Summary
ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。
Abstract
ゼブラフィッシュ胚は、小分子の大規模スクリーニングのための強力なツールである。蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュは、しばしば、遺伝子発現を調節する化学物質を同定するために使用される。ライブゼブラフィッシュで蛍光を分析化学の画面は、多くの場合、高含有量のスクリーニングのために高価な、特殊な装置に依存しています。私たちは、電動ステージ自動的に画像ゼブラフィッシュ胚に標準落射蛍光顕微鏡を用いて手順を説明し、組織特異的な蛍光を検出。 GFPの発現を介して、エストロゲン受容体活性を報告するトランスジェニックゼブラフィッシュを用いて、組織特異的にレポーターを活性化するエストロゲン受容体のリガンドをスクリーニングするための半自動化された手順を開発した。このビデオでは、96穴プレートに24〜48時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を配列し、エストロゲン受容体に結合する小分子を追加するための手順について説明します。 72〜96 HPFで、それぞれの画像は、ウェルからプレート全体が自動的に収集され、手動で組織特異的な蛍光検査される。このプロトコルは、心臓弁ではなく、肝臓での受容体を活性化エストロゲンを検出する能力を実証する。
Introduction
トランスジェニックゼブラフィッシュは、線維芽細胞増殖は1、レチノイン酸2因子 、ライブ胚において、3のエストロゲンシグナル伝達経路における活性を直接可視化を可能に開発されている。このようなツールは（蛍光強度の変化としてアッセイ）シグナル伝達経路を撹乱化学物質または組織特異的様式4（蛍光の局在の変化）でシグナル伝達を調節する化学物質のスクリーニングを可能にする。自動化された画像取り込みは、化学画面劇的5,6のスループットが向上します。ライブゼブラフィッシュにおける自動的アッセイ蛍光は、多くの場合、高価な、特殊な装置に依存している画面。いわゆる高含有量スクリーニングは、高分解能、定量的なイメージングが、共焦点顕微鏡、7,8のために装備、特殊なプレートリーダーを使用してのコストでの利点を提供します。このメソッドの目的は、ゼブラフィッシュ胚で自動的に分析組織特異的な蛍光である標準的な落射蛍光顕微鏡を用いて96ウェルプレート中。組織特異的蛍光は、この技術を用いて区別することができ、特殊なプレートリーダーまたはハイコンテントスクリーニング装置へのアクセスを欠いている実験室のための合理的なアプローチであり得る。
このプロトコルでは、3日後に受精（DPF）で組織特異的エストロゲン受容体（ER）ライブゼブラフィッシュにおけるアゴニストを検出するための自動化されたイメージングを使用する。トランスジェニック系統のTg（5xERE：GFP）c262/c262は、緑色蛍光タンパク質（GFP）の上流に5タンデムエストロゲン応答エレメントDNA配列（ERE）を含む3。リガンドの非存在下で、ERは、通常は不活性である。リガンド結合は、受容体がERE DNAと結合し、転写9を調節することができるように、コンフォメーション変化を誘発する。 5xERE：GFP魚ERモジュレーターのための化学ライブラリーをスクリーニングするために使用することができ、エストロゲン汚染物質の環境水サンプルをスクリーニングするために使用することができる。
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Protocol
注：このプロトコルは、バーミンガム機関動物実験委員会のアラバマ大学によって承認された。
1。ゼブラフィッシュの繁殖や卵コレクション
- 三日間化学物質暴露を開始する前に、別々の男性と女性のディバイダーで飼育タンクを組み立てる。養殖システムの水を各タンクを半埋める。 NETを使用して、TG（5xERE：GFP）を転送する分周器で区切られた各タンクに2人の男性と3人の女性を配置し、繁殖水槽に魚をc262/c262。各タンクに蓋を置き、交差するように、日付と株と語り合う場です。
- 翌朝は、すべての障壁を除去し、繁殖水槽の一端に浅い領域を作成するためにバッフルを傾けます。正確な発達のステージングを確保するために、10分間隔で胚を収集し、ゼブラフィッシュが交尾することができます。ペトリ皿にE3B媒体と優しくフラッシュ胚を用いて、茶こしを通して洗浄することによってきれいな卵。永久に成魚を返すタンク。
- 解剖顕微鏡を使用して、ソート、カウント、および任意の、未受精卵の異常または破損した胚を削除します。暗サイクル：午後02時10ライト付28.5℃でE3B媒体と家の中でペトリ皿に置き、胚。胚密度が発達に影響を与えることができる。 100×35mmディッシュと60×15 mmディッシュ中でせいぜい50胚では100以下の胚を置きます。
- 24 HPFにより、200μMの1 - フェニル-2 - チオ尿素（PTU）を含むE3Bでメディアを交換してください。 PTUは色素形成を防ぎ、ゼブラフィッシュの胚および改善された画像の鮮明さのための透明な幼虫を保持します。注意：集中PTUの株価は危険です。 E3B + PTU液を作るときは手袋を着用してください。
- 1日後受精（DPF）で、手動で細かい鉗子を使用して、各胚から絨毛膜を除去します。絨毛膜は、エストロゲンの浸透に影響を与えるようには見えない、しかし除去は画像の鮮明さを向上させます。メディアから絨毛膜を除去する必要はない。注：手動dechorionationの代わりに、胚のバッチはCHEすることができます以前に11を説明したようにmically、1 mg / mlのプロナーゼ処理を用いて絨毛膜を除去。
胚の2。化学処理
- 治療前の日は、DMSO中の千倍の濃度（または適切な溶媒）で各化学物質のストック溶液を準備します。たとえば、10μMビスフェノールA（BPA）に胚を露出させるために、100％DMSO中の10mM BPAのストック溶液を調製する。これは、各処理において均一なDMSO濃度を保証し、DMSOの非毒性の1:1,000希釈ビヒクル対照として働くことを可能にする。 -20℃での店舗の原液このプロトコルでは、胚は1および10μMのBPA、18.5 nMおよび1.85μMのゲニステイン、367 nMのエストラジオール（ポジティブコントロール）、車両（0.1％DMSO、ネガティブコントロール）に公開されます。
注意：このようなBPA及びエストラジオールのような化学物質は有害であり、人間の胎児への有害な影響を持つことができます。注意して内分泌かく乱物質を処理し、常に適切な個人保護具を使用しています。 - 治療の日には、解凍、ストック薬液を用意しました。 1.5mlのマイクロチューブに1ミリリットルE3B + PTUをピペットや株価化学溶液1μlを追加することで1:1,000に希釈します。渦精力的に。車両制御としてE3B + PTUにDMSOを1:1,000に希釈します。未処理の対照として1.5mlのマイクロチューブに1 mLのE3B + PTUを使用してください。
- 96ウェルプレートの各ウェルに大口径のプラスチックトランスファーピペット、ペトリ皿からの転送の胚を用いて、胚あたり3ウェル、条件あたり3ウェル。長期治療中の蒸発を防ぐために、プレートの外側行と列（行AおよびE、列1および12）からの胚を省略する。外側のウェルはE3B + PTU300μlで充填することができる。適切にプレートの蓋にラベルを付けます。
- 細かい傾いてプラスチック製のトランスファーピペットを用いて各ウェルからメディアを取り出します。胚を乾燥しないように迅速に働く。
- うまく対応に処理液を200μlを加える。未定義ふたをする適切なウェルに治療の追加を確実にするためのガイドとしてプレートをrneath。溶液中の化学物質を分配するためにピペッティングする前にボルテックス各チューブ。視覚的に各胚を処理液にあることを確認。胚は井戸の側にある場合には、処理液とよくにそれらを洗浄するためにクリーンなホールピペットを使用しています。
- 28.5℃のインキュベーターでプレートを置き胚を72ゼブラの蛍光について分析する。
96ウェルプレートに胚の3。自動画像
- 各ウェルに4 mg / mlのトリカイン10μlのを追加して、胚を麻酔。
注：以前の画像に胚を麻酔。 24-96ゼブラに、ゼブラフィッシュは、自発運動及び画像キャプチャ中に変化する光源への驚愕反応を示す。胚を麻酔して撮像中に動きを低減します。 - 電動ステージで96ウェルプレートを置き、ステージを校正。顕微鏡自動的用ツァイス禅ブルー2011ソフトウェアを使用して、上と制御、 サンプルキャリアのオプションを選択し、 マルチウェル96を選択します。 調整]を選択します。舞台を校正するために段階的に指示に従ってください。
注：このステップの後のタイルボタンをオフにしないでください。タイルボタンをオフにすると、キャリブレーションの設定が失われる可能性があり、96ウェルプレートを再校正する必要があります。 - 客観10倍と明視野（BF）の設定を使用して、陽性対照胚を特定し、蛍光シグナルがカメラが飽和していないことを確認して、BFとGFPのチャンネルのために適切に露出設定を設定します。シングル胚に焦点を当て、3トータルのZ-セクション、上記1の画像は50μmと現在の焦点面下の1が50μmを取得するための顕微鏡をプログラムします。
注：異なる組織、異なる焦点面を占有しているため、これは、それぞれのゼブラフィッシュの画像に焦点の心臓と肝臓で撮影されていることを確認します。 - GFP及び高炉channeを使用してタイル張りの画像を取得するために、ソフトウェアのパラメータを設定LS。 取得 ] タブで、[詳細設定 ] を選択します。 タイル領域を選択して、タイル。サークルウェルオプションを選択します。
NOTE：タイリングは、各ウェルの合成画像を作成するために使用される。単一のフィールド·オブ·ビューは、各ウェルの小部分のみを捕捉する。タイリング機能は、自動的に全体の十分の合成画像を作成して、各ウェルから複数の隣接するフィールド·オブ·ビューをキャプチャすることができます。各合成画像は、単一のウェルから数十個々の画像を含む場合、自動的にプレート当たり96合成画像をキャプチャすることが可能である。 - キャリアを選択し、[ 度90％を満たす 。 90％のフィルファクタを選択すると、各ウェルの面積の90％が合成画像に見えるように選択ウェルの複数の画像をキャプチャする。
NOTE：フィルファクタを選択すると、図は画像化される領域を表す表示されます。ウェルの面積が含まれる割合を選択それは、実験のために適切である。 - オプション ]で、必要なオーバーラップ量を選択します。
注：単一の代表的なイメージのために一緒にタイルをつなぎ合わせるときは5〜10％のオーバーラップは、画像間のスムーズな継ぎ目が可能になります。画像ステッチが不要な場合は、0％のオーバーラップを使用すると、撮影時間を減少させる。 90％のフィルファクタ及び5％のオーバーラップを使用して、単一ウエルの合成画像は、59の個々の画像からなる。 - 撮影開始。顕微鏡は、画像を自動的に取得します。
- 手動で組織特異的な蛍光（ 図1）のために、各ウェルの合成画像を検査します。
- 注：化学物質曝露前実験的治療ウェルを観察しましたことを確認するための陽性対照で始めるのがベストです。
96ウェルプレート内の胚の4。手動イメージキャプチャ
注：結果を確認するためには、ACに20X長作動距離の対物レンズを使用手動帖より詳細な画像（ 図2）。
- 客観20Xと明視野（BF）の設定を使用して、陽性対照胚を特定し、蛍光シグナルがカメラが飽和していないことを確認し、適切にBFとGFPのチャネルに対して露出設定を設定します。
- 手動で個々の胚とキャプチャ画像を識別。
注：露出設定が陽性対照胚用に選択されたら、設定を変更しないでください。各画像は、均一な条件下で捕捉されるように、これは蛍光強度の比較を可能にする。
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Representative Results
図1は、96ウェルプレートの各ウェルからの合成画像を示している。各合成画像は、5％の画像の重複を有する59個々の画像から構成されている。ライブゼブラフィッシュは、各ウェル内でランダムに配向していることに注意してください、まだ我々は、肝臓から心臓内の蛍光を区別することができます。明視野画像は、ゼブラフィッシュの方向性を評価し、形態異常（ 図1Aおよび1C）を可視化するための参考として有用である。 10倍の対物レンズを用いて自動化されたイメージングは化学物質をスクリーニングし、高倍率で手動評価を保証するかを決定するために使用される。 図2をより詳細な分析のために20倍の長作動距離対物レンズで撮影した画像を示す。これらの画像は、顕微鏡ステージからプレートを除去することなく、 図1に示される自動化されたスキャンの直後に採取した。 20X対物レンズを用いて、心の中の蛍光を正確心臓ヴァルに局在することができますVES（ 図2C-2F）。時折、胚の向きは、画像を捕捉するための準最適であってもよく、曖昧な結果をもたらすことができる。ウェルあたり3ゼブラフィッシュを配置し、三連で各処理を行う（プロトコルステップ2.3）が正確に蛍光を可視化するために、複数の機会を提供しています。
。。Tgが 図1の自動合成撮像が心臓弁および肝臓中の組織特異的な蛍光を明らかに明視野（A、C）および蛍光（B、DH）の画像（5xERE：GFP）2日後に示されている化学物質で処理c262/c262胚受精（DPF）及び図3のdpfで画像化した。各パネルを5％と59の個々の画像からなる単一のウェル（の合成画像を示す96ウェルプレートからオーバーラップ）AおよびB、0.1％DMSO（ビヒクルコントロール）中でインキュベートした胚は、GFP-陰性である。CHは 、胚を100 ng / mlの17β-エストラジオール（E2）、1.85μMゲニステイン（世代）と共にインキュベート心臓弁（矢印）と肝臓（矢じり）、18.5 nMのGENまたは1μMBPA展示心臓弁の蛍光ではなく、肝臓で処理された胚で、または10μMのBPA蛍光を示す。 B '、パネルBにDの箱入りの領域から単一の幼虫のデジタル的に拡大された画像」というように、パネルDの箱入りの領域からデジタルに拡大された画像、および。 = 500ミクロンスケールバー。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚で自動的に画像の組織特異的な蛍光の簡単な方法を説明します。プロトコルはツァイスアクシオオブザーバを使用して開発されました。禅ブルー2011ソフトウェアでZ1は、しかし技術は、合成画像を作成するためにタイリングを行うことができる電動ステージと顕微鏡制御ソフトウェアとの任意の倒立顕微鏡を使用して適合させることができる。電動ステージを倒立顕微鏡を装備すると、ハイコンテンツスクリーニングのための特殊な装置を購入する実用的な、より安価な代替手段を提供することができます。電動ステージは、ステージの顕微鏡と品質の製造元とモデルに応じて、数千から米ドル数万の範囲にある。
プロトコル内のいくつかの重要なステップがあります。いくつかの化学物質は、従って、それが治療中暗所で胚をインキュベートすることが有益であり得る、光感受性である。ゼブラフィッシュ胚は乾燥に敏感です。このため、化学のための校正曝露日以上持続することは、蒸発（プロトコールステップ2.3）を制限するために培地で96ウェルプレートのエッジに沿ってウェルを充填するために重要である。
なお、ステージを注意深く（プロトコールステップ3.2）に較正されることを保証することも重要である。よくある間違いは完全にプレートを固定することなく、ステージ上にプレートを配置することです。ステージが移動したときに、この場合に、ステージ上のプレートの位置は、いくつかのウェルがまったく部分的にか、画像化される可能性があり、これに変更することができます。連続して数枚を撮影するとき、それは限りプレートは、同じメーカーからであり、すべて同一の向きで、ステージに配置されているように、各プレートのための段階を再キャリブレーションは必須ではありません。
自動画像タイリングパラメータ（プロトコルステップ3.5）を設定する場合は、各ウェルの大半が画像化されることを確認してください。 3 DPFと高齢で、ゼブラフィッシュ幼生はWELのエッジ付近自身を配置する傾向があるlは、従って、90％のフィルファクタは、各ウェルの縁が可視化されることを保証することが推奨される。しかしながら、曲線因子より長い画像取得のための時間も大きい。
これは、分解能を向上させるために、複合画像についてステッチングアルゴリズムを実行することができる。ステッチングアルゴリズムが実行される場合、5〜10％の画像の重なり（プロトコールステップ3.6）を含むようにタイリングパラメータを設定する。ステッチアルゴリズムの性能より優れ、オーバーラップが高い。いくつかの場合において、10％オーバーラップがステッチ高倍率の対物レンズを用いてさらに視覚化を必要としない分析のための有益な画像を生成することを可能にし得る。しかし、オーバーラップより長い画像取得は複数の画像を、ウェル当たり捕獲されるように、なります。 0％のオーバーラップが画像取得時間を低減し、蛍光灯露光および光退色を最小限にするために使用されてもよい。この場合、20倍objectiを用いて選択したウェルのより詳細な画像を取り込むVEの（ 図2）。
このプロトコルの画像捕捉時間は、実験パラメータに依存する。 （90％のフィルファクタ、5％のオーバーラップ、撮影画像ごとに3つのzセクションおよびGFPチャネルのための50ミリ秒と明視野チャンネルのための1ミリ秒の露光時間）は、このプロトコルのパラメータを用いた画像取得は、3分50秒かかりウェルあたり。したがって、3時間50分で60ウェルをスクリーニングすることが可能である。それは、一日あたり180井戸、または三重に60のユニークな化合物をスクリーニングすることが可能です。
このプロトコルは、組織特異的な蛍光ための自動化された画像化を可能にするが、いくつかの制限があります。広視野蛍光画像化は、多くのハイコンテントスクリーニング技術において使用される共焦点画像の解像度を欠いている。さらに、蛍光定量は、ウェル内の各ゼブラフィッシュの配向の高い可変性のために困難である。これは、均一な条件下でゼブラフィッシュを撮像することによって回避することができる均一な向き5,10にゼブラフィッシュ胚を強制ウェルを有する金型を使用するか、マイクロプレートなどオリエンテーション条件。画像取得時間は、180日目にあたりスクリーニングすることができる井戸の数を制限します。一日あたり180井戸をスクリーニングは、手動イメージングに重要な改善である。しかし、典型的なハイスループット法は、一日に10,000ウェルの平均をスクリーニングするが、複雑で高価なワークステーションを必要とし得る。
このプロトコルは、容易に反転広視野蛍光顕微鏡で検査室によって適合させることができるハイコンテントスクリーニングに実用的な、より安価な代替を表す。ここに記載の撮像方法は、大幅に試料調製の速度と容易さを向上させる、慎重に取り付けられたまたは配向されていない胚における組織特異的な蛍光の分析を可能にする。合成画像は参考のためにアーカイブすることができます。このプロトコルは、ハイスループットスクリーニングoをを可能にするために開発された化学ライブラリーおよび環境水サンプルからfの組織特異的エストロゲン受容体リガンド。あるいは、この撮像プロトコルは、組織特異的活性のために、任意の蛍光レポーターをスクリーニングするために使用することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する金融利害関係はありません。
Acknowledgments
私たちは、スーザン·ファーマーやゼブラフィッシュケアのためのUABのゼブラフィッシュ研究施設のスタッフに感謝します。薬理学および毒物学の部門からの起動の資金が提供する資金調達。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic transfer pipettes; wide bore | Fisher | 13-711-23 | |
| Plastic transfer pipettes; fine tip | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-well, round, flat bottom plates | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm plates | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm plates | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | tip dimensions 0.05 x 0.01 mm, for manually removing chorions from embryos |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | see Zebrafish Book for recipe (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629-10G | Prepare 20 mM stock (100x) and use at 200 μM in E3B |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Protocol requires an inverted fluorescence microscope with a motorized stage | |
| 20x long working distance objective | Carl Zeiss | We use an objective with 0.4 NA and 8.4 mm working distance | |
| Axiocam HRm digital camera | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 microscope control software | Carl Zeiss | Protocol requires microscopy automation and control software to enable capturing of tiled images using a motorized stage | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25 grams | make 2% solution in RO water for use in E3B (below) |
| E3B | 60X E3 SOLUTION: NaCl - 17.2 grams KCl - 0.76 grams CaCl2-2H2O - 2.9 grams MgSO4-7H2O - 4.9 grams or MgSO4 - 2.39 grams Dissolve in 1 liter Milli-Q water; store in sterile 1 liter bottle. 1X E3B SOLUTION FOR ZEBRAFISH: 60X E3 150 ml 2% methylene blue 100 μl Bring to 9 liters with Milli-Q water |
References
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62 (2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene expression in transgenic reporter zebrafish. Developmental Biology. , 89-101 (2001).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of Estrogen Receptor Transcriptional Activation in Zebrafish. Endocrinology. 152, 2690-2703 (2011).
- Tsang, M. Zebrafish: A tool for chemical screens. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 90, 185-192 (2010).
- Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50, 319-324 (2011).
- Walker, S. L., et al. Automated reporter quantification in vivo: high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish. PLoS One. 7, (2012).
- Vogt, A., et al. Automated image-based phenotypic analysis in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 238, 656-663 (2009).
- Vogt, A., Codore, H., Day, B. W., Hukriede, N. A., Tsang, M. Development of automated imaging and analysis for zebrafish chemical screens. J. Vis. Exp. , (2010).
- Gruber, C. J., Gruber, D. M., Gruber, I. M., Wieser, F., Huber, J. C. Anatomy of the estrogen response element. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15, 73-78 (2004).
- Rovira, M., et al. Chemical screen identifies FDA-approved drugs and target pathways that induce precocious pancreatic endocrine differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108, 19264-19269 (2011).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th edn, University of Oregon Press. (2000).
