aldrich MB-1; 25 grams make 2% solution in RO water for use in E3B (below)
E3B 60X E3 SOLUTION:
NaCl                    - 17.2 grams
KCl                       - 0.76 grams
CaCl2-2H2O     - 2.9 grams
MgSO4-7H2O  - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams
Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle.

1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH:
60X E3      150 ml
2% methylene blue     100 μl 
Bring to 9 liters with Milli-Q water
 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
  2. Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
  3. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
  4. Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
  5. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
  6. Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
  7. Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
  8. Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
  9. Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
  10. Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
  11. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).

Tags

Developmental Biology zebravis Imaging fluorescentie microscopie oestrogeen ontwikkelingsbiologie endocrien verstorende stoffen
Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Romano, S. N., Gorelick, D. A.More

Romano, S. N., Gorelick, D. A. Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (87), e51533, doi:10.3791/51533 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter